Système musculosquelettique

84 souris mâles âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur pulmonaire par voie veineuse, une immunothérapie anti-PD1, une supplémentation nutritionnelle, et passent des tests de force et d'endurance sur dynamomètre, tapis roulant et rotarod. Le porteur indique que la pousse tumorale peut entraîner difficultés respiratoires, perte de poids, isolement et léthargie. Il affirme que la culture cellulaire ne permet pas d'aborder les relations inter-organes et conclut à la nécessité de l'animal.

Objectifs

L’immunothérapie est une stratégie thérapeutique en plein essor, notamment dans le cancer du poumon, car elle n’induit pas de toxicité secondaire comme les traitements par radiochimiothérapie. Son efficacité reste cependant à améliorer car tous les patients ne répondent pas aux traitements d’où la nécessité de travailler sur des traitements adjuvants. Nous souhaitons combiner 2 approches pour améliorer cette efficacité : - nutritionnelle : supplémentation en acides gras polyinsaturés et en béta-hydroxybutyrate - activité physique : mise en place d’enrichissement dédié à l’augmentation de l’activité physique volontaire.

Bénéfices attendus

Nous attendons à ce que nos traitements améliorent l’efficacité de l’immunothérapie. Pour voir cela, nous suivrons l’évolution du volume tumoral. Des traitements adjuvants tels qu’une supplémentation nutritionnelle ou la mise en place d’une activité physique adaptée est envisageable au cours du traitement par immunothérapie chez les patients. Il y a donc une réelle possiblité de transfert des résultats obtenus dans ce projet en clinique.

Procédures

Les supplémentations nutritionelles se feront ad libitum, par remplacement de l’eau de boisson par le béta-hydroxybutyrate et avec des croquettes pour les acides gras en débitant une semaine vant la tumorigenèse puis pendat les 30 jours du suivi tumoral. L’implantation des tumeurs sera effectuée par injection I.V dans la veine de la queue. Le suivie du volume tumoral par imagerie de biolomuminescence durera 30jours. L’administration de l’immunothérapie sera effectuée tous les 4 jours pendant les 30 jours de tumorigenèse par injection intra-péritonéale d’anicorps anti PD-1. La tumorigenèse sera suivie par imagerie avec calcul du volume tumoral sous anesthésie à l’halothane. La mesure de la synthèse protéique sera effectuée après injection sous cutané d’un traceur (isotope stable). Le test d'agrippement sera réalisé à l'aide d'un dynamomètre munie d'une grille où la souris s'accroche, le manipulateur tire alors la souris par la queue. La mesure de la vitesse maximale de course sera effectuée sur un tapis roulant, le test s'arrête quand la souris est épuisée, elle reste alors sur une grille en bout de tapis. Le test dure en moyenne une quizaine de minutes. Une habituation au tapis de course aura leiru en amont du test. Le test d'équilibre au rotarod se déroule sur un cylindre en rotation, les souris seront habituées à cette procédure en amont. Le test dure en moyenne 2-3 minutesLe passage en echoMRI implique une légère contention des animaux dans un tube placé dans l'appareil. La mesure dure 1 minute environ. Les mesures de performances physiques ainsi que l'echoMRI auront lieu juste avant l'implanttaion (J0) puis à J15 et J30 post-implantation.

Impact sur les animaux

La tumorigenèse peut s'accompager de difficultés respiratoires, d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité́ accrue ou une altération de la locomotion. Les souris seront surveillées quotidiennement pour suivre leur comportement général.

Devenir

tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour prélèvements de sang et de tissus

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas d’aborder les relations inter-organes et de mesurer simultanément la digestibilité des acides gras polyinsaturés w3 et du béta-hydroxy-butyrate, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant et enfin l’évolution du volume tumoral.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 25% pour le volume tumoral entre les souris supplémentées en acides gras ou en béta-hydroxybutyrate + activité physique et les souris nourries avec un régime standard. Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à la tumorigénèse, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 84. Pour comparer les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons une ANOVA (analyse de la variance) à 2 voies (effet régime, effet activité physique, interaction) suivie d’un test de comparaisons multiples, le test de Tukey si les conditions d’utilisation de l’ANOVA sont remplies (normalité des résidus et égalité des variances). Dans le cas contraire, le test non paramétrique de Kruskal-Wallis suivi d’un test de comparaisons multiples non paramétriques, le test de Dwass-Steel, seront réalisés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.

Choix des espèces

Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris C57BL/6 car nous allons leur injecter des cellules tumorales issues de souris C57BL/6. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique et orthotopique. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Chez l’homme, le cancer du poumon non à petites cellules est diagnotiqué à l’âge moyen de 65 ans. Nous utiliserons par conséquent des souris mâles adultes de 50 semaines.

243 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en sous-cutané un biomatériau libérant du glucose, sont suivies par imagerie sous anesthésie répétée, et 80 d'entre elles subissent une thoracotomie pour visualiser les vaisseaux, avant mise à mort à des temps échelonnés jusqu'à huit semaines. Le porteur indique que la chirurgie d'implantation peut entraîner douleur, stress et infection, et que la taille de certains implants peut gêner l'animal. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit l'environnement complexe de l'implantation et vise à terme une alternative aux autogreffes osseuses.

Objectifs

L’objectif du projet est de limiter la mort des cellules souches post-implantation dans le cas des défauts osseux dont la taille est trop importante pour permettre une réparation osseuse spontanée (défaut osseux de taille critique). Les autogreffes osseuses où le greffon est prélevé directement sur le patient sont la référence clinique. Cependant, ces greffons présentent des inconvénients tels que le recours à une deuxième chirurgie, et une quantité et qualité osseuses limitées. Une alternative développée est donc d’implanter des cellules souches dans le défaut osseux afin qu’elles induisent la formation osseuse soit en se différenciant en cellules osseuses soit en attirant les cellules osseuses environnantes. Malgré des résultats prometteurs, la réparation osseuse reste moins efficace qu’avec de l’autogreffe, à cause de la mort massive des cellules souches implantées (90%) observée lors des 15 premiers jours post-implantation. En effet, l’environnement dans lequel sont implantées les cellules souches est très peu vascularisé et caractérisé par un manque d’oxygène, de glucose et une accumulation de déchets métaboliques. Au laboratoire, nous avons démontré que le manque de glucose était le facteur responsable de cette mort cellulaire. L’objectif de ce projet est donc de limiter la mort des cellules souches transplantées afin de pouvoir augmenter leur contribution à la réparation du tissu lésé et à terme de remplacer les autogreffes. La stratégie développée par le laboratoire consiste donc à placer les cellules dans un biomatériau leur fournissant du glucose en quantité suffisante jusqu’à revascularisation du tissu. Le biomatériau comprend de l’amidon et une enzyme. Le glucose est ainsi fourni par dégradation de l’amidon sous l’action de l’enzyme. La preuve de concept de cette stratégie a déjà été établie in vitro et in vivo sur des temps courts, sans permettre cependant une survie cellulaire à long terme (28 jours). Une 2e version du biomatériau a donc été développée afin d’assurer une libération de glucose sur des temps plus longs. L’enzyme est cette fois-ci encapsulée dans des microparticules afin de ralentir sa libération et donc son effet sur l’amidon. Après une série de tests in vitro démontrant une survie des cellules souches sur du plus long terme, nous devons maintenant valider l’intérêt de cette 2e version du biomatériau sur la viabilité et fonctionnalité des cellules souches in vivo.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront dans un premier temps de tester la capacité de notre biomatériau d’assurer la survie des cellules souches transplantées dans un environnement physiologiquement pertinent et plus complexe que ce que permettent les études in vitro. Des résultats positifs permettraient de poursuivre les études en implantant cette fois-ci le biomatériau au sein d’un défaut osseux de taillle critique (chez la brebis, par exemple). L’objectif à long terme est ainsi de proposer une alternative aux greffes osseuses autologues qui présentent des limites comme le volume prélevable du greffon, sa qualité lorsqu’il s’agit de patients âgés ainsi que la nécessité d’avoir recours à un 2e site chirurgical. De plus, dans un cadre plus général d’ingénierie tissulaire ou de thérapie cellulaire, ce projet apportera une réponse au problème majeure que pose la mort massive de cellules transplantées qui sont confrontées à des conditions d’ischémie (transplantation de neurones dopaminergique pour Parkinson, transplantation de cellules souches pour les infarctus du myocarde).

Procédures

Pour tous les animaux (243 souris) : Mise en place des biomatériaux en sous cutané sous anesthésie générale et antalgie (1x, durée 20-30 min). Pour les animaux de l’étude 1 (43 souris) : Acquisition du signal fluorescent sous anesthésie générale gazeuse (8x, durée 5min, sur 4 semaines). Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l’étude 2 (100 souris) : Acquisition du signal bioluminescent sous anesthésie générale gazeuse (5x, durée 2x5min, sur 4 semaines). Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l’étude 3 (80 souris) : Infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque par thoracotomie sous anesthésie générale et antalgie (1X, durée 30 min). Pour les animaux de l’étude 4 (20 souris) : Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). .

Impact sur les animaux

La chirurgie d’implantation en sous-cutané peut entraîner de la douleur et du stress chez l’animal. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée. Enfin, la taille de certains implants peut entraîner une gêne de l’animal. Les anésthésies (gaz anesthésiant) nécessaires à l’imagerie non invasive en fluorescence et en bioluminescence vont entrainer du stress au moment de la contention et de la perte de conscience. Les animaux subiront également plusieurs injections sous-cutanées pour la gestion de la douleur, l’anesthésie et l’imagerie en bioluminescence.

Devenir

Après implantation, suivi par fluométrie ou par bioluminescence, les animaux impliqués dans les procédures 2 et 3 seront mis à mort au temps terminal prévu (4 semaines) afin de pouvoir explanter les biomatériaux et approfondir les résultats par des analyses histologiques ou histochimiques. Tous les animaux concernés par la procédure 4 seront mis à mort suivant des temps prédéfinis (1, 2, 3 et 4 semaines) afin de suivre la formation des vaisseaux sanguins au cours du temps, car la visualisation des vaisseaux sanguins par agent de contraste nécessite la mise à mort de l’animal. Les animaux de la procédure 1 non impliqués dans les procédures 2,3 et 4 seront mis à mort à 4 et 8 semaines afin de pouvoir explanter les biomatériaux et quantifier la formation osseuse par examen radiologique de l'explant.

Remplacement

L’environnement post-implantatoire choisi est un milieu très peu vascularisé et complexe dont de nombreux facteurs (pH, oxygène, osmolarité, etc.) peuvent affecter la survie et la fonctionnalité des cellules implantées. Bien que certains de ces facteurs soient bien caractérisés (oxygène) d’autres n’ont pas ou peu étaient explorés (glucose, pH, etc.). Il n’est donc pas possible à ce jour de reproduire cet environnement post-implantatoire dans des modèles in silico ou in vitro. De plus, de nombreuses intéractions cellulaires (avec les cellules vasculaires ou les cellules de l’inflammation, par exemple) et moléculaires (par sécrétion d’alarmine, d’hormones ou de facteurs de croissance) peuvent également affecter le devenir des cellules implantées. Bien que des modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des intéractions cellules-cellules, ils n’incluent que 2 ou 3 intéractions (cellules souches/macrophages, par exemple) et ne capturent pas toute la complexité moléculaire et cellulaire de l’environnement post-implantatoire. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la survie des cellules stromales mésenchymateuses en vue d’une réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, les études 1 et 2 seront des études de suivi longitudinal : les mêmes animaux seront imagés au cours du temps (et non un animal/temps). L’étude 1 permettra de sélectionner les groupes dans lesquels l’enzyme restera sur site d’implantation au moins 7 jours sans fuir hors du site. Ces groupes sélectionnés seront donc ensuite utilisés pour l’étude 2. Pour les études 3 et 4, seuls 2 profils sélectionnnés lors de l’étude 2 seront utilisés. Il s'agit du profil permettant la survie cellulaire la plus longue et du profil présentant une augmentation de la population cellulaire en début d’implantation. De plus, la comparaison avec le biomatériau de 1ère génération se fera en se basant sur les résultats historiques des études précédemment réalisées au laboratoire. En prenant en compte les variations de résultats observées dans nos études in vivo précédentes en site sous-cutané, nous affecterons 10 implants/groupe afin d’avoir un pouvoir statistique suffisant. Pour les analyses, un test statistique (test paramétrique) sera utilisé afin d'étudier l’effet de la composition des biomatériaux, l'impact de la durée d’implantation et leurs intéractions.

Raffinement

Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. La souffrance liée à l’implantation sous-cutanée sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire toutes les 12 heures pendant 24h. Un gel nutritif sera ajouté lors des 3 premiers jours post-opératoires pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation des animaux. Suite à la procédure chirurgicale, des points surveillés et scorés sur le comportement, l’aspect général (perte de poids) et les signes cliniques spécifiques à l’acte chirurgical (infection du site d'implantation) permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal deux fois par jour pendant les 3 premiers jours post-opératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. En cas de manifestations douloureuses et/ou d’inconfort l’analgésie sera augmentée ou prolongée. Si ces manifestations sont réfractaires aux soins adaptés et/ou si le score des points surveillés dépasse le seuil limite défini en amont du projet, l’animal sera retiré de l’étude. Pour les protocoles d’imagerie non invasifs, les souris seront anesthésiées par voie gazeuse puis installées dans la chambre d’imagerie pour acquérir le signal fluorescent ou bioluminescent in vivo. Lors de ces acquisitions, les souris seront maintenues sous anesthésie au masque. Un gel oculaire sera appliqué pour éviter un éventuel déssèchement occulaire.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est la souris immunodéficiente non consanguine. Le modèle souris est le mieux connu en termes de caractérisation génétique et immunologique. De plus, la fine épaisseur de la peau murine atténuant peu le signal, ce modèle permet d’utiliser des appareils d’imagerie non invasive, tel que la fluorescence ou la bioluminescence, pour un suivi longitudinal des implants. L'utilisation de souris immunodéficientes permet d’éviter une réaction immunitaire averse (rejet) lors de greffes d'origine humaine et ainsi d'évaluer le potentiel de cellules d'origine humaine. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 10 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30 g et qui permettent d'avoir un potentiel de néovascularisation et de néoformation osseuse optimal.

1 320 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'adjuvant dans les coussinets plantaires, à la base de la queue et dans les flancs, injection qui peut provoquer une douleur modérée à la marche, ainsi que des injections de toxine pertussis, des gavages et des injections intrapéritonéales, pour tester la stimulation de lymphocytes T régulateurs contre les myosites auto-immunes. Le porteur euthanasie les souris pour prélever muscles et rate. Le projet, entièrement financé par une entreprise pharmaceutique, renvoie ses retombées pour les patients au conditionnel et au futur, et le porteur affirme qu'il faut recourir à la souris parce que seule l'expérimentation animale permettrait une approche intégrée.

Objectifs

Les myosites auto-immunes sont responsables d’inflammations musculaires chroniques conduisant à une altération dégénérative des muscles. Ces maladies fortement invalidantes se caractérisent par une faiblesse musculaire symétrique, des douleurs occasionnelles pouvant entrainer de la fibrose et une atrophie des muscles des membres. Leur diagnostic repose sur la clinique et des examens complémentaires. Les traitements actuels visent à induire une rémission de la maladie en utilisant de fortes doses de corticoïdes puis à maintenir cette rémission par de faibles doses de corticoïdes en combinaison avec des immunosuppresseurs. Le but étant de restaurer une masse musculaire et des fonctions motrices normales. Malheureusement ces traitements sont souvent peu efficaces et exposent les patients à des effets indésirables fréquents et parfois graves. Il est donc nécessaire de trouver de nouveaux traitements. La stimulation d’une population cellulaire du système immunitaire, appelée lymphocytes T régulateurs représente une approche thérapeutique intéressante que nous allons tester dans ce projet. Les lymphocytes T régulateurs ont un rôle bénéfique dans les myosites en inhibant les réponses immunes et inflammatoires. L'objectif de ce projet est de proposer une nouvelle approche thérapeutique dans ces maladies consistant à stimuler spécifiquement ces cellules. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour tester l’efficacité de ce traitement. L’objectif de ce projet est donc de pouvoir proposer une nouvelle approche thérapeutique des myosites réfractaires aux traitements classiques. Du fait de la complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués dans les myosites auto-immunes, nous devons avoir recours à l'animal pour tester de nouvelles approches thérapeutiques. Il est important de rappeler ici que la plupart des avancées récentes en immunothérapie proviennent directement de données obtenues d'abord chez la souris. On voit donc l'intérêt de pouvoir tester ces approches chez la souris avant de pouvoir les appliquer à l'homme.

Bénéfices attendus

Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance du rôle des lymphocytes T régulateurs dans le contrôle des myosites auto-immunes et nous allons tester un nouveau traitement de ces maladies en stimulant ces cellules. Ce projet, entièrement financé par une entreprise pharmaceutique, pourrait se traduire par de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme dans le futur.

Procédures

On effectuera des immunisations des souris par voie sous-cutanée qui dureront moins de 30 secondes et des injections par voie intraveineuse de toxine pertussis qui dureront moins de 60 secondes. Dans les 2 cas, les animaux seront anesthésiés. On fera également des gavages et des injections par voie intrapéritonéale qui dureront moins de 30 secondes chacun par souris dont on fera une contention par le cou. On effectuera un suivi au moins 4 fois par semaine des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 30 secondes par souris. Enfin, ces souris, seront euthanasiés quand 3 à 4 semaines après le début de la procédure (compter 5 à 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Aucun phénotype dommageable n'a été rapporté ou observé au laboratoire chez les souris génétiquement modifiées qui seront utilisées dans ce projet. Les différents traitements réalisés dans ce projet n’entraineront pas d’effet indésirable en soi. Il pourrait y avoir un stress bref lors de la contention des souris par la peau du cou et lors du gavage. Pour les injections par voie intraveineuse, les animaux seront anesthésiés. Les effets indésirables attendus dérivent surtout de l’injection par voie sous-cutanée d’un adjuvant dans les coussinets plantaires, à la base de la queue et dans les flancs. L’injection de cet adjuvant peut entrainer une gêne qui sera plus ou moins forte en fonction du lieu d’injection. A la base de la queue et dans les flancs, son injection génère une induration localisée pouvant entrainer une gêne pendant quelques jours sans provoquer de douleur. Injecté dans les coussinets plantaires, l’adjuvant peut entrainer une gêne à la marche et une douleur modérée au moment où la souris pose le pied au sol. Pour limiter ce problème, l’injection ne sera effectuée que dans un seul membre postérieur. La myosite ne devrait pas entrainer d’effet indésirable notable. En effet, dans ce modèle il est décrit que les muscles ne sont que faiblement enflammés, n’entrainant pas de paralysie ou de faiblesses musculaires majeurs. Les symptômes cliniques sont absents ou très difficiles à détecter.

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (muscle, rate) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.

Remplacement

Etant donnée la complexité du développement des myosites auto-immunes, seule l'expérimentation animale permettra une approche intégrée de la compréhension des mécanismes impliqués. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des myosites auto-immunes et que nous avons développé au laboratoire des modèles de souris génétiquement modifiées uniques qui permettent de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de maladie interindividuelle entre souris, nous utiliserons des lots de 15 souris par groupe. Les expériences seront répétées 2 à 3 fois en fonction du type de question. Le nombre de souris par expérience et le nombre d’expériences ont été établis en tenant compte de l’expertise que nous avons développée depuis plus de 20 ans. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Pour objectiver au maximum l’interprétation des résultats, les expériences seront faites en aveugle, c’est-à-dire que la personne qui induira la maladie ne sera pas la même que celle qui fera l’évaluation des scores de la maladie. Ainsi, les scores seront évalués à l’aveugle, sans savoir à quel groupe la souris analysée appartient. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous prélèverons les différents muscles enflammés et la rate de chaque animal afin de collecter le plus de données possibles.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les souris seront hébergées selon les conditions de la règlementation européenne avec accès ad libitum à la nourriture et à la boisson. Le change de la litière sera réalisé 1 fois toutes les 2 semaines et les biberons chaque semaine. Les souris resteront toujours en groupes sociaux (de 2 à 5 souris) en milieu enrichi. Les animaux sont vérifiés tous les jours par le personnel du service de zootechnie. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, nous l’euthanasierons. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’Homme et les lymphocytes T régulateurs en particulier. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet de répondre aux questions posées dans ce projet. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Pour l’ensemble des expériences, celles-ci seront initiées chez des jeunes adultes de 8 à 10 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature.

108 souris, jeunes et âgées, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le muscle de leur patte est lésé par injection de venin de cobra afin d'étudier le rôle de deux protéines dans la régénération musculaire. Le porteur affirme que les injections ne provoquent pas d'effets indésirables et que les souris reprennent leur activité dès le réveil. Il indique léser les deux pattes de chaque animal pour diviser par deux le nombre de souris, et conclut que des lignées cellulaires ou modèles 3D ne reproduisent pas le muscle en régénération.

Objectifs

Des souris saines seront utilisées pour ce projet. Des études préliminaires dans le laboratoire ont montré la diminution avec l'age de protéine présente au sein du muscle et qui pourrait impacté le bon fonctionnement de la régénération musculaire. Le processus de lésion et régénération musculaire sera induit par une injection de toxine (venin de cobra). La toxine déclenche le processus de régénération musculaire sans affecter le comportement de l'animal. Cette technique permet une lésion de l'ensemble du muscle injecté de façon reproductible. L'injection de toxine sera utilisée pour suivre les différentes étapes de la régénération musculaire et voir l'effet de nos deux protéines d'intérêt sur le processus de régénération musculaire. Pour ce faire, nous allons effectuer l'extinction de ces protéines au sein des muscles de souris jeunes puis nous allons ajouter ces protéines au sein de muscles de souris agées afin d'observer si cela améliore leur régénération musculaire.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats du projet permettront de mettre en évidence le rôle de deux protéines d'interêt dans le processus de régnération musculaire dans la muscle squelettique, et cela dans le muscle jeune et plus agé. En plus d'augmenter les connaissances des mécanismes fondamentaux qui régulent la fonction des cellules qui participent à la réparation du muscle squelettique, les résultats de cette étude pourraient permettre la conception de nouvelles stratégies de médecine régénérative par la mise en évidence de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Trois injections intramusculaires dans le muscle releveur de la patte seront réalisées. Elles durent moins de 5 secondes et seront faites sur animaux anesthésiés. Deux injection d’analgésique (anti-douleur) sera également réalisée avant et après la lésion musculaire.

Impact sur les animaux

Les injections de la protéine d'intérêt n'ont pas été rapportées comme provoquant des effets indésirables chez l'animal aux doses utilisées. L'utilisation d'anesthésiques au cours des procédures de lésion musculaire et d'injection de la protéine garantit l'absence de stress chez l'animal et n'est utilisé que pendant un court temps, non nuisible pour l'animal. De plus, l'injection d'analgésique avant et après l'injection permet de réduire au maximum la douleur chez l'animal et donc le stress. Les expériences précédemment menées avec cette procédure confirment que les souris reprennent leurs activités dès le réveil et qu'elles ne montrent pas de signes de douleurs pendant les jours suivants.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et les muscles seront prélevés.

Remplacement

Les paramètres d'auto-renouvellement des cellules souches musculaires et leur potentiel de fusion avec les fibres musculaires sont essentiels pour comprendre la physiopathologie musculaire. Notre projet s'intéresse aux interactions entre les différents types cellulaires au sein du muscle en régénération, et nécessite donc des modèles murins. Ces résultats ne peuvent pas être obtenus par l'usage de lignées cellulaires, ni de modèle 3D qui ne reproduisent pas fidèlement la diversité et l'organisation des types cellulaires au sein du muscle en régénération.

Réduction

L'injection de cardiotoxine dans les deux pattes présente une nuisance supplémentaire pour les animaux mais reste tolérable et tout sera mis en œuvre pour limiter la souffrance des animaux. Cette double injection nous permettra de diviser par deux le nombre de souris nécessaire en utilisant chaque souris pour deux analyses différentes. Les expériences seront effectuées sur un lot expérimental réduit de 6 souris afin de garder suffisamment d’individus pour effectuer des analyses statistiques robustes et fiables tout en réduisant le nombre d’animaux au strict minimum. Nous utiliserons comme test statistique le test de Student pour comparer la moyenne des différentes conditions biologiques expérimentales entre elles (groupe contrôle versus traité)

Raffinement

1)L es animaux suivront une période d'acclimatation d'au moins une semaine à leur arrivée au sein de l'animalerie. 2) En plus de la surveillance quotidienne des animaux par le personnel animalier, les animaux seront observés par nos soins 2 fois par semaine. Cela va permettre de contrôler leur posture, leur mobilité, leur comportement et leur niveau d'interaction sociale, tout changement pourrait refléter une souffrance, douleur ou stress même minime chez l'animal. Les douleurs dues à la lésion musculaire et le mécanisme de régénération se mettant en place dans les premières 24h, l’animal sera particulièrement surveillé pendant cette période. L'animal sera mis à mort en cas de douleurs trop importantes pour éviter toute souffrance inutile. 3) Les animaux seront également pesés 4 jours avant l’injection de cardiotoxine puis 4 jours après afin de vérifier qu'il n'y a pas de perte de poids anormale. 4) La procédure est peu invasive (injection intramusculaire simple sans chirurgie) pour permettre d'induire le processus de régénération musculaire et l'injection des molécules. 5) Des anesthésiques (isoflurane 3-4%) et analgésiques seront utilisés au cours de la procédure afin de prévenir au maximum le stress des animaux. L'analgésique sera utilisé avant et après l'induction de la lésion musculaire et l'anesthésique au cours de l'induction de la lésion musculaire ainsi que durant les injections des molécules d'intérêt. 6) Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition : coton et cabanes. Comme la locomotion des animaux sera limitée pendant les premières 24h, des croquettes mouillées seront ajoutées au sein des cages pour leur permettre une alimentation et hydratation constante.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est extrêmement proche du tissu musculaire de l'Homme, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans son fonctionnement. La souris représente donc un modèle de choix pour l'analyse exploratoire des gènes impliqués dans la régulation du muscle. Afin d'observer si nos protéines ont un rôle dans le processus de régénération musculaire physiologique, des souris agées de 8 à 12 semaines seront utilisées afin de découvrir le rôle de nos deux protéines d'intérêt. Dans un second temps, afin d'observer si nos protéines peuvent avoir un effet sur la régénération musculaire dans un contexte de vieillissement, des experiences sur souris agées de 24 mois seront effectuées. Seules des souris mâles seront utilisées pour cette étude comme les hormones femelles peuvent impactées le processus de régénération musculaire, et que les mâles sont principalement touchés par les maladie du muscle comme la dystrophie.

405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de formulation d'ARNm puis des injections d'un substrat luminescent et des séances d'imagerie, avant d'être tuées pour mesurer l'expression de l'ARNm dans leurs organes. Le porteur revendique l'optimisation de vaccins à ARNm et la réduction de leurs coûts, et signale la douleur liée aux piqûres intramusculaires. Il affirme que les modèles cellulaires ne sont "pas prédictifs" et qu'"aucune méthode de remplacement fiable" n'est disponible.

Objectifs

Le projet a pour objectif l'augmentation de l'efficacité de la vaccination anticancer par ARNm. Les ARNm ne rentrent pas seuls dans les cellules et ont besoin d’être vectorisés pour résister aux nucléases extracellulaires. Les nanoparticules lipidiques (LNP) permettent de délivrer l’ARNm dans les cellules dendritiques pour exprimer l’antigène et induire une réponse immune. Dans le cas de la régénération osseuse, ce sont des cellules ostéoprogénitrices qui sont transfectées. Nous voulons comparer différentes formulations et différentes structures d’ARNm. Il n'existe pas de système permettant de modéliser l'interaction croisée des formulations d’ARNm de différentes structures avec l’organisme. Dans ce projet, nous cherchons à optimiser à la fois l'internalisation cellulaire des ARNm en sélectionnant différentes formules de LNP et leur traduction en protéines en sélectionnant différentes structures d'ARNm. Dans les deux cas l'objectif est de maximiser l'expression de l'ARNm thérapeutique, ce qui est quantifié dans cette demande en mesurant l'intensité du signal bioluminescent. Ces optimisations serviront aux deux applications thérapeutiques de l'équipe, la vaccination par ARN et la régénération tissulaire par ARN. Nous avons synthétisé une bibliothèque de lipides permettant de faire des LNP. Les tests sur modèles cellulaires nous ont permis de retenir 8 types de lipides pour évaluation in vivo. Cette évaluation in vivo est nécessaire car les modèles cellulaires ne sont pas prédictifs de l'activité des LNP dans un organisme. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de sélectionner pour chaque formulation la structure d’ARNm entraînant la plus forte expression in vivo après injection intramusculaire ou intraveineuse. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins chez l’homme.

Procédures

Les souris vont recevoir 1 seule injection de formulation ARNm soit en intramusculaire dans chacun des muscles des cuisses (1 injection par cuisse), soit en intraveineuse dans la queue (1 injection unique sur souris).L'injection des formulation se fait sous anesthésie gazeuse. Aucune formulation ne sera injectée dans le lot témoin. Au temps 6h, 24h, 48h et 96h au maximum après l’injection de la formulation (LNP-ARNm), les souris recevront par voie intrapéritonéale le substrat de la luciférase (4 fois au maximum durant l'étude), puis elles seront imagées en imagerie de bioluminescence.( 4 séances de 1 minute au maximum). Les souris seront anesthésiées sous isoflurane (2%) durant le rasage ( 1 fois 5 minutes) et les injections des formulations (1 fois 3 minutes maximum) mais seront vigiles durant l'injection intrapéritonéale du substrat de la luciférase.

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à une douleur suite au rasage et à l’injection des formulations mis à part la douleur induite lors de la piqure liée à l'aiguille et à l’injection de la solution en intra musculaire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort puis des prélèvements seront réalisés pour quantifier l'ARNm dans les organes où le signal a été détecté.

Remplacement

L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines structures augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible.

Réduction

L’effectif des souris mis en œuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive, le suivi longitudinal permettra de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests statistiques ANOVA.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement dès leur arrivée. Ils seront hébergés dans une animalerie confinée dans des cages de type 2 à cinq souris par cage avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum, un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Les cages contiendront un enrichissement qui sera soit un tube en carton, soit un cylindre opaque soit une petite maison transparente pour souris. Les méthodes utilisées seront mises en œuvre par du personnel formé. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive (imagerie de bioluminescence) chez la souris.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm et de régénération tissulaire. Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage de formulations et de structures ARNm. Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.

120 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque brebis subit une chirurgie osseuse sous anesthésie générale, avec création puis comblement d'un défaut osseux, avant d'être tuée pour analyser les échantillons d'os. Le porteur indique que l'intervention peut provoquer une fracture ou une inflammation prolongée avec douleur locale, la fracture déclenchant un point limite. L'objectif déclaré est de tester un biomatériau destiné à la médecine humaine et d'obtenir les autorisations de mise sur le marché, le porteur affirmant qu'il n'existe "pas d'autres méthodes" que l'animal.

Objectifs

Ce projet fait partie d’un ensemble de programme de recherche qui s’intéressent à l’ingénierie tissulaire et le développement des biomatériaux susceptibles de stimuler la formation de tissus osseux, seuls ou en association avec des cellules de moelle osseuse isolées et/ou de molécules actives. L’objectif de ce projet est de confirmer l’apport de ces biomatériaux sur la cicatrisation osseuse par l’utilisation du modèle brebis. Les résultats in vivo permettrait d’obtenir les autorisations nécessaires pour des études cliniques chez l’Homme ainsi que les autorisations de mise sur le marché (marquage CE, FDA).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de s’assurer de la tolérance et du comportement de ce biomatériau destiné in fine à un usage en médecine humaine.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. Après un période postopératoire (plus ou moins longue selon les protocoles), les animaux seront euthanasiés afin de prélever et analyser les echantillons osseux.

Impact sur les animaux

En raison de l’objectif de l’étude, les effets indésirables majeurs sont la survenue d’une fracture ou le développement d’une réaction inflammatoire prolongée au niveau des sites d’implantation pouvant générer une douleur locale et une inflammation chronique. La survenue d’une fracture constitue une atteinte immédiate des points limites. Un retentissement systémique de la réaction inflammatoire prolongée avec baisse d'activité et de l'appétit entraînant une perte de poids constitue également un des points limites lorsqu'un échec thérapeutique à l'administration d'antalgiques et de soins locaux est constaté.

Devenir

A la suite de la procédure,les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prelever et analyser les defauts osseux.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes d'étude de la tolérance de l'hôte permettant d’éviter ou de remplacer l’utilisation d’animaux pour l’approche thérapeutique abordée dans ce projet.

Réduction

Compte-tenu d’études comparables déjà publiées et des travaux précédemment réalisés sur la plateforme, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique. L’animal étant son propre témoin, cela nous permet de réduire la variabilité individuelle, d’augmenter la puissante du test statistique et de travailler sur des faibles effectifs (n=6) sans perdre la validité statistique. Réduction du nombre d'animaux par la mise en place de procédures raffinées (anesthésie, suivi et soin des animaux et prise en charge de la douleur, alimentation et enrichissement) limitant les pertes animales et l'atteinte de points critiques en cours de protocole.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont stabulés en groupe dans des conditions similaires à leur hébergement en élevage. Ils ont accès librement au foin et à l’eau (ad libitum). L’alimentation est complétée par des granulés spécifiques (Terrena, France) et par des pierres à lécher (apport en minéraux). Les animaux bénéficient d’un suivi individuel quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation : examen clinique et évaluation de la douleur/inconfort selon une grille présentée en annexe 1 : intégration dans le troupeau, comportement à l’approche de l’opérateur, appétit et rumination, vigilance, posture (debout, couchée), port de tête à l’arrêt et en déplacement, aspect et posture au niveau du dos et des membres postérieurs, confort global (sur une grille de 1 à 10). De façon générale, la gestion de la douleur per et post-opératoire est assurée par un vétérinaire qualifié qui suit les règles d’analgésie et d’antalgie en vigueur afin d’assurer un confort optimal pour l’animal. Un examen clinique sera fait quotidiennement par un vétérinaire pour déceler toute complication post-opératoire.

Choix des espèces

Le choix de la brebis est fondé sur plusieurs critères : - Animaux adultes car maturité squelettique - La taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie - Animaux faciles à gérer en stabulation - Modèles de reconstruction osseuse chez la brebis largement répandu décrit dans la littérature Animaux adultes : aspect anatomique (modèle validé)

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une myopathie métabolique, elles reçoivent des injections d'un peptide antimicrobien et développent une faiblesse musculaire progressive, avec une biopsie de la queue pour le génotypage. Les tissus sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que seuls les modèles in vivo reflètent la complexité de la maladie et annonce des expériences sur cellules pour limiter le recours à l'animal.

Objectifs

Certaines myopathies héréditaires sont causées par un déficit en une enzyme conduisant à une accumulation progressive d'un sucre et à une dégénérescence des muscles (myopathie métabolique). Le seul traitement spécifique à ces maladies est la thérapie substitutive avec l'enzyme manquante qui vise à stopper l'évolution naturelle de la maladie. Cependant, les limites de la thérapie incitent la communauté scientifique à approfondir ses recherches sur la maladie. Nous souhaitons explorer si une molécule antimicrobienne joue un rôle dans la physiopathologie de la maladie. Nos études préliminaires et la littérature montrent que cette molécule est exprimée dans le muscle sans que son rôle soit connu. Notre projet a pour but de comprendre ce rôle dans un modèle préclinique de la maladie.

Bénéfices attendus

mise en évidence du rôle thérapeutique d’une molécule antimicrobienne dans une myopathie métabolique.

Procédures

-Injections intrapéritonéales de cathélicidine (douleur de quelques secondes) -Développement de la maladie caractérisée par une faiblesse musculaire progressive sans paralysie invalidante. -Risque d'aggravtion du phénotype dans la lignée nouvellement générée. -Biopsie de queue pour génotypage.

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéales d'un peptide antimicrobien (douleur de quelques secondes) -Développement d'une myopathie caractérisée par une faiblesse musculaire progressive. Douleur légère pour la biopsie de queue.

Devenir

-Mise à mort à la fin de la procédure pour collecte des tissus post-mortem.

Remplacement

Pour étudier la physiopathologie de la maladie de Pompe, seuls les modèles in vivo sont capables de refléter la complexité de la maladie et notamment les interactions entre le systéme immunitaire et le muscle. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques. Des expériences in vitro sur des cellules primaires seront réalisées pour remplacer autant que possible les expériences in vivo.

Réduction

L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses biologiques et extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique.

Raffinement

-nombre d’individus par cage : 5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons); Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique. Concernant spécifiquement les souris présentant les symptômes de la myopathie (faiblesse musculaire) : nourriture humide (gel nutritif) en fond de cage.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Les souris C57BL/6 mutantes seront utilisées à 4, 12 et 24 semaines pour étudier les différents stades de développement de la myopathie.