Système musculosquelettique
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Rôle de l’inflammation microcristalline dans l’athérosclérose expérimentale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois millilitres d'air injectés sous la peau du dos pour former une poche, puis des cristaux injectés dans cette poche, subissent l'ablation de la rate au cours d'une opération de trente minutes, jusqu'à vingt-huit gavages quotidiens et huit semaines de régime gras. Le porteur annonce l'identification, "à moyen terme", de cibles thérapeutiques contre les lésions cardiovasculaires liées à la goutte et à la chondrocalcinose, et une amélioration des soins "à long terme". Sur le remplacement, il décrit des tests sur lignées cellulaires qui servent à caler les doses avant le passage aux souris.
Objectifs
Les maladies à dépôts de microcristaux de pyrophosphate de calcium (PPC) et d’urate de sodium (UMS) sont les rhumatismes inflammatoires les plus fréquents de l’adultes, responsables respectivement de la chondrocalcinose et de la goutte. Ces cristaux déclenchent des arthrites aiguës récidivantes qui dépendent de médiateurs inflammatoires comme l'interleukine (IL)-1β. Les crises inflammatoires déclenchées par ces 2 types de cristaux sont associées à un risque accru d’événements et d’accidents cardiovasculaires (CV). L’élévation persistante de l’urate sanguin et l’inflammation modifient la réponse immunitaire et stimulent des changements des précurseurs des cellules immunitaires dans la moelle osseuse en stimulant la formation de cellules plus inflammatoires. Cette modification de la réponse immunitaire, appelée immunité innée entraînée peut accélérer l’athérosclérose et contribuer à l’augmentation du risque CV observée chez des patients goutteux ou souffrant de la maladie à dépôts de cristaux de PPC. Dans les modèles expérimentaux d’athérosclérose, un régime riche en gras en alternance accélère les lésions vasculaires et favorise les ruptures de plaque qui dépendent de l'IL-1β, cytokine clé de l’inflammation microcristalline. Les objectifs de ce projet sont, d'une part, de caractériser l’impact des crises inflammatoires microcristallines dans le changement des cellules immunitaire de la moelle, d'autre part, d'étudier l’implication de cette mémoire entrainée sur le développement de l’athérosclérose expérimentale, et enfin, d’en identifier les mécanismes physiopathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à moyen terme : 1. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour réduire les lésions d'athérosclérose liées aux crises inflammatoires microcristallines, 2. L'identification de cibles thérapeutiques pour prévenir les lésions cardiovasculaires, 3. L'identification des mécanismes de régulation épigénétique et métabolique liés aux crises inflammatoires microcristallines et 4. L'identification des mécanismes de régulation inflammatoire par l'urate soluble. A long terme, il permettra l'amélioration des soins chez des patients en identifiant des cibles thérapeutiques permettant de mieux contrôler les conséquences de l'inflammation microcristalline et de réduire les risques cardiovasculaires et donc la mortalité.
Procédures
Création d'une poche à air par injection dans la région dorsale de 3 ml d'air sur animaux anesthésiés par inhalation d'isoflurane: 2 fois, 30 secondes par geste. Injection dans la poche à air de cristaux sur animaux anesthésiés par inhalation d'isoflurane: 1 fois, 30 secondes. Injection d'agent pharmacologique sur animaux vigiles: 1 fois, 30 secondes. Prélèvement sanguin sur animal endormi : 1 à 4 fois, 1 minute ; Splénectomie sur animaux anesthésiés : 30 minutes. Gavage quotidien pendant 1 à 4 semaines. Un gavage par jour, nombre de gavage maximal par animal: 28. Régime riche en graisse pendant 8 semaines
Impact sur les animaux
Dans le modèle de splénectomie des douleurs sont attendues durant au maximun 3 jours avec possiblement une perte de poids et une réduction de l'activité. De plus, la répétition de manipulation des animaux peut engendrer un stress notamment pour les injections répétées d’anticorps. Les injections et prélèvements pourraient également entrainer des douleurs locales très légères. La technique de gavage pourrait également entrainer une gêne chez l’animal du fait d’une contention serrée durant le passage de la canule
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des tissus. L'évaluation finale nécessite la mise à mort de l'animal car les analyses sont effectuées sur des tissus de plusieurs compartiments
Remplacement
Des tests in vitro seront utilisés au maximum pour déterminer les conditions optimales des études in vivo : tests sur des lignées cellulaires pour déterminer la dose thérapeutique efficace d'un agent pharmacologique avant son utilisation chez l'animal; tests in vitro pour identifier le meilleur modulateur de l'immunité entraînée avant de l'étudier chez l'animal : blocage de médiateurs inflammatoires par exemple et tests in vitro pour valider les mécanismes cellulaires avant validation in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit par l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal : analyses de l’inflammation dans les liquides de lavage des poches à air, analyses anatomopathologiques, immunohistochimiques ainsi que des analyses des ARN, protéines et composition cellulaire de l’aorte, analyses métabolomiques dans le sang et transcriptomes des cellules de la moelle.
Raffinement
Les animaux seront placés dans des cages enrichies en cotons, maisons, bois, papiers dans les conditions standardisées d'hébergement et d'élevage. Pour limiter la souffrance et l’angoisse, une surveillance quotidienne et/ou hebdomadaire sera mise en place. La réalisation de la splénectomie sera effectuée en plaçant les animaux sur une plaque chauffante thermorégulée à 37°C après anesthésie générale. Les animaux recevront deux doses d’analgésique en pré (30 min) et post opératoire (6 heures). Une 3ème injection peut être réalisée le lendemain si l'animal est douloureux. Une anesthésie locorégionale sera réalisée en péri-opératoire sur les plans cutanés et musculaire . Une surveillance quotidienne renforcée sera mise en place après les injections, le gavage et la splénectomie. Pour toutes les procédures, des points limites spécifiques ont été établis et en cas de douleur ou comportements anormaux les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous sédation préalable.
Choix des espèces
Les modèles expérimentaux reproduisent les maladies humaines et sont reconnus sur le plan international : modèle de poche à air pour étudier l’inflammation, modèle génétiquement modifié et régime WD pour étudier l’athérosclérose Les souris génétiquement modifiées développent, sous régime riche en matières grasses, des lésions d’athérosclérose similaires aux plaques d’athérosclérose humaines. Ces souris développent sous régime riche en matières grasses une hypercholestérolémie principalement sur la fraction des LDL, comme chez l’homme. Ces 2 modèles (inflammation dans poche à air et athérosclérose chez souris génétiquement modifiées) sont nécessaires dans l’exploration des mécanismes physiopathologies impliqués dans le développement de l’athérosclérose lié à l’inflammation microcristalline. Les souris génétiquement modifiées (Gain ou perte de fonction) sont d’une aide précieuse pour étudier les mécanismes physiopathologiques cellulaires et moléculaires. Jeune adulte entre 2 et 5 mois permettant 1/ d’éviter la modulation de la réaction inflammatoire liée au vieillissement et 2/ d’avoir des souris avec un système immunitaire et inflammatoire compétent.
Etude de l’effet de l’inflammation sur l’expression du gène Fkrp
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Des injections intramusculaires quatre jours de suite sous anesthésie, des injections intrapéritonéales deux à cinq fois par semaine sur animaux éveillés, des prélèvements sanguins deux fois par semaine : 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles et leurs organes. Les molécules injectées sont pro-inflammatoires. Le porteur décrit la réaction locale ou générale qu'elles provoquent comme transitoire, résolue en moins de 76 heures, et situe l'objet du projet dans la compréhension du lien entre inflammation et aggravation d'une myopathie des ceintures, les retombées pour les patients tenant à des "perspectives d'amélioration". Il retient la souris adulte parce que son muscle est assez volumineux pour recevoir la quantité de produit voulue, et affirme avoir "besoin" d'un modèle animal parce que les cultures cellulaires n'intègrent pas les interactions avec le système immunitaire.
Objectifs
Les dystrophies des ceintures sont des maladies génétiques qui affectent principalement les muscles proches du tronc, comme ceux des épaules et des hanches. Ces maladies entraînent une dégradation des muscles, ce qui cause une perte de mobilité des bras et des jambes. Parmi les différentes formes existantes, notre laboratoire étudie particulièrement la LGMD-R9 (Limb Girdle Muscular Dystrophy R9 en anglais ou Myopathie des Ceintures de type R9 en français), causée par des mutations dans le gène responsable de la production de la protéine FKRP. Une des options pour traiter cette maladie est la thérapie génique. Cela consiste à utiliser des virus modifiés pour introduire une version saine du gène FKRP (Fukutin Related Protein) dans les cellules malades. Cependant, même si cette méthode a montré des résultats prometteurs, elle pose encore des défis importants. Par exemple, les doses nécessaires pour traiter les muscles sont très élevées, ce qui peut provoquer des réactions immunitaires et des inflammations. Le but de notre projet est de comprendre comment l'inflammation est liée à l'aggravation des symptômes de cette maladie. En comprenant mieux ce lien, nous espérons développer de nouvelles méthodes de traitement pour cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permet d’approfondir nos connaissances fondamentales sur l’expression du gène FKRP. Les approches thérapeutiques destinées aux patients atteints de LGMD-R9 pourraient directement bénéficier des résultats générés par cette étude. Ces résultats pourraient contribuer aux perspectives d’amélioration des traitements de thérapie génique dans le cadre de cette maladie.
Procédures
Des injections sont réalisées par voie intramusculaire au maximum 1 fois par jour pendant 4 jours, ou en une seule fois sur la durée de l’étude, sous anesthésie gazeuse de courte durée, c’est-à-dire moins de 5 minutes. D’autres injections seront faites par voie intra-péritonéale (durée d’injection : moins de 1 minute), sur animaux vigiles. Dans ce cas les molécules seront injectées entre 2 et 5 fois par semaine en fonction de leur demi-vie. Des prélèvements de sang seront faits au maximum deux fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée, c’est-à-dire moins de 5 minutes. Aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont classées légères à modérées. Certaines sont liées à la nature des différents actes réalisés : douleur de l’injection pour administration de molécules en intramusculaire ou intra-péritonéale (classe légère). Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie (classe légère). Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. D’autres nuisances sont liées à la nature des molécules injectées. Il s’agit de molécules pro-inflammatoires induisant une réaction inflammatoire systémique ou locale (classe modérée). Il s’agit de réactions transitoires qui sont résolues en moins de 76h.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des muscles et des organes.
Remplacement
Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’aborder les questions posées dans ce projet qui doit prendre en compte des paramètres tels que les interactions avec le système immunitaire. Pour poursuivre l’étude et en tirer des conclusions potentiellement applicables à l’espèce humaine, nous avons donc besoin d’utiliser un modèle animal.
Réduction
Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôles pour les différentes conditions évaluées. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Un test statistique a été utilisé pour pouvoir tirer des conclusions à partir des expériences.
Raffinement
Le raffinement du projet inclut la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. Les souris étant des animaux sociaux, elles sont hébergées par groupes. Une phase d’adaptation de 7 jours est mise en place avant l’entrée en protocole. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi et sont observés quotidiennement. Les souris sont anesthésiées lorsque les procédures expérimentales sont potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes). Nous appliquons les points limites établis préalablement grâce à l’utilisation d’une grille d’évaluation de la souffrance pour lesquels des mesures sont mises en œuvre. Nous utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées, telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir une température corporelle stable lors de la phase de réveil et l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce souris car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur cette espèce. Les animaux seront utilisés au stade adulte. A ce stade les animaux présentent une taille de muscle suffisamment importante pour injecter une quantité suffisante de molécules. Chez une souris plus jeune nous ne pourrions pas injecter une quantité suffisante pour mesurer l’efficacité du traitement administré.
étude du role du métabolisme du glucose dans la croissance du muscle chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
216 souris vont être utilisées, dans des procédures allant du sans réveil au niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur muscle plantaire. Quarante-huit d'entre elles sont opérées dix minutes sous anesthésie pour surcharger un muscle, puis marchent librement en cage pendant 21 jours en ne s'appuyant que sur lui, avec des douleurs et une inflammation post-opératoires. Seize reçoivent dans l'eau de boisson une molécule qui bloque la production d'énergie à partir des sucres, huit une injection quotidienne d'activateur pendant 21 jours, la fatigue et l'hypoglycémie faisant partie des effets attendus. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle alternatif pour l'étude du muscle à maturité, tout en indiquant que l'ensemble des analyses des mécanismes cellulaires sera réalisé sur lignées cellulaires.
Objectifs
La perte de masse musculaire est une caractéristique commune à de nombreuses maladies, altérant l’autonomie, la qualité de vie et la survie des patients. Les exercices de musculation sont efficaces pour prévenir cette perte, cependant, plusieurs pathologies sont associées à une moindre prise de masse musculaire induite par l’exercice, ce qui complique la prise en charge des patients. L’identification des facteurs impliqués dans la résistance musculaire à la prise de masse est une étape essentielle pour le développement de thérapies adaptées. Le contrôle de la masse musculaire dépend fortement de l’énergie disponible dans l’organisme. La prise de masse musculaire en réponse à un entraînement physique induit une augmentation d’environ dix fois de la consommation de glucose par le muscle, ce qui souligne l’importance de l’apport énergétique durant la croissance musculaire. Cette augmentation de l’absorption du glucose suggère que son utilisation par le muscle influence directement la croissance musculaire. Cependant, le rôle précis de la consommation musculaire de glucose lors de cette croissance reste encore mal compris. La détermination de l’impact des apports énergétiques sur la prise de masse musculaire constitue un domaine de recherche prometteur qui permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la croissance musculaire. Ce projet vise à identifier les mécanismes cellulaires responsables de l’adaptation musculaire, en se concentrant plus particulièrement sur les voies de production d’énergie au sein des cellules musculaires
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'insensibilité aux effets de l’exercice physique observée chez de nombreux patients (obèses et âgés notamment). Ce projet pourrait donc permettre d’améliorer la prise en charge des patients et d’améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Quarante-huit animaux seront soumis à un prélèvement peu douloureux au bout de la queue afin de déterminer, par analyse génétique, leur aptitude à participer à l’étude. Ces 48 animaux recevront une injection quotidienne (piqûre de 2 secondes) pendant 5 jours. Ils recevront également une injection de sédatif et d’analgésique (piqûre de 2 secondes) avant l’opération, puis une injection d’un autre analgésique immédiatement après celle-ci (piqûre de 2 secondes). Une fois endormis et sous analgésie, les animaux subiront une intervention chirurgicale (10 minutes). Les animaux des mêmes groupes effectueront une prise de masse musculaire par surcharge des muscles, ces derniers étant alors seuls responsables du travail mécanique de la marche pendant 21 jours, simplement par déambulation libre dans la cage. Seize animaux recevront un traitement par une molécule réduisant la production d’énergie à partir des sucres pendant ces 21 jours (cette molécule sera diluée dans l’eau de boisson et ne nécessitera aucune manipulation supplémentaire). Huit animaux seront traités avec un activateur de la production d’énergie, sous forme d’une injection quotidienne (piqûre de 2 secondes) pendant 21 jours. Enfin, huit animaux subiront un prélèvement peu douloureux au bout de la queue pour obtenir une goutte de sang destinée à mesurer la glycémie.
Impact sur les animaux
Les animaux opérés pourront ressentir des douleurs légères et de l’inconfort liées à l’opération, la surcharge du muscle ainsi qu’à l’inflammation les jours suivant l’opération. Les autres effets indésirables sont la fatigue induite pas l’inhibition de la production d'énergie et de potentielles hypoglycémies provoquées par l’activateur de la production d'énergie.
Devenir
Pour mener notre une étude et identifier les mécanismes impliqués dans la réponse à la croissance du muscle, nous devons prélever le muscle plantaire et réaliser des analyses moléculaires à l’issue de la procédure. Cela nécessite de mettre à mort les animaux en fin de projet.
Remplacement
Cette étude ne peut être conduite que chez l'animal car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude du muscle à maturité. Cependant, toutes les études visant à déterminer les mécanismes cellulaires impactés par l'utilisation des sucres par les cellules musculaires seront ralisées sur lignée cellulaires.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux nous analiseront les deux pattes des animaux réduisant de moitier le nombre d’individus nécessaire. La quantité de tissu prélevable pour ce genre d’expérimentation est faible ; pour éviter d’augmenter le nombre de souris nécessaires pour identifier les mécanismes cellulaires d’un côté et analyser la prise de masse du muscle de l’autre, nous réaliseront les études des mécanismes cellulaires sur des cultures cellulaires.
Raffinement
Les groupes contrôles ne seront pas incisés pour éviter les souffrances inutiles. Les souris sont opérées sous anesthésiant, analgésique et hypnotique, les muscles dont le tendon aura été sectionné ne sont pas enlevés de la loge (pas de retrait du muscle), cela réduit un peu les effets de prise de masse mais réduit la lourdeur de l’opération (plus petite incision et moins d’inflammation) et donc l’ampleur des douleurs et gènes post opératoire. Les souris sont placées sur un plateau chauffant (37°C) pendant la période de réveil post opératoire. Un gel hydraté (hydrogel) est placé dans la cage des souris et la nourriture est mise au sol la semaine suivant l’opération pour faciliter l’accès à l’hydratation et à l’alimentation. Les souris sont surveillées (apathie, toiletage, expression faciale et poids) pendant les 3 premiers jours post opératoirse. Une perte de poids de plus de 20% ou une apathie chronique (3jours) conduira à la mise à mort de l’animal de façon anticipée.
Choix des espèces
Les conditions d’hypertrophie du muscle chez l’humain que nous souhaitons étudier plus précisément sont bien reproductibles dans le modèle souris. De plus, nous utiliserons des modèles génétiquement modifiés qui n’existent que chez la souris. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Effet d’un traitement préalable par l’halofuginone sur l’intégrité mitochondriale musculaire chez des souris lors de l’inactivité physique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Suspendues par l'arrière-train pendant trois jours pour que leurs pattes ne portent plus leur poids, 640 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles passent quatre semaines et demie seules en cage, reçoivent un gavage trois fois par semaine pendant trois semaines, puis une injection trente minutes avant la mise à mort. Le porteur veut savoir si l'halofuginone protège les mitochondries du muscle pendant l'inactivité, et décrit comme modérés les bouchons urinaires du début de suspension et la perte de poids d'environ 15 %. Sur le remplacement, il conclut que l'animal vivant est "la seule option possible", l'expérimentation sur des humains en situation d'inactivité étant selon lui éthiquement difficile.
Objectifs
Le muscle squelettique joue un rôle central dans le mouvement, le maintien de la posture, la thermorégulation et les processus de défenses contre les agressions. Maintenir la masse et la fonction musculaire est essentiel pour préserver l'autonomie, prévenir les blessures et favoriser une bonne qualité de vie, notamment avec l'âge ou en cas de maladie. Les mécanismes impliqués dans le maintien de la masse musculaire ont été beaucoup étudié avec l’identification de nombreux processus intracellulaires, dont le maintien de l’intégrité mitochondriale. Pourtant, à l’heure actuelle, il n’existe toujours pas de traitement pour lutter efficacement contre la perte de masse musculaire (atrophie) qui s’installe dans diverses situations physiologiques ou pathologiques. La lutte contre l’atrophie musculaire reste donc un enjeu majeur de santé publique. L’halofuginone est un composé dérivé d’une plante chinoise qui inhibe la fibrose et l'inflammation dans différentes pathologies musculaires et qui peut retarder l’atrophie musculaire induite par l'inactivité physique chez des souris ayant été préalablement traitées par l’halofuginone pendant 3 semaines. Le projet a pour but d’étudier les effets de l’halofuginone sur le maintien de l’intégrité mitochondriale dans le muscle lors de l'inactivité physique, notamment sur les aspects structuraux et métaboliques d’une part et sur les conséquences sur la fonction musculaire d’autre part.
Bénéfices attendus
L’halofuginone est une molécule utilisée dans des études cliniques (notamment dans le cadre du traitement de dystrophies musculaires, ou de la malaria…) et possède diverses propriétés. Son rôle potentiel sur la préservation de l’intégrité mitochondriale dans le muscle en situation d’atrophie n’est pas cependant pas documenté. Ce projet apportera donc des connaissances sur des mécanismes additionnels par lesquels l’halofuginone exerce ses effets bénéfiques sur la préservation de la masse musculaire, et pourrait donc permettre à terme d’élargir son utilisation en clinique humaine.
Procédures
4 types d'intervention: (1) Hebergement individuel : durée = 4,5 semaines. (2) Suspension anti-orthostatique : durée = 3 jours. (3) Gavages : 3 fois par semaine ; durée = 3 semaines. (4) injection : 1 seule fois. 30 min. avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
(1) Protocole de suspension anti-orthostatique (3 jours) : les animaux peuvent présenter des bouchons urinaires surtout au début de la suspension. Les animaux sont donc observés deux fois par jour pendant les 3 jours de suspension. Si un bouchon est observé, l’expérimentateur l’élimine à l’aide d’une compresse humide. La suspension des animaux entraine de fait un stress lié à la restriction de leur mobilité. Cependant, les effets sur la prise alimentaire et sur le poids corporel restent modérés avec une baisse de l’ordre de 15% les 2-3 premiers jours sont normalisés ensuite. (2) Administration par gavage (3 fois par semaine pendant 3 semaines) : Ce mode d'administration peut entrainer dans certains cas du stress lié à la contention avec une irritation et/ou un incorfort. Les animaux seront observés quotidiennement pour évaluer tout comportement pouvant témoigner de douleur et la prise alimentaire mesurée tous les jours pour s'assurer qu'elle reste stable. (3) Injection (1 fois) : Ce mode d'administration peut entrainer dans certains cas du stress lié à la contention.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque protocole expérimental, les prélèvements nécessitant une procédure terminale sans réveil.
Remplacement
Les fontes musculaires lors de pathologies sont caractérisées par une atteinte simultanée de plusieurs tissus et/ou fonctions. Cette complexité des interactions entre tissus et organes n’existe que chez les animaux vivants. L’inactivité physique est impossible à reproduire sur des modèles expérimentaux plus simples (culture de tissus ou de cellules, organoïdes). Enfin, les situations d’inactivité physique chez l’Homme sont retrouvées lors de maladies ou de grande fatigue rendant éthiquement difficile ce type d’expérimentation chez l’Homme. L’utilisation d’animaux vivants placés en situation d’inactivité physique est la seule option possible.
Réduction
Nous avons planifié le nombre d'animaux nécessaires afin de garantir une puissance statistique adéquate tout en anticipant les éventuelles exclusions de certaines souris. Les procédures seront chacune réalisées en 2 étapes. Un premier protocole expérimental sera réalisé avec un effectif de 10 animaux par groupe, puis répété pour valider les observations dans 2 expériences indépendantes. Ces protocoles ne seront répétés que si les données initiales le justifient, dans le but de limiter autant que possible le nombre de souris utilisées dans chaque procédure.
Raffinement
Les contraintes que les animaux subissent au cours des procédures seront prises en compte par la mise en place de différentes mesures : (i) aménagement du milieu est prévu notamment par des ouates de cellulose pour augmenter le bien-être des souris pendant l’expérimentation. (ii) suivi quotidien des souris pour identifier des signes de stress ou de souffrance, caractrisés par l'état du pelage, le comportement de la souris (agressivité/apathie), mobilité, alimentation... Le poids corporel et la prise alimentaire seront donc mesurés tous les jours. (iii) soins spécifiques pendant la période de suspension (elimination des bouchons urinaires) (iv) mise en place de points limites. En cas d'atteinte d'un point limite l'animal sera exclu des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Choix de l'espèce : Nous avons choisi d'utiliser des souris . La souris nous permet d'étudier les mécanismes par lesquels l'halofugionone permet de retarder l'atrophie musculaire lors de l'inactivité physique car cette espèce montre une bonne concordance avec l'atrophie musculaire observée chez l'homme en situation d'inactivité physique (bed rest, immobilisation), rendant les données obtenues particulièrement pertinentes pour une transposition potentielle des résultats. De plus, nous étudions ces phénomènes à un stade dé développement adulte pour s'affranchir des facteurs confondants liés à la croissance des animaux. Choix du stade de développement : Les souris seront matures âgées de 8-12 semaines, afin qu'elles soient matures d’un point de vue sexuel, ce qui permet d’éviter les modifications hormonales observées durant la croissance. De plus, la croissance musculaire est stabilisée ce qui permet d’observer les pertes de masse musculaire per se en réponse à la suspension, indépendamment d’un effet éventuel lié à un retard de croissance.
Caractérisation chez la souris de vecteurs synthétiques pour le transfert d’acides nucléiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Vingt prélèvements sanguins, un par semaine pendant vingt semaines, et jusqu'à quatre séries d'injections dans les deux muscles des pattes pour chaque souris. 1 840 souris vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leurs organes et y doser les vecteurs. Ces vecteurs synthétiques doivent transporter des ARN messagers codant des anticorps, avec l'idée de faire produire le traitement par l'organisme lui-même. Le porteur annonce un "tournant majeur dans la lutte contre les épidémies et les pandémies", alors que le projet en est à comparer l'efficacité de formulations chez la souris.
Objectifs
La prévention et le traitement des maladies infectieuses ainsi que le développement d’alternatives au antiviraux chimiques limités pourraient voir le jour sur la base de la production d’anticorps neutralisant directement par l’organisme ouvrant ainsi un nouveau paradigme en biothérapie. Le développement d'une plateforme universelle d’ARNm codant pour ces anticorps permettrai de concevoir rapidement des traitements antiviraux, et ainsi d'offrir des solutions thérapeutiques plus confortables et plus efficaces pour les patients et à moindre coût. Cette approche pourrait être un tournant majeur dans la lutte contre les épidémies et les pandémies. Dans ce cadre, l’utilisation de vecteurs synthétiques est un élément indispensable à son succès car les molécules d’ARN sont incapables de franchir la membrane cellulaire, étape pourtant indispensable pour la production de la protéine correspondante. Les avancées récentes dans la chimie des vecteurs synthétiques ont permis le développement de vecteurs composés de polymères ou lipides, et qui possèdent des caractéristiques permettant d’envisager le transfert d’acides nucléiques (ARNm) avec des efficacités similaires à celles obtenues avec des vecteurs d’origine virale. Cela permet d’envisager simplement l’utilisation de ce type de vecteur à des fins de vaccinations, ou afin d’induire la production de protéines thérapeutiques in vivo. Les objectifs de ce projet sont de poursuivre l’optimisation de vecteurs synthétiques existants et la découverte de nouveaux, d’optimiser leur développement en évaluant l’efficacité (par dosage dans le sang et les tissus) des vecteurs pour le développement de traitements antiviraux à base d’anticorps produits directement dans l’organisme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole, permettra de poursuivre la caractérisation et l’identification des vecteurs synthétiques de nouvelles générations efficaces, simples et non-toxiques. Également, cela permettra d’évaluer l’efficacité de ces vecteurs synthétiques dans le cadre du développement d’alternatives aux anti-viraux chimiques pour lutter contre les maladies infectieuses. - Long terme : en cas de succès de la preuve de concept chez la souris, la voie sera ouverte pour i) le développement de nouveaux traitements innovants des maladies infectieuses ou toute maladie nécessitant la production d’un anticorps thérapeutique, présentant une meilleure efficacité et moins d’effets indésirables et ii) le développement de méthodes de prévention d’infection non chimiques qui présenteraient moins d’effets secondaires et seraient mieux tolérées que les traitements actuels tout en préservant l’environnement de l’accumulation de métabolites chimiques dans l’environnement et (iii) limiter l’utilisation d’antibiotiques qui induisent des résistances. L’impact du succès de ce projet serait de proposer une approche ARNm universelle, immédiatement disponible pour toutes les indications thérapeutiques, offrant une réponse biologique robuste et facilement industrialisable grâce à un outil standardisé et unique quel que soit le produit
Procédures
Les animaux subiront des injections intramusculaires des vecteurs sous anesthésie gazeuse de l'animal, placé sur tapis chauffant. La procédure durera moins de 5 min. Au maximum 4 séries d'injections intramusculaires dans les 2 muscles par souris espacées d’au moins 3 jours. Des prélèvements de sang seront également effectués sur animal anesthésié. Des prélèvements sanguins sont prévus avant l'injection puis 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude pour un durée totale de 20 semaines, soit 20 prélèvements sanguins en tout. Chaque prélèvement durera moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés sont principalement dus à l’injection ou aux prélèvements de sang. Plus précisément, nous surveillerons quotidiennement l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un comportement anormal de l’animal, une perte de poids, un gonflement ou une inflammation au site de prélèvement sanguin, une léthargie…. Les nuisances attendues sur les animaux sont : 1) Inflammation transitoire au niveau du site d’injection; 2) Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang; 3)- Risque infectieux lié à la réalisation du geste invasif (injection et prélèvement).
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et les organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le vecteur et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les vecteurs, évaluer leur efficacité, et / ou réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
De manière systématique, les vecteurs évalués in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des vecteurs testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, la meilleure efficacité de transfection étudiée ici correspond aux conditions où le plus de protéine codée par l’ARN messager issu du vecteur est exprimée dans le tissu dans lequel a été injecté le vecteur, donc seule l’approche in vivo sera considérée pour évaluer leur efficacité. En outre, les vecteurs utilisés dans notre étude sont de nature polymérique et ne sont pas capables de délivrer des ARN dans des cellules en culture, ni même des organoïdes. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. C’est d’ailleurs par cette approche que cette nouvelle classe de vecteurs a été récemment validée et qui a fait l’objet d’un développement préclinique réglementaire dont le plan d’étude a été validé par l’ANSM et les résultats présentés également à l’ANSM démontrant aucune toxicité ni mortalité.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité autant que possible tout en garantissant l’obtention de résultats interprétables, afin d’éviter la nécessité d’une étude supplémentaire. Un premier criblage in vitro a permis de ne retenir que les vecteurs les plus efficaces. En tenant compte de la variabilité attendue des réponses, un maximum de 10 animaux par groupe a été prévu. Ce seuil permet d'assurer la pertinence des analyses et la fiabilité des comparaisons, tout en respectant le bien-être animal. Le nombre a été déterminé à partir de données historiques et d’une approche statistique, et l'utilisation de chaque animal a été optimisée grâce à des mesures longitudinales et à des études pilotes. L’effectif sera revu à la baisse si les résultats préliminaires d’efficacité le permettent, en visant des données cohérentes et reproductibles entre les individus.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement - tube, frisotis, dôme, facilité d’accès à l’alimentation), nous utiliserons un analgésique local lors des prélèvements sanguins. Dans le cas de l'observation d'un inconfort liée aux injections intramusculaires, une injection de buprénorphine sera effectuée. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sera effectué une fois par semaine. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors des prises de sang), et les injections seront réalisées sous anesthésie et les animaux positionnés sur tapis chauffant.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car les vecteurs que nous utiliserons à titre de comparaison ont été validés in vivo sur la souris. De plus, cette espèce mammifère (à l’identique du rat) présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets des vecteurs chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant et analysable de liquides biologiques peut parfaitement être récupéré à partir de cet animal de laboratoire. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté à aux vecteurs étudiés mais concernera quasi exclusivement des souris adultes d’environ 8 à 10 semaines pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux.
Maintien et génotypage invasif d’une lignée de souris génétiquement modifiée développant une atteinte musculaire progressive
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
La grande majorité de ces souris quitte le projet pour d'autres protocoles déjà autorisés, les autres, celles dont le génotype ne convient pas et les anciens reproducteurs, sont tuées. 4 428 souris porteuses d'une mutation provoquant une myopathie progressive vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit, jeune et éveillée, une biopsie de la queue pour identifier son génotype, geste répété au pavillon de l'oreille aux ciseaux fins quand l'analyse échoue. Le projet n'a d'autre objet que d'entretenir la lignée et de produire les lots d'animaux des projets de recherche, et le porteur ne justifie le chiffre de 4 428 que par le contrôle du nombre d'accouplements.
Objectifs
Nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes d’une maladie génétique du muscle conduisant à une atteinte musculaire (myopathie) et nous développons également des approches thérapeutiques pour cette maladie. Dans ce contexte nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifiée porteur de la mutation la plus fréquente chez l’homme qui récapitule en grande partie la pathologie humaine. Ces souris développent une faiblesse musculaire lentement progressive mesurable sur certains muscles par un perte de force. Il n y’a pas d’atteinte cardiaque ou respiratoire. Une biopsie sera nécessaire afin de génotyper les animaux. L’objectif est donc l'entretien de la lignée afin de générer les lots de souris du génotype d'intérêt pour nos études, indispensables pour mener à bien les projets de recherche. Cette lignée est essentielle pour comprendre les mécanismes pathologiques conduisant au développement de la maladie et pour pouvoir évaluer nos stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les souris générées dans ce projet permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur les mécanismes physiopathologiques d'une myopathie rare et invalidante (moins de 1 cas pour 100 000 naissances) et permettront le développement et la validation de traitements qui, à ce jour, n’existent pas pour les patients atteints de cette maladie. Les données générées pourront être extrapolées à d’autres pathologies caractérisées par des défauts similaires, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour d’autres maladies neuromusculaires.
Procédures
Un génotypage est nécessaire. Celui-ci sera effectué à partir d’une petite biopsie caudale réalisée sur un animal juvénile et vigile. Ce prélèvement aura lieu une seule fois au cours de la vie de l'animal et dure quelques secondes. Exceptionnellement, s’il y a un problème de génotypage une nouvelle biopsie pour vérification sera réalisée, dans ce cas une petite biopsie tissulaire au niveau du pavillon de l’oreille sera réalisée en quelques secondes avec des ciseaux fins aiguisés
Impact sur les animaux
Les prélèvements pour le génotypage permettant l’identification génétique pourront induire une douleur légère et un léger stress de courte durée chez l'animal. Il peut également y avoir un risque minime d'infection au site de prélèvement. La manipulation des animaux pourra engendrer un stress. Le phénotype des animaux induit une myopathie progressive qui peut entrainer une fatigue musculaire ainsi que des douleurs musculaires pouvant réduire la mobilité des animaux dans de rares cas.
Devenir
La grande majorité des animaux sera transférée pour expérimentation et affectée à d’autres projets préalablement autorisés utilisant des animaux à des fins scientifiques (utilisation continue). Les animaux qui n'ont pas le génotype d'intérêt pour les projets de recherche et les anciens reproducteurs seront euthanasié.
Remplacement
Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaire participant au développement de la pathologie musculaire. De la même manière, pour le développement de stratégies thérapeutiques seul une administration dans organisme entier permet de vérifier l’efficacité e la potentielle toxicité d’un traitement ainsi que sa bonne dispersion aux organes cibles (ici les muscles) en fonction de son mode d’administration. Un modèle animal est donc nécessaire pour une bonne compréhension de la physiopathologie et comme modèle préclinique pour tester des approches thérapeutiques.
Réduction
4428 animaux seront entretenus dans ce projet. Les protocoles expérimentaux des projets seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que les expériences soient interprétables et pour éviter de les répéter. Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet élevage, nous contrôlons le nombre d'accouplement afin de ne pas générer d'excédent de stock en fonction des projets en cours autorisés. Nous avons aussi optimisé notre stratégie de croisement afin d'obtenir des portées avec le bon génotype. Les accouplements seront échelonnés dans le temps afin d’obtenir des portées tout au long de l’année et d’arrêter les croisements si un nombre suffisant d’animaux est obtenu. Si les lots produits sont suffisants pour assurer les expériences dans le cadre des projets actuels et futurs, les accouplements seront arrêtés et une cryopreservation sera envisagée.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les animaux ne développent habituellement pas de phénotype conduisant à une diminution de leur locomotion mais le cas échéant, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. Tout animal blessé ou montrant des situations d'inconfort sera euthanasié. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Des animaux sont indispensables pour étudier le muscle in vivo dans un système pathologique. Le modèle le plus commun utilisé dans les études précliniques dans le domaine musculaire est la souris pour laquelle de nombreux outils analytiques sont disponibles. Le modèle utilisé est reconnu et validé par la communauté scientifique, permettant des comparaisons directes avec les données. Enfin, une nos stratégies thérapeutiques pour laquelle nous avons fait la preuve de concept est un outil génétique qui cible spécifiquement la mutation du gène portée par ce modèle. Les souris utilisées pour les accouplements auront entre 2 et 8 mois d'âge afin conserver une bonne productivité des accouplements. Les accouplements seront échelonnés dans le temps afin d’obtenir des portées tout au long de l’année et si les lots produits sont suffisants pour assurer les expériences dans le cadre des projets actuels et futurs, les accouplements seront arrêtés et une cryopréservation sera envisagée. Les animaux pour l’élevage sont utilisés à partir de 7 jours pour les biopsies et jusqu'à 8 mois de vie pour les reproducteurs. Les animaux seront utilisés dans le cadre de projets autorisés, entre 3 semaines et 8 mois. Cela permet d’étudier le développement de la maladie en physiopathologie et aussi de pouvoir intervenir avant l’apparition des symptômes (avant 3 semaines) ou bien sur un phénotype plus installé (après 3 mois) lors d’évaluation de l’efficacité des traitements à prévenir ou reverter la maladie.
Élevage d’un modèle de souris reproduisant un cancer colorectal conduisant à des altérations du système musculaire
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris de cette lignée sont modifiées pour développer des polypes intestinaux, un cancer du côlon qui leur fait perdre force et masse musculaires et provoque une anémie. 420 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toute la portée, y compris les souriceaux dont le génotype ne sert à rien pour l'étude, subit à sept à dix jours un prélèvement de tissu pour analyse génétique. Les mâles reproducteurs sont tués à quatorze semaines, âge auquel le porteur affirme que l'atteinte musculaire reste sans incidence notable, et 210 animaux repartent vers l'élevage ou vers un prélèvement de tissus après leur mise à mort.
Objectifs
Le développement d’une tumeur au sein du corps humain à des répercussions sur l’organise entier. Plus particulièrement, il a été démontré que la croissance d’une tumeur réduit la force et la masse musculaire mais les mécanismes biologiques sont encore mal connus. Le projet vise à décrire la procédure d’élevage d’un modèle de souris qui développe des polypes intestinaux, correspondant à un cancer du côlon.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus seront l’identification génétique de la lignée à partir d’une biopsie de tissu pour optimiser la gestion de l’élevage. Ce projet permet aussi d’organiser au mieux la production de cohortes d’animaux pour nos projets scientifiques (utilisation continue vers des projets liés à l’étude des dysfonctions musculaires liées au cancer).
Procédures
Pour sélectionner les souris génétiquement modifiées nécessaires à l’étude, un morceau de tissu sera prélevé à l’âge de 7-10 j sur toutes les souris de la portée (souris d’intérêt pour ce projet, mais aussi les souris de génotype non pertinent ou ne présentant pas phénotype dommageable) pour analyser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. Les souris atteintes d’un cancer du côlon seront utilisées jusqu’à l’âge de 14 semaines, stade au cours duquel les atteintes musculaires restent légères et sans incidence notable sur la capacité des animaux à se mouvoir, s’hydrater et s’alimenter
Impact sur les animaux
A l’âge de 7 jours, on prélève un morceau de tissu pour analyser l’ADN des souris génétiquement modifiée. Ceci peut entrainer une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés mais le geste est rapide (quelques secondes). Le risque de saignement est très faible. La nuisance liée au phénotype dommageable est principalement induite par une anémie et une légère diminution de la masse et de la force musculaire à l’âge d’utilisation des animaux qui n’impacte par leur capacité à se mouvoir, s’hydrater et s’alimenter.
Devenir
Les mâles reproducteurs du modèle de cancer du côlon âgés de 14 semaines seront mis à mort. Les animaux WT (mâles et femelles) âgés de moins de 8 mois pourront être réutilisés par des expérimentateurs de l’équipe dans le système d’élevage en vue du maintien de lignées ou pour un prélèvement de tissus post-mortem. Dans le cas contraire ils seront mis à mort.
Remplacement
Des analyses in vitro, utilisant des cultures cellulaires ont déjà été réalisées afin d’établir une évidence des processus biologiques. Afin de démontrer la pertinence des résultats, l’analyse des tissus ou des cellules de l’animal est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste en connaissant le schéma d’accouplement et le nombre de lots de souris nécessaires pour chaque projet d’expérimentation.
Raffinement
Pour vérifier la modification génique, la biopsie sera réalisée sur une zone peu innervée à l’âge de 7-10 jours pour limiter la douleur liée à la petite incision. Lors de la contention des nouveau-nés, le zootechnicien se frottera les mains dans la litière pour limiter le stress des animaux. La préhension des souris sera réalisée par transfert à l’aide d’un tunnel pour réduire le stress. L’âge de la mise à mort des animaux a été fixé à 14 semaines pour les mâles reproducteurs, stade au cours duquel les atteintes musculaires restent légères et sans incidence notable sur la capacité des animaux à se mouvoir, s’hydrater et s’alimenter.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l’homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans l’homéostasie du muscle strié squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes permettant ainsi de réaliser des études plus spécifiques.
Effet de l’âge et du poids sur les potentialités des cellules souches musculaires de truites arc en ciel
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Améliorer les pratiques d'élevage piscicole et mieux maîtriser la croissance musculaire de la truite : c'est d'abord à cela que sert ce projet, où 125 truites arc-en-ciel sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La procédure tient en une privation alimentaire d'un an, les poissons n'étant nourris que le lundi et le jeudi, ce qui les laisse jusqu'à cinq jours par semaine dans une sensation de faim que le porteur qualifie de modérée. Sur les 125 truites affamées, dix seulement serviront à produire les résultats, les autres étant là pour maintenir une densité correcte dans les bacs. La piste médicale évoquée, un traitement de l'atrophie musculaire, arrive après les objectifs zootechniques.
Objectifs
La croissance musculaire nécessite l'activation et la différenciation des cellules souches musculaires aussi appelées cellules satellites. Chez les poissons, la croissance musculaire est continue tout au long de la vie de l’animal mais la formation de nouvelles fibres (hyperplasie) diminue avec l’âge et(ou) le poids, et les mécanismes cellulaires sous-jacents ne sont pas encore connus. Nous avons précédemment montré que la fonctionnalité de la niche (environnement des cellules souches musculaires) diminuait rapidement pour atteindre un minimum dès 500g. Lors d'une expérience préliminaire nous avons montré que cette diminution était liée au poids et pas à l'âge. Notre objectif est maintenant de déterminer quelles sont les gènes différentiellement exprimés avec le poids qui peuvent expliquer cette diminution.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d'identifier les gènes différentiellement exprimés en fonction du poids et pas de l'âge des animaux. Cette question qui existe également chez les mammifères, ne peut être résolue que grâce à l’utilisation de poissons avec une croissance continue et une très forte plasticité de croissance comme la truite. Cette connaissance devrait permettre d’améliorer les pratiques zootechniques afin de maîtriser plus finement la croissance musculaire et les caractéristiques du muscle de truite. Au-delà de ces aspects agronomiques, une meilleure compréhension des impacts de l’âge et du poids sur les capacités des cellules souches à se différencier, pourrait fournir de nouvelles pistes dans le traitement de certaines pathologies d’atrophie musculaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à une restriction alimentaire afin de ralentir leur croissance pendant 1 an, puis ils seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être nourris uniquement 2 jours par semaine (lundi et jeudi) ce qui engendre une sensation modérée de faim pendant au maximum 5 jours par semaine. Néanmoins ces animaux, de par leur métabolisme, peuvent aisément gérer des périodes sans nourriture.
Devenir
A l'issue de la procédure les animaux seront mis à mort par une personne compétente désignée par les responsables du projet et des prélèvements de tissus musculaires seront réalisés pour analyser l'expression de l'ensemble des gènes.
Remplacement
Les objectifs du projet étant de déterminer l’impact de l’âge et du poids sur les capacités myogéniques du muscle, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.
Réduction
Pour soumettre le minimum d’animaux à la restriction alimentaire modérée, nous allons utiliser des bacs de petite taille afin de maintenir une densité optimale avec 125 poissons/bac au maximum. Parmi ces animaux, 10 seront utilisés pour obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité) et leur manipulation sera réduite au maximum avec un suivi du bien-être à l'aide d'une grille. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés. Un enrichissement particulier sera mis en place avec des plantes et tubes en plastique pour limiter l'agressivité potentielle.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). C’est une des rares espèces qui permet de tester séparément l’effet de l’âge et du poids compte tenu de sa croissance continue et de sa très grande plasticité de croissance. Nous allons utiliser des poissons de 10g et 1kg. Une expérience préliminaire, nous a montré que les capacités myogéniques de la niche étaient bien différentes à 10g (~6 et 12 mois) et 1kg (12 mois).
Sélection d’un vecteur optimisé pour une thérapie génique précoce d’un modèle murin de syndrome myasthénique congénital
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Injectées dès la naissance d'un vecteur viral, puis soumises trois ou quatre fois à des tests de force d'agrippement, de coordination, de fatigabilité musculaire et de capacité respiratoire, 2 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont toutes tuées, les unes avant sevrage parce qu'elles n'ont pas le génotype recherché, les autres en fin de procédure pour prélever leurs tissus. Le modèle porte une délétion du gène ColQ qui reproduit un syndrome myasthénique congénital, avec faiblesse musculaire généralisée dès les premiers jours de vie. Une précédente tentative de thérapie génique menée par la même équipe a provoqué une toxicité inattendue, fait que le résumé rapporte tout en présentant les prélèvements sanguins comme une douleur équivalant à l'introduction d'une aiguille.
Objectifs
Le syndrome myasthénique congénital est une maladie rare d’origine génétique, ayant une incidence estimée à 1 personne sur 250 000. Elle présente des caractéristiques cliniques et génétiques hétérogènes, puisque différents gènes déficients peuvent être individuellement associés à ce type de pathologie. Ces gènes sont impliqués dans le bon fonctionnement des jonctions neuromusculaires, qui est la structure permettant la transmission de l’information nerveuse vers les muscles et donc la contraction musculaire. L’un des syndromes myasthéniques congénitaux est associé à des mutations dans le gène COLQ, pour collagène Q. Les patients souffrent de faiblesse musculaire sévère, de fatigue, de scoliose importante, d’insuffisance respiratoire et ont une espérance de vie réduite. Pour le moment, il n’existe pas de traitement curatif mais uniquement des traitements symptomatiques. Le but du projet est de concevoir une approche de thérapie génique innovante pour le syndrome myasthénique congénital lié à ColQ, consistant à l’introduction du gène sain dans les cellules à l’aide de vecteurs. Pour cela, nous disposons d’un modèle murin déficient en ColQ qui reproduit les symptômes observés chez l’Homme. Dans une étude précédente, nous avons administré un vecteur viral non optimisé, porteur du gène sain COLQ, pour une première preuve de concept à un stade post-symptomatique et qui a provoqué une toxicité inattendue. Nous souhaitons, dans ce projet, traiter les animaux avec un vecteur viral que l’on optimisera pour une meilleure spécificité et efficacité pour le transfert du gène COLQ et son expression en protéine essentiellement dans le muscle squelettique, en tenant compte des résultats obtenus précédemment dans l’équipe. Nous avons sélectionné à partir d’études sur cellules en culture, 6 vecteurs différents. Le phénotype des souris traitées avec ces vecteurs à différentes doses sera analysé jusqu’à 3 mois ou 1 an, en évaluant l’état général des souris, la force musculaire et globale, la capacité respiratoire, l’état des jonctions neuromusculaires et la structure des fibres musculaires.
Bénéfices attendus
Grâce à l’étude de différents vecteurs, à différentes doses, ce projet pourrait permettre d’identifier chez la souris, un vecteur efficace pour traiter à une dose la plus faible possible le syndrome myasthénique congénital liée à l’absence de collagène Q, tout en réduisant le risque de toxicité. Ce vecteur optimisé pourra être utilisé pour le développement préclinique et clinique d’un candidat médicament pour cette pathologie mais pourra également être utilisé pour traiter d’autres syndromes myasthéniques congénitaux, en changeant uniquement le gène responsable de la pathologie.
Procédures
Injection des traitements : injection unique, environ 2min par souris. Mesure de l’activité des animaux : 1h30, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Mesure de la force d’agrippement : 2min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Test de coordination et de force musculaire : 10min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Test de fatigabilité musculaire : 5min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Mesure de la capacité respiratoire : 1 fois 10 min par souris. Mesure de la force globale : 1 fois 10 min par souris. Analyse de la transmission de l’information nerveuse vers les muscles : 1 fois 20 min par souris. Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés : 4 fois, environ 5 min par souris.
Impact sur les animaux
Les nuisances que ce modèle peut rencontrer sont liées au fait qu’il n’exprime pas la protéine collagène Q. Les animaux malades développeront des troubles du comportement moteur liés à une faiblesse musculaire généralisée. Suite aux traitements, dans le cas d’une injection à dose suboptimale, les nuisances seront liées à celles du modèle. Les injections intraveineuses ou les prélèvements sanguins provoquent une douleur légère équivalente au seuil de douleur lié à l’introduction d’une aiguille sous bonne pratique vétérinaire. L’animal subira, au cours des évaluations fonctionnelles, un stress lié à la manipulation. Très rarement, certains animaux pourront souffrir de blessures des griffes/doigts, de petites plaies ou d’altérations des fonction locomotrices suite aux tests fonctionnels.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés avant sevrage s’ils ne possèdent pas le génotype nécessaire pour être inclus dans les études. Le reste des animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever les tissus qui nous permettront de déterminer l’efficacité des traitements.
Remplacement
Dans ce projet, une présélection de vecteurs a été réalisée en mesurant l’efficacité de ces vecteurs à délivrer le gène thérapeutique dans les cellules musculaires, et à produire la protéine d’intérêt. Cependant, ces modèles en laboratoire ne nous permettent pas d'observer comment le vecteur se répartit dans tout le corps ni d'étudier les effets thérapeutiques, car ils ne peuvent pas simuler les problèmes de fonctionnement des muscles, comme la perte de force. Pour évaluer l’efficacité et la spécificité d’un vecteur administré dans l’ensemble du corps, l’utilisation d’animaux est indispensable. Notre modèle de souris reproduit la pathologie musculaire avec fidélité, ce qui nous permet de mesurer dans le temps et de façon prédictive de la clinique (c’est-à-dire chez l’Homme) l’efficacité des traitements sur l’ensemble des muscles squelettiques et la distribution du vecteur dans les différents tissus pour analyser leur spécificité. Ils permettent d’étudier les défauts liés à la fonction du muscle et de la jonction neuromusculaire ou encore les niveaux de biomarqueurs dans le sang.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de tests statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux pour observer des différences entre un animal sain et un animal traité. En amont de cette étude expérimentale sur des modèles animaux, nous avons sélectionné grâce à des études sur cellules les 6 meilleurs vecteurs viraux capables d’exprimer fortement la protéine COLQ dans les cellules musculaires. La première étape de ce projet nous permettra d’évaluer l’efficacité de ces 6 vecteurs à 3 doses différentes pour cibler l’ensemble des muscles et traiter la pathologie à moyen terme, sur 3 mois. Les 2 meilleurs candidats seront sélectionnés afin de déterminer la dose thérapeutique optimale sur une période de 1 an. Dans l’étude à 3 mois, nous procèderons par étape, en injectant en premier les animaux avec la plus forte dose de vecteurs. Si des animaux injectés avec une certaine dose d’un vecteur donné montrent des signes d’absence d’efficacité, nous n’injecterons pas les doses plus faibles pour ce vecteur. Si un des vecteurs injectés dans l’étude à 3 mois a un effet thérapeutique nettement supérieur aux autres, l’étude de dose à un an se fera uniquement avec ce vecteur. La toxicité d’un médicament est évaluée avec la dose thérapeutique optimale sur des animaux sains. Dans cette étude, des animaux sains seront injectés avec les 3 doses de ce vecteur car la portée est entièrement injectée à la naissance. Par conséquent, nous utiliserons ces animaux pour l’étude de toxicité, au lieu d’injecter ultérieurement de nouvelles portées lorsque nous serons capables de déterminer la dose thérapeutique optimale. Nous réduisons ainsi le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
D’une façon générale, toutes les mesures possibles permettant d’améliorer les conditions de vie des animaux seront prises. Les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies à l’aide de coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. S’il s’avère qu’un seul animal se retrouve dans une cage, au sevrage, puisqu’il est le seul à devoir être suivi sur la période d’étude, un animal compagnon sera ajouté pour éviter l’isolement. Pour éviter des bagarres entre mâles, le compagnon sera un frère de la même portée si possible. Sinon un autre mâle du même âge sera ajouté dès le sevrage, ce qui réduira les risques. Après sevrage, les souris mutantes traitées ou non seront observées quotidiennement avec attention et des mesures de poids seront effectuées 2 fois par semaine. Avant sevrage, la fréquence est réduite à une fois par semaine pour limiter les manipulations et donc le stress pour la portée et la mère. Un aliment hydratant et nourrissant sera appliqué dès constatation que les animaux éprouvent des difficultés à se mouvoir. Des points limites adaptés ont été mis en place afin d’éviter toute souffrance animale. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress de l’animal lié à l’acte et assurer son immobilité.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène ColQ (pour collagène Q), responsable d’un syndrome myasthénique congénital, ce qui en font le plus petit modèle animal présentant les signes cliniques et pathologiques caractéristiques de cette maladie. Afin de favoriser l’expression de la protéine COLQ le plus tôt possible et de ralentir la progression de la maladie, les animaux seront traités dès la naissance, sachant que les animaux malades présentent des signes de la pathologie dès les premiers jours de vie. Les animaux seront suivis sur une période de 3 mois ou de 1 an, pour déterminer l’efficacité des traitements à moyen et long terme.
Le rôle des granulines dans la régénération des organes du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
936 poissons zèbres adultes vont être utilisés, tous tués pour prélever leur cœur, leur nageoire ou d'autres tissus, dont 768 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 432 subissent l'amputation au scalpel d'une partie de la nageoire caudale, d'autres une cryolésion du cœur de deux minutes sous anesthésie, et 168 sont écartés après génotypage parce qu'ils ne portent pas la modification recherchée. Le porteur décrit ensuite de l'hyperventilation, une prise alimentaire réduite et des comportements qu'il qualifie d'anxiété ou de résignation, prostration au fond du bac ou nage exclusive en surface, et prévoit de tuer immédiatement les poissons dont la nage devient erratique. Le bénéfice annoncé se limite à l'identification de stratégies immunomodulatrices capables de stimuler la régénération des organes chez les mammifères, perspective lointaine face aux lésions cardiaques et aux amputations infligées maintenant.
Objectifs
Les mammifères, y compris les humains, sont généralement incapables de régénérer leurs organes, ce qui constitue un obstacle aux nouvelles stratégies thérapeutiques pour plusieurs événements traumatiques et maladies dégénératives (infarctus du myocarde, ostéoporose, fracture osseuse). Cette incapacité à se régénérer contribue à une diminution à long terme de la fonction des organes et à une augmentation de la morbidité, et devient particulièrement importante dans les populations âgées. En particulier, selon l'Organisation Mondiale de la Santé (World Health Organization), les cardiopathies ischémiques telles que l'infarctus du myocarde représentent la première cause de mortalité dans le monde (13% du nombre total de décès dans le monde) et la deuxième cause de morbidité, juste après le COVID-19, dans la dernière évaluation (2021). Après un infarctus du myocarde, par exemple, le tissu mort est remplacé en permanence par du tissu cicatriciel, ce qui diminue la fonction cardiaque. Avec l'allongement de la durée de vie des populations modernes, l'ostéoporose, qui est de plus en plus répandue dans les populations âgées et qui est associée à des conditions pro-inflammatoires, diminuent également la qualité de vie et constituent un fardeau important pour la santé - elle touche une femme sur trois et un homme sur cinq de plus de 50 ans dans le monde (Organisation Mondiale de la Santé). Contrairement aux mammifères, le poisson zèbre peut régénérer entièrement ses organes, y compris le cœur et la nageoire (c'est-à-dire un modèle de régénération osseuse), et retrouver leur fonction. Le moment, l'étendue et le type de réponse immunitaire après une lésion d'organe influencent fortement les résultats de la régénération. En particulier, une vague inflammatoire autolimitée est essentielle pour parvenir à une régénération correcte des organes. Les granulines sont molécules naturellement produites par l'organisme pour aider à contrôler l'inflammation et potentiellement soutenir la réparation des tissus, et jouent un rôle important dans la prolifération cellulaire. De plus, elles sont régulées à la hausse dans les tissus en régénération chez le poisson zèbre. Nous émettons l'hypothèse que les granulines jouent un rôle clé dans le processus de régénération. Ce projet vise à étudier le rôle des granulines pendant la régénération des organes du poisson zèbre (cœur et nageoire). Cette étude sera essentielle pour stimuler la régénération dans des scénarios non régénératifs.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d'étudier les aspects immunitaires particuliers qui stimulent la régénération des organes. Cela permettra d'identifier des stratégies immunomodulatrices pour stimuler la régénération des tissus tout en minimisant les dommages causés aux tissus après une blessure.
Procédures
Pour les études cardiaques, 336 animaux seront soumis au génotypage par prélèvement caudal sous anesthésie. Parmi eux, 50 % (168) n'auront pas le bon génotype et ne subiront donc pas d'autres procédures (ils sont donc classés comme modérés). 168 animaux seront génotypés sur la base de la seule fluorescence. Cela est réalisé en analysant rapidement la fluorescence au niveau des yeux sous un stéréomicroscope, sous anesthésie. Parmi ces derniers, 336 seront soumis à une cryoblessure cardiaque pour étudier le processus de régénération et la réponse immunitaire correspondante. L'intervention elle-même dure environ 2 minutes. Le processus de régénération sera suivi pendant les 7 premiers jours, avec un petit nombre d'animaux (48) suivis jusqu'aux stades de régénération tardive et complète. Pour les études de régénération de la nageoire caudale, certains poissons-zèbres (432) seront soumis à une amputation d'une partie de nageoire, une procédure considérée comme légère. Pour ce faire, les poissons anesthésiés sont placés sur le côté dans une boîte de Pétri et, à l'aide d'un scalpel, une coupe rapide est effectuée sur la nageoire caudale et une petite partie du tissu est enlevée, sans affecter les autres tissus environnants. La procédure prend quelques secondes et le processus de régénération sera suivi jusqu'à 14 jours (nous n'étudions ici que les 7 premiers jours, lorsque le processus de régénération est très actif). Les autres interventions légères comprennent l'imagerie en direct (jusqu'à 10 minutes) du tissu de la nageoire caudale en cours de régénération, et la coloration des os en direct (15 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent : - La cryoblessure (cryoinjury) pour étudier la régénération cardiaque. Les effets indésirables potentiels surviennent généralement dans les 12 premières heures suivant la blessure. Il s'agit notamment de l'hyperventilation et de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Occasionnellement, un petit nombre d'animaux peut présenter une nage erratique (c'est-à-dire des poussées de nage verticale) immédiatement après l'opération. Pour éviter que ces animaux meurent en quelques heures ils sont donc immédiatement euthanasiés lorsque ce comportement est observé. - Amputation de la nageoire caudale. Les effets indésirables potentiels se produisent généralement immédiatement après la blessure et comprennent l'hyperventilation et des changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Celles-ci ne durent généralement que quelques minutes. Aucun fardeau phénotypique n'a été identifié pour les mutants grn1/2, mais on s'attend à ce qu'ils présentent une immunosuppression à un moment donné de leur vie, car ils pourraient être plus sensibles aux infections/maladies. Ce phénomène sera donc surveillé. Les animaux surexprimant le gène grn1 ne devraient avoir des niveaux de grn1 affectés que lors d'un choc thermique, car il s'agit d'une lignée inductible. La surexpression de grn1 peut également conduire à des altérations immunitaires et sera donc également surveillée, en particulier après un choc thermique. Toutes les autres interventions n'entraînent généralement pas de nuisances ou d'effets indésirables en elles-mêmes, à l'exception de l'anesthésie qui leur est associée et qui entraîne généralement une hyperventilation pendant quelques minutes après la récupération.
Devenir
Tous les poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés après la dernière intervention, car nous devons prélever le cœur ou la nageoire caudale (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les cellules et les composants moléculaires (réponse immunitaire et marqueurs de régénération), ce qui nécessite de prélever du tissu pour un traitement ultérieur après l'euthanasie du poisson.
Remplacement
Dans le cadre de ce protocole, nous prévoyons d'étudier la réponse immunitaire et la capacité de régénération, en utilisant une combinaison de plusieurs outils géniques. Ces outils génétiques, ainsi que le pouvoir exploratoire du modèle du poisson zèbre, le rendent unique pour ces processus de manière intégrée chez les mêmes individus (principe de remplacement). En raison de la nature systémique et physiologique de la réponse régénérative, ainsi que de la réponse immunitaire, des modèles plus simples tels que les systèmes in vitro et organoïdes sont incapables de répondre aux questions scientifiques de ce projet.
Réduction
Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 6 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction).
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau : nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental (principe de raffinement). NB: L’évaluation du poids sera effectuée toutes les deux semaines. Les poissons ne seront pas anesthésiés pour évaluer leur poids. Ils seront placés vigiles dans un bac d’eau sur une balance préalablement tarée.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est génétiquement modifiable, ce qui permet des études à grande échelle rapides et peu coûteuses. De nombreuses lignées transgéniques et mutantes sont disponibles pour répondre à des questions biomédicales clés. Le poisson-zèbre adulte est capable de régénérer ses organes, offrant des perspectives pour favoriser la régénération dans des contextes non régénératifs. Cette capacité diminue avec l’âge, reflétant la réduction de la capacité réparatrice et le dysfonctionnement des organes observés chez les mammifères. Le système immunitaire du poisson-zèbre est conservé chez les mammifères. Ces caractéristiques font du poisson-zèbre un modèle précieux pour l’étude de la régénération des organes et de la réponse immunitaire. Toutes les expériences seront réalisées sur des poissons adultes, car toute la pathophysiologie que nous étudions se développe à l'âge adulte, et le protocole se concentre sur la réponse immunitaire (et la réponse immunitaire adaptative n'est mature que chez les animaux adultes). En outre, l'objectif proposé se concentre sur l'étude de la régénération chez les individus adultes.
Evaluation in vivo de l’activité ostéogénique de vésicules extracellulaires extraites de tissus osseux de souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les vésicules testées viennent des os de souris mises à mort pour les fournir, et 768 autres souris vont être utilisées pour les évaluer, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'opération du crâne dure une vingtaine de minutes, le temps de déposer un matériau chargé de ces vésicules dans un défaut osseux créé au préalable, suivie de deux injections intrapéritonéales de fluorochromes six jours et un jour avant la fin. Le porteur écrit n'attendre ni gêne fonctionnelle ni perte de poids, seulement quelques signes de stress après la pose de l'implant et des douleurs post-chirurgicales légères. Sur la réduction, il fait état d'un calcul du nombre d'implants nécessaires, sans expliquer comment ce calcul aboutit à 768 souris.
Objectifs
En vieillissant, la communication entre les cellules responsables de la formation et de la destruction des os se modifie, ce qui peut entraîner une perte de densité osseuse. Récemment, des petites particules, les vésicules extracellulaires, ont été découvertes comme un moyen de communication entre ces cellules osseuses, et elles pourraient jouer un rôle important dans la réparation des os. Nous pensons que ces particules pourraient aider à stimuler la régénération du tissu osseux. Dans ce projet, nous allons tester si ces particules peuvent effectivement aider à la régénération des os. Pour cela, nous allons les extraire des os de souris mises à mort et les tester dans des conditions réelles, en comparant leur effet à celui d’un traitement déjà utilisé en clinique pour stimuler la guérison osseuse mais présentant des effets secondaires. Ces particules seront associées à un matériau permettant leur maintien sur le site osseux à réparer. Cette étude sera réalisée sur des souris en implantant ce matériau contenant les particules au niveau du crâne sous médication adaptée (anesthésie et analgésie), pour voir s’il y a formation d’os et réparation.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra pour la première fois de valider chez l’animal la capacité de ces particules extraites d’os à former du tissu osseux. Les perspectives de cette étude pourront nous apporter de nouvelles connaissances des phénomènes impliqués dans la régénération osseuse. A plus long terme, l’utilisation de ces particules pourra permettre de remplacer les thérapies actuelles et pourront être appliquées à l’Homme.
Procédures
Une première procédure chirurgicale sera réalisée durant laquelle les animaux seront soumis à l’implantation d’un matériau chargé en particules dans l’os du crâne au niveau d’un défaut osseux, préalablement réalisé, ou directement au contact de celui-ci (temps opératoire max : 20 minutes). Cette procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et une analgésie pré- et post-opératoire adaptée sera appliquée. Les animaux vigiles recevront également deux injections intrapéritonéales de deux fluorochromes possédant une affinité pour le tissu osseux respectivement 6 jours et 1 jour avant la fin de l’expérimentation.
Impact sur les animaux
En se basant sur nos connaissances et nos études antérieures, nous n’attendons aucune gêne fonctionnelle ni perte de poids au cours de cette expérimentation. Quelques signes de stress peuvent être observés après la pose de l’implant. Des douleurs post chirurgicales légères pourraient être observées. Pour cela, les animaux seront soumis à une analgésie pré-opératoire et post-opératoire.
Devenir
En fin d’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort et les crânes seront prélevés pour analyser la pousse osseuse ou le comblement des défauts osseux.
Remplacement
Des analyses in vitro ont été réalisées afin d’évaluer le rôle de ces particules sur des cellules osseuses. L’utilisation de souris reste maintenant nécessaire afin de valider les propriétés des matériaux chargés en particules en termes de régénération osseuse. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés en raison de l’étude menée sur le tissu osseux.
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, le matériau utilisé a été sélectionné en amont et déjà testé pour sa biocompatibilité in vivo. Par ailleurs une approche statistique, nous a aidé à calculer le nombre d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs afin de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants à l’obtention de résultats significatifs et à la valorisation des résultats de cette étude.
Raffinement
Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Après leur arrivée, pendant leur acclimatation à l’animalerie, les animaux seront habitués à être manipulés par l’expérimentateur avant toute intervention de sorte à limiter leur stress à son contact le jour de l’expérimentation. Les animaux seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée en prémédication et jusqu’à 48 heures après la chirurgie. La surveillance régulière des animaux permettra d’évaluer des points limites selon une grille d’évaluation détaillé. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à sa mise à mort en fin d’étude. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux dans des cages enrichies sous forme de frisottis, cabane en carton et tube en plexiglas et recevront une nourriture standard et de l’eau de boisson ad libitum.
Choix des espèces
Les modèles de repousse osseuse chez la souris au niveau du crâne sont couramment utilisés dans la littérature et parfaitement validés. De plus, les particules que nous étudions étant issues de souris, nous avons décidé de rester chez la même espèce pour la validation expérimentale de notre hypothèse d’étude.
Rôle immunosuppressif et origine des ostéoclastes dans l’ostéosarcome chez la souris femelle
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Une mesure au pied à coulisse deux fois par semaine, sur animal vigile, suit la croissance des tumeurs : 471 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées, dont 258 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une injection de cellules d'ostéosarcome au contact du tibia sous anesthésie gazeuse, et le porteur indique que la tumeur se développe alors chez 100 % des animaux, en envahissant l'os. Il décrit une douleur croissante avec le développement tumoral, traduite par une perte de poids, des mouvements limités et de la prostration. Trois seuils déclenchent la mise à mort immédiate par dislocation cervicale : un score de souffrance de 6, une perte de poids supérieure à 15 %, ou un centimètre d'écart entre la patte injectée et l'autre.
Objectifs
L'ostéosarcome est un cancer osseux agressif touchant surtout les enfants et adolescents. Le taux de survie à cinq ans n'est que de 60%, il diminue à 20% en cas de métastases et les traitements ne sont donc pas satisfaisants. Dans l'os, les cellules tumorales établissent un environnement favorable au développement tumoral de 2 façons. Elles augmentent la formation d'ostéoclastes, cellules responsables de la dégradation de l'os qui libèrent des molécules favorisant la tumeur. De plus, elles inhibent la réponse immunitaire anti-tumorale. Il a été récemment démontré qu’il existe plusieurs populations d'ostéoclastes, d'origine différente, qui ne sont pas impliqués seulement dans la dégration osseuse mais aussi dans les réponses immunitaires. En particulier, certains ostéoclastes peuvent inhiber ces réponses. Mais la fonction immunitaire des ostéoclastes dans la réponse anti-tumorale reste inconnue. Notre objectif est de caractériser la contribution des ostéoclastes au blocage de la réponse anti-tumorale et de définir l'origine des ostéoclastes associés à l'ostéosarcome afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblées sur les ostéoclastes néfastes pour la réponse anti-tumorale. Nous utiliserons un modèle d'ostéosarcome induit chez la souris normale par injection de cellules d'ostéosarcome en site péri-osseux (tibia). Dans ce modèle, la tumeur se développe chez 100% des animaux injectés et envahie l’os en augmentant la formation d'ostéoclastes. Ces ostéoclastes seront étudiés pour comprendre leur fonction immunitaire. Pour identifier leur origine, nous utiliserons 1 lignée de souris génétiquement modifiées chez lesquelles les cellules à l’origine des ostéoclastes sont identifiables grâce à l’expression de marqueurs fluorescents et dans lesquelles nous induiront un ostéosarcome comme décrit ci-dessus. Nos résultats permettront de comprendre le rôle des ostéoclastes dans la réponse anti-tumorale et d'identifier les facteurs impliqués qui pourront être ciblés spécifiquement pour bloquer les ostéoclastes protumoraux ou les cellules dont ils sont isses afin de prévenir ou limiter le développement tumoral. Ils auront des retombées pour d'autres types de tumeurs et de métastases se développant dans l’os dans lesquelles les ostéoclastes jouent également un rôle important.
Bénéfices attendus
Le dialogue établi entre les cellules cancéreuses et les ostéoclastes est considéré comme un point majeur dans la progression tumorale, mais le rôle immunitaire des ostéoclastes n'a jamais été étudié dans ce contexte. Ce projet permettra de caractériser et de comprendre comment les différents types d'ostéoclastes évoluent et contribuent à la réponse immunitaire dans l'ostéosarcome. Ces aspects sont très peu étudiés dans la littérature. Le projet est donc original et apportera de nouvelles connaissances sur la biologie des ostéoclastes et l'environnement immunitaire des ostéosarcomes. Les mécanismes et processus identifiés pourront à terme permettre d’améliorer les traitements en ciblant les ostéoclastes néfastes sans affecter ceux nécessaires au remodelage osseux physiologique. Ils pourront avoir des conséquences plus larges pour d'autres contextes pathologiques qui présentent des caractéristiques similaires de formation augmentée d'ostéoclastes, par exemple les métastases osseuses de tumeurs répandues (cancer du sein, de la prostate, du poumon...) ou le myélome multiple.
Procédures
Tous les animaux recevront: - 1 injection de cellules cancéreuses ou de PBS (pendant quelques secondes), 1 seule fois pour induire la tumeur. Cela concerne tous les animaux. - 1 injection d'antalgique au moment de l'induction tumorale (quelques secondes). Cela concerne tous les animaux. - 1 prélèvement sanguin à la veine mandibulaire (2 minutes) au moment de la mise à mort. Cela concerne 416 animaux. - 1 anesthésie par inhalation d’isoflurane. Cela concerne tous les animaux. - Les volumes tumoraux seront suivis manuellement à l’aide d’un pied à coulisse deux fois par semaine sur animal vigile (durée de la manipulation : 2 minutes/animal). Cela concerne tous les animaux.
Impact sur les animaux
Toutes les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons ne présentent pas de phénotype dommageable (viabilité, poids, comportement et reproduction normaux). Elles sont entretenues à l’état homozygote donc sans nécessité de génotypage. L’injection de cellules en intra-musculaire peut générer une douleur très transitoire. Le développement tumoral peut entrainer avec le temps de la douleur qui se traduit par une perte de poids, des mouvements limités, une prostration
Devenir
Tous les animaux dans chacune des procédures seront mis à mort pour permettre le prélèvement des organes pour l'analyse du phénotype et de la fonction des ostéoclastes et de leurs progéniteurs, ainsi que pour la mise en culture de cellules primaires.
Remplacement
L’existence de plusieurs populations d’ostéoclastes n’a été mise en évidence que très récemment et les rares lignées de cellules disponibles pour étudier les ostéoclastes ne reproduisent pas leur diversité et ne permettent pas d'analyser leur interaction avec leur environnement. Elles ne reproduisent pas non plus le phénotype des ostéoclastes pathologiques. De plus, étant donné la complexité des mécanismes impliqués et du microenvironnement tumoral, aborder ce problème seulement par des analyses in vitro n'est pas suffisant et le recours à des modèles animaux est lui aussi indispensable. Pour l’instant, aucune méthode alternative in vitro n’est adaptée afin de remplacer totalement le modèle murin. Cependant, nos résultats pourraient permettre à terme d’améliorer ces modèles in vitro en les modifiant génétiquement grâce aux marqueurs et autres caractéristiques que nous identifierons pour qu'ils reproduisent les différentes populations d'ostéoclastes en cancer. Si cela est possible, cela permettrait à terme de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés pour l’étude de ces cellules en condition normale et pathologique.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé au plus juste en fonction du nombre de cellules nécessaire aux différentes analyses et d'une évaluation statistique, en tenant compte de pertes éventuelles afin de ne pas avoir à répéter inutilement les procédures et avec le nombre de souris minimum par groupe. Pour l'évaluation statistique, nous avons utilisé le test G*power qui permet d'estimer le nombre d'animaux nécessaires en fonction des différences attendues sur la base de nos expériences antérieures et des résultats de la littérature. La procédure 1 nous permettra de définir les conditions expérimentales optimales (nombre de cellules injectées et cinétique) pour nos analyses. Cela nous permettra de réduire le nombre d'animaux dans les procédures suivantes en ne conservant que les groupes les plus appropriés. Chaque animal inclus dans l'analyse est utilisé de façon optimale pour permettre l'analyse simultanée d'un maximum de paramètres et réduire encore le nombre d'animaux. Nous ne produisons ni ne commandons plus d'animaux que ceux nécessaires à chaque expérience. Enfin, l’excédent de cellules sera congelé pour utilisation ultérieure ce qui nous permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.
Raffinement
Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Une attention particulière sera portée au suivi des signes de souffrance des animaux. L’injection intramusculaire de cellules tumorale sera faite sous anesthésie gazeuse courte (quelques minutes). Pour réduire la souffrance des animaux pendant le développement tumoral, une grille de score (en annexe) a été établie pour le suivi des animaux avec des critères bien définis pour détecter tout signe de souffrance et des points limites bien définis. Un antalgique sera administré si les animaux présentent des signes de souffrance. Si ces signes ne disparaissent pas, comme indiqué dans la grille de score, ils seront mis à mort par dislocation cervicale. Si le score atteint la limite de 6 (point limite) les animaux seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale. Les animaux seront pesés toutes les semaines après l’injection des cellules tumorales. Si une diminution du poids est observée (>15%) ils seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale (point limite). Le volume des tumeurs induites sera contrôlé à l’aide d’un pied à coulisse sur animaux vigiles. Le diamètre le plus grand de la patte injectée sera comparé à celui de la même région de la patte non injectée. Dès que la différence entre les 2 pattes atteint 1cm (correspondant à un volume tumoral d’1cm3), les souris seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale (point limite).
Choix des espèces
Les données de la littérature sur lesquelles nous nous appuyons et nos résultats précédents ont été obtenus chez la souris. Nous allons travailler par analogie avec ces résultats dans la continuité de nos travaux antérieurs sur les ostéoclastes. De plus, les cellules tumorales que nous utilisons sont des cellules de souris. Enfin, les modèles déjà existants pour tracer l’origine des ostéoclastes sont tous uniquement des modèles murins. Pour toutes les procédures, nous utiliserons des souris au stade jeunes adultes (6-8 semaines) afin de mimer au mieux les tumeurs chez les patients (adolescent et jeune adulte).