Système musculosquelettique

Pour savoir si le tramadol améliore les performances physiques, 96 souris d'une lignée au phénotype anxieux sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever muscles, plasma et cerveau. Elles courent sur tapis roulant cinq jours par semaine pendant six semaines, la moitié recevant du tramadol, avant des mesures de capacité physique et un test d'activité spontanée. Le porteur ne signale comme effet indésirable possible que des "dommages physiques pendant l'entrainement". Les bénéfices annoncés relèvent de la lutte antidopage et de la "compétition loyale" dans le sport, et le porteur affirme que la réponse du tissu musculaire à l'effort ne peut être appréhendée qu'au sein d'un "organisme vivant entier".

Objectifs

Mettre en évidence les effets périphériques musculaires ergogeniques et centraux du traitement tramadol en analysant les performances physiques, les paramètres métaboliques musculaires et la modulation des systèmes opiodergic et non opiodergiques, chez la souris BALB/cJ de phénotype anxieux. Cette première expérimentation doit montrer un éventuel effet musculaire ergogène du tramadol. Il s’agira ensuite de préciser l’origine centrale ou périphérique de cet effet.

Bénéfices attendus

Santé et sécurité des athlètes: Le tramadol est connu pour avoir divers effets secondaires, y compris des étourdissements, des nausées et une altération de la fonction cognitive. Comprendre ses effets dopants pourrait aider à identifier les risques potentiels associés à son utilisation abusive dans le sport. En sensibilisant aux risques pour la santé, les athlètes peuvent prendre des décisions éclairées sur l’utilisation du tramadol comme médicament améliorant la performance. Compétition loyale et l’intégrité de sports : Le tramadol a été interdit par plusieurs organisations sportives, dont l’Agence mondiale antidopage (AMA), en raison de ses propriétés potentielles d’amélioration de la performance. L’étude de ses effets peut aider à faire respecter les règlements antidopage, garantissant ainsi une compétition équitable entre les athlètes. En détectant et en dissuadant l’abus de tramadol, l’étude peut contribuer à maintenir l’intégrité des sports. Politique et réglementation : Une étude approfondie sur les effets du dopage du tramadol peut fournir des données précieuses pour éclairer les décisions politiques concernant son utilisation dans le sport.Les résultats peuvent contribuer à la mise à jour et à l’amélioration des politiques et des règlements antidopage, en renforçant le cadre des contrôles antidopage et des sanctions. Ceci, à son tour, peut aider à maintenir la crédibilité et la fiabilité des instances dirigeantes du sport. Perception du public et efforts antidopage : En étudiant les effets dopants du tramadol, l’étude peut contribuer à sensibiliser le grand public à l’utilisation abusive des médicaments d’ordonnance dans le sport. Cela peut aider à combattre la perception selon laquelle le dopage se limite aux substances illicites et à souligner l’importance de mesures antidopage strictes dans divers domaines.

Procédures

1- Habituation au tapis roulant : 84 souris au total, pendant une semaine avant les premiers tests, 2- Mesures des capacités physiques avant entrainement: 84 souris au total, durée entre 20 min et 35 min. 3- Entrainement sur tapis roulant : 6 semaines, durée 5 jours par semaine. 4- Traitements : 42 souris Tramadol, 42 souris sans aucun traitement. 5- Mesure des capacités physiques après entrainement: 84 souris au total, durée entre 20 min et 35 min. 6- Test d'activité spontanée, 84 souris au total, durée 30 min. 7- Mise à mort et prélèvements des animaux.

Impact sur les animaux

Effets indesirables possibles : dommages physiques pendant l'entrainement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes qui iduisent une réponse comportementale n'est à ce jour pas modélisable. La réponse globale du tissu musculaire, incluant la quantification de paramètres liés à l'effort musculaire, ne peut être appréhendée qu’in vivo, au sein d’un organisme vivant entier.

Réduction

L'objectif principal est d'observer l’effet ergogénique musculaire du tramadol chez des souris qui subissent un exercice physique sur tapis roulant. Pour observer les changements biochimiques induits par l'exercice au niveau musculaire, nous envisageons des groupes de 21 animaux. L'objectif de réduction est atteint grâce à la réalisation de prélèvements multiples (plasma, tissu musculaire, cerveau) pour chaque animal et à l'utilisation de méthodes statistiques adaptées.

Raffinement

Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées pour limiter la souffrance animale. Une habituation au tapis roulant est réalisée au départ pour limiter le stress. L’isolement des animaux est évité. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne est effectuée pour verifier le comportement et l'état général des animaux. Des soins locaux sont prévus en cas d'irritation des pattes. Les animaux pour lesquels une habituation est impossible sont retirés de l'expérimentation, afin que l'exercice ne soit pas associé à un stress important.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans nos procédures appartiennent aux espèces dont la liste est fixée réglementairement et ils proviennent d’éleveurs ou de fournisseurs agréés. Ces animaux sont de petite taille pour faciliter la manipulation pendant l’exercice physique sur tapis roulant et les tests neurocomportementaux. De plus de nombreux outils sont disponibles chez la souris pour les études moléculaires. Les souris sont souvent considérées comme un choix plus acceptable sur le plan éthique pour la recherche que les animaux plus gros. Leur petite taille et leur capacité à être logées en groupe facilitent la prestation de soins appropriés et minimisent les souffrances. Animaux jeunes adultes de 8 semaines, age pour lequel l'entrainement physique en aérobie aura le plus d'effet sur le système musculaire.

Pour tester de nouveaux agents d'embolisation, 100 lapins sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus. L'arthrose du genou leur est provoquée par chirurgie, suivie d'une embolisation artérielle de deux heures, d'imageries hebdomadaires pendant dix semaines et d'une ponction de liquide synovial. Le porteur indique que l'induction peut entraîner un œdème et une boiterie gênant les déplacements, et que les microsphères injectées peuvent atteindre des zones non ciblées. Il décrit une présélection des produits in vitro, puis conclut que seule l'expérimentation sur l'animal vivant permet d'évaluer l'efficacité attendue chez l'humain.

Objectifs

L'arthrose du genou est une maladie courante qui peut provoquer des douleurs, un handicap fonctionnel voire une dépression chez les personnes affectées. La prévalence mondiale de l'arthrose du genou est estimée à 22,9 % chez les individus âgés de ≥ 40 ans, soit 654,1 millions de personnes dans le monde en 2020, et la plupart des patients vivent des décennies avec la maladie. De nouveaux traitements non chirurgicaux sont nécessaires pour répondre aux besoins cliniques non satisfaits. Le projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de nouveaux agents d'embolisation (AE) sur un modèle de lapin arthrosique induit mécaniquement au niveau du genou. Ce sont des produits qui peuvent être issus de la recherche interne ou de partenariats académiques ou privés.

Bénéfices attendus

Sur le court terme, ce projet va permettre de documenter l’efficacité de nouveaux agents d'embolisation (AE) in vivo. La comparaison de nouveaux AE entre eux et par rapport à des agents déjà commercialisés ou en développement dans ce modèle animal a pour but de déterminer leurs performances et leurs limites. Sur le plus long terme, ce projet s’inscrit dans l’intérêt clinique des patients.

Procédures

-Induction de l'arthrose par chirurgie (durée : 1h) -Traitement par radiologie interventionnelle (durée : 2h) -Imagerie pour suivre l'efficacité du traitement (durée: 1h, fréquence : maximum 1 fois / semaine durant le suivi de 10 semaines) -Prélèvements de sang sur animal vigile (durée: 5-10min dans une cage à contention, prélèvement rapide puis point de compression efficace jusqu'à l'arrêt du saignement, fréquence : maximum 3 fois durant le suivi de 10 semaines espacé de plusieurs semaines) pour mesurer les marqueurs systémiques de l'inflammation -Prélèvement de liquide synovial sur animal anesthésié en point final (durée: 5-10 min, fréquence : uniquement avant l’euthanasie de l’animal) pour mesurer les marqueurs locaux de l'inflammation.

Impact sur les animaux

L'anesthésie prolongée peut provoquer une deshydratation de l'animal. Les anesthésies répétées diminuent les prises hydriques et alimentaires des lapins. L'induction de l'arthrose de genou peut entrainer un oedème/hématome provoquant une boiterie génant l'animal lors de ses déplacements. L'embolisation avec des matériaux solides (microsphères) peut atteindre des zones non ciblées et générer une légère ischémie de ces zones. L'administration des différents médicaments (analgésie / anesthésie) sur l'animal vigile induit une douleur légère.

Devenir

La procédure sera considérée comme modérée puisqu'un même animal aura une imagerie et/ou des prélèvements sanguins, une induction chirurgicale de la pathologie et/ou une procédure d'embolisation artérielle. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'étude afin de prélever les tissus pour une analyse histologique.

Remplacement

La réussite d'une embolisation est dépendante de différents paramètres. Il y a tout d'abord les paramètres intrinsèques à l'agent embolisant (taille, stabilité, viscosité ...) qui seront déterminés in vitro pour faire un premier tri des produits. En parallèle, des études sur des systèmes en flux donneront des premiers renseignements sur le pouvoir embolisant des différents produits et permettront de réduire le nombre d'agents d'embolisation à tester in vivo. Passée cette préselection, seule l’expérimentation in vivo permettra d'évaluer l'efficacité attendue chez l'Homme. En effet, il est nécessaire de prendre en compte toutes les interactions entre l'agent d'embolisation et le vaisseau comme le flux, la tortuosité des vaisseaux, les interactions avec la paroi vasculaire, les systèmes de coagulation...

Réduction

Chaque étude sera composée de n= 5 animaux par groupe pour chaque agent d’embolisation étudié. Il est nécessaire de comparer le nouvel agent d’embolisation à une référence clinique dans les mêmes conditions expérimentales. Un seul groupe d’animaux contrôle sera utilisé comme référence pour tous les agents d’embolisation d’une même classe. Le nombre de 5 animaux par groupe est nécessaire et suffisant pour réaliser des analyses statistiques et comparer ainsi l'efficacité des traitements.

Raffinement

Comme indiqué dans la description détaillée de la procédure, une prémédication à la buprenorphine est systématiquement mise en place avant la chirurgie / embolisation pour assurer une bonne analgésie. Pour pallier aux nuisances ou effets indésirables liés à la chirurgie les mesures suivantes sont mises en place : une hydratation sous cutanée avec 50 mL de NaCl est réalisée avant la chirurgie / embolisation, une injection IV d’héparine (bolus et maintien toutes les heures) est réalisée pour prévenir les complications post opératoires. Une couverture par un Anti Inflammatoire Non Stéroïdien (flunixine) est également mise en place sur les 7 jours post induction de l'arthrose de l’animal. Du foin (appétant pour les lapins) et une eau gélifiée sont placés dans la cage pour leur permettre de récupérer plus rapidement post chirurgie. L'enrichissement (balle, morceaux de bois...) est conservé dans la cage. Le comportement des animaux opérés et embolisés est observé par le zootechnicien quotidiennement.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi car, du fait de sa taille, il répond à tous les critères permettant de réaliser l'ensemble des procédures. La mesure du flux sanguin est accessible par les méthodes non invasives (échographie, IRM) ou mini invasives (fluoroscopie) et la réalisation de l'embolisation sélective se fait par progression d'un microcathéter assisté d'un microguide (comme en clinique) via l'artère auriculaire. C'est également le modèle le plus référencé dans la littérature. Il est donc déjà validé et cela nous permettra de comparer nos résultats à ceux des autres agents embolisants. Enfin, l'expérience acquise dans le laboratoire sur cette espèce et avec des procédures similaires permet de s'assurer de la meilleure inclusion des animaux. Animaux adultes de plus de 10 semaines, d'environ 3 kg - 3.5 kg au moment de l'induction mécanique de l'arthrose. En effet, il faut que l'animal ait une croissance squelettique stable au moment de l'induction de la pathologie.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la flunarizine par gavage quotidien pendant 14 jours, subissent des tests moteurs et un test d'anxiété, un électromyogramme sous anesthésie et une biopsie de l'oreille pour génotypage. Le projet cherche à savoir si cette molécule déjà commercialisée pourrait ralentir une forme de sclérose latérale amyotrophique liée au gène FUS, maladie sans traitement. Le porteur pose ce repositionnement comme une hypothèse et affirme que seul un modèle souris reproduit la complexité comportementale et nerveuse recherchée.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la forme principale de maladie du motoneurone adulte (neurones localisés dans la moelle épinière et impliqués dans la transmission du signal moteur). La maladie du motoneurone principale chez l’enfant est l’amyotrophie spinale. Il existe des points communs au niveau génétique et fonctionnel entre ces deux maladies. Ces deux maladies entrainent une mort inévitable des patients et aucun traitement n’est actuellement disponible pour la SLA liée à la mutation du gène FUS. Des travaux récents ici d'une collaboration ont identifié une nouvelle molécule, la flunarizine, comme une molécule ayant un effet protecteur dans le contexte de l’amyotrophie spinale. La SLA et l’amyotrophie spinale partageant un certain nombre de points communs, y compris dans les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie, il est raisonnable de faire l’hypothèse que la flunarizine puisse aussi exercer une action protectrice dans la SLA-FUS. C’est ce que nous voulons tester dans ce projet. La flunarizine possède une autorisation de mise sur le marché et est utilisée essentiellement pour des traitements de courte durée mais peut entrainer à forte dose des effets néfastes. Nos objectifs sont donc : (i) de déterminer la dose de flunarizine ayant un effet bénéfique (expression de gènes cibles) mais sans effet secondaire chez des souris sauvages (ii) de caractériser l’effet de la flunarizine sur les défauts moteurs établis dans un modèle murin de SLA-FUS.

Bénéfices attendus

La SLA FUS est une maladie fatale, sans traitement à l’heure actuelle. La flunarizine est une molécule disposant d’une autorisation de mise sur le marché qui a fait ses preuves dans un modèle murin modélisant une maladie ayant des similitudes avec la SLA. Notre projet pourrait amener les arguments expérimentaux pour repositionner la flunarizine pour le traitement de la SLA-FUS.

Procédures

Les animaux recevront un traitement (administration par gavage sur animal vigil afin de limiter les risques de fausse route) durant 14 jours, à raison de 1 fois par jour. La durée du gavage est d’environ 20 secondes. Nous réaliserons un suivi mensuel des capacités motrices (force musculaire). Ce test se passe en 3 session de 3 minutes maximum chacune, entrecoupées de phases de repos de 5 minutes. Les animaux seront toujours remis en groupe. Nous réaliserons un test d’anxiété 2 fois au cours de la vie de l’animal (avant le début du traitement et un mois après). Ce test se déroule sur une session unique de 5 minutes. L’examen du fonctionnement des muscles (EMG) durera environ 20 minutes et sera réalisée en fin de procédure, sur les souris anesthésiées afin d’éviter toute souffrance. Nous réaliserons un prélèvement d’un petit bout d’oreille (1mm de diamètre) lorsque les souris auront entre 7 et 10 jours ce qui entrainera une douleur légère et de courte durée.

Impact sur les animaux

Nous pourrions observer chez les souris traitées des fausses routes liées à l’administration du traitement, raison pour laquelle nous avons développé une grille spécifique de scorage afin de suivre chacune des souris dès le début du traitement. La molécule utilisée peut entrainer des problèmes musculaires lorsqu’elle est administrée à forte dose. Nous avons développé une seconde grille d’évaluation afin de nous assurer que les doses choisies ne sont pas néfastes. Nous pourrions également observer un stress causé par la passation du test moteur et du test d’anxiété. Un temps de repos sera systématiquement appliqué pour le test moteur qui nécessitent plusieurs passages successifs. Si nous remarquons que les souris sont fatiguées, nous espacerons les différentes sessions. La procédure d’électro myo gramme qui permet d’observer la présence ou non d'atteinte des muscles sera réalisée sous anesthésie, les souris ne ressentiront donc aucune douleur. Le prélèvement d’un morceau d’oreille pour définir le génotype de nos souris entrainera une douleur légère et brève.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements et analyses.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer s’il est possible d’utiliser la flunarizine pour contre carrer, ou du moins ralentir, le développement des troubles moteurs observés dans la SLA. Pour étudier cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale (avec l’apparition possible des troubles de l’anxiété et des troubles moteurs) mais aussi une complexité structurelle du système nerveux, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme. La souris nous offre la possibilité de travailler avec ces deux niveaux de complexité.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les analyses histologiques et moléculaires sur les mêmes animaux que ceux chez qui auront réalisé le suivi longitudinal. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude pour 1. vérifier que la flunarizine soit utilisable dans nos conditions d’expérimentations, 2. déterminer la dose de flunarizine que nous utiliserons ensuite et 3. diminuer le nombre de souris impliquées dans l’étude longitudinale (nous n’étudierons plus qu’une dose de flunarizine au lieu de trois si nous ne faisions pas cette première étude).

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal. Toutes les approches expérimentales que nous souhaitons utiliser dans ce projet sont couramment réalisées dans notre laboratoire, ce qui limite fortement les risques de perte de tissus pour des raisons purement techniques. Par ailleurs, la procédure d’étude du muscle sera réalisée sous anesthésie gazeuse afin de réduire toute souffrance de l’animal et de réduire le stress lié à la manipulation.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau et de la moelle épinière adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives et motrices qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes (4 mois) car les patients souffrant de SLA liée à FUS présentent très rarement des formes juvéniles.

208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des tests de tolérance au glucose avec prélèvements sanguins répétés, des tests d'effort où des chocs électriques sont appliqués, des injections de vecteurs viraux dans le sinus de l'œil sous anesthésie et un tatouage, pour étudier le rôle d'une enzyme sur la masse musculaire et l'obésité. Le porteur indique qu'un régime gras peut créer une obésité et une résistance à l'insuline sources d'inconfort, et qu'une souris est retirée du test d'effort au-delà de vingt chocs électriques. Il décrit des essais préalables sur cellules musculaires mais juge l'animal entier "indispensable" pour relier les taux de lipides à la fonction musculaire.

Objectifs

Les sphingolipides constituent une vaste famille de lipides complexes impliqués dans de nombreux mécanismes physiopathologiques. Les céramides, à la base de leur métabolisme, sont connus pour influencer la sensibilité à l’insuline dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique. Plus récemment, plusieurs travaux ont démontré que l’inhibition de la synthèse de novo des céramides chez la souris permet de prévenir le déclin de la masse musculaire et de la performance physique dans plusieurs contextes pathologiques et notamment au cours du vieillissement. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la réduction des concentrations intramusculaires de ces espèces de céramides sur la masse musculaire, la performance physique et l’homéostasie glucidique et ce, chez des animaux adultes jeunes, mais également au cours du vieillissement et dans le contexte de l’obésité et de la thermoneutralité, qui sont des contextes favorisant le développement de la résistance à l’insuline.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous apporter de nouvelles connaissances théoriques sur la physiologie des muscles squelettiques et plus précisément sur l'importance de certains lipides sur la dégradation de certaines fonctions musculaires notamment lors de l'obésité et/ou du vieillissement.

Procédures

A l'issue de leur réception, après 15 jours d'acclimatation et durant ce projet, les animaux seront soumis à trois tests permettant d'évaluer leur métabolisme glucidique. Ceux-ci durent moins de 3 heures et nécessitent le prélèvement de 3 à 5 µL de sang via la veine caudale à 9 reprises durant un test. Une mesure de la composition corporelle, entraînant un isolement et une contention dans un tube en plexiglas, causera un inconfort à l'animal qui n'excèdera pas 2 minutes. Cette manipulation sera répétée une fois en fin de protocole pour les jeunes mâles et de manière mensuelle pour les mâles âgés. Les tests d'exploration des capacités musculaires, d'une durée maximale de 5 minutes, vont générer soit de l'inconfort soit du stress. Ce dernier sera diminué par la présence de personnel formé et attentif, par l'entraînement des animaux et par la diminution de l’intensité des chocs électriques, lors du test d'endurance, à la valeur seuil minimale de détection. Les animaux recevront des vecteurs viraux par voie rétro-orbitaire, ceci sera réalisé une seule fois sur animaux anesthésiés ce qui diminuera grandement la douleur, d'autant qu'un collyre anesthésiant sera appliqué en per opératoire. Cette partie des procédures expérimentales n'excède pas 10 minutes entre l'endormissement et le réveil de l'animal. De même, l'identification par tatouage sera faîte sur animaux anesthésiés et une fois en début de protocole, acte rapide (15 secondes environ) et peu invasif.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés. Un stress lié à l'isolement, même s'il est de courte durée, pourrait être constaté lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance. Un stress lié à la contention et aux injections par voie intrapéritonéale pourrait survenir lors des tests in vivo de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline. Un inconfort pourrait être constaté au réveil des animaux anesthésiés pour l'injection des vecteurs viraux via le sinus rétro-orbitaire ou pour leur identification par tatouage. La mise en régime enrichi en lipides en créant une obésité associée éventuellement à une insulino-résistance voire à un diabète pourrait engendrer un grand inconfort à l'animal.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront nécropsiés, des tissus et organes collectés pour des analyses histologiques, d'expressions génique et/ou protéique.

Remplacement

Des expériences préliminaires sur des cultures cellulaires issues de muscles squelettiques ont déjà été réalisées et ont montré l'importance de l'intérêt porté aux lipides intramusculaires. Cependant, pour faire le lien entre les quantités de certaines espèces lipidiques, ici les céramides, et la masse musculaire, les perfomances physiques ainsi que l'homéostasie glucide, l'animal en tant que modèle intégré est indispensable.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests non paramétriques utilisés soit pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, ou pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, et encore pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche du centre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans le Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages, quantité qui sera augmentée au moment de l'administration des vecteurs viraux. Après l'identification par tatouage, si une inflammation locale ou systémique (encore plus rare que la précédente) survenait, les souris seraient traitées par un mélange antibiotique/anti-inflammatoire. Si cette médication ne suffisait pas elles seraient alors mises à mort. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme ce qui devrait diminuer le stress des animaux et indirectement la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées; elle permettra également de vérifier l'absence de perte de poids qui, si elle excède 20% du poids corporel, entraînerait une mise à mort de l'animal concerné. Le réveil de l'animal, après anesthésie par un mélange isoflurane-oxygène, pour l'injection des vecteurs viraux, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. Enfin, la mesure du test d'exercice en endurance ne sera réalisée qu'une fois en toute fin des procédures, donc avec des animaux habitués à la manipulation et après deux tests à blanc de courte durée. Malgré toutes ces précautions, un animal sera sorti du protocole si le nombre de chocs devient supérieur à 20.

Choix des espèces

L'espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d'Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux adultes jeunes (3 mois lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 7-8 mois en fin de protocole) ou âgés (15 mois lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 21-22 mois en fin de protocole) seront utilisés. En effet, nous souhaitons analyser divers paramètres et facteurs (cf description du projet et procédures) sur des animaux jeunes contrôles et les comparer soit à des animaux rendus obèses par un régime nutrionnel approprié ou par modification de leur température d'hébergement ou âgés, pour lesquels une obésité associée à une insulino-résistance peut s'installer et se développer.

132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des muscles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des séances de course en montée, une immobilisation du train arrière pendant trois semaines, une exposition à la chaleur (30 minutes à 40°C) et des injections de puromycine, pour évaluer si la chaleur amplifie la récupération musculaire après immobilisation. Le porteur indique que l'immobilisation provoque une perte de masse musculaire des pattes arrière. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" faute de modèle cellulaire reproduisant les effets "corps entier" et qualifie l'usage d'animaux d'étape "obligatoire", les retombées annoncées pour les athlètes et les personnes en rééducation restant au conditionnel.

Objectifs

L’activité physique, en sollicitant la force musculaire, provoque l’augmentation de la masse musculaire (hypertrophie). Cette modalité d'exercice est recommandée lors de situations de perte de masse musculaire (atrophie), par exemple après une période d'immobilisation (alitement, pose d’un plâtre). Par ailleurs, l'exposition à certaines conditions environnementales spécifiques, tel que la chaleur, peut amplifier la prise de masse musculaire ou limiter sa perte. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets de la récupération musculaire en atmosphère chaude après une série d’exercices de course en montée chez des souris saines ou présentant une perte de muscle suite à une immobilisation

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer si la chaleur est bénéfique pour amplifier les adaptations musculaires à l’exercice, ce qui permettra d'envisager des perspectives non seulement pour les athlètes, mais aussi chez les personnes en réhabilitation post-blessure ou post-opération chirurgicale. Les populations sédentaires ou souffrant de pathologies métaboliques (e.g. diabète, insuffisance rénale chronique) ou de pertes de masse musculaire (cancers, vieillissement) bénéficieront également de perspectives d'intérêt. D’autre part, l’exercice couplé à la chaleur permettrait d’accélérer davantage la prise de masse musculaire chez les populations atrophiées.

Procédures

Pour la procédure aigüe, les animaux subiront deux à trois interventions : - groupe E : l’exercice physique (une séance de 1 heure) + injection sur animal vigile (5 secondes) - groupe E+C : l’exercice physique (une séance de 1 heure) + la récupération en milieu chaud (30 minutes à 40°) + injection sur animal vigile (5 secondes). Pour la procédure chronique, les animaux subiront une à quatre interventions : -groupe NS (pas d’immobilisation) : une injection (5 secondes) -groupe S (immobilisation) : immobilisation de trois semaines + injection (5 secondes) -groupe NS-E (pas d’immobilisation + exercice) : 6 semaines d’entraînement + injection (5 secondes) -groupe S-E (immobilisation + exercice) : immobilisation de trois semaines + 6 semaines d’entraînement + injection (5 secondes) -groupe NS-E+C (pas d’immobilisation + exercice + chaleur) : 6 semaines d’entraînement + récupération en ambiance chaude (30 minutes à 40°) + injection (5 s) -groupe S-E+C (immobilisation + exercice + chaleur) : immobilisation de trois semaines + 6 semaines d’entraînement + récupération en ambiance chaude (30 minutes à 40°) + injection (5 s) -groupe S-C (immobilisation + chaleur): immobilisation de trois semaines + récupération en ambiance chaude (30 minutes à 40°) + injection (5 s) -groupe NS-C (pas d'immobilisation + chaleur) : récupération en ambiance chaude (30 minutes à 40°) + injection (5 s) -groupe S-SED (immobilisation + sédentarité): immobilisation de trois semaines + maintien en cage 2 semaines + injection (5 secondes)

Impact sur les animaux

Les stress auxquels seront soumis les animaux sont l’exercice physique, l'immobilisation, la chaleur et l’injection intrapéritonéale de puromycine. Les 3 séances de familiarisation permettront d’éduquer les souris au tapis de course. L'immobilisation du train arrière provoquera un déconditionnement des souris, avec une perte de masse musculaire, mais cela ne concerne que les pattes postérieures. Au niveau de la chaleur, le stress sera relativement court (30 minutes à 40°C) et l’hydratation sera ad libitum. Enfin, l’injection intrapéritonéale de puromycine durera 5 secondes. Il s’agit d’une injection dans le bas ventre de puromycine, permettant de suivre le taux de synthèse des protéines. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement également.

Devenir

La totalité des animaux sera euthanasiée à l'issue de chaque procédure dans le but de prélever les biceps fémoraux pour l'étude des gènes et protéines jouant un rôle dans la régénération musculaire.

Remplacement

Ce projet nécessite une réalisation dans un environnement très contrôlé pour éviter des biais qui pourraient provenir de facteurs externes. De plus, nous souhaitons évaluer les effets de la chaleur, ce qui ne peut être contrôlé précisément que dans des conditions de laboratoire avec des animaux. L’immobilisation partielle est aussi une contrainte qui rend difficile la réalisation du projet chez l’homme. Dans le cadre de ces expérimentations très spécifiques, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux étant donné l’absence de modèle cellulaire permettant de mimer les effets corps entier de l’immobilisation sur l’ensemble des tissus d’intérêt ainsi que les effets des méthodes de prévention. De plus, ces expérimentations ne peuvent pas être directement réalisées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc ici une étape obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique de par les résultats très précieux qu’elle génère.

Réduction

Le calcul a été effectué avec l’aide l’un logiciel de statistiques afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux tout en gardant la puissance statistique nécessaire à l’interprétation des résultats.

Raffinement

Pour l’activité physique et les tests réalisés sur tapis roulant, les animaux y sont préalablement habitués progressivement pour réduire le stress induit au changement d’environnement. Afin de réduire au maximum les nuisances sur le bien-être des souris, les animaux seront constamment surveillés au cours de la séance pour prévenir tout accident. Les procédures de suspensions du train arrière sont, elles, validées et optimisées, et des soins quotidiens sont réalisés pour prévenir toute complication. Les animaux seront hébergés par deux pour éviter l’isolement. Chaque procédure possède également des points limites et critères d’arrêts stricts en cas d’évènement potentiellement néfaste pour les animaux en ce qui concerne la douleur, le mal-être, etc. Les suivis quotidiens des animaux permettent d’identifier des signes de souffrance.

Choix des espèces

Le choix des souris a été fait car nous voulons utiliser le même protocole d’entraînement que les études qui montrent des adaptations similaires post-entraînement chez l’homme et chez la souris. De plus, comme chez l’homme, il a été montré que l’immobilisation induit une perte de masse musculaire chez la souris également. La souris Mus musculus a été privilégiée pour plusieurs raisons. Les espèces murines rat et souris sont des espèces se rapprochant de l'humain en ce qui concerne le système musculosquelettique. Les systèmes de dégradation et de synthèse protéique sont similaires chez l'homme et chez la souris bien qu'il existe des différences subtiles de typologie entre les deux espèces. Ainsi, les conclusions tirées de ces études chez la souris pourront être étendues chez l'homme. Les souris utilisées seront toutes des adultes de 8 semaines.