Système immunitaire

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 180 d'entre elles, dont une lignée génétiquement modifiée privée de cellules tuft, sont infectées par voie gastrique avec trois virus digestifs puis autopsiées entre un et dix jours après, pour mesurer le rôle de ces cellules dans la défense antivirale de l'intestin. Le porteur qualifie la balance bénéfice-risque de "clairement favorable" et attend une perte de poids et des coliques comme principaux effets. Il affirme ne disposer d'aucune méthode alternative au modèle souris pour ces questions.

Objectifs

L’objectif de ce projet est simple, et consiste à évaluer la susceptibilité d’une lignée de souris génétiquement modifiées (dans lesquelles certaines cellules, nommées cellules tuft sont absentes) à des infections virales. Nos données, obtenues dans un modèle cellulaire, indiquent que l’absence des cellules tuft inhibe la synthèse de molécules antivirales sans lesquelles la réponse d’un hôte infecté est compromise. Ces données, inédites et encourageantes, méritent d’être approfondies le plus rapidement possible dans un modèle physiologique, afin de mesurer le réel impact de ce défaut. Notre stratégie expérimentale est simple, et consistera à infecter des souris de nos souches avec des virus digestifs. Les virus utilisés seront de 3 types, pour des expériences n’excédant pas 10 jours. Nous comparerons ainsi la progression de l’infection et de la réponse antivirale mise en place entre nos souris contrôle, et les souris sans cellules tuft. Cette stratégie nous permettra de répondre à des questions simples : (1) quelles sont les cellules impliquées dans la mise en place de la réponse immune suite à une infection virale et (2), l’absence de certains type cellulaire compromet-elle l’efficacité de la réponse de l’hôte suite à une infection ?

Bénéfices attendus

La balance bénéfice/risque associée à ce projet est clairement favorable. Nos données préliminaires indiquent en effet que les expériences associées à cette étude peuvent aboutir à la découverte de nouveaux mécanismes associés à l’immunité antivirale. Les retombées attendues en termes de connaissances fondamentales sont importantes, et pourraient avoir des répercussions en termes de santé publique, dans le contexte de pandémie que nous connaissons. Ce projet pourrait virtuellement d’expliquer les raisons pour lesquelles certains individus réagissent favorablement à une infection virale (réponse adéquate), alors que d’autres développent des formes graves (réponse inflammatoire prédominante). Notre stratégie expérimentale est simple, et devrait donner des résultats rapides et robustes.

Procédures

Les souris de nos 3 cohortes expérimentales se verront chacune être infectées par chacun des trois virus décrits, par voie gastrique (pour un total de 180 souris infectées et 60 souris contrôle non infectées). Suite aux traitements, les animaux seront progressivement analysés dans un laps de temps allant de 1 à 10 jours tout au plus, se focalisant sur les conséquences précoces de l’infection.

Impact sur les animaux

La source principale de stress pour tous les animaux impliqués dans ce projet sera l’étape d’inoculation des particules virales, et, selon nos prévisions, une potentielle perte de poids et des coliques.

Devenir

Les animaux devront être mis à mort, puisqu’autopsiés afin de récupérer les organes digestifs.

Remplacement

Ce projet a pour objet l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et certains virus. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions autre que les modèles de souris.

Réduction

Le nombre de souris engagées dans cette procédure a été défini selon les données de méthodologie classiquement retrouvées dans la littérature, nous conduisant à utiliser des cohortes de 40 individus par infection. Ce nombre, étant donnée l’effet drastique que nous attendons, nous permettra d’assurer des données robustes et exploitables. Nous réduirons le nombre d’animaux à produire en utilisant des individus des deux sexes. Finalement ; lorsque possible, nous compléterons nos données en utilisant des modèles de cultures cellulaires.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum les hypothétiques risques de douleur et d’angoisse chez les individus du groupe mutant, un suivi individuel des individus sera réalisé selon les paramètres de masse corporelle et d’activité. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou l’apparition de signe de prostration seront considérés comme des points limites. En cas de signes de détresse ou de douleur, d’atteinte d’un point limite, en accord avec le personnel qualifié, le protocole sera immédiatement stoppé pour ces animaux qui seront euthanasiés et autopsiés.

Choix des espèces

Le système digestif de la souris présente de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. De plus, nous disposons du modèle idéal (souris KO Pou2f3, dans lesquelles les cellules tuft sont absentes) pour aborder notre question. Les individus seront utilisés à partir de 8 semaines d’âge, lorsque le système digestif est mature. Notre étude se focalise sur les individus adultes et la mise en place précoce de la réponse antivirale.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le champignon Candida albicans injecté dans la veine de la queue, puis suivies pendant deux à sept jours avant une prise de sang et une mise à mort par dislocation cervicale, pour étudier le rôle du gène Card9 des neutrophiles dans la dissémination de l'infection. Le porteur qualifie la dose de subléthale et estime la souffrance modérée, l'infection pouvant entraîner une perte de poids jusqu'au point limite de 20 %. Il indique avoir mené des expériences préliminaires in vitro et s'être limité à un seul modèle d'infection pour réduire le nombre d'animaux non-humains.

Objectifs

La présence de champignons dans les différents microbiotes de nos muqueuses, et notamment de l’intestin, est associée à diverses pathologies. Parmi les champignons intestinaux, le plus connu est Candida albicans. C'est une espèce pathogène opportuniste, c'est-à-dire qu'elle est la plupart du temps inoffensive, mais qu’elle peut déclencher une infection dans certaines circonstances, comme après un traitement antibiotique, une chimiothérapie intense ou dans le cas des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse. En effet, un échec des cellules immunitaires à contrôler les champignons intestinaux, et notamment C. albicans, peut mener à ce type d’inflammation sévère et chronique de l'intestin. Il est ainsi important de comprendre le rôle des gènes de susceptibilité aux MICI également impliqués dans la réponse aux champignons. Par exemple, une mutation ponctuelle (appelé polymorphisme) dans le gène Card9 est associé au développement de MICI, et les mutations plus importantes entraînant une perte de fonction de la protéine CARD9 sont quant-à-elles associées à des infections fongiques invasives, notamment à C. albicans. CARD9 est exprimé dans les cellules de l'immunité innée, mais les types cellulaires impliqués dans la pathologie et les mécanismes en jeu ne sont pas connus. Nous avons montré in vitro que les neutrophiles mutés pour le gène Card9 ont une capacité réduite à éliminer C. albicans. Cependant, le rôle des neutrophiles, cellules immunitaires innées en première ligne de défense contre les envahisseurs, reste très peu compris. Les patients dont les neutrophiles ne sont pas fonctionnels peuvent développer différentes formes d'inflammation intestinale et les neutrophiles des patients atteints de MICI présentent des défauts fonctionnels. Ainsi, l’utilisation d’un modèle d'infection systémique nous permettra de mieux comprendre le rôle des altérations génétiques liées aux MICI, et notamment de CARD9, dans la réponse contre les champignons. Nous étudierons aussi d’autres gènes en lien avec CARD9 impliqués dans la reconnaissance des champignons par les neutrophiles.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances précieuses sur le rôle de Card9 et des neutrophiles dans le développement d'infections fongiques invasives, telles que celles causées par Candida albicans. Le modèle d'infection à Candida albicans par voie intraveineuse est un modèle très bien caractérisé, reproductible et qui permet de mimer les infections invasives humaines dues aux cathéters, notamment. Candida albicans est une levure naturellement présente dans l’organisme mais qui peut causer des infections graves chez des personnes immunodéprimées ou avec une mutation génétique dans CARD9 par exemple. En effet CARD9 est protecteur dans le sens où il permet de protéger l’organisme contre ces infections en éliminant le champignon. CARD9 est principalement exprimé sur les cellules de l’immunité innée, mais son rôle dans les différents types cellulaires (neutrophiles, macrophages, cellules dendritiques, monocytes…) reste inconnu. Ici, nous nous intéressons aux neutrophiles, d’où l’intérêt de la lignée mutée pour CARD9 dans les neutrophiles. Cependant il est important de comprendre comment CARD9 est activé, si cela passe par les récepteurs de surface aux champignons de type Dectin, ou pas ; et si les cellules de l’immunité adaptative ont effectivement aucun rôle dans le phénotype protecteur de CARD9, ou pas. Comprendre les mécanismes en jeu, et surtout les types cellulaires impliqués, permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives aux patients souffrant de ce type d'infection chronique et invasive.

Procédures

L'infection à C. albicans sera réalisée par injection intraveineuse dans la veine caudale, en une dose subléthale et unique, sur animal vigile. Le poids corporel sera suivi quotidiennement le jour d'avant et après l'infection, soit pendant 2 ou 7 jours (quelques secondes sur la balance). Les fèces seront prélevées quotidiennement, pendant 2 ou 7 jours. Pour cela, les souris sont délicatement déposées dans des pots en plastique. Lorsqu'elles ont fait 1-3 crottes (au bout de quelques minutes), elles sont rentrées dans leur cage. Le jour de la fin de l'expérimentation, 2 ou 7 jours après l'infection, nous réaliserons le prélèvement sanguin juste avant l’euthanasie de l’animal (300ul, 30 secondes environ).

Impact sur les animaux

La douleur imposée aux animaux est d'origine infectieuse. Du fait de l'utilisation d'une dose subléthale, c'est-à-dire ne menant pas à la mort de l'animal, on peut estimer que son intensité sera modérée. La douleur de la piqure est une douleur seuil considérée comme légère en expérimentation animale. Les animaux seront également pesés quotidiennement pendant 2 ou 7 jours, et placés quelques minutes dans des pots en plastique afin de prélever leurs fèces. Un prélèvement sanguin juste avant l’euthanasie de l’animal sera également réalisé.

Devenir

La méthode de mise à mort prévue à l'issue de chaque procédure est la dislocation cervicale. Celle-ci est réalisée dans une pièce dédiée (pièce de manipulation post-mortem) par des personnes formées et autorisées.

Remplacement

Des expériences préliminaires in vitro, sur neutrophiles murins de la moelle osseuse, ont été réalisées afin de remplacer des expériences in vivo et de ne réaliser qu'un seul modèle infectieux chez la souris pour ce projet. Par exemple, un « endpoint dilution assay » (dilution au point limite, où l'on compte grâce à un microscope le nombre de colonies de C.albicans ayant résisté aux neutrophiles) a permis de mettre en évidence que les neutrophiles mutés pour Card9 sont moins capables d'éliminer C. albicans in vitro. Ces résultats obtenus par expérimentation in vitro auraient pu faire l'objet d'expérimentation in vivo, par exemple par des modèles complémentaires d’infection à C. albicans par voie orale chez la souris. Nous avons décidé de nous limiter à ce modèle in vivo par voie intra-veineuse, pour réduire l’expérimentation animale tout en assurant une compréhension optimale de la maladie.

Réduction

Le nombre d’animaux est basé sur le rapport de biostatisticiens. 20 souris par groupe sont nécessaires à l’obtention de différences statistiquement significatives pour l’étude de la résistance à l’infection et de la dissémination dans les organes à 2 ou 7 jours. Cela prend en compte un effet attendu de ±60% (hypothèse nulle moyenne de 1500 cfu C. albicans/organe dans le groupe contrôle, hypothèse nulle alternative de 2400 cfuC. albicans/organe dans le groupe expérimental), une P-value de 5%, puissance de 80%, déviation standard Sigma de 0,5, et test 2-sided. Nous utiliserons des groupes de mâles et de femelles afin d'optimiser l'utilisation des souris générées pour ce projet, tout en veillant à ce que les souris mutées et leurs contrôles soient du même sexe, afin de pouvoir conclure quant à l’importance de la mutation sur le contrôle de la dissémination du champignon.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans les conditions standard. Nous veillerons à enrichir le milieu de vie par l’ajout de feuille de cellulose dans les cages et d’un abri prévu à cet effet. Les souris seront au maximum 5 par cage. Les souris seront observées quotidiennement afin de surveiller leur état de santé et bien-être. Si un animal des signes liés à la perte de poids et à la déshydratation (sans atteindre une perte de 20% correspondant au point limite), du Diet Gel sera placé dans la cage afin de faciliter l’accès pour l’animal à une source d’hydratation. Si la perte de poids atteints 20% du poids initial, l’animal sera mis à mort par limiter sa souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé dans le cadre de l'étude de pathologies intestinales humaines. Le modèle d'infection à C. albicans par voie intraveineuse est un modèle très bien caractérisé, reproductible et qui permet de mimer les infections invasives humaines dues aux cathéters notamment, dans le contexte nosocomial. Les lignées utilisées sont déjà en élevage. Aucun de ces génotypes n'est dommageable. Nous utiliserons des souris de fond génétique C57BL/6, âgées au début de chaque expérimentation de 7 à 11 semaines, mâles ou femelles, afin d'optimiser l'utilisation des animaux. A chaque fois, les souris mutées et leurs contrôles seront du même sexe. Les souirs utlisées seront âgées d'au minimum 7 semaines, soit à partir du moment où le système immunitaire est mature. L'utilisation de l'espèce Mus musculus pour l'étude des infections fongiques invasives à Candida albicans est cruciale pour mieux en comprendre le mécanisme infectieux dans un organisme complexe. Cela permettra de développer des solutions préventives et thérapeutiques innovantes pour les patients souffrant d'un affaiblissement immunitaire, soit causé par une mutation génétique, soit par un contexte fragilisant comme les séjours prolongés à l'hôpital.

577 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, une injection de cellules souches et deux irradiations sur animal non anesthésié maintenu en boîte, ainsi que des prélèvements sanguins rétro-orbitaires répétés, pour étudier la production de cellules immunitaires infiltrant les tumeurs. Le porteur indique que les souris développent des tumeurs mammaires. Il affirme que ni la modélisation ni les systèmes in vitro ne remplacent la souris, présentée comme "indispensable".

Objectifs

Les cellules dendritiques sont des cellules phagocytaires qui jouent un rôle clef dans l’initiation des défenses immunitaires contre les tumeurs. En effet, les cellules dendritiques des tissus capturent les cellules tumorales et présentent les antigenes tumoraux aux lymphocytes T pour déclencher la réponse immunitaire. Les monocytes quant à eux sont les précurseurs directs d’une autre population de cellules phagocytaires appelée macrophages et qui, au contraire des cellules dendritiques, peuvent inhiber la réponse immunitaire anti-tumorale. Un enjeu primordial de la recherche contre le cancer est de mieux comprendre les interactions moléculaires et cellulaires entre la tumeur et les cellules phagocytaires qui l’infiltrent. En particulier, dans le cadre des thérapies anti-cancéreuses, nous souhaitons 1) augmenter la quantité des cellules dendritiques favorables aux réponses immunitaires dirigées contre le cancer ; et 2) diminuer la production des macrophages qui favorisent la croissance tumorale. Cela est possible en étudiant les mécanismes de production de ces cellules qui ont lieu dans la moelle osseuse à partir des cellules souches dites hématopoétiques (HSC). Dans ce projet, nous étudierons les mécanismes moléculaires et cellulaires qui permettent aux HSC de la moelle osseuse de produire des cellules dendritiques et des macrophages lors du développement tumoral.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de production des cellules dendritiques et des macrophages et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d’inhiber la production des macrophages et d’augmenter la production de cellules dendritiques. En parallèle, nous nous interresserons aussi aux mécanismes par lesquels les macrophages inhibent les réponses immunitaires dans la tumeur. Nous développerons des stratégies pour bloquer l’effet inhibiteur des macrophages. En conclusion, ce projet nous permettra de mettre en lumière les mécanismes tumoraux qui activent la production des macrophages. Cela nous permettra de mieux les cibler dans le cadre d’interventions thérapeutiques visant à augmenter les réponses immunitaires contre les cancers.

Procédures

1- Injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée : La contention de l’animal et l’injection durent maximum 30 secondes. Cette intervention aura lieu 1 fois au début de la procédure 2- Injection de cellules souches hématopoïétiques par voie intraveineuse rétro-orbitale La contention de l’animal et l’injection durent maximum 30 secondes. Cette intervention aura lieu 1 fois au début de la procédure 3- Irradiation L’irradiation dure au maximum 5 minutes durant lesquelles les animaux (non anesthésié) sont disposés dans une boite en plexiglass prévu à cet effet. Cette intervention aura lieu 2 fois au début de la procédure 4- Prélèvement sanguin par voie rétro-orbitale La contention de l’animal et le prélèvement durent maximum 30 secondes. Cette intervention aura lieu : 1 fois à 8 semaines au cours de la procédure 3 5 fois au cours de la procédure 4 (à 2 semaines, 4 semaines, 8 semaines, 12 semaines, 16 semaines)

Impact sur les animaux

Les souris développeront des tumeurs mammaires.

Devenir

Mise à mort

Remplacement

La production des cellules dendritiques et des monocytes/macrophages a été étudiée chez la souris in vitro et in vivo dans des situations non-pathologiques ou d’infection par des pathogènes. Cependant les mécanismes de production des cellules dendritiques et des monocytes/macrophages lors du développement tumoral restent mal connus. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent d’étudier la production et la circulation des cellules phagocytaires (cellules dendritiques et monocytes/macrophages) dans le sang et les mécanismes de leur entrée et leur différenciation dans les tumeurs. La souris reste donc un modèle indispensable pour le projet et permettra de tester de nouvelles thérapies anti-cancéreuses ciblant les cellules phagocytaires.

Réduction

les résultats attendus à l’issue de ce projet n’ont pas été publiés à ce jour dans la littérature scientifique. Le nombre d’animaux utilisés pour mener à bien ce projet a été réduit au minimum pour chaque modèle tout en assurant des résultats statisquement interprétables.

Raffinement

La lignée de souris utilisée développe des tumeurs mammaires très progressivement sur 5 mois. Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour suivre les éventuels signes de souffrance ou de stress. Des soins supports tels les aliments gélifiés et la ré-hydratation seront introduits dans les cages en cas de souffrance. Les expérimentations seront arrêtées avant l’atteinte des points limites définis.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées pour la recherche en onco-immunologie et en therapeutique du cancer car la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt ainsi qu’un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées. De plus, la grande homologie avec l’Homme permet d’envisager de transposer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.

465 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des instillations intranasales d'un produit bactérien sous anesthésie, un transfert de cellules lymphoïdes et des injections d'une neurotoxine pour dénerver le poumon, avant prélèvement pulmonaire, pour étudier la formation de structures lymphoïdes tertiaires. Le porteur indique que les instillations peuvent provoquer une gêne respiratoire et fixe la mise à mort à une perte de poids de 20 pour cent. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne permet de provoquer ces structures.

Objectifs

Le projet vise à élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la formation des structures lymphoïdes tertiaires en conditions inflammatoires. La présence de ces structures a en effet été corrélée à un bon pronostic dans de nombreux types de tumeurs solides, et notamment dans les cancers du poumon non à petites cellules. Nous souhaitons étudier le rôle de cellules lymphoïdes innées dans la néogenèse de ces structures. L'étude des voies de signalisation à l'origine de l'induction de ces structures dans les poumons pourrait permettre à l'avenir leur manipulation à des fins thérapeutiques, avec l'identification de molécules candidates jouant un rôle dans leur néogenèse. L'expérimentation sera réalisée en utilisant un modèle inflammatoire visant à induire ces structures pulmonaires. Les objectifs principaux de ce projet sont : 1 – d'étudier la population de cellules lymphoïdes innées au cours de l'inflammation induite par un produit bactérien, par l'analyse cinétique des différents compartiments cellulaires des poumons de ces souris ; 2 - d'étudier la néogenèse des structures lymphoïdes tertiaires et la présence des cellules lymphoïdes innées pulmonaires au cours de l'inflammation, en présence ou absence de fibres nerveuses ; 3 - de transférer des cellules lymphoïdes innées pulmonaires chez des souris naïves ou ayant reçu un traitement avec une faible dose du produit bactérien, afin d'étudier la capacité des cellules transférées à induire ces structures en conditions non ou faiblement inflammatoires.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d'élucider les mécanismes sous-jacents à la formation des structures lymphoïdes tertiaires, et plus particulièrement d'évaluer le rôle des cellules ILC3 dans ces processus. Pour cela, l'utilisation de souris rapportrices RORgt-EGFP dans lesquelles nos cellules d'intérêt expriment l'EGFP, représente un outil pour étudier cette population mais aussi pour les purifier en vue de réaliser des tests fonctionnels. Ce projet vise donc à mieux comprendre le processus de formation des TLS, et étudier la cible thérapeutique que pourraient représenter des ILC3 pulmonaires dans différentes maladies. Induire des TLS chez les patients cancéreux ouvrirait la voie à de nouvelles possibilités thérapeutiques tous stades de la tumeur confondus, et pourrait ainsi contribuer à allonger la survie de ces patients, même lorsqu'ils sont inopérables.

Procédures

- Instillations intranasales : 5 instillations par voie intranasale (lent dépôt de 14 µL/narine de chaque souris maintenue verticalement ; durée totale environ 2-3 minutes/souris en fonction du rythme respiratoire) de NaCl 0,9% ou de LPS à des animaux préalablement anesthésiés. - Transfert adoptif d'ILC3 pulmonaires par voie intraveineuse : injection dans la veine de la queue de 100 µL de suspension cellulaire (1000 cellules en PBS 1X stérile) sur souris vigile, sous lampe chauffante et placée brièvement dans un dispositif de contention lors de l'injection (durée totale environ 1 minute, chauffage préalable environ 5-10 min). Cette intervention n'est réalisée qu'une fois par animal. - Injections de 6-OHDA par voie intrapéritonéale : Sur animal vigile, injection de 200 µL de NaCl 0,9% ou de 6-OHDA resuspendue en NaCl (100mg/kg puis une deuxième injection à 250 mg/kg 48h plus tard). Durée totale < 30 secondes. - Prélèvements : Tous les prélèvements (poumons, plasma) sont réalisés sur animaux euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux ne subiront aucune manipulation plus douloureuse qu'une injection ponctuelle par voie intra-péritonéale ou intraveineuse (cellules), ou une instillation intranasale (LPS) sous anesthésie générale. Les injections pourront provoquer l'apparition d'un stress chez les animaux, mais toutes sont rapides (pas plus de quelques secondes) et les animaux sont maintenus immobiles le temps de l'injection (voie i.p. ou i.v.) afin de limiter au maximum l'éventuelle douleur provoquée. Dans le cas des instillations intranasales, une gêne respiratoire pourra dans certains cas être observée au moment des instillations dans la narine.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les poumons des animaux seront prélevés dans le but d'analyser les TLS pulmonaires ainsi que les ILC3. Les animaux devront donc être euthanasiés suite à l'inflammation induite par le LPS afin de prélever leurs poumons pour procéder aux analyses ex vivo décrites dans les procédures (suivi de la densité de TLS et de la population d'ILC3, purification d'ILC3 fonctionnelles pour leur utilisation in vitro et in vivo). Du sang sera également prélevé post mortem sur les animaux afin de procéder à des dosages plasmatiques de catécholamines, afin de s'assurer notamment de la dénervation du système nerveux sympathique.

Remplacement

Il n'existe pas actuellement d'approches alternatives in vitro pour provoquer la formation des structures lymphoïdes tertiaires dans les situations inflammatoires et permettant d’évaluer le rôle des différentes sous-populations cellulaires pulmonaires dans l’induction de ces structures.

Réduction

Nous utiliserons au maximum un total de 465 souris sur trois années dans les approches expérimentales envisagées. Ce nombre a été calculé au plus juste, afin de permettre des analyses statistiques fiables pour chaque expérience. Ces expériences ne répèteront pas d’expériences publiées antérieurement.

Raffinement

Transport depuis le lieu du fournisseur agréé et période d’acclimatation d’au moins une semaine, conditions d’hébergement des souris soigneusement contrôlées : les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés en groupe (5 par cage au maximum). Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté). Locaux d’expérimentation agréés. Les instillations intranasales pouvant engendrer une gêne et un stress intenses seront réalisées sur les animaux sous anesthésie générale (par injection par voie i.p. d'un mélange xylazine-kétamine) afin de limiter ces perturbations. Les animaux seront maintenus immobiles pour les injections afin de limiter la douleur et le stress pouvant éventuellement être provoqués par leur mouvement. Expériences arrêtées dès les premiers symptômes comportementaux et physiologiques d’une santé altérée apparaissant chez les souris : l'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent responsables du bien-être des animaux. Les points limites tout au long des procédures sont déterminés comme suit. 1. Tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, d'une détresse ou d'une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos voûté, difficultés respiratoires) 3. Anomalies pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial de l'animal (pesées entre 1 et 3 fois par semaines selon les procédures : J0-J4-J6-J10-J15 et J20 pour la procédure 1 ; J0-J2-J4-puis 1x/semaine jusqu'à J30-J32-J34-J37 et J40 pour la procédure 2 ; J0-J4-J7-J10 et J14 pour la procédure 3), plaies et ulcères, tumeurs, fractures... Les éventuels risques anesthésiques seront également pris en compte, avec une surveillance de la détresse respiratoire des animaux lors des instillations intranasales (avec arrêt et/ou modulation du rythme des instillations si observation de difficultés respiratoires), et surveillance des animaux après les instillations et avant leur réveil.

Choix des espèces

La souris est l’animal permettant d’explorer le plus facilement la formation des TLS ainsi que les interactions entre cellules du système immunitaire et fibres nerveuses grâce à l’accessibilité d’un grand nombre de réactifs (ex. anticorps, cellules de lignée cellulaire tumorale transfectées avec l’ADNc codant la luciférase). Par ailleurs, les cellules immunitaires ont été exhaustivement caractérisées chez la souris : les marqueurs des cellules d’intérêt de cette étude sont connus et de nombreux anticorps spécifiques sont disponibles. Enfin, différents protocoles développés chez la souris sont décrits de façon détaillée dans la littérature et sont donc applicables sans nécessité de mises au point longues et consommatrices d’animaux. Les animaux seront reçus à l'âge de 12 semaines, puis mis en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation (8 semaines pour la procédure 2). Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d'un système immunitaire et nerveux mature. Les expériences durent entre 10 à 40 jours soit un âge maximum de 17,5 semaines (ou avant si les souris présentent des signes de souffrance, une perte de poids>20% de leur poids initial ou détresse respiratoire) à la fin de l'expérience.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intraveineuses de vecteurs viraux et d'un Nanoprimer dans la veine caudale, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires pendant un à trois mois, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. L'objectif est d'évaluer un produit censé réduire les doses de vecteurs de thérapie génique et leur toxicité pour le foie. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité des interactions in vivo.

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène « médicament » dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix comme en atteste la commercialisation de trois produits de thérapie génique utilisant les vecteurs AAV (Luxturna®, Glybera® et Zolgensma®). Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Cependant, l’administration de l’AAV par voie intraveineuse (IV) peut induire une élimination rapide du gène « médicament » par le foie. Pour compenser cette élimination, de fortes doses de vecteurs sont nécessaires afin de toucher les tissus cibles comme les muscles squelettiques, le cœur, les poumons etc…). Par ailleurs, il a été rapporté que chez les patients que ces fortes doses de vecteur peuvent induire des effets indésirables liés à une toxicité dans le foie. Cette toxicité a entraîné dans certains cas la suspension des essais cliniques. Dans cette étude, nous proposons de tester un Nanoprimer® (Curadigm) en combinaison avec notre vecteur AAV pour d’une part diminuer son élimination par le foie et favoriser l’atteinte de tissus-cibles tels que les muscles squelettiques et d’autre part, prévenir l’hépatotoxicité liée à la forte concentration du vecteur après son injection. L’objectif scientifique de ce projet est de développer une stratégie pour diminuer les doses de vecteur de thérapie génique injecté et prévenir une éventuelle hépatotoxicité.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une stratégie pour diminuer les doses de vecteur de thérapie génique injecté et prévenir une éventuelle hépatotoxicité et permettre ainsi d’améliorer les traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr.

Procédures

Les souris seront injectées en IV dans la veine caudale avec dans un premier temps 100 µl de PBS ou d’AAV. Selon les groupes d’animaux, 150µl de Nanoprimer seront injectés 10 minutes après l’injection d’AAV puis à J+2 et J+5. Pour ces injections, les souris seront placées dans un tunnel de contention. Pour limiter le désagrément de la piqûre, un anesthésique local de type crème EMLA sera appliqué juste avant la procédure. Un prélèvement sanguin sera réalisé la semaine avant les injections puis toutes les semaines jusqu’à l’euthanasie pour les animaux suivis pendant 1 mois. Pour les souris suivies pendant 3 mois, les prélèvements seront espacés tous les 15 jours au bout du premier mois et ce jusqu’à la fin du protocole. Le prélèvement n’excédera pas la quantité recommandée par animal par semaine soit 7.5% du volume sanguin total. Les animaux seront anesthésiés dans une cage à induction, puis transférés sur une planche chauffante équipée d’un masque anesthésique. Le sang sera prélevé au niveau de la veine jugulaire par du personnel compétent pratiquant ce geste en routine. Conformément à la réglementation, la mise à mort des animaux sera réalisée sur des souris isolées visuellement et phoniquement du reste des animaux. Les animaux en attente, resteront dans leur cage et salle d’hébergement. Afin de réaliser des études post mortem, les animaux subiront une anesthésie gazeuse préalable suivie d’une décapitation qui sera systématiquement réalisée par du personnel compétent pratiquant cette technique en routine.

Impact sur les animaux

Les vecteurs AAV et le Nanoprimer ont tous déjà été administrés chez la souris à des doses supérieures ou égales à ce qui est envisagé dans ce projet, sans observation de signe clinique notable. L’injection en intra veineuse dans la veine caudale engendre une légère douleur due à la piqure. Pour limiter le désagrément, un anesthésique local de type crème EMLA sera appliqué juste avant la procédure. Pour le prélèvement sanguin, la souris sera sous anesthésie gazeuse et ne pourra donc pas ressentir de douleur. Une légère douleur au point de prélèvement due à la piqure peut être ressenti après le réveil. Pour l’euthanasie, les souris seront sous anesthésie gazeuse que ce soit pour la dislocation des cervicales ou la décapitation

Devenir

Mise à mort pour prélèvement d'organes pour des études post mortem.

Remplacement

Les modèles in vitro ne peuvent s'approcher de la complexité des interactions entre le vecteur et l’environnement biologique in vivo et rendent donc difficile la reproductibilité de ces résultats in vivo. L’utilisation de la souris est donc justifiée pour évaluer ces différents paramètres.

Réduction

Dans le contexte de cette étude pilote, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum pour avoir suffisamment de données pour une suite ou non de ce projet. En première intention, 110 souris réparties sur 11 groupes seront utilisées pour tester le Nanoprimer et l’AAV8 avec deux doses différentes. Selon les résultats obtenus, des analyses supplémentaires pourraient être étendues à d’autres sérotypes d’AAV cliniquement pertinents comme l’AAV9. Dans ce cas, 4 groupes représentant un total de 40 souris supplémentaires seraient injectés.

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.).

Choix des espèces

Dans la majorité des études de thérapie génique, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée à la fois par la possibilité de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Par ailleurs, l’utilisation de souris est justifiée par la disponibilité de nombreux modèles murins transgéniques mimant des pathologies pouvant être traitées par thérapie génique. La preuve de concept de l’utilisation du nanoprimer co-injecté avec le vecteur de thérapie génique pourra être étendu à différents modèles de maladies. Notre étude sera réalisée sur de jeunes adultes d’environ 8 à 12 semaines.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des applications cutanées répétées de la bactérie Staphylococcus aureus, d'imiquimod, de calcipotriol et de l'allergène DNFB, ainsi que des injections de toxine diphtérique, pour induire psoriasis, dermatite atopique et eczéma de contact, avec un risque de nécrose cutanée. L'objectif est d'étudier la réponse immunitaire mémoire de la peau. Le porteur affirme que cette réponse tissulaire ne peut être remplacée par des modèles in vitro.

Objectifs

Staphylococcus aureus (S. aureus) est une bactérie colonisant la peau des patients atteints de dermatite atopique (DA) et de psoriasis (Pso). Des données cliniques montrent que S. aureus aggrave la DA, mais il n’y a pas d’évidence pour le Pso. La compréhension des mécanismes par lesquels la bactérie aggrave une inflammation cutanée plutôt qu’une autre permet de définir de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées sur ces mécanismes. Des résultats préliminaires obtenus dans un modèle murin montrent qu'une souche de S. aureus isolée de patients atteints de DA, est capable d’induire une inflammation cutanée de type DA, ainsi qu’une infiltration de lymphocytes T. D’autres résultats montrent que la réponse mémoire à S. aureus diffère dans des modèles sans inflammation cutanée préalable, des modèles de Pso ou de DA. Mais le rôle des lymphocytes T induits par S. aureus dans ces modèles est actuellement inconnu. Un modèle d'eczéma allergique de contact (EAC), fort pourvoyeur de lymphocytes T, sera également inclus. L’objectif principal du projet est de caractériser la réponse mémoire à S. aureus dans les différentes conditions d’inflammation cutanée (DA, Pso ou EAC) afin de trouver de nouveaux mécanismes par lesquels S. aureus est capable d’aggraver la DA. Les objectifs des procédures sont : (i) caractériser l’infiltration de lymphocytes T induite par S. aureus dans des modèles de Pso, de DA et d’EAC ; (ii) caractériser le rôle de l’infiltration de lymphocytes T dans la réponse d’hypersensibilité à S. aureus et son rôle protecteur lors d’une réexposition à la bactérie.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objet l’étude des mécanismes impliqués dans la dermatite atopique (DA), une maladie complexe touchant jusqu’à 20% des enfants dans les pays occidentaux. Les bénéfices attendus sont multiples. 1. Comprendre l’interaction entre colonisation cutanée à S. aureus et réponse immunitaire cutanée ; 2. Corréler la qualité de la barrière cutanée (normale, inflammée type 2, 17 ou 1) et la réponse mémoire cutanée à S. aureus ; 3. Comprendre les mécanismes par lesquels S. aureus aggrave la DA. Ces analyses mécanistiques s’intrègrent dans la réflexion actuellement menée sur les thérapeutiques à développer pour traiter et/ou prévenir la DA chez l’homme. La compréhension des mécanismes par lesquels S. aureus pourrait aggraver une inflammation cutanée, selon la qualité de la barrière cutanée, devrait ouvrir des opportunités thérapeutiques ciblant 1. S. aureus et ses toxines, 2. le microbiote cutané commensal et 3. la réponse immunitaire cutanée à S. aureus. Ainsi ces données alimenteront la réflexion sur l’utilisation des inhibiteurs de toxines de S. aureus, la restauration de la barrière cutanée par l’utilisation d’émollients éventuellement associés à l’application de bactéries commensales ou de pré/probiotiques et l’utilisation de traitements ciblés sur les lymphocytes T résidents mémoires.

Procédures

Application de Staphylococcus aureus à J0, J2, J6 et J8 pour induire une réponse primaire (4 applications) et éventuellement une application à J60 (1 application). Durée 5 secondes par face. Application quotidienne de 10 µl d’imiquimod de J0 à J3 et J6 à J8 (7 applications). Durée 5 secondes par face. Application de 12.5 µl de calcipotriol par face d’oreille, à J0, J2, J6 et J8 (4 applications). Durée 5 secondes par face. Application de 5 µl/face d’oreille de DNFB 0.13% à J0, J2, J6 et J8 (4 applications). Durée 5 secondes par face. Injection intrapéritonéale d'un mélange dilué de kétamine et xylazine à J0, J2, J6 et J8 pour induire une réponse primaire (4 injections) et éventuellement une injection à J60 (1 injection). Durée de l'injection 5 secondes. Injection de toxine diphtérique diluée à J56 et J59, et J66 (3 injections). Durée de l'injection 5 secondes. Mesure de l'épaisseur quotidienne des oreilles. Durée de la mesure 3 secondes par oreille. Sédation par isoflurane 3,5% pendant 30 secondes. Pesée dans une boîte adaptée, durée 5 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux, toutefois les animaux sont surveillés 5 jours par semaine et tout animal qui présenterait des signes physiologiques anormaux (souris prostrées ou encore apparition de nécrose cutanée) suite à l’application cutanée des composés, serait mis à mort.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort et certains organes sont utilisés pour analyse de la reponse immunitaire

Remplacement

L’utilisation de modèles in vivo, animaux, ne peut être remplacée par d’autres modèles. Il s’agit d’une caractéristique de la biologie cutanée : nous analysons la réponse immunitaire tissulaire, et non systémique. Ainsi les modèles in vitro, s’ils tendent à être optimisés, ne permettent pas d’analyser la réponse mémoire tissulaire. Par ailleurs, les modèles humains ne sont pas développés pour cette thématique, limités par le nombre de prélèvements réalisables. Il n’existe pas d’autre modèle expérimental de DA, de Pso ou d'EAC avec colonisation cutanée par S. aureus. Les modèles de peau reconstruite, de plus en plus utilisés en biologie de la peau, ne permettent pas l’inclusion et la stabilité de cellules immunitaires de type lymphocytes T ; l’analyse en phase mémoire est actuellement impossible. Par ailleurs, l’étude des lymphocytes T résidents mémoires se fait nécessairement au sein d’un complexe immun cutané qui n’est aujourd’hui pas modélisé dans ces peaux reconstruites. Au niveau humain, isoler les mécanismes immunitaires induits par S. aureus chez des patients atteints de DA (ou d’autres pathologies cutanées) est évidemment impossible. Les méthodes d’exposition aux bactéries (type patch-tests) ne sont pas développées et sont limitées par le nombre de biopsies réalisables chez l’Homme.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédeure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Les soins et les procédures seront réalisées par du personnel qualifié. Le poids des animaux sera egalement suivi tout au long de l'experience, et si des animaux perdaient du poids (+ de 5% de leur poids), des croquettes humides seraient mises dans le fond de la cage.

Choix des espèces

L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie et autres inflammation cutanée en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires ou encore l’induction de des différentes populations de lymphocytes mémoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris entrent dans les procédures à 8-10 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.

54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une irradiation puis une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie et deux injections intrapéritonéales, pour étudier une protéine régulant les lymphocytes T dans l'auto-immunité intestinale. Le porteur indique qu'environ 30 % des souris modifiées développent une inflammation ano-rectale, et que les animaux sont tués par dislocation cervicale pour prélever rate, ganglions et côlon. Sur le remplacement, il affirme que les interactions entre cellules immunitaires ne peuvent être reproduites in vitro de façon fiable.

Objectifs

Les maladies auto-immunes résultent d'un dysfonctionnement du système immunitaire conduisant ce dernier à s'attaquer aux constituants normaux de l'organisme. C'est par exemple le cas dans le diabète de type 1, la sclérose en plaques ou encore la maladie de Crohn. Ces maladies sont généralement la conséquence d’une activation incontrôlée des lymphocytes T (LT). La caractérisation des protéines régulant l’activité des LT a donc un fort intérêt thérapeutique. Nous avons développé un modèle de souris dans lesquelles la protéine X est spécifiquement invalidée dans les LT ; certaines de ces souris développent spontanément une auto-immunité spécifiquement dans le colon, caractérisée par une forte activation des LT. Nous souhaitons confirmer ces données sur une cohorte plus large d’animaux, puis étudier les rôles spécifiques de X dans les différents sous-types de LT afin d’identifier le mécanisme responsable de la survenue de l’auto-immunité.

Bénéfices attendus

Ces travaux ont tout d’abord une portée fondamentale, puisqu’ils pourraient permettre l’identification d’un mécanisme moléculaire responsable du développement des maladies auto-immunes touchant l’intestin. D’autre part, nous espérons mettre en évidence les niveaux d’expression de la protéine X comme facteur de risque ainsi que comme cible thérapeutique dans ces maladies.

Procédures

Les souris seront soumises à une irradiation (30 minutes), puis recevront une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie générale (1 minute). Huit semaines plus tard les animaux vigiles recevront deux injections intra-péritonéales à 24h d’intervalle (2x 30 secondes).

Impact sur les animaux

Environ 30% des souris déficientes pour la protéine X développent une inflammation ano-rectale à partir de 9 mois après la naissance ; il s’agit d’un phénotype dommageable de gravité moyenne. Les autres souches de souris utilisées ne présentent pas de phénotype dommageable. L'irradiation suivie de reconstitution de moelle, l'injection de cellules par voie intraveineuse et l'injection intrapéritonéale ne provoquent pas d’effets secondaires dommageables détectables chez la souris. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité modérée, susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée. Le comportement, le poids, l’éventuelle déshydratation des souris, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale ; les rates, ganglions lymphatiques et colon seront prélevées pour analyse du phénotype immunitaire par cytométrie en flux et analyses histologiques. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines X dans la fonction des lymphocytes au cours de l’auto-immunité intestinale.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences dans un contexte physiologique pertinent, c’est-à-dire chez l’animal. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Certains animaux transgéniques utilisés développent un phénotype dommageable (prolapsus rectal) ; d’autre part certaines procédures peuvent induire une douleur légère à modérée (irradiation, injections intraveineuses et intra-péritonéales). Les protocoles d’injection que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le comportement, le poids, l’éventuelle déshydratation des souris, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles transgéniques nous permettant de mesurer spécifiquement le rôle de la protéine X dans les lymphocytes T et la survenue de l’auto-immunité. Ces animaux seront suivi jusqu’à un an après la naissance.