Système musculosquelettique

370 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun subissant soit quatre membranes artificielles implantées sous la peau du dos, soit une perte de substance créée dans le fémur et fixée par une plaque vissée. Trente rats pour la première phase, cent dix pour la deuxième, deux cent trente pour la troisième. Après l'opération, ils sont placés seuls en cage jusqu'à sept jours, le temps que la douleur et la boiterie s'atténuent, et le porteur prévoit une hyperthermie possible par infection, une perte de poids et des anomalies de cicatrisation pendant une quinzaine de jours. Les bénéfices décrits concernent des patients humains, une seule chirurgie au lieu de deux et un retour plus rapide au travail, quand l'atteinte porte, elle, sur des fémurs de rats ouverts puis prélevés.

Objectifs

La gestion des pertes de substances osseuses critiques (supérieur à 5 cm) est une préoccupation quasi quotidienne en chirurgie orthopédique et traumatologique. Elle peut être prise en charge par la technique de la « membrane induite ». Cette technique consiste à placer une entretoise en ciment (PMMA ou polymethylmetacrylate) dans la zone de perte de substance osseuse. Une réaction autour du ciment permet la formation d’une membrane (en 2 à 3 mois environ) qui servira de réceptacle à une autogreffe osseuse prélevée sur le patient. Malgré les avancées permises par cette technique, il s’agit d’une procédure nécessitant le développement de cette membrane dans un délai assez long, requérant donc 2 interventions, retardant tout autant la récupération de l’autonomie du patient. De plus, la qualité de la membrane induite par l’organisme reste variable et dépendante du patient (âge, fumeur, comorbidités…), elle est hélas parfois quasi inexistante, friable et fragile, limitant les chances de succès et entraînant donc d’autres procédures chirurgicales plus agressives. L’immobilisation du patient et la mise en décharge plusieurs semaines présente des conséquences physiques lourdes à savoir : Amyotrophie, enraidissement articulaire mais aussi des conséquences socio-économiques avec une hospitalisation à deux reprises, souvent supérieures à 48-72h et un retard au retour aux activités personnelles et professionnelles (coût social de la perte d’activité). Ainsi, l’objectif de ce projet est d’être dans la mesure d’évaluer in vivo de membranes artificielles synthétiques, implantables, autorisant une consolidation osseuse en une chirurgie tout en ayant une maniabilité compatible avec le terrain chirurgical orthopédique et traumatologique. Ces membranes artificielles auront pour rôle d’être un soutien à la formation de la membrane induite naturellement par le corps mais également de servir de soutien à la greffe osseuse qui serait réalisée en un seul temps opératoire, optimisant donc la technique initiale sur les plans orthopédiques, rééducatifs mais aussi socio-économiques pour les patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont les suivants : - Limiter les échecs de la technique de la membrane induite dans sa forme actuelle en implantant un dispositif artificiel permettant de soutenir la formation de cette membrane induite, qui aurait donc des caractéristiques plus propices à la consolidation osseuse. - Limiter le nombre de chirurgies : en effet, il est impossible chez l’homme et chez l’animal de simplement greffer de l’os lorsque la perte osseuse est trop importante, cela résulte en une résorption du greffon et donc en un échec de la technique. Implanter une membrane artificielle aux propriétés supérieures permettrait de surseoir au temps de formation de la membrane induite, réduisant la chirurgie en 1 seul temps au lieu de 2. - Retirer le temps de formation de la membrane. Chez le rat, cette membrane se forme en 4 semaines mais chez l’homme celle-ci se forme en minimum 6 semaines (conditions idéales du jeune homme sans comorbidités) voire plusieurs mois (en moyenne 3 mois). Ce temps de formation chez l’homme, très long, limite grandement les capacités de mobilisation du membre concerné et donc la rééducation (avec pour conséquence une perte de musculature, un enraidissement articulaire), la reprise des activités professionnelles et personnelles. Les matériaux employés par les membranes artificielles ont pour objectif de maintenir l’autogreffe viable en 1 seul temps chirurgical, le temps d’obtenir une une consolidation osseuse indépendamment de la formation de la membrane induite et donc des comorbidités des patients et de la gravité de leur affection. - Au final : Limiter le temps d’immobilisation du patient, sa mise en décharge et ses conséquences : Perte musculaire, enraidissement articulaire, limitation des conséquences socio-économiques à savoir une double hospitalisation, souvent d’une durée supérieure à 48-72h, limiter le temps avant retour aux activités professionnelles et personnelles et donc limiter le coût socioéconomique de ces pathologies orthopédiques. - Accélération de la consolidation osseuse : les membranes artificielles, ayant des caractéristiques angiogéniques et ostéogénique ont pour objectif associé d’obtenir une consolidation du defect dans un délai plus rapide.

Procédures

Le nombre d'animaux se base sur une analyse de la littérature sur les mêmes modèles de defect femoral et d'implantation sous-cutanées du rat. La première phase du projet requiert 30 rats, la seconde 110 et la 3ème 230 (au maximum). Les résultats des matériaux étudiés permettront d'ajuster le nombre de rats nécessaires à l'étape 2 puis 3. La première phase consistera en l'implantation sous-cutanée de 4 membranes artificielles dans le dos des rats. Il s'agit de l'unique procédure chirurgicale réalisée par rat. L'objectif principal sera d'évaluer la capacité des matériaux à générer une membrane au propriétés histologiques supérieures à celle produite dans les groupes contrôles. Cette étape est la moins agressive et permettra de diminuer les nuisances animales. Le temps chirurgical est de 30 minutes pour les 4 implantations par rat. Pour la 2ème phase de l'étude, le groupe contrôle comportera 10 rats et 10 groupes de matériaux maximum seront analysés. L'objectif principal sera d'évaluer la capacité des matériaux à produire une membrane aux propriétés histologiques supérieures à celles produites dans le groupe contrôle. Une seule procédure sera réalisée par rat : la création d'un defect osseux fémoral et une stabilisation par plaque vissée (ostéosynthèse). Cela autorisera un appui sur le membre opéré juste après l'intervention. Cette procédure sera réalisée en 1h. Pour la 3ème phase de l'étude, une groupe contrôle de 15 rats sera requis et chaque groupe d'étude comportera 10 rats (10 groups maximum). L'objectif est d'étudier la consolidation en présence des membranes d'interêt comparé à la technique habituelle. L'analyse se fera à 2 points temporels différents. Le groupe contrôle comportera 15 rat car ce groupe requierts 2 chirurgies, augmentant le risque de complications. Cela correspond à ce qui est réalisé chez l'homme (temps de formation de la membrane induite autour du ciment). La greffe osseuse sera réalisée au cours de la 2nd chirurgie, 4 semaines plus tard. Les groupes d'étude ne comporteront qu'une seule chirurgie car il s'agit d'un des objectifs majeurs de ce projet (1 seul temps chirurgical). La greffe osseuse osseuse sera prelevée lors du même temps chirurgical et consistera au prélèvement de 2 à 3 vertèbres de la queue du rat, fragmentées et intégrées au defect osseux fémoral. La chirurgie est réalisée en 1h. Toutes ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale (gazeuse) associée à une analgésie multimodale.

Impact sur les animaux

Le projet est pourvoyeur de plusieurs nuisances et effets indésirables qui seront recherchés, anticipés et traités en cas d’apparition. En premier lieu, plusieurs données générales seront analysées notamment : - Douleur de palier modéré à sévère étant donné qu’il s’agit d’une chirurgie avec incision cutanée pour la phase 1 et orthopédique avec réalisation d’un defect osseux pour les phases 2 et 3, la douleur est également prévisible et sera surveillée tout au long de l’étude, particulièrement la 1ère semaine post-opératoire. - Hyperthermie : pouvant être due à une infection post-opératoire, ce risque est présent au moins les 15 premiers jours, le temps de la cicatrisation cutanée. Elle sera recherchée par la mesure de la température de l’animal. - Perte de poids : par douleur et/ou difficulté de mobilisation due à la chirurgie sur le membre inférieur de l’animal (phases 2 et 3), entrainant une restriction alimentaire et hydrique, la durée prévisible est 7 jours d’après les modèles retrouvés dans la littérature, les rats retrouvant une mobilité habituelle après ce délai. Elle sera dépistée par la pesée régulière de l’animal. - Anomalie de la cicatrisation cutanée : désunion, saignement, hématome, écoulement suspect (infection), ce risque est présent au moins les 15 premiers jours, le temps de la cicatrisation cutanée. Il sera recherché par l’inspection de la cicatrice en période post-opératoire. - Limitation de la mobilité de l’animal dans les suites opératoires : bien que la chirurgie permette la déambulation, une diminution de la mobilité dans les modèles similaires est observée la première semaine post-opératoire (phases 2 et 3 notamment). - Altération de l’état physiologique par stress postopératoire de l’animal : trouble de la posture, du toilettage, dépilation, durée prévisible de 7 jours post-opératoire. Cela sera limité par la médication antalgique associée à ce protocole de recherche.

Devenir

A l’issue de chaque étape de ce protocole il sera réalisé une euthanasie car il est nécessaire de prélever les membrane formées et les fémurs opérés pour analyse comparative. Les méthodes d’euthanasie employées seront le surdosage d’anesthésique, réalisé sur animal préalablement sédaté (anesthésie gazeuse) ou l’inhalation de CO2 par incrémentation progressive.

Remplacement

Le principe de la membrane induite repose sur la réaction de l’organisme à la présence d’un matériau (le ciment en PMMA) sur le lieu de l’implantation, provoquant une réaction tissulaire à corps étranger, vascularisée et riche en facteurs de croissance. Dans notre travail, différents biomatériaux auront pour vocation à remplacer le PMMA pour optimiser cette réaction. Le but étant de former une membrane « induite » optimisée autour du matériau. Il s’agit d’une réaction complexe mêlant à la fois une réaction immunitaire « à corps étranger », une hypervascularisation locale et une stimulation de la formation d'os sur un organisme vivant. Dans la membrane induite, il est retrouvé des éléments cellulaires de ces 3 lignées (immunitaire, vasculaire et osseuse) avec une différenciation qui a lieu sur plusieurs semaines avant d’obtenir une membrane induite mature. Il n’est pas retrouvé dans la littérature de modèle in vitro, ex vivo ou in silico permettant de reproduire l’ensemble des éléments et des étapes menant à la formation de la membrane induite et cela empêche l’analyse in vitro. La seule analyse préalable, permettant de réduire l’agressivité chirurgicale est l’implantation sous-cutanée, suffisante pour analyse la réaction tissulaire immunitaire et la formation de vaisseaux et limitant drastiquement la sévérité du geste sur l’animal. Néanmoins, avant réalisation des études sur animal, des analyses in vitro de cytotoxicité et cytocompatibilité sur les des cellules osseuses, vasculaires et immunitaires seront menées sur les matériaux sélectionnés pour remplacer le PMMA actuel afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’analyse in vivo.

Réduction

La détermination du nombre d’animaux se base sur une analyse de la littérature étudiant le même modèle animal, sur le même sujet d’étude. 5 études d’implantation sous cutanée dans la littérature ont également été analysées. Le nombre moyen d’animaux par matériau analysé était de 10 pour l’implantation osseuse (10 échantillons par groupe). Pour l’analyse en implantation sous-cutanée, 5 échantillons de membrane induite étaient utilisés en moyenne par groupe. Une seule (defect osseux) étude publiée réalisait une analyse de puissance basée sur les résultats histologiques, avec un niveau de puissance de 80% et retrouvait un nombre requis minimal de 8 rats par groupe. En se basant sur ces différentes études et leurs résultats, un nombre de 10 rats par groupe a été sélectionné. La stratégie de réduction s’applique également dans le design de l’étude puisque pour limiter au maximum le nombre d’animaux nécessaires, la première phase consistera à étudier la formation de la membrane induite après implantation sous-cutanée du matériau et la seconde phase après réalisation du defect osseux. L’implantation sous-cutanée permet également d’implanter plusieurs matériaux (jusque 4) sur un seul rat ce qui n’est pas possible en implantation osseuse. L’ensemble des membranes artificielles aura eu préalable une analyse de cytotoxicité et de cytocompatibilité in vitro. Ces analyses ne permettent pas de reproduire le procédé in vivo de formation de la membrane induite qui intègre simultanément des phénomènes immunitaires, vasculaires et osseux. Cependant elle permettra de vérifier sur chaque lignée l’absence de cytotoxicité limitant l’implantation chez l’animal. De même, ce projet est réparti en 3 phases car à l’issue de chaque phase, des résultats inférieurs aux groupes contrôles entraîneraient le retrait du matériau lors des étapes suivantes de l’étude. Cela permettra de sélectionner les matériaux ayant les meilleurs résultats à l’issue de chaque étape tout en limitant l’agressivité chirurgicale des procédures.

Raffinement

En premier lieu les conditions de vie des animaux respecteront un cycle de 12h jour/nuit en alternance. Le milieu de vie sera dans une salle à flux d’air contrôlé, avec une température contrôlée (21°C). Les animaux disposeront d’un accès à l’eau et à l’alimentation à volonté, selon des aliments standards (pas de modifications du régime alimentaire habituel). Le milieu de vie sera enrichi et consistera en un sol dur comportant une litière, disposant de moyens d’exploration et de cachettes (tunnels en cartons par exemple, ou petits dômes en papier maché etc.). Des éléments permettant la nidification seront présents également, (cylindre de coton, carré de cellulose, rondelles de peuplier compressé), enfin des éléments permettant aux rats de ronger seront présent (morceaux de bois). Avant l’intervention, les rats seront placés en cages, avec 3-4 rats par cages afin de respecter leur comportement social. Cependant, après la chirurgie et devant les conditions diminuées de déambulation et de douleur post-opératoire (notamment phases 2 et 3), ils seront placés en cage seuls, pour une durée minimale mais pouvant aller jusqu’à 7 jours. Il s’agit du temps requis avant reprise d’une déambulation habituelle et sans douleur à l’issue de la procédure. Plusieurs éléments seront analysés pour contrôler le bien-être des animaux à savoir : le poids avec mesure bihebdomadaire pendant 7 jours post-opératoire puis une fois par semaine, la température à la recherche d’une hyperthermie, mesurée tous les jours en post-opératoire (recherche d’une infection post-opératoire). Une analyse de la plaie post-opératoire (désunion, saignement, hématome) sera quotidienne les 7 premiers jours postopératoire. Une évaluation quotidienne de la capacité de déambulation de l’animal qui doit progressivement devenir normale en 7 jours pour les phases 2 et 3. Enfin une analyse comportementale sera réalisée notamment la posture, la position des oreilles, l’enfoncement des yeux mais aussi si un manque de toilettage est constaté (à l’aide de l’échelle d’évaluation des expressions faciales du rats, édité par la NC3Rs). Les sources d’eau et de nourriture seront placés à des lieux accessibles à proximité de la zone de repos et stabilisés pour qu’ils ne soient pas renversés facilement.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour cette étude est le rat. Il s’agit dans la littérature de l’espèce animale la plus utilisée. Dans une revue systématique publié en 2022, 70% (28/40) des études animales évaluant la membrane induite étaient réalisées sur un modèle de rat. Sur ces études sélectionnées et utilisant un defect fémoral (24 études), 20 étaient réalisées sur le rat. Le choix de cette espèce permet donc d’obtenir des résultats comparables avec la littérature. En outre, l'élevage de ces animaux est plus rapide et plus facile, avec des coûts considérablement réduits. Les rats seront à un stade adulte de leur développement, correspondant à 10 semaines de vie avec un poids de 400-450 gr. Cela correspond à l’âge d’un humain adulte d’environ 18 ans. En effet, la technique de la membrane induite est le plus fréquemment utilisée chez le jeune adulte dans le cadre d’accidents à haute cinétique de la voie publique (moto, voiture etc.). De plus, l’utilisation des moyens d’ostéosynthèse chez des rats non matures et plus jeunes expose à des difficultés techniques matérielles (moyen d’ostéosynthèse non adapté à la taille des fémurs de rats plus jeunes).

800 souris reçoivent dans le muscle de la patte une injection de cardiotoxine, un venin de serpent qui lèse les fibres et provoque une douleur que le porteur reconnaît, après cinq jours de tamoxifène et, pour certains groupes, la pose chirurgicale d'un implant d'androgènes. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance sévère, le plus élevé de l'échelle. Le porteur écrit pourtant n'avoir "pas prévu d'administrer d'analgésiques", hors chirurgie, et fixe la mise à mort à une perte de plus de 20 % du poids sur une semaine. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour que leurs muscles soient analysés, l'enjeu déclaré étant de savoir si les androgènes améliorent ou aggravent la réparation d'un muscle lésé.

Objectifs

La régénération musculaire est indispensable pour maintenir la fonctionnalité du muscle squelettique. Le muscle squelettique adulte est capable de se régénérer spontanément à la suite d'une lésion grâce à des cellules souches musculaires localisées à la périphérie des fibres musculaires. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la dégénération d’une part et la régénération musculaire d'un muscle adulte d’autre part. Pour ce faire, les muscles des souris de type sauvage (non sujettes à des mutations) seront traitées à la cardiotoxine (un venin de serpent) afin d'induire une blessure au niveau du muscle tibial antérieur. Ces souris seront en parallèle traitées avec une substance synthétique qui a le même rôle des androgènes sécrétés par l'organisme ou un placébo afin de mettre en évidence une amélioration ou au contraire une aggravation du processus de réparation du muscle lésé.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces procédures permettra de déterminer le potentiel thérapeutique des androgènes dans le processus de régénération musculaire.

Procédures

Tous les animaux seront traités au Tamoxifène par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris), anesthésiés à l'isoflurane (5-10 min/ souris), injectés à la cardiotoxine par voie intramusculaire (30 sec/souris). Un des groupes subira un implant d'androgènes en sous-cutané dans la région interscapulaire (5 min/souris). Un autre recevra les androgènes par voie musculaire en même temps que la cardiotoxine (30 sec/souris).

Impact sur les animaux

Les injections peuvent très rarement causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. L'injection de cardiotoxine engendrera une douleur au niveau du muscle lésé. La chirurgie nécessaire pour la pose de l'implant pourra générer un inconfort dans les premiers jours suivant l'intervention.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer le potentiel thérapeutique des molécules identifiées dans des systèmes cellulaires, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans la régénération fibrillaire. Ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, pour une même souris une patte sera utilisée pour des analyses moléculaires et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et de cardiotoxine. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage et son activité (un dos vouté, un pelage hérissé ou inactivité après stimulation, sont tous des signes d'incofort de l'animal). Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de cardiotoxine, la substance synthétique et la chirurgie seront faites sous anesthésie. Nous n'avons pas prévu d'administrer d'analgésiques. Ils seront par contre donnés pour la chirurgie.

Choix des espèces

Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les souris de 7 à 11 semaines seront utilisées. En effet, le projet s’intéresse à l’organisme adulte et les souris jeunes possèdent davantage de cellules satellites que les souris agées.

160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever intestin, rate, foie, reins et articulations. Une arthrite leur est provoquée par injections sous la peau à la base de la queue, ou bien elle se déclare seule chez les lignées génétiquement modifiées, et elles reçoivent jusqu'à onze gavages de composants de membranes bactériennes sur dix semaines. Le porteur indique que l'analgésie restera limitée, les antidouleurs modifiant la perméabilité intestinale qu'il veut mesurer. Ces expériences complètent un travail antérieur, en réponse aux commentaires demandés par un journal scientifique avant publication.

Objectifs

Les rhumatismes inflammatoires correspondent à une inflammation articulaire (arthrite) dans le cadre de maladies générales de l'organisme avec un risque de handicap et une baisse de la qualité de vie dont la cause est inconnue. Les causes des rhumatismes inflammatoires restent mal connues. Le but de notre recherche est d'étudier si des modifications au niveau du tube digestif peuvent changer l’issue de l’arthrite. L'exploration du lien entre le tube digestif et l'arthrite inflammatoire doit tenir compte des intéractions complexes entre le contenu du tube digestif et les nombreuses structures mécaniques, chimiques et immunologiques présentes dans l'intestin. L’étude de la physiologie gastro-intestinale ne peut être réalisée que sur des animaux puisqu’à ce jour aucun système cellulaire ne permet de reproduire les interactions complexes. Nous avons choisi d'utiliser des modèles murins pour des raisons de faisabilité, les modèles d’arthrite expérimentale étant largement documentés dans la littérature, y compris des souris génétiquement modifiées qui développent spontanément de l’arthrite à l'âge adulte.

Bénéfices attendus

Nous formulons l’hypothèse que des modifications au niveau du tube digestif peuvent changer l’issue de l’arthrite. En cas de résultats positifs, ce projet permettrait une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l'arthrite et participerait à ouvrir la voie vers de nouvelles approches thérapeutiques pour agir sur l’alimentation et l’intestin.

Procédures

Pour étudier l'effet des composants bactériens sur l'arthrite nous administrerons différents composants de la membrane bactérienne par gavage gastrique. Les souris recevront ces composants par voie orale une fois par semaine pendant maximum 10 semaines soit maximum 11 administrations selon les procédures. La perméabilité intestinale sera mesurée chez la souris après gavage par un sucre couplé à un marqueur fluorescent suivi d’un prélèvement de sang au niveau de la veine de la joue pour mesurer la fluorescence. Les souris seront prélevées maximum 5 fois à des intervalles de deux à trois semaines selon les procédures. Ces manipulations ne nécessitent pas d’anesthésie. Dans le modèle d’arthrite induite, l’arthrite est induite par injections sous la peau à 2 semaines d’intervalle à la base de la queue sous anesthésie générale. Pour l’étude du passage de composants bactériens à travers l’intestin, nous utiliserons un composant bactérien radioactif administré par gavage une fois. Les prélèvements ultérieurs seront réalisés après euthanasie de l’animal par dislocation cervicale. L’évaluation des souris sera faite à l’aide d’un score prenant en compte l'arthrite, la sensibilité articulaire, l'apparence, les fonctions du corps et le comportement.

Impact sur les animaux

-Selon notre expérience, l’arthrite apparaît progressivement dès 2 semaines pour être maximale vers 6 semaines. Cela provoque un gonflement des pattes qui peut affecter la mobilité de la souris. Néanmoins dans notre modèle, selon nos observations antérieures, la mobilité reste fonctionnelle et les souris ne sont pas prostrées. - Dans le modèle d’arthrite induite au collagène, à peu près 5-10% des souris peuvent développer des lésions cutanées aux sites d'injection. Il s’agit ici de réaliser des expériences complémentaires en réponse à la demande de commentaires d'un journal, utilisant des procédures d’un précédent travail. Ainsi, les procédures et les traitements sont bien connus. Et le nombre de souris a été restreint. Les points limites ont bien été définis. Selon nos observations antérieures, notre modèle ne génère que très peu de signes généraux et affecte peu la mobilité de la souris. En effet, dans le cadre du précédent travail, seul un petit nombre de souris (< 0,3%) ont nécessité une euthanasie précoce.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les souris seront immédiatement euthanasiées par un personnel compétent. Cela permettra l’analyse des tissus (intestin, rate, foie, rein, articulations) post mortem pour mieux comprendre le rôle des composés bactériens dans l’arthrite inflammatoire.

Remplacement

L'exploration de cette hypothèse doit tenir compte des intéractions complexes entre le contenu du tube digestif et les nombreuses structures qui forment la barrière intestinale. Ainsi, l'exploration de notre hypothèse ne peut être faite que dans le contexte d’un être vivant.

Réduction

Les expériences ayant été déjà réalisées dans le cadre d’une précédente autorisation de projet, et s’agissant d’expérimentations supplémentaires demandées par le journal, chaque expérience ne nécessitera pas d’être répétée. Cela permet de réduire au maximum le nombre de souris nécessaires pour ce projet.

Raffinement

Les moyens de soulager la douleur seront limités à cause de l'impact des médicaments sur la perméabilité intestinale et l'arthrite. Cependant, un système d'évaluation clinique donnant lieu à des mesures adaptées comme la disponibilité de la nourriture directement dans la cage, de l’eau gélifiée et une surveillance rapprochée a été mis en place. Si les points limites sont atteints : déshydratation, score d’arthrite très élevé ou prostration/immobilité persistante entraîneront la mise à mort . Les animaux seront évalués 2 fois par semaine avec un suivi plus rapproché lors de la deuxième phase de l’arthrite. La durée de l'arthrite est limitée. Elle apparait 3 à 4 semaines après la 1re injection dans le modèle d’arthrite induite au collagène et vers l’âge de 4 semaines dans le modèle transgénique. Dans les deux modèles (arthrite induite au collagène et transgéniques), les souris développent de l’arthrite et sont surveillées et évaluées de la même manière. La procédure sera donc interrompue au plus tard 10 semaines après l'induction ou après l'apparition de signes cliniques dans le modèle d'arthrite spontanée. Dans le modèle d’arthrite induite au collagène, à peu près 5-10% des souris peuvent développer des lésions cutanées aux sites d'injection. En cas d'apparition de lésions cutanées, celles-ci seront désinfectées et surveillées.

Choix des espèces

La souris est un mammifère avec une physiologie et un système immunitaire très proche de l’homme pour laquelle il existe un grand nombre de lignées mutée sur des gènes permettant des études mécanistiques approfondies. Ainsi, les résultats expérimentaux seront très probablement transférables à l’homme. Les souris seront de jeunes adultes (souris à maturité sexuelle) d’au moins 5 semaines d’âge au début de l’expérience. À cet âge, la maturation du système immunitaire et l'homéostasie sont établies dans l'intestin - des conditions stables et requises pour nos études.

Inoculées d'un cancer de la tête et du cou puis traitées par chimiothérapie au cisplatine, 60 souris mâles seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur attend une fonte musculaire massive, une perte de poids, de la léthargie, de l'isolement social et une agressivité accrue, et prévoit des jeûnes de seize heures ainsi qu'une contention en tube pour mesurer la composition corporelle. La mise à mort sert à prélever les muscles squelettiques et la totalité du sang. L'hypothèse testée, un effet protecteur du cannabidiol sur le muscle, repose sur des effets que le porteur décrit comme démontrés "principalement in vitro".

Objectifs

La cachexie est un syndrome caractérisé par une fonte musculaire massive, responsable de 25% des décès chez les patients atteints de cancer de la tête et du cou (CTC). Cette perte de masse musculaire est prédictive de l’incidence des complications, de l’efficacité des traitements anticancéreux, et de la survie des patients à long terme. La cachexie est également associée à une augmentation de la fatigue et de la fragilité, à une diminution de l'activité physique entraînant une perte d'autonomie et une dégradation de la qualité de vie. Dans ce contexte, le maintien de la masse musculaire chez les patients atteints de cancer est un défi majeur pour l'amélioration de la réponse aux thérapies et l'amélioration de leur qualité de vie.

Bénéfices attendus

D'après la littérature, l'utilisation du cannabidiol (CBD) semble moduler la respiration mitochondriale, ainsi que le développement et le métabolisme musculaire. Il est largement documenté que la cachexie est associée à un dysfonctionnement mitochondrial et à une atrophie musculaire. Enfin, les effets antinéoplasiques du CBD ont été démontrés dans de nombreux types de cancers, principalement in vitro. Par conséquent, nous postulons que dans notre modèle préclinique de CTC, le traitement au CBD limitera l’atrophie musculaire en favorisant le maintien d'une fonction mitochondriale optimale, et ralentira la croissance tumorale. A l’heure actuelle, les indications retenues par la Haute Autorité de Santé pour l'utilisation du CBD concernent des pathologies neurologiques infantiles et un vaste champ d’expérimentations dans la prise en charge des douleurs cancéreuses est en cours. Notre projet s’intéressera à l’utilisation de cette molécule comme adjuvant à la nutrition et aux molécules de chimiothérapie antinéoplasiques. Malheureusement, seule une partie des patients atteints d'un cancer avancé bénéficient de manière optimale de cette chimiothérapie en raison de la résistance tumorale et des effets toxiques (toxicité hématologique, toxicité du tractus gastro-intestinal, neurotoxicité). Dans le présent programme, nous souhaitons utiliser le CBD comme adjuvant dans le traitement des CTC afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints de CTC. L’apport de CBD en plus des traitements anti-cancéreux pourrait ainsi favoriser le maintien de la masse musculaire au cours de ces traitements, ce qui améliorerait leur tolérance et ainsi leur efficacité, et impacterait positivement la qualité de vie des patients. L’utilisation de CBD s’est aujourd’hui démocratisée dans le grand public et son utilisation clinique commence à se mettre en place dans le cadre de l’expérimentation du cannabis à usage médical (pilotée par l’ANSM). Certains traitements comme l’Epidyolex (CBD médical) sont disponibles, et de nombreux effets positifs du CBD sont démontrés. Ainsi, l’utilisation clinique du CBD apparait comme une approche thérapeutique adjuvante intéressante et innovante pour la prise en charge des patients atteints de CTC. Cette utilisation pourrait être facile à mettre en œuvre. Seules manquent des résultats précliniques pour organiser rapidement des études cliniques pour démontrer ces effets positifs chez l’Homme.

Procédures

Les souris incluses dans ce projet seront inoculées avec un cancer par une injection unique de cellules cancéreuses. Deux semaines après cette injection tumorale, un traitement de chimiothérapie par injection de cisplatine (une fois par semaine pendant 2 semaines), et un traitement par injection de CBD (trois fois par semaine pendant deux semaines) seront effectués. Les animaux seront soumis à différents tests permettant d'évaluer leur force musculaire et leur capacité locomotrice. A la fin de ce protocole, les animaux recevront une injection unique de traceurs isotopiques stables pour mesurer la vitesse de synthèse des protéines musculaires. Les animaux seront également soumis à des mises à jeun (de 16h) et à une contention en tube pour l'analyse de leur composition corporelle par echo MRI (imagerie par résonance magnétique nucléaire qui permet de déterminer la masse grasse, la masse maigre, l’eau libre et l’eau corporelle totale d’un petit animal).

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental consiste à induire un cancer chez l’animal. Il comprend l'injection de cellules tumorales pour induire un développement tumoral et des injections sous cutanées de cisplatine, cannabidiol et traceurs isotopiques stables. La tumorigenèse peut s'accompagner d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité accrue ou des altérations de la locomotion. Les différentes mesures de fonctionnalité musculaire, et de composition corporelle réalisées ne seront quant à elles que très peu invasives.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses sur les différents tissus prélevés qui permettront de répondre aux objectifs du projet. En effet, le prélèvement des muscles squelettiques est nécessaire pour mesurer le niveau de synthèse protéique au sein de ce tissu. De même, l'ensemble du sang des animaux doit être prélevé pour pouvoir mesurer leur statut inflammatoire et réaliser leur bilan sanguin

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacée par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, le développement de la cachexie est la résultante d’altérations métaboliques systémiques impactant de nombreux tissus et organes (muscle squelettique, foie, tissu adipeux, système immunitaire…). La complexité tumorale (mélange de cellules tumorales et immunitaires), la complexité du dialogue tumoral avec les différents tissus et la complexité du dialogue entre ces tissus eux même, ainsi que les conséquence de la croissance tumorale sur la fonctionnalité musculaire la mobilité ne peuvent être complètement reproduits in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Le nombre de souris nécessaire à l’étude est calculé pour une variation attendue de 25% du volume tumoral entre les souris porteuses de tumeur traitées au cisplatine ou au CBD et les souris porteuses de la tumeur uniquement. Ainsi, le nombre de souris nécessaire par groupe est de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaire à la réalisation de ce projet est donc de 60 souris.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Un enrichissement de l'environnement sera mis en place, correspondant en divers éléments (tubes en plexiglass, boules métalliques...). Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. L'atteinte d'un point limite grave entrainera la mise à mort de l'animal concerné . Les points limites et l’arbre de décision adapté à cette étude sont présentés en annexes.

Choix des espèces

Nous envisageons d'étudier l'impact d'une supplémentation en cannabidiol sur la mise en place de la cachexie en réponse au développement tumoral et à son traitement par chimiothérapie. Nous envisageons d'inoculer des cellules cancéreuse chez des souris pour induire un cancer qui sera ensuite traité par injection de cisplatine +/- cannabidiol. Les cellules cancéreuses utilisées dérivent de métastases pulmonaires produites chez la souris en réponse à l'implantation de carcinome épidermoïde de l'oropharynx. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique. Ce type d'expérimentation ne peut pas être menée chez l'Homme. De plus, ce protocole requière de nombreux prélèvements tissulaires dont certains sont très difficile à obtenir chez l'Homme (en particulier au niveau musculaire) et la recherche de métastases au niveau hépatique et pulmonaire. Pour réalisée ce protocole, nous utiliserons des souris mâles agées de 12 semaines. Des souris de cette âge sont couramment utilisées pour ce type d'inoculation de cancer. Nous avons choisi cet âge afin de valider que l'inoculation du cancer que nous décrivons est bien conforme à ce qui a été publié précédemment et pour faciliter la comparaison des résultats que nous obtiendrons avec ceux pré-cités.