Système musculosquelettique

Cinq injections abdominales en cinq jours induisent la myopathie, puis chaque souris est transportée une demi-journée vers un second établissement et passe trois examens RMN de quarante-cinq à soixante minutes sous anesthésie, espacés de quinze jours. 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin pour prélever leurs muscles. Le porteur attribue un stress modéré à la perte de poids et de force musculaire ainsi qu'au transport, et affirme que les molécules testées n'induiront pas d'effet indésirable puisqu'elles ont déjà été administrées à des humains ou à d'autres animaux. Une grille de score propre à ce modèle doit fixer les points limites et les critères d'arrêt.

Objectifs

La myopathie à cores centraux est une maladie causée par des mutations dans un gène codant pour une protéine essentielle à la contraction musculaire dont l'absence est mortelle. Chez l'homme, nos études précédantes ont montré qu'une réduction de sa quantité en dessous de 50% conduit à une myopathie à cores centraux dont la sévérité augmente avec la quantité de protéines manquantes. Nous avons développé et caractérisé un modèle de souris qui reproduit cette maladie et ses mécanismes. Il n’existe actuellement aucun traitement contre cette maladie. Cependant, différentes molécules, déjà testées chez l'homme ou la souris pour d'autres pathologies, présentent un potentiel thérapeutique fort pour la myopathie à core car elles agissent sur les mécanismes identifiés dans ce modèle. Il apparaît donc opportun d'évaluer les répercussions fonctionnelles au niveau du muscle de l'administration de ces molécules dans un modèle animal parfaitement caractérisé de cette pathologie. C'est l'intérêt de ce projet qui vise à étudier chez l'animal dans son intégrité les effets des traitements sur le métabolisme et la fonction musculaire chez un modèle de souris souffrant de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester des approches thérapeutiques susceptible d’améliorer les performances musculaires chez un modèle de souris de la myopathie à cores centraux. Sachant qu’il n’existe encore à l’heure actuelle aucun traitement curatif contre cette myopathie, ce projet est une première étape indispensable avant l’application à l’homme.

Procédures

Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs, avec, pour chaque animal, un seul transport entre les deux établissements dans un véhicule dédié (durée environ 1/2 journée) . Chaque animal subira cinq injections (une par jour, durée: moins de 15s/injection) dans l'abdomen et trois explorations strictement non invasives par RMN. Ces explorations, espacées entre elles de 15 jours, auront une durée de 45-60 minutes et seront réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

1/ Les injections dans l'abdomen pour induire la pathologie pourront entrainer une petite irritation au site d'injection et un stress léger. 2/L’induction de la pathologie pourra engendrer un stress modéré lié à la perte de poids et de force musculaire. 3/ Le transport des animaux d'un établissement à l'autre pourra engendrer un stress modéré. 4/Les explorations RMN pourront provoquer un stress léger de l’animal pendant les phases d’induction de l’anesthésie et de réveil. Le traitement n'induira pas d'effet indésirable car les molécules testées ont déjà été utilisées chez l'homme ou l'animal sans effet indésirable observé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet afin de réaliser des prélèvements post-mortem de muscles sur lesquels seront réalisées des analyses. Cette étape est indispensable pour caractériser chez chaque animal l’état d’avancement de la pathologie.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer de façon non invasive et à différents temps lors du développement de la maladie si les molécules testées permettent d’améliorer les performances des muscles atteints de myopathie à cores centraux. Le métabolisme et la force musculaire que nous allons étudier mettent en oeuvre une communication entre différents organes, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules musculaires. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.

Réduction

Notre approche non invasive offre la possibilité d’explorer les animaux au cours de l'évoution de la pathologie ce qui permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le recours à la RMN réduira également le nombre d’animaux utilisés car elle permettra d’obtenir pour chaque animal les mesures dans différentes conditions (repos, activité musculaire, récupération post-activité) au cours d’un seul examen, contrairement aux techniques classiques qui auraient nécessité d'euthanasier des animaux à différents temps pour chacune de ces conditions afin de réaliser les mesures sur muscles. Lorsque cela est possible, les mêmes animaux controles seront utilisés pour le test de deux molécules afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les injections seront réalisées par du personnel formé, le geste sera rapide et précis. Le transport des animaux entre les deux établissements sera réalisé par un transporteur agréé avec une livraison dans la foulée du chargement. Le suivi en RMN sera réalisé sur animaux anesthésiés afin de réduire le stress des animaux. Enfin, une grille de score spécifique à ce modèle de souris de la myopathie à cores centraux a été établie et permettra l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui ait une physiologie proche de l’Homme et qui soit génétiquement modifiable, c'est pour cela que la souris a été choisie. Les animaux seront utilisés au stade adulte (ils seront âgés de 8-10 semaines au début du projet) afin de pas avoir d'interférence avec le développement musculaire, et parce que l’induction de la pathologie ne peut se faire que dans les fibres musculaires adultes.

Pour tester si des molécules déjà administrées à des êtres humains améliorent la fonction musculaire dans la myopathie à cores centraux, 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit cinq injections abdominales quotidiennes destinées à déclencher la maladie, puis est transporté pendant une demi-journée vers un second établissement. Il y subit trois explorations RMN de 45 à 60 minutes sous anesthésie générale, espacées de quinze jours. Le porteur affirme que le traitement n'induira pas d'effet indésirable puisque ces molécules ont déjà été utilisées sans effet observé, ce qui n'empêche pas de provoquer chez les souris une perte de poids et de force musculaire.

Objectifs

La myopathie à cores centraux est une maladie causée par des mutations dans un gène codant pour une protéine essentielle à la contraction musculaire dont l'absence est mortelle. Chez l'homme, nos études précédantes ont montré qu'une réduction de sa quantité en dessous de 50% conduit à une myopathie à cores centraux dont la sévérité augmente avec la quantité de protéines manquantes. Nous avons développé et caractérisé un modèle de souris qui reproduit cette maladie et ses mécanismes. Il n’existe actuellement aucun traitement contre cette maladie. Cependant, différentes molécules, déjà testées chez l'homme ou la souris pour d'autres pathologies, présentent un potentiel thérapeutique fort pour la myopathie à core car elles agissent sur les mécanismes identifiés dans ce modèle. Il apparaît donc opportun d'évaluer les répercussions fonctionnelles au niveau du muscle de l'administration de ces molécules dans un modèle animal parfaitement caractérisé de cette pathologie. C'est l'intérêt de ce projet qui vise à étudier chez l'animal dans son intégrité les effets des traitements sur le métabolisme et la fonction musculaire chez un modèle de souris souffrant de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester des approches thérapeutiques susceptible d’améliorer les performances musculaires chez un modèle de souris de la myopathie à cores centraux. Sachant qu’il n’existe encore à l’heure actuelle aucun traitement curatif contre cette myopathie, ce projet est une première étape indispensable avant l’application à l’homme.

Procédures

Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs, avec, pour chaque animal, un seul transport entre les deux établissements dans un véhicule dédié (durée environ 1/2 journée) . Etablissement utilisateur 1/2: chaque animal subira cinq injections (une par jour, durée: moins de 15s/injection) dans l'abdomen. Etablissement utilisateur 2/2: chaque animal subira trois explorations strictement non invasives par RMN. Ces explorations, espacées entre elles de 15 jours, auront une durée de 45-60 minutes et seront réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

1/ Les injections dans l'abdomen pour induire la pathologie pourront entrainer une petite irritation au site d'injection et un stress léger. 2/L’induction de la pathologie pourra engendrer un stress modéré lié à la perte de poids et de force musculaire. 3/ Le transport des animaux d'un établissement à l'autre pourra engendrer un stress modéré. 4/Les explorations RMN pourront provoquer un stress léger de l’animal pendant les phases d’induction de l’anesthésie et de réveil. Le traitement n'induira pas d'effet indésirable car les molécules testées ont déjà été utilisées chez l'homme ou l'animal sans effet indésirable observé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet afin de réaliser des prélèvements post-mortem de muscles sur lesquels seront réalisées des analyses. Cette étape est indispensable pour caractériser chez chaque animal l’état d’avancement de la pathologie.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer de façon non invasive et à différents temps lors du développement de la maladie si les molécules testées permettent d’améliorer les performances des muscles atteints de myopathie à cores centraux. Le métabolisme et la force musculaire que nous allons étudier mettent en oeuvre une communication entre différents organes, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules musculaires. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.

Réduction

Notre approche non invasive offre la possibilité d’explorer les animaux au cours de l'évoution de la pathologie ce qui permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le recours à la RMN réduira également le nombre d’animaux utilisés car elle permettra d’obtenir pour chaque animal les mesures dans différentes conditions (repos, activité musculaire, récupération post-activité) au cours d’un seul examen, contrairement aux techniques classiques qui auraient nécessité d'euthanasier des animaux à différents temps pour chacune de ces conditions afin de réaliser les mesures sur muscles. Le nombre d'animaux nécéssaire dans chaque groupe a été déterminé par une approche statistique et avec nos expériences précédantes. Lorsque cela est possible, les mêmes animaux controles seront utilisés pour le test de deux molécules afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les injections seront réalisées par du personnel formé, le geste sera rapide et précis. Le transport des animaux entre les deux établissements sera réalisé par un transporteur agréé avec une livraison dans la foulée du chargement. Le suivi en RMN sera réalisé sur animaux anesthésiés afin de réduire le stress des animaux. Enfin, une grille de score spécifique à ce modèle de souris de la myopathie à cores centraux a été établie et permettra l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui ait une physiologie proche de l’Homme et qui soit génétiquement modifiable, c'est pour cela que la souris a été choisie. Les animaux seront utilisés au stade adulte (ils seront âgés de 8-10 semaines au début du projet) afin de pas avoir d'interférence avec le développement musculaire, et parce que l’induction de la pathologie ne peut se faire que dans les fibres musculaires adultes.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié d'entre elles passant dix-huit mois sous régime gras avant d'être transportées vers un second établissement pour y subir jusqu'à six tests de comportement. Dans le premier site, elles sont pesées sept fois, injectées, gavées, prélevées à trois reprises, mesurées trois fois pour leur masse grasse et isolées quarante-huit heures en cage individuelle. Les tests portent sur l'anxiété, l'activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices et les capacités physiques, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une avancée potentielle en connaissances et l'identification de cibles pour de futurs médicaments, quand la certitude porte sur dix-huit mois de régime imposé et sur la mise à mort finale pour analyse histologique.

Objectifs

Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladies du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Il étudie aussi l'impact du vieillissement biologique dans la survenue des pathologies avec l'âge et le déclin des fonctions physiques et cognitives. Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes au cours du vieillissement - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme (vieillissement biologique). Le projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira à une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ Dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques de protéines, notamment mitochondriales impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique, sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes du métabolisme lipidique et glucidique et de régulation de la fonction mitochondriale, et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, - Comprendre l'impact du vieillissement sur le fonctionnement des organes, 2/ Dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l’homme: - Identifier des voies de signalisation et cibles thérapeutiques du métabolisme énergétique et lipidique, visant au développement de futurs médicaments.

Procédures

Dans le premier établissement, la moitié des animaux (souris) seront mis sous régime gras pendant 18 mois. Ils subiront, des pesées (7 fois, 30 sec), une injection (5 sec), un gavage (30 sec) et des prélèvements à 3 reprises (5 sec à 3 min), une mesure de la composition corporelle en matières grasses à 3 reprises (4min) et une mesure de la dépense énergétique où l’animal est hébergé seul (1 fois pendant 48h). Dans le second établissement, ils subiront jusqu’à 6 tests de comportements (durée 6min à 30min) afin d’évaluer l'anxiété, l’activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices, et les capacités physiques de l’animal.

Impact sur les animaux

Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. Le changement de régime alimentaire peut induire un stress à l'animal (degré modéré). La faim est une nuisance pouvant survenir lors de la mise à jeun des animaux (degré léger). La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux à l'occasion des prélèvements (degré léger à modéré), ou de leur isolement dans certaines procédures (degré léger). La peur et le stress peuvent aussi survenir lors la découverte de nouveaux environnements (degré léger), ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant prélèvement (degré léger à modéré). D'autres nuisances sont la douleur à l'injection (degré modéré), lors des prélèvements (degré léger à modéré), ou à l'occasion de certains tests comportementaux (degré léger à modéré).

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort à des fins d’analyse et d’études histologiques.

Remplacement

Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques En parallèle,des tests de culture cellulaire sont à l'étude pour étudier des mécanismes précis et limiter le nombre d'animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est déterminé sur la base de nos études antérieures ou de la littérature correspondante. Dans ce contexte, le nombre d’animaux utilisé dans chaque groupe étudié sera suffisant pour réaliser les analyses statistiques. De plus, plusieurs données scientifiques pourront être obtenues avec un même animal ce qui réduira le nombre d'animaux dans le projet.

Raffinement

Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre : - les moyens pour limiter le stress aux animaux seront appliqués: avant les expériences, les animaux seront manipulés et habitués à l’expérimentateur afin de favoriser leur coopération dans les actes non invasifs et non douloureux. Ils seront acclimatés aux différentes conditions expérimentales (pièce, hébergement individuel, et différents expérimentateurs). Les expériences seront réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs. - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur. - des anesthésiques et analgésiques seront utilisés dans les procédures en terminal. Un transporteur agréé pour le transport d'animaux sera réquisitionné. La durée du transport entre les établissements utilisateurs n’excèdera pas les 30 minutes. Les animaux seront transportés dans leur cage d'origine (enrichissement compris) afin de limiter le stress lié au transport. Des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis, - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits, - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après les actes quand c'est nécessaire (application d’un désinfectant et d’une pommade cicatrisante en cas des blessures superficielles sur la peau) , - la mise en place de procédures de mise à mort quand c'est nécessaire.

Choix des espèces

La finalité du projet est d'identifier les effets de la mutation de protéines, notamment mitochondriales, impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique et le vieillissement. Ainsi, il est indispensable de travailler sur l’animal entier pour comprendre le rôle de ces protéines. Le choix du modèle souris vient du fait que celui-ci offre de larges potentialités pour l'application des méthodes d'ingénierie génétique et d'étude expérimentale du comportement. Il est possible, grâce à ce modèle, d’invalider l’expression des protéines étudiées dans ce projet, et ainsi d'évaluer leur rôle. Nous disposons de lignées murines transgéniques sur ces protéines pour réaliser notre projet. Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides et des glucides sur ce modèle animal. Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'athérosclérose et de la maladie du foie (inflammation et stéatose) sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour démarrer le régime dans les études portant sur l'étude du métabolisme ou de l'athérosclérose. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris et l'impact du régime alimentaire sur l'altération des fonctions au cours du vieillissement de l'animal. Dans les articles scientifiquement, le vieillissement chez la souris, est classiquement étudié chez des souris âgées de 12 à 18 mois.

Les souris de ce projet portent la mutation d'une maladie osseuse pédiatrique rare qui remplace l'os des mâchoires par un tissu fibreux, et leur phénotype osseux s'installe entre six et dix semaines de vie. 72 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à six injections intrapéritonéales sous anesthésie, quatre examens d'imagerie à quinze jours d'intervalle et deux heures seules en cage métabolique pour le recueil d'urine. Toutes sont tuées par ponction cardiaque afin de prélever les tissus et de comparer l'évolution de l'os à celle des flores buccale et intestinale, une piste que le porteur présente comme suggérée par la littérature sans y avoir été confirmée.

Objectifs

Nous nous intéressons à une maladie osseuse pédiatrique rare caractérisée par le remplacement de l’os des mâchoires par un tissu mou fibreux appelé granulome. Cette pathologie se met en place vers 3 à 5 ans et est d’origine génétique. Les lésions spécifiques de cette maladie sont toujours symétriques et bilatérales et peuvent ne concerner que des zones restreintes de la mandibule ou au contraire toutes les mâchoires jusqu’au plancher de l’orbite. Le principal traitement proposé aux patients pour le moment consiste principalement en chirurgies itératives et quelques rares molécules pour les formes très sévères. Ce qui définit la localisation anatomique et la période d’apparition de cette pathologie ne sont pas connues. Avoir accès et comprendre l’apparition du granulome permettrait de proposer des traitements plus précoces et efficaces aux patients. L’objectif de ce projet est donc de définir le rôle du microbiote oral et microbiote intestinal dans le développement du phénotype osseux. Nos travaux précédents ont confirmé la progressivité du phénotype osseux entre 6 et 10 semaines. Nous souhaitons désormais étudier la qualité et le potentiel changement dans la composition de la flore buccale et intestinale. L’implication de cette flore orale dans le développement de la perte ossuese liée au chérubisme a été suggérée sans confirmation par la littérature. Nous allons donc suivre en parallèle le phénotype osseux et deles microbiotes oral et intestinal dans un modèle murin de la maladie pour mettre en évidence une éventuelle dysbiose susceptible de participer au développement de la perte osseuse. La cinétique d’évolution des 2 types de flores en parallèle du phénotype osseux n’a jamais été réalisée et pourrait démontrer l’importance de la flore buccale et intestinale dans le phénotype osseux et offrir de nouvelles possibilités de traitement de la maladie.

Bénéfices attendus

L’origine et la localisation très particulière du chérubisme ne sont pas clairement expliquées. L’implication du microbiote oral dans le développement des granulomes pathognomoniques du chérubisme a été suggérée. Nous souhaitons vérifier cette hypothèse. Cette implication pourra permettre de proposer de nouvelles stratégies de traitement (une fois des cibles thérapeutiques identifiées) pour le chérubisme dont les patients atteints manquent cruellement.

Procédures

examen d’imagerie non invasif sur animal anesthésié (5 min), tous les 15 jours au maximum 4 fois, recueil passif d’urine en cage métabolique, 1 fois, maximum 2h, injections en intrapéritonéal de fluorochrome, 2 fois, durée max d’une min.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis au maximum 6 injections intrapéritonéales (anesthésies et injections de fluorochromes), 2h de cage métabolique et une ponction cardiaque terminale. La répétition des manipulations entraine une sévérité modérée. Aucun autre dommage que d’être manipulé pour pratiquer les injections, lesquelles peuvent éventuellement provoquer une gêne très passagère qui ne nécessite pas de médication particulière. L’isolement en cage métabolique peut également engendrer un stress.

Devenir

L'étude nécessite la mise à mort de tous les animaux pour les prélèvements nécessaires aux analyses prévues.

Remplacement

Les mutations du gène identifé comme responsable de la maladie n'expliquent pas toutes les caractéristiques de la maladie. L’implication du microbiote oral a été proposée. Nous voulons aussi évaluer l’impact du microbiote intestinal dans le développement de la maladie. L’effet d’une perturbation de la flore intestinale ou orale sur le squelette ne peut pas être modélisée in vitro et nécessite un organisme entier avec son microbiote oral.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (72) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires à l’analyse de l'impact des flores orale et intestinale sur le développement du phénotype osseux.

Raffinement

Les mesures de densité minérale osseuse, seront effectuées tous les 15 jours sous anesthésie avec analgésie ). Le temps de radiographie sera d’environ 5 minutes par animal et il sera surveillé jusqu’à son réveil. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance quotidienne. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux aux différents temps de la procédure. Cependant, dans l’éventualité d’apparitions de points limites mentionnés plus loin, une surveillance plus fréquente et un apport de nourriture gélifiée et appétente seront mis en place.

Choix des espèces

Les mutations du gène identifé comme responsable de la maladie n'expliquent pas toutes les caractéristiques de la maladie. L’implication du microbiote oral a été proposée. Nous voulons aussi évaluer l’impact du microbiote intestinal dans le développement de la maladie. L’effet d’une perturbation de la flore intestinale ou orale sur le squelette ne peut pas être modélisée in vitro et nécessite un organisme entier avec son microbiote oral. A 10 semaines le granulome est mis en place (comme décrit précédemment). Nous voulons analyser le phénotype osseux en parallèle de l’évolution du microbiote oral et du microbiote intestinal entre 6 et 10 semaines, les âges où le phénotype osseux est le plus prononcé.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié soumise à un régime gras pendant dix-huit mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe 48 heures seul en cage de mesure de la dépense énergétique, subit sept pesées, une injection, un gavage et trois prélèvements, puis jusqu'à six tests évaluant l'anxiété, l'activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire et les capacités sensorimotrices. La faim liée à la mise à jeun, la peur pendant les manipulations et l'isolement figurent parmi les nuisances déclarées. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur "l'animal entier" et retient la souris pour la facilité d'y invalider des gènes, les corps servant ensuite aux analyses histologiques.

Objectifs

Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladies du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Il étudie aussi l'impact du vieillissement biologique dans la survenue des pathologies avec l'âge et le déclin des fonctions physiques et cognitives. Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes au cours du vieillissement - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme (vieillissement biologique). Le projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira à une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ Dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques de protéines, notamment mitochondriales impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique, sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes du métabolisme lipidique et glucidique et de régulation de la fonction mitochondriale, et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, - Comprendre l'impact du vieillissement sur le fonctionnement des organes, 2/ Dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l’homme: - Identifier des voies de signalisation et cibles thérapeutiques du métabolisme énergétique et lipidique, visant au développement de futurs médicaments.

Procédures

Dans le premier établissement, la moitié des animaux (souris) seront mis sous régime gras pendant 18 mois. Ils subiront, des pesées (7 fois, 30 sec), une injection (5 sec), un gavage (30 sec) et des prélèvements à 3 reprises (5 sec à 3 min), une mesure de la composition corporelle en matières grasses à 3 reprises (4min) et une mesure de la dépense énergétique où l’animal est hébergé seul (1 fois pendant 48h). Dans le second établissement, ils subiront jusqu’à 6 tests de comportements (durée 6min à 30min) afin d'évaluer l'anxiété, l’activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices, et les capacités physiques de l’animal.

Impact sur les animaux

Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. Le changement de régime alimentaire peut induire un stress à l'animal. La faim est une nuisance pouvant survenir lors de la mise à jeun des animaux.La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, à l'occasion des prélèvements ou de leur isolement dans certaines procédures. La peur et le stress peuvent aussi survenir lors la découverte de nouveaux environnements, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant prélèvement. D'autres nuisances sont la douleur à l'injection, lors des prélèvements, ou à l'occasion de certains tests comportementaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort à des fins d’analyse et d’études histologiques.

Remplacement

Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques En parallèle,des tests de culture cellulaire sont à l'étude pour étudier des mécanismes précis et limiter le nombre d'animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est déterminé sur la base de nos études antérieures ou de la littérature correspondante. Dans ce contexte, le nombre d’animaux utilisé dans chaque groupe étudié sera suffisant pour réaliser les analyses statistiques. De plus, plusieurs données scientifiques pourront être obtenues avec un même animal ce qui réduira le nombre d'animaux dans le projet.

Raffinement

Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre : - les moyens pour limiter le stress aux animaux seront appliqués: avant les expériences, les animaux seront manipulés et habitués à l’expérimentateur afin de favoriser leur coopération dans les actes non invasifs et non douloureux. Ils seront acclimatés aux différentes conditions expérimentales (pièce, hébergement individuel, et différents expérimentateurs). Les expériences seront réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs. - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur. - des anesthésiques et analgésiques seront utilisés dans les procédures en terminal. Un transporteur agréé pour le transport d'animaux sera réquisitionné. La durée du transport entre les établissements utilisateurs n’excèdera pas les 30 minutes. Les animaux seront transportés dans leur cage d'origine (enrichissement compris) afin de limiter le stress lié au transport. Des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis, - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits, - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après les actes quand c'est nécessaire, - la mise en place de procédures de mise à mort quand c'est nécessaire.

Choix des espèces

La finalité du projet est d'identifier les effets de la mutation de protéines, notamment mitochondriales, impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique et le vieillissement. Ainsi, il est indispensable de travailler sur l’animal entier pour comprendre le rôle de ces protéines. Le choix du modèle souris vient du fait que celui-ci offre de larges potentialités pour l'application des méthodes d'ingénierie génétique et d'étude expérimentale du comportement. Il est possible, grâce à ce modèle, d’invalider l’expression des protéines étudiées dans ce projet, et ainsi d'évaluer leur rôle. Nous disposons de lignées murines transgéniques sur ces protéines pour réaliser notre projet. Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides et des glucides sur ce modèle animal. Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'athérosclérose et de la maladie du foie (inflammation et stéatose) sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour démarrer le régime dans les études portant sur l'étude du métabolisme ou de l'athérosclérose. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris et l'impact du régime alimentaire sur l'altération des fonctions au cours du vieillissement de l'animal. Dans les articles scientifiquement, le vieillissement chez la souris, est classiquement étudié chez des souris âgées de 12 à 18 mois.

Section définitive du nerf sciatique pour une partie, pincement du nerf par mini clamp pour l'autre : 54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'opération vise à savoir si le stress oxydatif lié à la dénervation altère la capacité des cellules satellites à régénérer le muscle. Le porteur décrit cette chirurgie comme "modérément invasive" comparée à une chirurgie abdominale, et souligne que les souris, quadrupèdes vivant à ras du sol, sont peu invalidées par la perte d'usage d'une patte arrière. Il conclut que le recours à la souris est "indispensable", la mise en culture des cellules satellites leur faisant perdre l'état de quiescence qu'il veut étudier.

Objectifs

Il a été décrit que pendant la dénervation, les cellules musculaires subissent un fort dommage oxydatif et nous avons récemment montré que le dommage oxydatif peut modifier les capacités régénératives des myoblastes. Notamment, un dommage oxydatif chimiquement induit diminue la capacité de fusion et d’accrétion de cellules dérivant des cellules satellites musculaires. Les cellules satellites sont quiescentes in vivo et elles peuvent être isolées du muscle adulte. Une fois en culture, elles perdent leur statut quiescent pour proliférer en myoblastes. Actuellement les conséquences sur les cellules satellites du stress oxydatif lié à la dénervation sont peu connues. Nos travaux sont destinés à comprendre si et comment l’activité régénérative des cellules satellites est altérée pendant le processus de dénervation. La base du matériel biologique étudié correspond aux muscles innervés par le nerf sciatique. Notre projet a donc 3 objectifs principaux : 1. Évaluer l’ampleur du dommage oxydatif dans les cellules satellites et les myotubes après dénervation par marquage des espèces réactives de l’oxygène (ROS), mais aussi à l’aide de marquages fluorescents spécifiques visualiser les modifications chimiques de l’ADN, et les modifications des protéines impliquées dans la réponse aux dommages de l’ADN en particulier au niveau des nucléoles lieu de synthèse des ARN ribosomiques. 2. Évaluer la réparation des dommages oxydatifs dans les cellules satellites et les myotubes après dénervation à différents temps après la dénervation. La réparation sera évaluée par la disparition des signaux observés dans le point 1 3. Mesurer l’index de fusion des cellules satellites après dénervation, par mise en culture et différentiation. 4. Mesurer l’accrétion des cellules satellites après dénervation, par marquage fluorescent de leur ADN et co-culture avec des myotubes non marqués. L’ensemble des tissus prélevés seront soumis à des analyses, en imagerie à fluorescence, éventuellement biochimiques par extraction de protéines et d’extraction/isolement des cellules satellites pour leur mise en culture in vitro

Bénéfices attendus

Ce projet a deux volets qui ont un intérêt scientifique général : Tout d’abord nous allons évaluer comment le dommage oxydatif conséquence de la dénervation va affecter les fibres musculaires et les cellules satellites. Nos résultats dans les cellules en culture nous laissent présager que ce dommage va impacter la capacité régénérative des cellules satellites et contribuer au processus d’atrophie musculaire post-dénervation. Une étude aussi complète de l’effet des dommages oxydatifs dans la problématique de la dénervation n’a jamais été effectuée. Quelques études montrent que le nombre de cellules satellites musculaires ne change pas après dénervation, néanmoins il n’y a aucune étude qui montre que leur capacité à fusionner ou à accomplir l’accrétion est la même. Cette investigation est d’autant plus importante car ses conclusions pourraient être applicables aux accidents de dénervation ou pincements des nerfs qui peuvent survenir chez l’humain. Il est important de connaitre les conséquences du dommage oxydatif induit par la dénervation pour pouvoir chercher des thérapies adaptées pour soulager la conséquente atrophie musculaire (détoxification des ROS, thérapies anti-oxydants, lignes directrices nutritionnelles). De plus, il est essentiel de vérifier si l’activité de régénération des cellules satellites est conservée après dénervation et comprendre comment la préserver pour limiter l’atrophie musculaire. Au vu des bénéfices attendus en termes scientifiques et médicaux et de l’impact très limité sur les souris, nous estimons que cette étude sera extrêmement rentable pour la société.

Procédures

Une partie des souris subira par chirurgie une dénervation définitive par section du nerf sciatique et une autre partie un pincement du nerf permettant une dénervation réversible.

Impact sur les animaux

La technique de dénervation définitive, par section du nerf sciatique présente l’avantage d’être une intervention chirurgicale modérément invasive si on la compare par exemple à une chirurgie abdominale. Les conséquences de la dénervation permettent une vie quasi-normale en captivité des animaux traités, la cage d’élevage comprenant de la litière adaptée ainsi qu’un enrichissement sous forme de petite cabane. La technique microchirurgicale de dénervation est effectuée avec le maximum de précautions pour limiter les douleurs post-opératoires des animaux (anesthésie générale et locale du nerf et administration d’antalgique en pré-opératoire et anti-inflammatoire en post-opératoire). La dénervation est effectuée sur l’une des pattes arrière de la souris et ne concerne pas tous les muscles, d’autres afférences nerveuses permettent à la souris de se relever ainsi que ses déplacements sans difficulté sur la litière de la cage. La dénervation par pincement du nerf sciatique reprend les éléments de chirurgie de la dénervation définitive, la section du nerf étant remplacé par son pincement à l’aide d’un mini clamp hémostatique. 15 jours après pincement du nerf les souris commencent à retrouver une mobilité quasi normale qui est complète à 30 jours, seule persiste une atrophie musculaire comme observée lors de la dénervation définitive. Il est par ailleurs à considérer que les souris étant quadrupèdes et vivant à ras du sol, elles sont par conséquent peu invalidées par cette opération pour une vie en captivité.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements d’organes

Remplacement

Le recours à des souris est indispensable parce que la dénervation induit des modifications physiologiques sur l’ensemble du muscle qu’il est impossible de reproduire sur des cellules en culture. De plus, la mise en culture des cellules satellites modifie leur état de quiescence, ce qui peut modifier leur réponse au stress et aux dommages à l’ADN. En effet, la réparation de l’ADN n’est pas la même dans des cellules qui se divisent, des cellules qui ne se diviseront plus ou des cellules quiescentes qui ont toujours une possibilité de se diviser. Nous avons réalisé, en amont de ce projet, des tests préliminaires sur cellules en culture pour certaines mises au point de nos analyses (Immunofluorescence, colorations, traitement aux agents oxydants) permettant de ne recourir aux animaux que lorsque c’est absolument nécessaire.

Réduction

La première phase du projet portant sur le comportement des cellules souches musculaires à fusionner ou s’agréger in vitro après dénervation a pu être réalisée en limitant à 18 le nombre de souris initialement prévu et a permis une bonne robustesse de nos observations. Dans la deuxième phase, où nous nous sommes rendu compte de la faible durée de conservation des muscles fixés pour des signaux histologiques de qualité, nous estimons nécessaire l’utilisation de 36 souris pour satisfaire l’ensemble des analyses à réaliser comprenant des analyses histologiques en immunofluorescence sur des fibres musculaires isolées. Ces considérations nous permettent de maintenir à 54 le nombre de souris.

Raffinement

Grâce aux précautions prises lors de l’anesthésie générale ainsi que les mesures médicamenteuses analgésiques et anti-inflammatoires pratiquées en pré et post-opératoire, les souris traitées retrouvent très rapidement un comportement similaire à leur congénère non traités Les animaux seront élevés en groupe avec une litière adaptée et quelques éléments d’enrichissement avec pas plus de 5 individus par cage aux dimensions adaptées, et observés quotidiennement par les personnels de l’établissement utilisateur de façon à pouvoir intervenir le plus rapidement possible pour limiter la douleur ou souffrance e. Par ailleurs, pour faciliter l’alimentation des souris dénervées qui pourraient présenter une difficulté en raison de l’absence temporaire de réactivité de la patte dénervée, la nourriture sera placée de façon plus accessible dans la cage. Pour respecter le mode de vie grégaire de l’espèce, des souris compagnons de même lignée, âge et sexe seront ajoutés quand ce sera nécessaire pour éviter l’isolement des souris en expérimentation.

Choix des espèces

La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères. Nous avons choisi le stade jeune adulte de 8 semaines pour notre étude car la croissance musculaire est terminée et les cellules satellites ne se divisent plus dans les conditions d’élevage pratiquées.

Une ablation partielle du quadriceps, une injection de toxine qui détruit les fibres musculaires, des électrostimulations sous anesthésie pendant 45 minutes : 1 224 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur reconnaît que l'ablation du quadriceps et la mesure de force in situ sont sources de douleur, et note que la mobilité revient deux heures après la chirurgie. L'objectif déclaré est de mettre au point des greffes de cellules souches musculaires pour réparer des pertes de muscle massives, l'expérimentation sur les souris servant à valider des données obtenues sur cellules humaines. Le choix de l'espèce, tel qu'il l'expose, tient à la disponibilité de lignées immunodéprimées et à une gestation courte, compatible avec la durée des expériences.

Objectifs

Le muscle squelettique adulte contient des cellules souches appelées Cellules Satellites (CS), qui lui permettent de se réparer après une blessure. Cependant, dans certaines conditions pathologiques (maladies musculaires) ou post-traumatiques (accidents, chirurgie), cette capacité de réparation est altérée, et le muscle ne peut plus fonctionner normalement. Nous utilisons les CS pour développer des traitements pour aider le muscle à se réparer après une lésion traumatique. Nos travaux s’articulent selon 3 projets de recherche : 1) L’optimisation des méthodes de purification des CS : nous améliorons les méthodes de purification des CS humaines pour augmenter la quantité de cellules obtenues et leur qualité pour la clinique, mais également des CS de souris afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche (Réduction). 2) Le développement de méthodes permettant de produire un nombre élevé de CS humaines in vitro tout en préservant leur pouvoir réparateur (capacité à réparer un muscle endommagé et à reconstituer un pool de CS appelé auto-renouvellement). 3) Le développement de stratégies de médecine régénérative pour réparer les lésions musculaires massives post-opératoires ou post-traumatiques, pour lesquelles il n’existe pas de traitement à ce jour. Nous étudions le potentiel thérapeutique de nouveaux matériaux associés à différentes sources de cellules ayant un pouvoir de réparation du muscle (les CS et les cellules souches pluripotentes induites [iPSC] humaines).

Bénéfices attendus

Projet 1 : Court terme : Améliorer le rendement de purification des CS de rongeurs permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés la recherche pré-clinique sur les CS. Long terme : Améliorer le rendement de purification des CS humaines permettra de franchir une étape vers leur utilisation clinique en thérapie cellulaire. Projet 2 : Court terme : Nos expériences permettront de mieux comprendre la façon dont les CS humaines fonctionnent et ainsi d’élaborer une méthode pour préserver leurs pouvoir réparateur in vitro. Long terme : Préserver le pouvoir réparateur des CS humaines permettra d’élaborer des traitements pour les lésions musculaires localisées (ex : l’insuffisance urinaire et certaines pathologies musculaires). Projet 3 : Court terme : Notre projet permettra de mieux comprendre les évènements intervenant lors d’une lésion massive des muscles (ou VML), et de développer des approches de médecine régénérative pour remplacer le muscle lésé. Long terme : Nos approches de médecine régénérative conduiront vers le développement clinique de stratégies thérapeutiques pour les patients souffrant de lésions musculaires massives.

Procédures

4 injections intrapéritonéales (IP) sur animal vigile : 2 min (1 fois/jour) ; 1 injection intramusculaire (IM) sous anesthésie générale : 10 min. 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie sous anesthésie générale : 30 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min. Mesure force musculaire : 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie et électrostimulations sous anesthésie générale : 45 min. 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie sous anesthésie générale : 30 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min. Mesures extension du genou sous électrostimulations sous anesthésie générale : 45 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min (3 fois/souris).

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales peuvent générer un inconfort passager pendant l’injection. Aucune perte de mobilité n’a été constatée. L’injection intramusculaire d’une toxine induisant une destruction des fibres musculaires est source de douleur. Les animaux retrouvent leur mobilité 10 à 15 min maximum après l’injection. L’ablation partielle du quadriceps est source de douleur pour l’animal. Les animaux retrouvent leur mobilité totale 2h après la chirurgie. La mesure de force musculaire in situ est source de douleur. Les électro-stimulations réalisées sur les muscles d’animaux anesthésiés sont de faible intensité mais peuvent être source d’inconfort. Aucune perte de mobilité n’est constatée. Pour toutes les procédures, des points limites adaptés ont été déterminés et seront appliqués.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l'issue des procédures.

Remplacement

Pour l’ensemble de nos projets, les expériences seront réalisées en priorité sur des CS humaines quand cela sera possible. L’expérimentation sur les animaux ne sera utilisée que pour valider nos données in vitro et in silico (Evaluation du potentiel de greffes des hCS préamplifiées in vitro), ou lorsque les processus biologiques doivent être étudiés au niveau de l'organisme entier (Approches d’ingénierie tissulaire pour la réparation des lésions VML). Ces projets pré-cliniques ont un fort potentiel translationnel pour le traitement des lésions musculaires focales et des lésions musculaires massives (VML), et doivent donc être validés in vivo sur l’animal avant d'envisager un transfert vers la clinique.

Réduction

Afin de respecter le principe de Réduction dans nos projets, nous avons calculé le nombre d’animaux minimum (strictement nécessaire) par des analyses statistiques (test de puissance). Pour les différents axes, le nombre d’animaux a été calculé indépendamment, en tenant compte des résultats déjà obtenus, de la variabilité inhérente aux différentes procédures expérimentales, et des résultats déjà disponibles dans la littérature scientifique. De plus, toutes les expériences seront conçues et programmées de manière à recueillir le maximum de données par animal. Par exemple, un même muscle sera utilisé pour la mesure de force et plusieurs autres analyses.

Raffinement

Le concepteur et l’applicateur du protocole prendront les dispositions appropriées pour éviter toute souffrance, douleur, angoisse ou inconfort aux animaux. Les expérimentations seront effectuées par du personnel qualifié et expérimenté. Le milieu sera enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, abris en carton, carré de coton compacté et billes de bois. Les protocoles d’analgésie pré- et post-opératoires seront adaptés en fonction de la procédure expérimentale. Ils pourront également être adaptés pendant la réalisation des procédures de façon à limiter au maximum la douleur pouvant être ressentie par l’animal. Les procédures nécessitant l’anesthésie des animaux sont étudiées pour assurer une profondeur suffisante de l’anesthésie et pour limiter les difficultés de récupération pendant la phase de réveil des animaux. Pour prévenir tout risque d’hypothermie, les animaux seront placés sur une plate-forme chauffante pendant l’intervention et la phase de réveil , et ne sont remis en stabulation qu’une fois actifs. Les animaux seront à nouveau contrôlés 2 heures après le réveil et de la nourriture humidifiée et de l’hydrogel seront placés dans la cage pour en faciliter l’accès, pendant les premières 24h suivant l’intervention, les potentiels signes de souffrance seront surveillés. Si l’un des point limites énumérés dans le projet était atteint, l’animal concerné serait immédiatement mis à mort (directive européenne 63/UE/2010).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour 2 principales raisons : (1) La disponibilité des modèles transgéniques reporteurs et immunodéprimés nécessaires à nos expériences de greffe, (2) La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Les expériences de greffe et de réparation post-lésionnelle ne peuvent être réalisées que sur des souris adultes en raison de la taille des souris. De plus, le processus d’auto-renouvellement des cellules souches (retour à l’état quiescent) ne peut être étudié que sur le muscle adulte.

1 968 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus articulaires. À dix semaines, chacune subit une chirurgie du genou droit d'environ quinze minutes qui déstabilise un ménisque et déclenche une arthrose, après des injections intrapéritonéales quotidiennes ou un régime alimentaire médicamenteux de deux à quatre semaines. Le porteur décrit une possible prostration dans les trois jours suivant l'opération, l'isolement de l'animal et l'arrêt du toilettage social, ainsi qu'un risque d'infection des sutures. Les retombées annoncées pour les 500 millions de personnes touchées par l'arthrose restent au conditionnel, et le porteur compte parmi les bénéfices du projet le fait d'y tester un mode d'administration moins invasif.

Objectifs

L’arthrose, la plus répandue des maladies rhumatismales, impacte plus de 500 millions de personnes dans le monde. A ce jour, il n’existe pas de traitements qui permettent de soigner ou ralentir la maladie, les traitements disponibles sont uniquement palliatifs. Notre projet s’intéresse particulièrement aux mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la dégradation du cartilage articulaire lors de l’arthrose. L’une des étapes clé de cette dégradation semble correspondre à une augmentation anormale du volume (i.e. hypertrophie) des cellules du cartilage (chondrocytes). Dans le contexte de l’arthrose, une invasion pathologique du cartilage articulaire par des vaisseaux sanguins nouvellement formés via un mécanisme nommé « angiogenèse » se met en place. Cette invasion vasculaire favorise la dégradation du cartilage. Nous proposons l’hypothèse que les chondrocytes hypertrophiques, joueraient un rôle fondamental dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Cependant, à ce jour, aucune étude n’a rapporté, de manière précise, la phase de la maladie à laquelle les chondrocytes deviennent hypertrophiques, ainsi que le devenir de ces cellules au cours du temps. C’est dans ce contexte, que notre projet, se propose, pour la toute première fois, de documenter le mécanisme de l’hypertrophie des chondrocytes qui survient lors de l’arthrose. Pour ce faire, nous souhaitons générer et utiliser une lignée de souris génétiquement modifiées, permettant de visualiser les chondrocytes hypertrophiques grâce à une protéine fluorescente spécifique. Une arthrose sera induite chirurgicalement chez ces souris et l’apparition des chondrocytes hypertrophiques sera suivie au cours du temps. Par la suite, ces expérimentations nous permettrons de définir le moment idéal pour mettre en place des stratégies thérapeutiques anti-arthrose qui ciblent spécifiquement les chondrocytes hypertrophiques.

Bénéfices attendus

Notre projet comporte plusieurs bénéfices attendus. Dans un premier temps, notre projet va permettre d’approfondir, de manière générale, les connaissances de la communauté scientifique sur les mécanismes cellulaires/moléculaires impliqués dans l’apparition de l’arthrose et plus précisément, sur le rôle que tiennent les chondrocytes hypertrophiques dans le développement de cette maladie. Dans un second temps, les résultats obtenus, nous permettront d’évaluer l’intérêt de cibler l’étape d’invasion vasculaire du cartilage pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l’arthrose. Ce projet comporte également une partie dédiée à évaluer des modes d’administrations du traitement moins invasif et stressant pour les souris, ce qui permettra, in fine, une amélioration et un raffinement de ce protocole, dans un souci de respecter les 3Rs de l’expérimentation animale Enfin, il faut prendre en compte que l’arthrose est une maladie chronique douloureuse et extrêmement répandue au sein de la population (40% des personnes de plus de 70 ans développe de l’arthrose), qui, de fait, exerce une pression importante sur le milieu médical. De manière connexe, l’arthrose de la hanche et du genou représente des poids financiers conséquents pour les pays européens, en effet, ils sont estimés entre 408-817 milliards d’euros et 350-700 milliards d'euros/an respectivement. Ainsi, au travers de l’étude de nouvelles cibles thérapeutiques, notre projet s’inscrit dans une démarche visant à améliorer la qualité de vie des patients (amélioration de la mobilité et de l’autonomie des patients, diminution des douleurs chroniques et de comorbidités associées) et à réduire les coûts socio-économiques (limitation de dépenses liées aux arrêts de travail prolongé et aux intervention) exercées par l’arthrose sur notre société.

Procédures

Les animaux âgés de 8,10,12 ou 14 semaines recevront des injections intrapéritonéales du composé d’intérêt quotidienne de quelques secondes sur une période de 3/5 jours ou seront soumis à un régime contenant le composé d’intérêt pendant 2/4 semaines. Un site différent sera choisi pour chaque injection afin de limiter les risques d’irritation pour l’animal. A l’âge de 10 semaines de vie post-natale, les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d’un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs de l’articulation) du genou droit. Cette opération sera effectuée dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et associées à un traitement anti-douleur pré- et post-opératoire. Une injection sous-cutanée de solution saline physiologique sera également effectuée afin de prévenir la déshydratation des animaux.

Impact sur les animaux

Dans les trois premiers jours suivant la chirurgie, si des douleurs sont ressenties par l’animal, celui-ci peut entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux de la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Cette douleur pourrait notamment être causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant les chirurgies. De plus, une infection pourrait survenir au niveau des sutures post-chirurgicales. Comme indiqué dans la littérature, la présence du composé d’intérêt dans la nourriture peut provoquer une aversion chez les animaux et donc entraîner une perte de poids significative. Une acclimatation des souris à ce régime spécifique sera réalisée, de même, la prise de nourriture et le poids des animaux feront l’objet d’une évaluation régulière. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué...) seront attentivement surveillés.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements post-mortem de tissus articulaires. Ces prélèvements sont indispensables pour évaluer la fiabilité et la reproductibilité d’induction de l’arthrose post-traumatique au sein de notre lignée de souris génétiquement modifiée, ainsi que pour mieux caractériser la progression de la maladie (notamment l’apparition de cellules hypertrophiques pathologiques) chez ces animaux.

Remplacement

Des modèles in vitro/ex vivo permettent d’étudier la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et sont utilisés en amont de la présente étude pour remplacer au maximum le recours aux expérimentations animales. Ces modèles impliquent l’utilisation de cellules endothéliales d’origine humaine pour des tests de formation de tubes ou de migration cellulaires. Lors de ces tests il est possible de faire varier plusieurs paramètres et d’évaluer l’effet de communication cellulaires d’intérêt. Cependant l’utilisation de ces modèles reste limitée par le fait que les cellules endothéliales nécessitent un milieu de culture spécifique, peu compatible avec de nombreux autres types cellulaires. Or, dans le cadre de l’arthrose, l’environnement articulaire se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial trop complexes à prendre en compte dans la mise en place de modèles in vitro ou informatiques, ni même dans un modèle d’animal invertébré. D’autre part, l’arthrose est une pathologie aux causes et conséquences multiples difficilement reproductibles dans un système in vitro non intégré. C’est pourquoi, aujourd’hui, aucun autre modèle substituable aux modèles animaux ne nous permet d’évaluer les processus impliqués dans le développement de l’arthrose ni l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Dans le cadre du respect des 3Rs en éthique animale, le nombre d’animaux utilisés dans les procédures a été réduit au strict minimum. Le nombre de 9 animaux de chaque sexe par groupe a été calculé par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative. Pour l’analyse des résultats, le test statistique le plus adapté sera utilisé pour pouvoir comparer toutes les conditions. Il est également important de souligner que chaque souris fera l’objet de prélèvement multi-organes (prélèvement de sang, colonne vertébrale, pattes avant et arrières, trachée et poumons, artère aorte). Cette approche présente l’avantage de rassembler une collection d’échantillons suffisante sur un nombre restreint d’animaux. Enfin, notre projet comprend l’utilisation de techniques d’analyses très haut débit qui permettent de générer un grand nombre de données pertinentes scientifiques à partir d’un faible nombre d’échantillons.

Raffinement

Cette étude prend en considération la règle des 3R en intégrant une optimisation du raffinement des protocoles par l’évaluation de l’efficacité de mode de délivrance alternatifs d’un composé actif, afin de réduire le recours à des gestes invasifs sur les animaux. Premièrement, nous déterminerons si l’utilisation d’un régime alimentaire contenant le composé actif peut se substituer aux injections intrapéritonéales, plus invasives et stressantes pour l’animal. Dans un second temps et uniquement si le premier protocole de raffinement ne donne pas de résultats satisfaisants, nous évaluerons l’intérêt d’un mode de délivrance qui associe un nombre réduit d’injections intrapéritonéales et un régime alimentaire à base de composé actif. Pour le protocole d’induction de l’arthrose, une analgésie est assurée en avant et après l’opération. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’écarter tout risque d’hypothermie. Les souris seront ensuite transférées dans une cage de réveil également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer. Après 6h et 24h post-chirurgie, un traitement antalgique est administré aux animaux dans un souci de raffiner la prise en charge de la douleur suceptible d'être ressentie par ces derniers. Les animaux sont observés quotidiennement pendant les 3 premiers jours post chirurgie puis 2 fois par semaine. Des grilles de points limites ont été définies pour chacune des procédures et permettront une gestion de la douleur adaptée selon le nombre et la sévérité des signes cliniques observés.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle animal dans ce projet est fondé sur plusieurs critères. La souris est tout d’abord un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Notre projet est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui permettent des études précises et pertinentes dans les tissus squelettiques d’intérêt pour la recherche thérapeutique sur l’arthrose. Ces lignées de souris génétiquement modifiées sont déjà développées et disponibles. Le modèle de souris d’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médian est le plus décrit dans la littérature et fait ainsi office de référence pour l’étude de cette pathologie. Le choix de l’espèce souris s’explique également par la nécessité de travailler sur des animaux arrivés à maturité squelettique. Les animaux inclus dans cette étude seront à maturité squelettique et âgés de 8-14 semaines, il s’agit du stade de développement consensus dans la littérature pour l’induction de l’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médial.