Système musculosquelettique
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Thérapie pour les myopathies de type BIN1 & Dynamin 2 par ajout de tamoxifène dans l’alimentation.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des tests comportementaux répétés chaque semaine, des mesures de force musculaire sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour évaluer le tamoxifène comme traitement de myopathies congénitales. Le RNT ne précise pas lesquels de ces tests comportementaux sont pratiqués. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'évaluer la contractilité musculaire sur l'"organisme entier" et décrit une application clinique comme rapide.
Objectifs
Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques. A ce jour aucun traitement n’est disponible pour les patients atteints de ces maladies qui impactent grandement leur survie ou qui sont handicapantes au quotidien. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique d’un agent pharmacologique déjà utilisé en clinique dans d’autres maladies pour le traitement de myopathies congénitales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de fournir des informations relatives aux effets d’une molécule pharmacologique déjà approuvée et utilisée en clinique dans d’autres pathologies pour le traitement de myopathies congénitales. Ce projet permettra de proposer un traitement pouvant avoir une application en clinique rapide.
Procédures
Des tests de comportement peu invasifs seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant à partir de 3 semaines jusqu’à l’âge de 8 semaines ou 15 semaines. Chaque test sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque essai. Chaque essai durera entre 10 secondes et 5 minutes selon le test comportemental. La production de force sera mesurée sur une durée maximale de 30 minutes chez l’animal anesthésié par injection intrapéritonéale d’un anesthésique et d’un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes. Un prélèvement sanguin sera effectué sur animal vigile ou sous anesthésie légère pendant un maximum d’une minute. Un prélèvement sanguin sera effectué sur animal sous anesthésie générale sur une durée maximale de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter une perte de masse corporelle. Les animaux seront mis sous anesthésie générale par injection d’anesthésiques qui pourra provoquer une douleur ou une inflammation au point d’injection. Lors du prélèvement de sang, l’animal pourra ressentir un stress lors de la manipulation et un inconfort au niveau du point de piqure.
Devenir
Les animaux utilisés pour les tests seront euthanasiés après prélèvement des organes nécessaires pour les analyses au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Dans ce projet qui consiste à évaluer les effets d’un agent pharmacologique sur le muscle, le modèle murin est privilégié car l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer la contractilité du muscle. D’autre part, il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo les effets d’une molécule. L’évaluation des effets d’un agent pharmacologique in vivo est un prérequis indispensable avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire par groupe (i.e. 10 animaux par groupe), basé sur de précédentes études, a été déterminé à l’aide d’une analyse statistique mettant en évidence une différence phénotypique entre les animaux malades non traités et les animaux contrôles. Les tests comportementaux peu invasifs offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement en fin de traitement, ce qui permet non seulement de collecter les différents tissus sur ces mêmes animaux mais également de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. Enfin, les groupes d’animaux ne recevant pas d’agent pharmacologique serviront de groupe contrôle pour les différentes doses d’agent pharmacologique testées. Ces points sont importants car ils sont à l’origine de la réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. Les tests comportementaux seront peu invasifs et permettront un suivi longitudinal. Afin de diminuer le stress lié à ces tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide système permettant la circulation d'eau chaude et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées.
Choix des espèces
Le modèle murin est privilégié car il s’agit de l’espèce la plus proche de l’Homme physiologiquement et structurellement pour laquelle les manipulations génétiques permettent de reproduire les caractéristiques principales de la maladie étudiée. Le traitement des souris mères débutera 14 jours après la naissance des animaux ce qui permet aux animaux nés de recevoir le traitement via le lait maternel dès les premiers jours de vie, et ainsi de traiter au plus tôt la maladie qui est présente dès la naissance. Les mâles et les femelles seront utilisées car la maladie se développent indépendamment du sexe. Les tests comportementaux seront réalisés une fois par semaine sur des animaux âgés de 3 semaines jusqu’à l’âge de 8 ou 15 semaines, i.e. à partir du sevrage et pendant toute la durée du traitement.
Pré-conditionnement des cellules stromales mésenchymateuses ex vivo avec alpha-tocophérol : accélération de la régénération osseuse ?
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
133 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 28 mis à mort sans réveil comme donneurs de cellules et 105 opérés du crâne sous anesthésie en souffrance modérée. Un défaut osseux est créé chirurgicalement dans la calotte crânienne puis comblé par un biomatériau, les rats étant hébergés deux à huit semaines avant mise à mort pour analyser la régénération osseuse. Le porteur décrit une douleur post-opératoire prise en charge par analgésie et des points limites déclenchant l'euthanasie. Il affirme que ces études de reconstruction osseuse "ne peuvent être menées que sur des animaux".
Objectifs
L’objectif de cette étude est de tester l’hypothèse selon laquelle le traitement, pré-implantation, de cellules souches autologues avec une molécule nommée l’alpha-tocophérol (AT) peut améliorer leur participation au phénomène de réparation osseuse. Cette hypothèse est établie sur la base des résultats montrant que l’AT favorise la formation de cellules productrices de tissu osseux à partir de cellules souches mésenchymateuses. Ces effets sont obtenus sans effet toxique de l’AT.
Bénéfices attendus
Les précédentes expériences effectuées in vitro suggèrent que les CStroM traitées avec l’AT pourraient avoir une meilleure capacité de régénération osseuse se traduisant par une résolution des défauts plus rapide et de meilleure qualité. Dans ce cas, nous allons tester, sur un modèle animal, la preuve de principe d’une procédure thérapeutique (accélération de la régénération osseuse) innovante. La mise au point d’un essai préclinique sur grand animal est la perspective directe de ces expériences, utilisant les réactifs et consommables de grade clinique, compatibles avec une procédure ex vivo de médicament de thérapie innovante (MTI). Dans la même perspective, nous préparerons ces cellules pour le développement d’un MTI et d’un essai clinique de grade 1/2 en médecine humaine. De même, ces résultats peuvent orienter la recherche sur l’effet de l’AT ex vivo sur les cellules souches isolées à partir d’autres tissus, ce qui pourrait, à son tour, ouvrir des perspectives vers le développement d’autres MTI.
Procédures
Les animaux (rats) prévus pour ce projet seront soumis à une seule procédure chirurgicale (procédure 1, durée environ 30 minutes, 105 rats), à l'exception des rats donneurs de cellules qui seront euthanasiés pour obtenir des cellules souches mésenchymateuses (28 rats).
Impact sur les animaux
Durant ce projet, uniquement une douleur post chirurgie est attendue pour les animaux. Comme indiqué dans la suite du formulaire, l’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur et/ou par le personnel de l’animalerie. Cette estimation sera ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements [voir annexe 2 et 3]. Les critères utilisés seront ceux de Lloyd.
Devenir
Les animaux (105 rats) ayant subi l'unique procédure 1 seront hébergés entre 2 et 8 semaines puis sacrifiés pour prélever les implants et réaliser les différentes analyses ayant pour but de quantifier la régénération osseuse induites par les matériaux implantés.
Remplacement
Le processus de développement et de validation des biomatériaux utilisés pour la reconstruction osseuse nécessite des études précliniques qui ne peuvent être menées que sur des animaux et, dans le cas de ce projet, sur des rongeurs. Les études faisabilité, de fonctionnalité et de régénération osseuse chez l’animal sont indispensables pour le développement des biomatériaux. Ces tests menés chez le rongeur sont une étape nécessaire pour permetre la suite de notre projet dirigé vers la clinique. Le principe général est de créer chirurgicalement un défaut osseux dans la calvaria puis de mettre en place un biomatériau de comblement permettant de stimuler la reconstruction osseuse. Les procédures d’évaluation comprennent un suivi clinique (inflammation, douleur), ainsi qu’un suivi histologique et radiologique par microscanner, après euthanasie des animaux.
Réduction
Afin d'utiliser le moins d'animaux possibles mais également afin d’avoir un nombre suffisant d’échantillons à la fin de l’étude, tout en prenant en compte le risque de perte d’animaux, une approche statistique nous a permis d'établir que notre projet comprendra des groupes de 5 rats pour l'expérience préliminaire puis de 8 rats pour chaque condition dans les expériences suivantes. Pour l’analyse statistique, nous comparerons les résultats obtenus avec les différents échantillons.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et dans des cages avec de l'enrichissement adapté afin de leur offrir un cadre d'hébergement optimal: litière en copeaux de peupliers et des jouets. Après la chirurgie, chaque animal se réveillera dans une cage séparée pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, l’animal reviendra dans sa cage d’origine. L'anesthésie des animaux sera réalisée au masque (anesthésie gazeuse) par de l’isoflurane (4,5% pour l’induction, puis 2.5% pour le maintien). L'analgésie sera réalisée en pré oépratoire par une par une injection sous-cutanée d’un anesthésique local (lidocaïne) et par une injection sous-cutanée de buprénorphine, 30 minutes avant l'intervention, ainsi qu'une injection en post-opératoire. L'estimation de la souffrance animale sera constamment mesurée: 1/ Tout au long de l’intervention chirurgicale, les signes avant-coureurs du réveil seront surveillés et, si un de ces signes apparait, une augmentation temporaire du taux d'isoflurane à 4,5% sera réalisée. Si les signes persistent, l'animal, qui sera toujours sous anesthésie sera euthanasié par dislocation cervicale. 2/ L’estimation de la souffrance sera mesurée dans les 5 premiers jours post chirurgie concernant leurs activités et comportements. Les critères utilisés seront ceux de Lloyd et al. : le score limite est de 14 et au-delà, l’animal sera euthanasié. Toute souffrance plus modérée sera traitée par l’administration quotidienne, par voie intra-péritonéale, de buprénorphine pendant 3 jours. La persistance de douleurs entraînera l’euthanasie de l’animal. Les critères suivants seront prépondérants dans la détermination du point limite : apparence de l’animal, prise d’eau et de nourriture, signes cliniques (rythme cardiaque et respiratoire), comportement naturel et provoqué. En cas de blessures corporelles suite à un combat, l’animal sera isolé et soigné avant de retourner dans sa cage pour être surveillé en continu. En cas de problème de cicatrisation des plaies, les soins nécessaires seront effectués. Selon la gravité, la plaie sera ré-ouverte pour enlever pus ou hématomes, et un traitement antibiotique. Les animaux ayant atteint les points limites seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le défaut de calvaria chez le rongeur est un modèle largement utilisé dans notre recherche, validé dans la littérature. C'est un modèle de choix pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. Pour ce projet, nous devons nous placer dans des conditions expérimentales in vivo qui miment l’allogreffe. Nous travaillerons ainsi avec une souche allogénique de rats couramment utilisé pour ce type d’expérimentation : des rats Sprague Dawley. Nous utiliserons un modèle de rat plutôt qu'un modèle plus petit (comme la souris) car ce modèle est mieux adapté aux types de matériaux (nature et taille) et car nous avons déjà une bonne expertise de la culture des CStroM de rats qui rend ce projet réalisable sans mise au point.. Les animaux seront commandés et hébergés environ 2 semaines avant l’intervention pour permettre leur acclimatation. Nous utiliserons des animaux adultes (10 à 12 semaines pour les rats). Cela permettra d’éviter que la croissance osseuse des animaux vienne interférer avec les processus de régénération.
Caractérisation de l’effet anti-inflammatoire de la molécule TEM2085 dans deux modèles d’inflammation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une arthrite au collagène et une colite au Dextran Sodium Sulfate leur sont induites, puis des composés sont administrés par gavage répété, pour tester la molécule TEM2085 dans deux modèles de maladies inflammatoires. Le porteur indique que la douleur des deux modèles, sévère, ne peut être soulagée par aucun antalgique sans fausser les résultats, les animaux étant mis à mort pour analyses histologiques. Sur le remplacement, il affirme que cette étude in vivo est une part "impérative" du développement préclinique et conclut que le projet ne peut être remplacé par aucune alternative.
Objectifs
Dans le cadre d'un projet européén ayant pour objectif d'accélérer la mise sur le marché d'une nouvelle thérapie anti-inflammatoire, la molécule TEM2085 est apparue comme le meilleur composé sur la base de test pharmacologique in vitro et in vivo en raison de sa stabilité et de son efficacité dans le modèle de psoriasis chez la souris. L'expérimentation animale est nécessaire au développement pré-clinique de cette molécule. La présente étude est menée pour évaluer son efficacité dans le modèle d'arthrite au collagène comme modèle de polyarthrite rhumatoïde, ainsi que sur le modèle de colite au Dextran Sodium Sulfate comme modèle de rectocolite hémorragique, une maladie inflammatoire chronique de l'intestin. S'il s'avère efficace dans ces modèles, le TEM2085 pourra être développé en tant que médicament dans de multiples maladies inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu pour la société est une potentielle nouvelle solution thérapeutique pour les maladies inflammatoires chroniques comme la polyarthrite rhumatoïde ou les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. En effet, ces maladies restente encore incurables et les thérapies actuelles sont inefficaces ou le deviennent chez environ 1/3 des patients et sont associées à des effets indésirables graves. Le bénéfice pour notre structure de recherche est de comprendre comment le TEM2085, qui s'est déjà avéré efficace dans un modèle de psoriasis, agit, et si son mécanisme d'action est partagé dans l'arthrite et dans la colite. Il s'agit d'une étude préliminaire qui décidera de l'avancement de cette molécule pour des essais cliniques.
Procédures
Nuisance n°1 Induction de l'arthrite sous anesthésie générale, d'une durée de 3 min environ, temps d'induction compris, cette anesthésie est réalisée sous isoflurane. Nuisance n°2 Développement des maladies: Perte de poids et douleurs pour les animaux induits par la colite et l'arthrite. La douleur considérée comme sévère pour les deux modèles, ne peut être prise en charge pharamacologiquement car à ce jour aucune molécule antalgique n'a été identifiée comme dépourvue d'effet anti-inflammatoire. Nuisance n°3 Administration des composés pharamcologiques par gavage répétés. Le gavage d'une durée de 15 secondes par animal maximum est réalisé par du personnel expérimenté. Une habituation au gavage sera effectué au préalable avec gavage d'une solution sucrée.
Impact sur les animaux
Perte de poids et douleurs pour les animaux induits par la colite et l'arthrite. La douleur considérée comme sévère dans les deux modèles, ne peut être prise en charge pharamacologiquement car à ce jour aucune molécule antalgique n'a été identifiée comme dépourvue d'effet anti-inflammatoire.
Devenir
Des analyses histologiques sur les articulations (arthrite) ou sur l'intestin (colite) seront réalisées à l'issue des procédures expérimentales nécessitant la mise à mort des animaux.
Remplacement
La présente étude a été planifiée après une recherche documentaire approfondie et de nombreuses études in vitro. Après avoir soigneusement analysé les études thérapeutiques cruciales in-vivo, il a été observé que les modèles de souris mâles DBA/1J et de souris C57BL/6 sont les modèles de référence pour respectivement, la polyarthrite rhumatoide et la rectocolite hemorragique. De plus, compte tenu des développements déjà réalisés sur cette molécule, cette étude in-vivo est cruciale et constituera un jalon pour progresser sur l'avenir de la molécule TEM2085. Cette étude est une partie impérative du développement préclinique de la molécule. Après avoir consulté la littérature et considéré l'importance de cette étude pilote, le présent projet ne peut être remplacé par aucune autre étude alternative.
Réduction
Ce projet est planifié en gardant à l'esprit le nombre minimum d'animaux nécessaires (8 animaux par groupe) pour atteindre le niveau de signification pour chaque modèle. Le projet est divisé en trois groupes : le groupe témoin inflammatoire, le groupe traité avec le TEM2085 et le groupe traité avec le médicament approuvé par la FDA, l'upadacitinib. Pour une étude comparative, il est important d'inclure ce groupe témoin qui servira de norme pour les comparaisons nécessaires pour comprendre l'impact du médicament sur la gravité et la progression de la maladie. Le deuxième groupe est traité avec le TEM2085, cette molécule a montré des résultats positifs dans un modèle de psoriasis chez la souris, par conséquent, elle peut être une molécule thérapeutique potentielle pour la polyarthrite rhumatoide et la rectocolite hemorragique également. Par conséquent, le groupe TEM2085 est très important à inclure dans le présent projet. Le troisième groupe de l'étude est le groupe upadacitinib. Comme ce médicament est très efficace dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde et de la rectocolite hémorragique, il est important de l'utiliser comme molécule de référence. Ce groupe aidera à comprendre l'efficacité thérapeutique du TEM2085. Compte tenu de l'importance de chaque groupe dans l'étude, il n'est pas possible de réduire le nombre de groupes et d'animaux. Une analyse par test statistique pour les comparaisons entre les trois groupes sera réalisée. Sur la base des études in vitro/in vivo antérieures, la force de l’effet de TEM2085 a été évaluée et considérant une puissance de 80% et un risque alpha de 5%, un effectif de n=8 animaux/groupe d’étude devrait être suffisant pour révéler des différences significatives entre les groupes.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 4 dans des cages conventionnelles conformes pour cette espèce (directive 2010/63/EU) au sein de notre animalerie conventionnelle. L'enrichissement est apporté par des objets (tunnel, maison) dédiés à cet usage. Les injections intra-dermiques sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale. Les deux modèles sont bien connus et maîtrisés au laboratoire en termes de douleurs. Nous surveillerons quotidiennement les animaux. Les animaux seront pesés deux fois par semaine. Un changement de litière bi-hebdomadaire puis quotidien lorsque les animaux seront en phase d’arthrite sévère ou de colite sévère, l'utilisation de tunnel permettra de diminuer le stress occasionné par le changement de litière. Si des anomalies du comportement (vocalisation, pilo-erection, cachexie) ou des troubles du mouvement pouvant traduire une douleur intense et/ou une perte pondérale supérieure a 25% par rapport à J0 étaient observés, les animaux concernés seraient mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. L’apparition éventuelle d’une infection au niveau du site d'injection nous obligerait également à mettre à mort l’animal.
Choix des espèces
Les souris mâles DBA1/J ont été largement étudiées dans la littérature comme modèle expérimental de la polyarthrite rhumatoïde. L'immunisation avec le collagène de type II provoque une réponse auto-immune similaire à celle de l'homme. Les souris atteintes d'arthrite au collagène développent une synovite, des érosions du cartilage et des articulations, tout comme les humains. Ces résultats démontrent que cette espèce est le modèle de référence de l'arthrite expérimentale. Le modèle de référence pour la rectocolite hémorragique est la souris C57BL/6 induite par le DSS. Dans ce cas, 3 % de DSS sont ajoutés à l'eau de boisson des souris (J0 àJ3). À cette concentration, le DSS pénètre la membrane muqueuse de l'intestin et agit comme une toxine chimique qui endommage les cellules de l'épithélium colique. Cette lésion entraîne le développement d'un contenu intestinal pro-inflammatoire de type colite aiguë. Le modèle de souris C57BL/6 induite par le DSS a été bien établi dans la littérature pour la rectocolite hémorragique. Ces caractéristiques font de ce modèle un modèle standard et le plus pertinent pour réaliser des études précliniques in vivo. Des souris adultes mâles seront utilisées pour cette étude car totalement développées d'un point de vue immunologique et sans influence hormonale immunomodulatrice des oestrogènes.
Évaluation des effets d’une thérapie peptidique sur la régénération musculaire chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque une lésion du muscle par injection de chlorure de baryum et deux prélèvements sanguins au niveau de l'œil, une partie étant des rats porteurs d'une dystrophie musculaire proche de la maladie de Duchenne qui se dégrade jusqu'à la mise à mort. Le porteur indique administrer des analgésiques et présente la thérapie peptidique testée comme dépourvue de toxicité. Il renvoie les bénéfices pour les enfants malades au long terme et affirme que la validation à l'échelle de l'"organisme entier" ne peut se faire in vitro.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie rare qui est causée par différentes mutations qui peuvent survenir tout au long du gène de la dystrophine porté par le chromosome X. La myopathie est rapidement invalidante.notamment avec la perte de la marche à un âge médian de 10 ans. L'atteinte des muscles respiratoires et du muscle cardiaque entraine une insuffisance cardiorespiratoire fatale à l'âge médian de 20 ans. Il n'existe à ce jour aucune thérapie curative. Cependant, le traitement par les glucocorticoïdes, largement répandu chez les enfants, permet de retarder significativement la perte de la marche et le décès d'environ 2 à 8 ans, avec le désavantage de provoquer un grand nombre d’effets secondaires qui dégradent la qualité de vie des patients. L'absence de dystrophine dans les cellules cardiaques et les fibres des muscles squelettiques induit une dysfonction et une fragilité puis une rupture des membranes cellulaires, soumises à des forces d'étirement lors des cycles de contraction/relâchement. Il s'ensuit une mort des fibres musculaires à l'origine de la perte de force musculaire et une série de mécanismes secondaires délétères tels que l'inflammation chronique et la fibrose (remplacement du tissu musculaire par du tissu fibreux non contractile). Cette combinaison d’évènements empêche les cellules souches musculaires de réparer durablement le muscle.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet vise à obtenir des données robustes démontrant le bénéfice du traitement avec un peptide candidat sur les capacités régénératives du muscle compromises dans le modèle original du rat DMD. Ce peptide est un nouvel acteur dans la gestion de la progression de la DMD grâce à son nouveau mécanisme d'action. Il permet de rééquilibrer la balance vers la regénération aux dépens de l’inflammation dans les muscles atteints par la maladie. Plus particulièrement, il devrait améliorer la contribution des cellules souches du muscle à la réparation musculaire. Ce traitement devrait donc permettre de bénéficier simultanément de différentes propriétés thérapeutiques sans les effets indésirables des corticoïdes actuellement utilisés dans le traitement de la DMD pour contrer l’inflammation. En cas de bénéfice évident chez les rats, les données précliniques produites seront un argument fort pour accélérer le financement des essais cliniques chez les enfants atteints de DMD. A long terme, le bénéfice attendu est une amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des enfants atteints de DMD. La diminution de la dégénérescence musculaire, aussi bien au niveau des muscles squelettiques qu’au niveau du coeur, retarderait la progression de la maladie et pourrait même prévenir la perte de la marche et l'insuffisance respiratoire ou cardiaque fatale. Cette thérapie est conçue en particulier pour remplacer les glucocorticoïdes en récapitulant ou en augmentant leurs effets bénéfiques, tout en annulant leurs effets secondaires. Nous prévoyons également une étude comparative avec les glucocorticoides seuls ou en combinaison avec le peptide étudié afin de vérifier ses effets et de voir un potentiel effet conjugué des deux traitements. Le but est également de permettre d’obtenir un terrain favorable aux thérapies curatives ultérieures.
Procédures
Les animaux seront prélevés au sinus rétro-orbital 2 fois. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes, réalisé par une personne très expérimentée. Avant ce prélèvement, l'animal est anesthésié par voie générale et locale et reçoit en plus un traitement anti-douleur injectable. La procédure d’induction de la blessure du muscle tibial antérieur sera réalisée sous anesthésie générale et induite par l'injection intramusculaire d'un produit chimique après un traitement anti-douleur local. Cet acte nécessitera moins de 5 minutes. Les animaux seront ensuite réveillés et traités avec un anti-douleur injectable toutes les 8h pendant 2 jours au minimum et jusqu’à la mise à mort en cas de signe de douleur après ces deux jours. Il n'y a pas de chirurgie prévue.
Impact sur les animaux
La lésion musculaire induite par le chlorure de baryum provoque la mort des cellules musculaires qui entraine une sensibilité excessive d'origine inflammatoire. Nous connnaissons bien les conséquences de ce processus temporaire et avons anticipé toute forme de ressenti de la douleur par les injections de buprénorphine, très efficace par expérience sur ce type de procédure. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle à partir de l'âge de 4 semaines. La perte de masse musculaire cause une faiblesse musculaire et une difficulté croissante à se mouvoir. Le fonctionnement du cœur et du diaphragme est également progressivement altéré, ce qui conduit à une déficience cardiorespiratoire progressive. Ces défaillances combinées conduisent à la nécessité d'une mise à mort compassionnelle entre 6 et 13 mois d'âge. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie ce qui garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Les procédures de ce projet n’incluent que des animaux jeunes chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont faibles et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers. En ce qui concerne le traitement, il n'est attendu aucun effet indésirable majeur à la suite de l'injection du peptide étudié. En effet, il est reconnu que la thérapie par peptide présente l'intérêt majeur de ne pas produire de toxicité. Pour ce qui est du traitement avec le Déflazacort (anti-inflammatoire), sur la durée de traitement envisagée, nous n’attendons pas d’effet indésirable majeur mais nous serons particulièrement attentifs à la possible perte de poids observée précédemment avec d'autres molécules de la même famille.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires.
Remplacement
Le peptide extracellulaire utilisé a été identifié comme une protéine cible de médicaments dans de nombreuses maladies, en particulier dans les troubles associés à l'inflammation. Le tests in vitro ont démontré son efficacité sur la prolifération cellulaire cependant la validation à l'echelle de l'organe ou de l'organisme entier ne peuvent être reproduit in vitro. Le traitement avec une forme ameliorée de cette protéine lors d’une lésion musculaire chez la souris, favorise la guérison du tissu en induisant la prolifération des cellules souches musculaires et en mobilisant les macrophages sans accentuer dramatiquement l'inflammation. Sur la base de ces résultats préliminaires, nous souhaitons avec ce projet valider les effets d’un traitement avec ce peptide chez le rat DMD qui représente une modèle plus robuste de la dystrophie musculaire de Duchenne que le modèle souris mdx couramment utilisé.
Réduction
Le modèle de rats DMD est maintenant bien caractérisé et reproduit de façon très similaire le développement de la pathologie humaine. Les calculs de puissance statistique recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce qui a été validé avec d'autres projets terminés utilisants des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). La correction des données avant analyse statistique a été optimisée et adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. En raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wild type, WT) et DMD traités avec un placebo ou le diluant du produit à tester, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il a donc été possible ici de ne pas inclure d'animaux WT, sans perte d'information biologique de référence.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de l'homme constitue un modèle apprécié. Les outils récents d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin. Pour la procédure de lésion musculaire induite, nous utiliserons des rats sauvages de 10 semaines puisqu'il s'agit ici de tester l'effet du composé sur la régénération musculaire dans un modèle de lésion induite bien calibré dans notre laboratoire. Pours les procédures de traitement avec les corticoides seuls ou en combinaison avec le composé à tester, nous utiliserons des animaux DMD à l'âge de 10 semaines. Notre étude de caractérisation du modèle rat DMD ainsi que les résultats in vitro montrent que la fibrose musculaire (remplacement du tissu musculaire par du tissu fibreux) est significativement augmentée et quantifiable dès l’âge de 3 semaines. Le démarrage du traitement à 10 semaines permettra d’évaluer la capacité du composé testé à réduire l’endommagement musculaire et par conséquent, à différer l’installation progressive de la fibrose et ses conséquences fonctionnelles sur les muscles.
Etude préclinique de reconstruction osseuse par greffe de cellules progénitrices dérivées de la muqueuse orale en chirurgie maxillo-faciale chez le mini-porc.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
10 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées sévères. Chaque animal subit quatre interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la création de pertes osseuses de la mâchoire et une greffe de six heures, le porteur comparant la douleur attendue à celle de l'ablation des dents de sagesse chez l'humain et signalant l'impossibilité de s'alimenter pendant 48 heures après chaque opération. Les mâchoires et les plaies sont prélevées après mise à mort pour évaluation histologique. Le porteur revendique l'intérêt de la technique pour réparer les "gueules cassées" et les "accidents de la face", et affirme qu'après des tests in vitro il devient "incontournable" de passer au modèle animal.
Objectifs
Il s’agit de pouvoir réparer les lésions des os de la face et du crâne en implantant des cellules souches là où la matière manque. Pour cela, notre équipe utilise les cellules mésenchymateuses issues de la pulpe dentaire, qui ne présentent pratiquement aucun risque de rejet. En effet, les cellules de la pulpe issues des dents et celles de la plupart des os de la face et du crâne ont une origine embryologique commune, ce qui explique l’intérêt de la pulpe dentaire pour réparer les os crânio-faciaux. A terme, les applications thérapeutiques pourront concerner aussi bien les os que les cartilages ou la dentition, et ainsi bénéficier à des maladies chroniques ou rares (rachitismes génétiques, maladies des os de verre) induisant de grandes pertes osseuses… Cette technique à fort potentiel peut également inspirer des thérapies pour réparer les « gueules cassées », militaires blessés de guerre ou en OPEX, civils accidentés de la route ou des sports à risques…
Bénéfices attendus
Cette nouvelle technique de greffe et particulièrement l’utilisation de cellules dérivées de la muqueuse orale apporte une avancé considérable en chirurgie maxillo-faciale reconstructrice. La perte importante de substance osseuse très fréquente dans les différents « accidents de la face » reste un obstacle majeur lors de ces chirurgies réparatrices. Les cellules issues de la muqueuse buccale ainsi préparées et amplifiées en laboratoire permettent de disposer d’une grande quantité de « biomatériaux » greffable comme substitue osseux. Elles ont le pouvoir de se différencier en ostéoblastes et n’induisent aucun rejet par le système immunitaire. Les premiers tests effectués ont montré une parfaite reconstruction à 2 mois de la greffe. Aujourd’hui il est important de connaitre l’évolution du greffon à long terme.
Procédures
Les animaux subiront 4 interventions chirurgicales sous anesthésie générale: -Prélèvement de tissus cutanés et gingivaux. Création de défaut osseux sur la mâchoire. (4h par animal) -Greffe osseuse au niveau des défauts induits (6h par animal) -Prélèvement des plaies cutanées et gingivales en cicatrisation. (2h par animal)
Impact sur les animaux
Suite au prélèvements du tissu gingival et des plaies palatines les animaux sentiront irritation du palais et une salivation excessive. L’ablation des dents, la réalisation des défauts osseux puis celle des greffes provoqueront une inflammation et une douleur similaire à l’ablation des dents de sagesse chez un humain. Pendant 48h après chaque intervention l’alimentation sous forme de granulés sec ne sera plus possible.
Devenir
La fin de la procédure nécessitera la mis à mort de l'animal car les machoires et les plaies seront prélevées pour une evaluation histologique et protéomique.
Remplacement
De nombreux tests préliminaires in-vitro sur explant ont permis de maitriser les différents paramètres de la greffe, à savoir le support à utiliser le type cellulaire et la stratégie d’analyse des résultats. Au terme de ces tests il devient incontournable de passer sur un modèle animal afin d'évaluer l'efficacité de la greffe dans un milieu complet ou interagissent les cellules greffées et le système immunitaire du receveur. Le mini-porc Aachner présente une mâchoire adulte aux environs de 18 mois et malgré quelques différences morphologiques les caractéristiques sont très proches de l'homme de par son alimentation omnivore. Le mini-pig permet une étude à long terme sans prise de poids qui rendrait la manipulation délicate.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au maximum afin d’offrir des résultats statistiquement fiables. L’évaluation des cicatrisations cutanées gingivales et osseuses sont réalisé sur le même individu afin de diminuer d’autant le nombre d’animaux utilisés. A la fin des procédures, les animaux mis à mort seront prélevés pour l’évaluation de nos tests et les cadavres seront mis à disposition des étudiants vétérinaire pour des cours d’anatomie et d’autopsie. Plusieurs des organes comme les poumons, les reins, le cœur et la moelle osseuse seront donnés au laboratoire de recherches pour des études ex-vivo.
Raffinement
Afin d’éviter tout stress et tout inconfort des animaux, l’ensemble des procédures sera effectués sur des animaux totalement acclimatés. Un hébergement en groupes sociaux de 2 à 4 animaux, dans un milieu enrichi de jouets dédier. Une routine de soins avec un entrainement à la manipulation ce qui permettra une induction directement dans l’espace de vie sans aucune appréhension. Toutes les interventions chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale avec intubation et analgésie morphinique. Les analgésies poste opératoire seront assurées par des patch de fentanyl à diffusion constante ce qui évite tout manque d’antidouleur dans l’organisme et assure une analgésie efficace et constante. Une couverture antibiotique post opératoire évitera tout risques infectieux. Après chaque procédure les animaux auront une nourriture adaptée sous forme de pâté liquide facilitant la mastication. En plus des nombreuses visites des soigneurs en post opératoire la surveillance est renforcé par un système vidéo continu. Les points limites ont aussi bien été établis en amont de l’étude. Les animaux atteignant un des points limites seront prises en charge par le stomatologue qui procédera aux soins adaptés puis les animaux seront vu par notre vétérinaire référent avant d’être envoyé vers un refuge adapté.
Choix des espèces
De nombreux tests préliminaires in-vitro sur explant ont permis de maitriser les différents paramètres de la greffe, à savoir le support à utiliser le type cellulaire et la stratégie d’analyse des résultats. Au terme de ces tests il devient incontournable de passer sur un modèle animal afin d'evaluer l'efficacité de la greffe dans un milieux complet ou inter-agissent les cellules gréffée et le systême immunitaire du receveur. Le mini-porc Aachner présente une machoire adulte au environs de 18 mois et malgrè des différences morphologiques des caractéristique très proches de l'homme de par son alimentation omnivore. les animaux seront agés de 15 à 20 mois qui correspond à l'age adulte et permet d'avoir des animaux avec une dentition définitive.
Effet de l’âge et du poids sur les capacités myogéniques des cellules souches myogéniques de truites arc en ciel
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
300 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 250 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont d'abord soumises à une restriction alimentaire, nourries deux jours par semaine seulement, puis servent à prélever ou recevoir par injection des cellules souches musculaires avant d'être tuées trois semaines plus tard. Le porteur indique que ce jeûne provoque une sensation de faim modérée jusqu'à cinq jours par semaine. Il présente d'abord un objectif agronomique, maîtriser la croissance du muscle de truite d'élevage, avant d'évoquer au conditionnel des pistes contre des maladies musculaires humaines.
Objectifs
La croissance musculaire nécessite l'activation et la différenciation des cellules souches musculaires aussi appelées cellules satellites. Chez les poissons, la croissance musculaire est continue tout au long de la vie de l’animal mais la formation de nouvelles fibres (hyperplasie) diminue avec l’âge et(ou) le poids, et les mécanismes cellulaires sous-jacents ne sont pas encore connus. Nous avons mis en place un protocole d'extraction de cellules souches de muscle de truite et de transplantation dans le muscle de ces cellules. Nos premiers résultats montrent que les capacités des cellules souches et de leur niche diminuent rapidement pour atteindre un minimum dès 500g. Notre objectif est de déterminer si cette diminution des capacités myogéniques est due à l’âge des animaux ou au poids.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de déterminer si la baisse de capacité myogénique de la niche et des cellules souches est due à l’âge ou bien au poids des animaux. Cette question qui existe également chez les mammifères, ne peut être résolue que grâce à l’utilisation de poissons avec une croissance continue et une très forte plasticité de croissance comme la truite. Cette connaissance devrait permettre d’améliorer les pratiques zootechniques afin de maîtriser plus finement la croissance musculaire et les caractéristiques du muscle de truite. Au-delà de ces aspects agronomiques, une meilleure compréhension des impacts de l’âge et du poids sur les capacités myogéniques, pourrait fournir de nouvelles pistes dans le traitement de certaines pathologies d’atrophie musculaires telles que la cachexie, sarcopénie ou l’amyotrophie.
Procédures
Les animaux seront soumis à une restriction alimentaire afin de ralentir leur croissance, puis ils seront utilisés pour extraire les cellules souches musculaires ou être transplantés avec des cellules souches musculaires. Nous utiliserons 250 poissons dans la première procédure (restriction) et 60 poissons dans la deuxième (transplantation). Les animaux seront mises à mort 3 semaine après la transplantation.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être nourris uniquement 2 jours par semaine (lundi et jeudi) ce qui pourrait engendrer une sensation modérée de faim pendant au maximum 5 jours par semaine. Pour les animaux qui vont être transplantés, ils pourraient ressentir une légère douleur suite à la piqure par une aiguille pendant quelques secondes.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mises à mort par une personne compétente désignée par les responsables de projet. Les responsables du bien-être des animaux sont bien sûr informés.
Remplacement
Les objectifs du projet étant de déterminer l’impact de l’âge et du poids sur les capacités myogéniques du muscle, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.
Réduction
Pour soumettre le minimum d’animaux à la restriction alimentaire modérée, nous allons utiliser des bacs de petite taille afin de maintenir une densité optimale avec 125 poissons/bac au maximum. Nous avons réduit le nombre d’animaux transplantés à 60, car cela correspond à 10 animaux par point ce qui est suffisant pour atteindre les objectifs scientifiques de l’étude et détecter des différences de capacités myogéniques
Raffinement
Pour limiter au maximum la blessure lors de la transplantation intramusculaire, nous utiliserons des aiguilles avec un faible diamètre (0,45mm). Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, enrichissement). Pendant la procédure de transplantation, les animaux seront anesthésiés, leur manipulation sera réduite au maximum et une surveillance du comportement des animaux sera effectuée. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). C’est une des rares espèces qui permet de tester séparément l’effet de l’âge et du poids compte tenu de sa croissance continue et de sa très grande plasticité de croissance. De plus, nous disposons d'une lignée de truites transgéniques mlc2-GFP qui expriment la GFP dans les cellules souches musculaires. Cette espèce n'est pas incluse dans la liste des espèces identifiées comme devant provenir d’élevage ou de fournisseurs agréés. Nous allons utiliser des poissons de 10g et 1kg. Une expérience préliminaire, nous a montré que les capacités myogéniques des cellules souches et de la niche diminuaient rapidement dès 100g et atteignaient un minimum autour de 500g. Ainsi pour maximiser nos chances d'observer une différence de capacité de myogénique nous allons utiliser des animaux de 10g (~5 et 14 mois) et de 1kg (14 mois).
Caractérisation mécanique et histologique du muscle squelettique immobilisé chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
28 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On immobilise une patte avant de vingt d'entre eux dans un gilet pendant sept à quatorze jours, avec des tests de motricité et des échographies sous anesthésie, pour mesurer comment le muscle se raidit après une immobilisation de type post-AVC. Le porteur indique que le gilet entrave le toilettage et gêne l'accès à la nourriture, et qu'une perte de plus de 20 % du poids entraîne la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico n'existe et conclut que les rats sont "essentiels".
Objectifs
L’immobilisation du muscle squelettique en position courte à la suite d’un AVC est la facteur qui entraine le plus de dommages et provoque l’atrophie du tissu contractile, l’épaississement du tissu conjonctif et une altération du comportement mécanique passif avec une augmentation de la raideur du muscle squelettique. C’est dans ce contexte que ce projet vise à mesurer l’évolution des propriétés mécaniques et structurelles du muscle squelettique, au fil du temps, à la suite d'une immobilisation chez le rat.
Bénéfices attendus
In fine, ce projet permettra d’apporter des informations sur l’évolution des propriétés du muscle squelettique après une immobilisation post-AVC aux personnels soignants et ainsi de donner une possibilité d’amélioration de la prise en charge des patients.
Procédures
La première étape du protocole consiste à mesurer le niveau d’asymétrie des deux pattes avant à travers un test de motricité indolore. La seconde étape consiste à mesurer la rigidité du muscle squelettique à l’aide d’un échographe, sous anesthésie gazeuse, pendant 20 minutes. Toujours sous anesthésie, les pattes avant gauche des rats des groupes « immobilisation pendant 7 et 14 jours » (20 au total) sont ensuite immobilisées à l’aide d’un gilet confectionné à partir des bandes auto-adhésives et de bandes velcro. Les animaux seront sous surveillance lors de leur réveil et la tenue du gilet d’immobilisation ainsi que leur état de santé seront surveillés tous les jours (prise/perte de poids, état général). Les tests de motricité (d'une durée de 2 minutes) et les mesures par imagerie échographique seront effectuées à Jour 0, Jour 7 et Jour 14.
Impact sur les animaux
L'immobilisation de la patte avant entrave le toilettage normal de l'animal. Ceux-ci seront brossés et nettoyés deux fois par jours avec une lingette humide. De plus, des difficultés à se déplacer et à se nourrir pourraient intervenir. Par conséquent, une gamelle de granulés humidifiés ou des gels nutritifs pourront être déposés quotidiennement au sol de sorte que les animaux puissent se nourrir plus facilement, si ils n'arrivent pas à atteindre les granulés des mangeoires.
Devenir
Tous les animaux du projet sont mis à mort afin de prélever les muscles des pattes avant. Ces muscles seront soumis à des tests mécaniques in vitro permettant de déterminer l'évolution de leurs propriétés mécaniques après 7 et 14 jours d'immobilisation. Des coupes histologiques seront par la suite réalisées pour évaluer la quantité de tissu conjonctif, la taille des fibres musculaires et, entre autres, le type de fibre.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l’évolution des propriétés mécaniques et structurelles du muscle squelettique immobilisé. Les modèles animaux sont donc essentiels et ne peuvent donc être remplacés.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin de garantir une quantité suffisante de matériel biologique pour les analyses post-mortem, tout en tenant compte de la variabilité individuelle observées dans d’autres études. De plus, le protocole d’immobilisation a été adapté pour assurer son efficacité sur le plus grand nombre d’animaux possible.
Raffinement
Il existe un moyen d'immobilisation plus rapide à mettre en place et moins encombrant pour l'animal. En effet, les bandes auto-cohésives couplées à des bandes de velcro permettront d'immobiliser la patte de l'animal tout en étant plus souple et plus léger que le plâtre. L'ajout de velcro permettra de protéger temporairement les bandes cohésives du grignotage par les congénères. Les bandes de velcro pourront être remplacées si besoin. Ce dispositif permettra aussi de maintenir les animaux par groupe et non plus individuellement comme c'est le cas pour le plâtre. Un surplus d'enrichissement à ronger sera ajouter dans chaque cage et la nourriture sera humidifiée et déposée dans une gamelle afin d'aider les animaux à se nourrir plus facilement. L'immobilisation et les échographies seront effectuées sous anesthésie gazeuse et les animaux seront positionnés sur un plateau chauffant à 37±0.5°C afin d'éviter une hypothermie. Si les animaux présentent des signes de douleurs, celles-ci seront prises en charge par des analgésiques. Si les animaux perdent moins de 20% de leur masse initiale, des aliments appétents seront distribués. En revanche, si la perte de masse est supérieure à 20%, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle de rat est approprié à notre étude pour plusieurs raisons: - Il partage de nombreuses similitudes anatomiques, physiologiques et génétiques avec les êtres humains, notamment sur l'aspect des propriétés biomécaniques du muscle squelettique. - Sa petite taille permet de mesurer facilement les paramètres physiologiques (notamment moteurs) et dans le cas de notre étude d'immobiliser facilement un membre. - Il y a une bonne homogénéité entre les différentes souches de rats et donc la possibilité de comparer les résultats collectés à ceux d'autres études - Les dimensions limites pour réaliser les tests de traction-relaxation font que le modèle de rat permet de tester mécaniquement plus de muscle que le modèle de souris. - Il est souvent utilisé dans des études sur les effets de l'immobilisation du muscle squelettique. Des jeune adultes de 10 semaines sont choisis pour ce projet. Leur prise massique est réduite de l’ordre de 15% de prise de masse en 14 jours, ce qui permet de réaliser le protocole d’immobilisation sans avoir à modifier les gilets d’immobilisation à plusieurs reprises.
Etude de souris avec déficits partiels de l’hydrolyse de l’acétylcholine
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Aucun geste expérimental ne leur est infligé, la souffrance provenant des modifications génétiques elles-mêmes, qui produisent un retard de croissance, un nanisme et des faiblesses musculaires, certaines souris ne survivant pas au sevrage. Le projet étudie deux enzymes qui dégradent un neuromédiateur, avec pour horizon les inhibiteurs médicaux et les gaz neurotoxiques. Sur le remplacement, le porteur affirme que la fatigabilité musculaire et la communication entre organes ne peuvent être reproduites en culture cellulaire.
Objectifs
L’acétylcholine est une molécule de communication locale entre neurones (neuromédiateur) mais aussi une molécule de communication à l’extérieur du système nerveux. Nous cherchons à comprendre les fonctions de deux cholinestérases qui détruisent très efficacement l’acétylcholine. Dans les jonctions neuromusculaires, ces deux enzymes sont localisées dans des domaines différents et contrôlent la fatigabilité des souris. Nous utilisons des approches génétiques sophistiquées pour établir une nouvelle voie de signalisation contrôlée par ces enzymes dans cette synapse et montrer son importance dans la fatigabilité. Au niveau de l’animal entier, ces deux cholinestérases jouent des rôles complémentaires probablement pour maintenir les réseaux de communications par l’acétylcholine relativement indépendants. Nous utilisons des approches génétiques sophistiquées pour établir que les muscles pourraient être une source d’acétylcholine qui interfère avec des fonctions physiologiques autres que la motricité.
Bénéfices attendus
Les inhibiteurs de cholinestérases sont largement utilisés (Alzheimer, myasthénie, anesthésie, syndrome du golfe) et provoquent beaucoup d’effets indésirables. Des pesticides et des armes de destruction massive (gaz neurotoxiques sarin VX novitchok) sont aussi des inhibiteurs de cholinestérases et sont extrêmement toxiques. En comprenant les fonctions respectives des deux cholinestérases dans le contrôle du niveau d’acétylcholine dans les systèmes nerveux et en dehors des systèmes nerveux, nous devrions pouvoir 1) sélectionner de nouveaux inhibiteurs pour le traitement des maladies neuromusculaires ou pour les anesthésies; 2) proposer de nouvelles prises en charge des intoxications par des pesticides ou des gaz neurotoxiques.
Procédures
Aucune. Les animaux présentent des altérations fonctionnelles d'origines génétiques.
Impact sur les animaux
Les résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire ainsi que sur les lignées transgéniques publiées ont montré que les nuisances pour les souris sont variables en fonction des génotypes mais concernent principalement un retard staturo-pondéral et des faiblesses musculaires. Nous anticipons qu’une partie des lignées aura un développement incomplet jusqu’à l’âge adulte. Ces phénotypes ont été observés avec des souris sans la protéine AChE ou souris sans les protéines AChE et BChE. Les souriceaux de ces lignées seront étudiés dans la période périnatale (P0-P1) et en fin de développement embryonnaire. Certaines souris ne survivent pas après le sevrage et seront étudiés à P13-P15. L’autre partie de lignées développées pourront développer des atteintes du fonctionnement de la communication neuromusculaire mais peuvent se développer jusqu’à l’âge adulte. Elles sont actives, se nourrissent dans la mangeoire. La respiration basale s’est adaptée et les souris vivent plus d’un an. Ces souris présentent une fatigabilité notable, une faiblesse musculaire qui ne permet pas à la souris de rester accrocher à une barre. Elles sont plus petites à partir de 7-8 jours de développement post-natal et ce nanisme persiste à l’état adulte. Les mécanismes impliqués sont probablement nombreux (thermorégulation, métabolisme, digestion, circulation).
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort afin de procéder à des analyses histologiques
Remplacement
Objectif 1 La fatigabilité est une notion qu’il est difficile d’explorer ex-vivo car les stimulations nerveuses utilisées ex-vivo pour contracter un muscle ne reproduisent pas le profil d’activations utilisé dans la réalisation de ses mouvements. La fatigabilité n’est pas simplement liée à la force maximale développée par un muscle. Objectif 2 Le retard de croissance dans les différents mutants de souris résulte probablement d’une communication entre organes, l’ACh qui s’échappe des muscles, interfère avec des communications médiées par l’ACh entre les cellules variées dans d’autres organes. Cette communication ne peut pas être reproduite en culture cellulaire ou organoïde. La modélisation est impossible en absence de connaissance 1) du niveau de la fuite potentielle d’ACh à partir des muscles (hypothèse), 2) des cibles possibles : cardiorespiratoires, vasculaire, digestives, inflammatoires ; 3) des conséquences sur le métabolisme ; de la dynamique de l’ACh dans le milieu intérieur.
Réduction
Les études sur l’ACh sont conduites jusqu’à présent en utilisant des inhibiteurs des cholinestérases, ces approches nécessitent l’utilisation de différentes doses d’inhibiteurs et donc de nombreuses cohortes d’animaux. Les interprétations sont difficiles car les inhibiteurs peuvent avoir d’autres cibles que les enzymes visées. Nous développons ici des approches génétiques pour utiliser moins d’animaux. Pour l’objectif 1, chaque souris est son propre contrôle. Le suivi longitudinal des souris dans leur cage d’élevage limite le nombre d’animaux. Pour l’objectif 2, une approche systématique permettait de produire 48 génotypes, nous proposons de produire une moitié de ces génotypes (24), et les avons soigneusement choisis afin qu’ils soient pleinement exploités pour valider notre hypothèse.
Raffinement
Pour étudier spécifiquement les questions liées aux conséquences de l’ACh endogène, nous avons développé des approches génétiques sophistiquées, mutations ponctuelles dans une sélection de gène qui abolissent la fonction hydrolyse d’ACh et pas d’autres propriétés du gène AChE, délétion de courte séquence dans le génome pour limiter les modifications chromosomiques. Nous avons aussi sélectionné des lignées parmi toutes les combinaisons alléliques possibles, pour lesquelles le retard de croissance devrait être visible de façon précoce et touchera tous les animaux nés. Nous utilisons des conditions propices à l’élevage des souris. Les croisements sont conduits avec un mâle et une femelle en élevage continu.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui permet d’aborder la dynamique de l’ACh dans l’organisme, 1) L’ACh est le neuromédiateur des muscles chez la souris comme chez l’homme (une source majeure d’ACh); 2) il est possible de créer des modèles génétiques afin de modifier précisément la fonction, la production ou la localisation des enzymes de dégradation de l’ACh. Objectif 1 Souris adultes âgées de 2 à 9 mois. Objectif 2 Jeunes à P0et à P13.
Méthotrexate pour le traitement de l’arthropathie hémophilique dans un modèle murin d’hémophilie B – Projet Multi-établissement EU 2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
21 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va du léger au sévère. L'arthropathie est provoquée par trois ponctions du genou, puis les souris reçoivent des traitements pendant six semaines, subissent une IRM des genoux de deux heures sous anesthésie et des prises de sang, avant d'être tuées et disséquées. Le porteur justifie la mise à mort par un prélèvement d'un millilitre de sang "non compatible avec le maintien en vie". Il fonde le recours à l'animal sur le "besoin d'un modèle vivant" et présente la souris comme un modèle "éprouvé et fiable".
Objectifs
L’hémophilie B est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur IX (FIX) et dont la sévérité est définie par la quantité de FIX restant dans le sang. La forme la plus sévère, où le taux de FIX est in détectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Ces saignements spontanés peuvent se répétés au niveau des articulations et conduire à la présence de sang dans le liquide articulaire, induisant une inflammation et une dégradation de l’articulation qui est handicapante pour le patient. Cette atteinte répétée porte le nom d’arthropathie hémophilique (AH) et est une complication grave de la maladie. L'AH partage certaines caractéristiques avec d’autres maladies articulaires telles que la polyarthrite rhumatoïde (PR) dont une inflammation importante au stade précoce de la maladie. A ce jour, le traitement de l’hémophilie comprend des injections de facteur manquant pour éviter tous saignements donc ceux responsables de l'arthropathie. Cependant, aucun traitement actuellement disponible ne cible spécifiquement l’inflammation articulaire qui apparait au stade précoce de l’AH. Dans le cadre du traitement de la PR, le méthotrexate est largement utilisé en tant que médicament de première intention. Le méthotrexate est un médicament visant à contrôler l’inflammation qui à montrer 34% de rémission et 50% d’amélioration de la PR dans des études conduites chez des patients atteints de PR. Nous avons fait l’hypothèse que le méthotrexate pourrait réduire l’inflammation de l’articulation chez les hémophiles et empêcher l’évolution de cette arthropathie handicapante, comme il fait dans la PR. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’efficacité du méthotrexate pour traiter l’AH et de bloquer ainsi l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B. l'étude s'effectue dans deux animalerie distincxtes avec : l'induction de la maladie et le traitement qui se font à l'UE1 (animalerie 1) et l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qui se font à l'UE2 (animalerie 2).
Bénéfices attendus
La comparaison entre le traitement habituel par facteur de coagulation et le méthotrexate, va permettre d’évaluer l’efficacité potentielle de ce médicament dans le contexte d’arthropathie hémophilique. le méthotrexate est un médicament couramment utilisée dans la polyarthrite rhumatoïde dont les dégâts articulaires sont similaires à ceux causés par l’hémophilie. Si les résultats de l’étude montre une efficacité suffisante du méthtrexate dans l’arthropathie hémophilique, une étude clinique pourra alors être proposée pour évaluer l’efficacité du méthotrexate chez des patients hémophiles.
Procédures
Au sein de l'UE1 Au sein de l'UE1, l’arthropathie hémophilique est induite chez des souris hémophiles B par 3 ponctions articulaire (J1, J15 et J30) avec une surveillance et mesure du diamètre du genou les 15 premiers jours. Par la suite, le premier groupe reçois un traitement anti-hémophilique de référence tous les 4 jours et ce durant 6 semaines. Le deuxième groupe reçois également le traitement anti-hémophilique de référence (même durée et fréquence) mais également un traitement de référence utilisé dans la polyarthrite rhumatoïde une fois par semaine. Une prise de sang est réalisée à J0, J15 et J30 pour surveiller la possible toxicité du traitement de référence utilisé dans la polyarthrite rhumatoïde. Après 6 semaines de traitement, les souris sont transférées à l'EU2 où elles bénéficieront d’une IRM des genoux pour évaluer l’atteinte articulaire. Ensuite, une prise de sang sera réalisée pour la mesure des marqueurs inflammatoires ainsi que les marqueurs d’atteinte cartilagineuse et osseuse. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale après administration d’un médicament anti-douleur. Les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrière seront disséquées pour l’étude histologique à la recherche d’une inflammation articulaire. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min) (UE1), une prise de sang (1 min) (UE1), la mesure du genou (30 sec) (UE1), une injection seule ou double (1-2 min)(UE1), une IRM du genou (120 min)(UE2), un prélèvement total de sang et mise à mise à mort (3-5 min)(UE2).
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaire handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments anti-hémophiliques et d’étudier l’arthropathie hémophilique. L’absence des facteurs anti-hémophiliques murins analogues à nos facteurs anti-hémophiliques est un prérequis pour l’induction de l’hémarthrose et pour la mesure de l’activité des molécules prophylactiques testées. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette altération génétique, n’est pas victime de saignement spontané et tout saignement provoqué sur la souris hémophile est résolutif sans prise en charge particulière. Souris matures (8-9 semaines) de 25-30g. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car les cartilages sont en cours de maturation durant la croissance et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible des taux de certains facteurs de coagulation avec l’âge, comme le fibrinogène, facteur Willebrand et le FVIII qui peuvent modifier la capacité hémostatique globale du modèle et par conséquent la tendance hémorragique.
Étude fonctionnelle des gènes d’une famille de facteurs de transcription chez le poissons-zèbre pour l’étiopathogénie de la scoliose idiopathique-EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
780 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Trois lignées mutantes sont créées par inactivation de gènes, avec un prélèvement de nageoire caudale sous anesthésie et des imageries au micro-scanner à huit, douze et seize semaines, pour chercher si ces mutations reproduisent une scoliose. Le porteur annonce comme phénotype attendu une possible déformation de la colonne sans empêcher la nage ni l'alimentation, et euthanasie les poissons présentant des anomalies handicapantes. Il retient le poisson zèbre pour sa colonne longitudinale autorisant une torsion axiale, absente chez les modèles quadrupèdes.
Objectifs
La scoliose, dite idiopathique, qui touche près de 3 pourcents des sujets selon les régions géographiques, comporte une composante génétique. Cependant, les modalités exactes de transmission ne sont pas clairement établies. L’hypothèse sous-tenant le projet « scoliose et génétique » est que s’il existe des gènes de prédisposition à la scoliose « idiopathique », une analyse génétique poussée de familles scoliotiques présélectionnées par leur arbre généalogique permettra de détecter de nouvelles mutations spécifiquement associées à la pathologie par comparaison entre patients atteints et apparentés « sains ». Cette analyse a permis de découvrir une mutation d’un gène codant une protéine impliquée dans la transcription de l’ADN chez plusieurs personnes atteintes de scoliose idiopathique dans deux familles indépendantes. Chez le poisson-zèbre, il existe trois gènes qui pourraient être l’homologue de ce gène chez l’homme. Nous allons donc inactiver ces trois gènes indépendamment afin de générer trois lignées de mutants poissons-zèbres. Les mutants poissons-zèbres ainsi générés seront par la suite analysés cliniquement par l’imagerie afin de vérifier l’absence ou la présence de scoliose chez ces animaux. De ce fait, nous souhaitons utiliser le poisson-zèbre comme modèle animal pour étudier le rôle fonctionnel de cette protéine, et son implication dans la physiopathologie de la scoliose idiopathique. (ce projet se fera dans 2 établissements utilisateurs)
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est la validation du gène exploré dans la genèse de la scoliose idiopathique. Cette hypothèse serait renforcée par le développement de scolioses chez les mutants ainsi créés. La validation de ce variant permettrait d’avancer dans la compréhension de la genèse des scolioses idiopathiques (physiopathologie) et éventuellement à long terme d’avancer dans la prédiction de progression des courbures scoliotiques découvertes. En effet, la progression de l’identification des mécanismes génétiques causaux à la scoliose dite « idiopathique » permettrait de pouvoir proposer aux patients chez qui une scoliose est découverte un séquençage génomique précoce de manière à avoir une meilleure connaissance du risque et donc d’adapter le traitement des patients (agressivité du traitement orthopédique par corset, nécessité de chirurgie correctrice).
Procédures
EU1 : Afin d’identifier le type de mutation porté par les poissons, un prélèvement du tissu de la nageoire caudale sera réalisé sous anesthésie générale afin de minimiser la souffrance des animaux. Un seul prélèvement de quelques millimètre sera effectué par animal, la manipulation dure 1-2 minutes. Cette intervention n’entraîne pas de séquelles impactant la nage ou les capacités d’alimentation. EU2 : Les animaux seront transportés de l’animalerie (UE1) jusqu’au laboratoire d’imagerie (EU2) pour la réalisation d’une imagerie micro-scanner à 8,12 et 16 semaines de vie. La durée est de 30 minutes maximum par trajet. L’analyse par imagerie micro-scanner, anesthésie incluse aura une durée totale de 3 à 4 minutes. Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Concernant la création d’une lignée mutante, le phénotype (Ensemble des caractères apparents d'un individu) attendu causerait éventuellement une déformation de la colonne vertébrale, il ne devrait pas y avoir d’impact majeur sur la capacité des poissons à se mouvoir ou à s’alimenter (classe légère). L’inactivation d’un gène codant pour une protéine qui est impliquée dans la synthèse des neurotransmetteurs pourrait entrainer des modifications de la physiologie des animaux et potentiellement affecter leur croissance et leur capacité à se reproduire, sans pour autant les empêcher de se nourrir ou de se déplacer, bien qu’ils puissent être de taille plus petite ou avoir un axe corporel incurvé ou déformé. L’effet indésirable prévu chez les animaux suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale pour identification génétique est une petite plaie de quelques millimètres suivie ensuite d’un processus cicatriciel, indolore et capable de se regénérer en quelques jours. Le transport jusqu’au lieu du scanner ainsi que la réalisation des imageries peuvent être source de stress ou d’angoisse pour les poissons. Le protocole d’imagerie sera réalisé sous anesthésie générale afin de maintenir les poissons immobiles, ce qui peut entrainer un risque anesthésique. Les animaux sont placés en quarantaine jusqu’à la fin du protocole d’imagerie puis euthanasiés afin d’éviter toute contamination par d’éventuels pathogènes de l’aquarium principal.
Devenir
Nous générons au total 780 animaux, 180 animaux porteurs d’une mutation des gènes cibles seront conservés à l’animalerie. Les autres animaux (soit 600 animaux) seront euthanasiés une fois la génération d’une lignée de mutation de troisième génération, stable sur le plan génétique soit établie. Ces 180 animaux seront euthanasiés après la procédure d’imagerie micro-scanner, un retour de quarantaine au système principal de l'animalerie étant impossible par sécurité sanitaire.
Remplacement
Les études sur lignées cellulaires ne permettent pas d’analyser la colonne vertébrale en entier et de suivre l’apparition de scolioses. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les poissons-zèbres, du fait de leur forme longitudinale, permettant une torsion axiale de la colonne (contrairement aux quadrupèdes par exemple) sont un modèle de choix pour l’étude des scolioses.
Réduction
Les expériences sont réalisées sur des poissons juvéniles puis adultes. Nous limitons le nombre minimal au maintien d’une lignée, dont 20 poissons par aquarium. Nous avons besoin de 3 générations de 260 individus pour chaque lignée soit au total 780 individus. La population adulte de poissons utilisée pour produire les embryons est ainsi restreinte pour limiter le nombre d’animaux mais suffisamment développée pour assurer des conditions de reproduction efficaces pour les études envisagées. Concernant la réalisation des scanners : Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses, soit 120 poissons mutants et 60 contrôles sauvages.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des animaux, nous nous appliquerons à réduire la souffrance, la douleur et l’angoisse. L’alimentation sera composée d’aliments secs et de proies vivantes adaptés au stade développemental des poissons-zèbre afin de leur permettre d’exprimer leur comportement naturel de prédateur. Les animaux ne seront jamais hébergés seuls. Dans le cas de l’identification d’un poisson-zèbre exprimant notre mutation d’intérêt, alors nous mettrons en place un enrichissement social en introduisant dans l’aquarium d’autres congénères. Les poissons présentant des anomalies qui les empêcheraient d'appréhender leur milieu normalement seront euthanasiés. De même pour préserver l'ensemble des poissons hébergés et le maintien d'un certain statut sanitaire, une limite d'âge de 18 mois est appliqué pour éviter la propagation d’infections par des animaux vieillissants. Les manipulations nécessitant une immobilisation et les prélèvements de nageoire caudal, seront conduites sur animaux anesthésiés. Nous surveillerons les animaux après le prélèvement de la nageoire caudale pour vérifier qu’il n’y ait pas de saignement et que dans les jours qui suivent la régénération de la plaie se met en place. Dans chaque cas, nous suivrons les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience ou à une euthanasie (présence de points limites).
Choix des espèces
Le modèle poisson-zèbre partage 71pourcents de son génome avec celui de l’homme et celui-ci est facilement modifiable par des techniques de biologie moléculaire. De plus, son élevage et sa reproduction sont rapides et aisés. Dans le cas de notre étude sur la scoliose qui est une déformation en trois dimensions de la colonne vertébrale, les modèles animaux quadrupèdes sont de mauvais modèles d’étude car la présence d’appui sur les pattes avant leur permet de compenser et d’empêcher l’évolutivité d’une telle déformation. Les poissons-zèbres cependant constituent un bon modèle pour ces déformations vertébrales, leur colonne vertébrale comportant de grandes similarités avec l’espèce humaine : une structure vertébrale longitudinale, constituée d’éléments osseux mobiles et de disques intervertébraux, organisée en 4 segments. L’analyse de la morphologie de la colonne vertébrale par micro-scanner chez le poisson-zèbre a déjà été validée par des études précédentes. Les animaux seront étudiés du point de vue phénotypique (apparition de scoliose) à 3 points cinétiques à 8, 12 et 16 semaines, qui correspondent respectivement à une période de forte croissance, au stade juvénile (parallèle avec l’aggravation pubertaire des scolioses humaines) et une analyse finale au stade adulte. Ceci permettra de suivre l’évolution de la scoliose dans le temps lors de sa phase de constitution puis une analyse finale à l’âge adulte.
Le rôle de la protéine C activée dans le développement de l’arthropathie hémophilique chez des souris hémophiles A sévères – Projet Multi-établissement EU 2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
88 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère. Elles subissent des ponctions du genou provoquant des saignements articulaires répétés, des injections, une IRM de deux heures et des prises de sang, avant dissection des pattes arrière. Le porteur décrit comme seule nuisance une gêne locomotrice et applique un point limite de perte de poids de 20 %. Il vise à étudier le rôle d'une protéine dans la destruction articulaire et justifie le recours à l'animal par le "besoin d'un modèle vivant, dynamique et doté d'un système vasculaire et locomoteur".
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes de la destruction articulaire induite par l’hémophilie permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques mais également de disposer de nouveaux outils de diagnostic précoce. Pour cela, l’étude du rôle de l’APC nous semble intéressante puisque cette protéine régule d’autres qui sont chargées de la dégradation et du remodelage du cartilage articulaire. Si notre hypothèse est confirmée, alors un inhibiteur de l’APC peut être un candidat thérapeutique pour l’atteinte articulaire chez les hémophiles.
Procédures
Afin de mimer la maladie chez l’homme, les souris vont développer une atteinte articulaire suite à des saignements articulaires répétés. Le rôle de la protéine C activée (APC) va être étudié 7 et 30 jours après 2 ponctions du genou induisant un saignement articulaire. Cette atteinte articulaire va être étudiée en utilisant des méthodes complémentaires : mesures de marqueurs d’inflammation, de dégradation cartilagineuse, l’étude de modification des ARN au niveau des tissus articulaires et du sang, étude histologique avec marquage de molécules responsables de la dégradation articulaire. L’APC sera bloquée par un inhibiteur spécifique et les conséquences de cette inhibition seront comparées à la situation où l’APC est active au niveau du sang et du liquide synovial. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et si douloureux après administration d’un médicament anti-douleur. Après anesthésie et antalgie, les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrières seront disséquées pour l’étude histologique après marquages et colorations spécifiques. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min), la mesure du genou droit (30 sec), une injection (1-2 min), une IRM du genou (120 min), une prise de sang et mise à mort (3-5 min). Les temps exprimé ne comptent pas l’induction et la vérification de la profondeur de l’anesthésie, compter 5min. Afin d’éviter de multiple anesthésie générale, le maximum de geste est groupé comme suit • Anesthésie générale + mesure du genou droit + ponction articulaire à J0, J15 et J30 : temps estimé : 9 min • Injection seule tous les 4 jours: temps estimé : 7 min • Injection d’inhibiteur tous les 4 jours: temps estimé : 9 min • Imagerie par IRM à J42 : temps estimé : 125 min • Prise de sang : 10 min. tous les gestes sont effectués dans l'UE1 à l'exception de l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qsui sont réaisée dans l'UE2.
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
Les animaux ne ressortent vivant de cette procédure car des prélèvements terminaux pour analyses histologiques et immunohistochimies sont prévus.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie préalables. Au cours de l'étude, les points limites sont appliqués avec comme limite stricte une perte de poids de plus de 20% due à une gêne locomotrice, gravité d'un hématome au point d'injection si les actions de corrections ne sont pas suffisantes.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Etude des mécanismes régulant la régénération musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un tatouage et une biopsie d'oreille, des injections de tamoxifène puis une injection de cardiotoxine dans les muscles des deux pattes arrière pour provoquer une lésion, avec risque de boiterie et de douleurs musculaires persistantes. Le projet étudie les cellules souches qui réparent le muscle et le déclin de cette réparation avec l'âge. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne dépassent pas quelques jours et que la souris reste "essentielle" pour étudier la régénération musculaire.
Objectifs
L’objectif est de mieux comprendre les processus impliqués dans la régénération du muscle squelettique. Après la naissance, des cellules souches musculaires vont se placer en position satellite autour des fibres musculaires et sont appelées cellules satellites (CS). Elles constituent la réserve de cellules qui permet de réparer les muscles tout au long de la vie. En cas de lésion musculaire, les cellules satellites sont activées et se multiplient et permettent de réparer les fibres musculaires ou d’en former de nouvelles. Cependant, le potentiel de régénération du muscle squelettique décroit avec l’âge, ce qui participe au déclin de la masse musculaire. Des travaux précédents ont montré l’activation spécifique d’une signalisation cellulaire dans le muscle âgé. Pour comprendre les conséquences de cette dérégulation, un nouveau modèle de souris génétiquement modifié sera généré. Ce modèle permettra de cibler les cellules satellites adultes grâce à un système inductible par une molécule qui sera injectée à la souris adulte. La capacité de régénération du muscle sera évaluée en condition normale et lors d’une réponse à un dommage musculaire réalisé par une injection d’une molécule altérant l’intégrité du muscle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’altération de la capacité de régénération du muscle au cours du vieillissement. Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués et donc le développement de nouvelles perspectives diagnostiques ou thérapeutiques pour limiter le déclin de la masse musculaire au cours du vieillissement et dans les maladies chroniques.
Procédures
Tous les animaux seront tatoués au niveau des phalanges et subiront une biopsie d'oreille (1mm), à 21 jours; le temps des gestes par animaux sera < 1min. Tous les animaux recevront 4 injections consécutives à l’âge de 10 semaines environ, espacées de 24heures. 1 semaine après ces injections, un lot d'animaux recevra 1 injection dans un des muscles des membres inférieurs sous anesthésie générale de 1h30 à 2h obtenue par une injection. Toutes les souris seront mises à mort entre 3 jours et 28 jours après l'injection dans le muscle. Les injections ne durent que quelques secondes et sont réalisées par des personnels expérimentés.
Impact sur les animaux
Des nuisances seront liées à l'inconfort et la douleur lors de la contention pour le tatouage et la biopsie d'oreille, nécessaires à l'identification des animaux et le génotypage. Des nuisances seront liées à l'inconfort et aux douleurs des injections IP de tamoxifène associées à la contention et la blessure potentielle d'un organe au passage de l'aiguille. Des nuisances seront liées à l'inconfort et les douleurs liées à l'anesthésie, la réalisation d’une lésion musculaire par l’injection intramusculaire de la cardiotoxine dans un muscle spécifique des deux pattes postérieures. Les effets indésirables pourraient être le développement de boiterie et de douleurs musculaires persistentes, notamment chez les animaux mutants s'ils présentaient un défaut de régénération du muscle.
Devenir
mise à mort afin de collecter les muscles pour des analyses de biologie moléculaire, de biochimie, et d'histologie et la préparation de cultures de cellules.
Remplacement
Des expériences dans les cellules seront réalisées en amont quand cela sera possible. Cependant, les modèles in-vitro ne permettent pas une étude de traitement au-delà de quelques jours. Le modèle murin est essentiel pour produire les cultures primaires de cellules génétiquement modifiées et étudier le processus de régénération musculaire.
Réduction
Nous utiliserons le nombre d’animaux minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs; le personnel est formé aux tests statistiques. Le maximum de données pouvant être généré à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. Des conseils auprès de collaborateurs expérimentés et une consultation approfondie de la littérature permettent d'optimiser les expériences et réduire la variabilité donc le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Si le processus de régénération musculaire est inhibé chez la souris mutante, alors les temps d'analyse les plus longs seront supprimés, le nombre d'animaux sera donc réduit.
Raffinement
Un personnel expérimenté pratiquera les injections sur les animaux. Des anesthésiques et analgésiques sont utilisés pendant les expérimentations afin de réduire au maximum le stress et la souffrance des animaux. Après anesthésie, les animaux seront placés dans une armoire chauffante jusqu’à leur réveil. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée après les injections et après la lésion musculaire pour détecter les signes de souffrance. Les animaux seront pesés 1 fois par semaine après le début des expérimentations et jusqu'à leur euthanasie. Des points limites suffisamment prédictifs seront mis en place pour éviter toute souffrance des animaux et au-delà desquels la procédure sera arrêtée. Les animaux seront mis à mort immédiatement si signes de souffrance. Si les animaux mutants montrent des signes de souffrance liés à un défaut de régénération musculaire, la cinétique d'analyse des muscles après lésion musculaire sera écourtée.
Choix des espèces
Le modèle murin permet le développement d'animaux génétiquement modifiés. La physiologie musculaire des souris est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour que l’on puisse en tirer des données extrapolables. La souris est un modèle très accessible, de maintien aisé et manipulable génétiquement afin de répondre au questionnement scientifique. Le projet concerne des animaux adultes. Le muscle termine sa croissance aux alentours de 8 à 10 semaines, les animaux seront traités à l’âge de 10 semaines environ. A cet âge les cellules satellites ont fini de participer à la croissance musculaire et rentrent en dormance.