Système immunitaire

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc puis une injection de cellules Natural Killer dans le sinus rétro-orbitaire, avec une mesure quotidienne de la tumeur, pour étudier l'activité antitumorale de ces cellules immunitaires. Le porteur indique que les souris sont tuées quand la tumeur atteint 15 millimètres ou dès qu'un point limite est atteint, comme une gêne au déplacement ou une prostration. Sur le remplacement, il affirme que le nombre d'acteurs cellulaires et moléculaires en jeu rend la modélisation in vitro impossible et que les cellules NK n'existent que chez les mammifères.

Objectifs

Les cellules immunitaires Natural Killer (NK) appartiennent à la première ligne de défense du corps contre les agents pathogènes. En effet, ces cellules sont capables de reconnaître et d’éliminer les cellules infectées par des virus mais également les cellules cancéreuses. Ces cellules sont également douées d'une certaine mémoire, ce qui signifie que leur réponse sera amplifiée lors d'un second contact avec une cellule infectée ou tumorale. Ainsi, chez des souris porteuses de tumeurs, il a été montré une diminution de la taille des tumeurs et une meilleure survie des souris quand celles ci sont traitées avec des cellules NK pré-activées. Cette pré-activation consiste en une incubation de 16h de cellules NK purifiées avec un cocktail de cytokines. Les cellules NK ainsi pré-activées sont dites cellules NK mémoires car elles montrent une meilleure survie et de meilleures fonctions effectrices in vitro et in vivo lors d'un second contact avec des cellules tumorales. Le but de ce projet et de mieux comprendre l'interaction et l'importance de chaque cytokine prise séparément et en cocktail sur la préactivation des cellules NK. Il permettra notamment d'évaluer l'importance de différentes voies moléculaires en aval de ces cytokines pour la génération de NK mémoires. Afin d'évaluer leur rôle anti-tumoral in vivo, les cellules NK seront traitées avec différentes combinaisons de cytokines en présence d'inhibiteurs de ces voies. Ces cellules NK seront ensuite injectée à des souris porteuses de 4 types de tumeurs afin d'établir l'importance de ces voies moléculaires sur l'activité anti-tumorale des NK mémoires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'impact des cellules NK préactivées sur la pousse tumorale et de caractériser les voies essentielles à leur fonction in vivo. Il pourra permettre d'affiner les méthodes de pré-activation des NK, méthodes potentiellement transposable en immunothérapie contre le cancer.

Procédures

Injection de cellules tumorales en sous cutanée sur le flanc droit, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, une fois . Injection de cellules NK purifiées préactivée en intra veineuse au niveau du sinus retro-orbital, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, une fois. Mesure de la tumeur, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, journalier.

Impact sur les animaux

Le transfert de cellules NK par injection intra veineuse au niveau du sinus retro-orbatal ne devrait créer aucun stress particulier. Les cellules tumorales seront injectées en sous cutané au niveau du flanc droit ce qui conduit à une gêne associée à la pousse de la tumeur, c'est pourquoi la mesure de la tumeur sera journalière.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude ou avant si un point limite est atteint.

Remplacement

Ce type de projet nécessite l'utilisation de modèles animaux, le nombre d'acteurs cellulaires et moléculaires mis en jeu étant trop nombreux et leurs interactions trop complexespour pouvoir être modélisés in vitro. D'autre part, les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères ce qui exclut le recourt à d'autres modèles animaux non mammifères.

Réduction

Une étude bibliographique appuyée par nos expériences relevant d'autres projets nous ont déjà permit de définir les doses de cellules tumorales et NK à injecter ainsi que la cinétique de croissance des tumeurs ce qui limite les études préliminaires. Le nombre d'animaux nécessaires a été calculé de façon à apporter des réponses statistiquement fiables tout en évitant des mises à mort inutiles (test de LogRank pour les statistiques reliées à la survie, nombre d'animaux par groupe calculé par epiR package version 0.9-030). Afin d'optimiser le nombre d'animaux utilisés de nombreux paramètres sur la pousse de la tumeur, la fonction des cellules NK et leur phénotype à la fin de l'expérimentation seront analysés sur un même animal.

Raffinement

Lors de cette procédure, un suivit des animaux et des mesures journalières de la tumeur seront réalisées. Ainsi l'animal sera mis à mort lorsque le plus grand diamètre de la tumeur atteint 15 mm (Workman et al, BJC, 2010). D’autre part, les animaux seront mis à mort dans l’un des cas suivants : blessure au niveau de la tumeur, gène dans le déplacement, prostration, absence d’interaction avec le groupe. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l'injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroïde et un antibiotique jusqu'à disparition des symptômes.

Choix des espèces

Les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des souches murines génétiquement modifiées (KO, KI, possibilité d'utiliser la technique CRISPR/cas9) et des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris âgées de 8-12 semaines seront utilisées pour les expérimentations. Cet âge correspond, selon la courbe de croissance des souris C57BL/6, à un poids de 19-21 grammes à jeun. A cet âge, les souris ont un système immunitaire mature.

8 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Fortement immunodéprimées, elles reçoivent des cellules T humaines et des cellules tumorales, avec une à deux injections ou prélèvements par semaine, pour optimiser l'efficacité de ces cellules contre le lymphome. Le porteur indique une perte de poids possible et l'arrêt de l'expérience en cas de souffrance. Il affirme que cette analyse de cellules humaines ne peut se faire qu'in vivo, sur un modèle murin très immunodéprimé.

Objectifs

Le traitement des cancers des cellules du sang représente un enjeu majeur et dans ce contexte, de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer ont récemment été développées en utilisant notre système de défense pour cibler et éliminer les tumeurs. Notamment, des immunothérapies basées sur l’injection de cellules immunitaires spécifiques de protéines tumorales, comme par exemple les approches utilisant des cellules T modifiées pour reconnaitre spécifiquement une tumeur, ont démontré leur potentiel thérapeutique, et sont maintenant approuvées en clinique pour certaines applications. Cependant des cas de résistances/rechutes pour ces patients restent trop nombreux et de nombreuses questions demeurent pour en comprendre les raisons et en conséquence, pouvoir optimiser la persistance et la réactivité des cellules T greffées chez ces patients. Dans ce projet, nous proposons de déterminer dans un modèle murin adapté : 1) l'efficacité anti-tumorales de cellules T humaines générées à partir d’échantillons de patients atteints de lymphome 2) de quelle manière le processus de préparation des cellules T et la nature de la tumeur, affectent le devenir et l’efficacité des cellules T greffées. Les résultats obtenus pourraient permettre une amélioration de l’efficacité de ces nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de notre projet sont tout d’abord une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans une réponse anti-tumorale efficace d’une population de cellules de notre système immunitaire, les cellules T. D’autre part, nous espérons que nos résultats auront pour conséquence l’amélioration dans un premier temps du traitement des lymphomes mais également, à plus long terme, d’autres types de cancers. Cette problématique reste en effet une problématique majeure puisque le traitement des cancers des cellules sanguines en général, et du lymphome en particulier, représente toujours un enjeu de santé majeur (plus de 5000 nouveaux cas/an dont 1/3 de cas réfractaires aux traitements de premières lignes). Dans ce contexte, comme indiqué ci-dessus, le développement de nouvelles stratégies anti-tumorales, basées sur les propriétés du système immunitaire pour cibler et éliminer les tumeurs, a permis d’améliorer les traitements contre le cancer et notamment les hémopathies. Ainsi, les traitements basés sur l’injection de cellules T anti-tumorales sont maintenant approuvés en clinique pour le traitement de différents cancers hématologiques tels que les leucémies ou les lymphomes. Toutefois, malgré des résultats spectaculaires, des formes réfractaires à cette approche persistent. Différentes explications peuvent être invoquées comme une faible/absence d’expansion des cellules T anti-tumorales après infusion, un défaut de persistance ou encore une altération de leur fonctionnalité. Ainsi, il est crucial de déterminer les causes de ces échecs afin d’optimiser l’efficacité de ces nouvelles thérapies pour cet enjeu majeur de santé publique. Ce projet permettra ainsi comme indiqué précédemment d’accroître nos connaissances sur les paramètres pouvant impacter l’efficacité des cellules T anti-tumorales et ainsi, identifier de nouvelles pistes pour optimiser cette approche thérapeutique prometteuse.

Procédures

Les animaux subiront différents types d'injections ou prélèvements pour lesquelles la douleur est faible à modérée et ne requièrent pas plus que quelques minutes par animal. Par souci du bien être animal et en fonction du type d'injection, l'intervention sera réalisée sous anesthésie ou contention appropriée de l'animal. En moyenne, un animal subira 1 à 2 injections ou prélèvements par semaine au cours d’une expérience.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental mis en place afin de répondre à nos objectifs peut induire une perte de poids transitoire chez l’animal. Les animaux seront observés et suivis régulièrement afin de détecter l’apparition de tout signe de douleur détaillée dans une fiche de suivi clinique (perte de poids, altération du comportement, de la qualité du poil, de la mobilité, …). En cas de souffrance de l'animal, l'expérimentation sera arrêtée.

Devenir

La totalité des animaux impliqués dans cette demande sera mise à mort en fin d'expérimentation afin de prélever les organes lymphoïdes et réaliser des analyses par cytométrie en flux et microscopie.

Remplacement

La caractérisation des effets anti-tumoraux des cellules T de patients modifiées ex vivo en parallèle du suivi du développement tumoral ne peut être abordé à ce stade qu’in vivo. Il n’existe pas d’approches in vitro ou in silico qui permettent de s’en affranchir. Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de la fonctionnalité de cellules T humaines anti-tumorales, en présence de tumeurs. Toutefois, de nombreuses conditions de culture et/ou modifications des cellules T de patients seront, dans une première phase, testées ex vivo de manière à sélectionner et ainsi optimiser, le nombre de conditions testées in vivo.

Réduction

Cette étude est basée sur les données de la littérature et l’expertise de nos collaborateurs dans la réalisation d’expériences comparables. Par ailleurs, de nombreuses conditions de culture et/ou modifications des cellules T de patients seront dans une première phase testées ex vivo de manière à sélectionner et ainsi optimiser le nombre de conditions qui seront ensuite testées in vivo. Les modèles tumoraux utilisés dans cette étude permettent un suivi facilité du développement tumoral par bioluminescence et une limitation du nombre d’animaux utilisés. De plus, nous avons évalué en fonction des données connues, du degré d’hétérogénéité de la pathologie et de la prise des greffes, que le nombre d’animaux par groupe expérimental (n=8) permettait d’atteindre une puissance statistique suffisante. Les expériences proposées sont décrites en deux phases ce qui permettra de sélectionner et limiter les conditions à tester dans la deuxième phase et ajuster, si nécessaire, le nombre d’animaux requis. Par ailleurs, mâles et femelles pourront être utilisés dans ce projet afin d’optimiser au maximum l’utilisation des animaux. Enfin, les données obtenues seront systématiquement évaluées au moyen de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Durant les expériences, les animaux seront suivis quotidiennement par les zootechniciens et/ou chercheurs. Pour leur bien être et réduire le plus possible souffrance et angoisse, les animaux seront maintenus systématiquement à plusieurs par cage avec un enrichissement suffisant pour leur permettre de construire des nids et ainsi améliorer leur bien être. Afin d'évaluer la souffrance des animaux en expérimentation, la qualité du poil, la mobilité, la posture et le poids des souris seront monitorés (en utilisant une grille d'évaluation clinique). Une attention toute particulière sera portée à la perte de poids : ainsi, le poids des animaux sera mesuré régulièrement et un peu de nourriture humidifiée (et/ou substitut gélifié) sera déposé si besoin directement dans la cage afin d’éviter aux souris d’aller chercher en hauteur la nourriture et l’eau. L’expérimentation sera arrêtée immédiatement si un état de souffrance est détecté chez les animaux.

Choix des espèces

Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de la fonctionnalité de cellules T humaines anti-tumorales, en présence ou en absence de tumeurs. Ces questions ne peuvent pas être abordées à l’heure actuelle au moyen de méthodes alternatives in vitro ou in silico, et demandent ainsi de faire appel à des modèles animaux, murins dans le cas présent, en raison des grandes similitudes du système immunitaire murin et humain. Par ailleurs, pour cette étude faisant appel au transfert adoptif de cellules T humaines, seul un modèle murin fortement immunodéprimé peut être utilisé. Dans cette optique, des animaux adultes males et femelles (agés de 8-15 semaines) seront utilisés pour les expérimentations proposées.

2 259 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou un carcinogène associé à un produit inflammatoire dans l'eau de boisson pour déclencher un cancer du côlon, puis du tamoxifène, avant leur mise à mort par dislocation cervicale. Le projet étudie le rôle des lymphocytes T régulateurs dans les tumeurs. Le porteur indique que l'induction du cancer colorectal peut provoquer prolapsus et perte de poids, et affirme que seul l'animal permet une approche intégrée.

Objectifs

Les cancers représentent la première cause de décès en France. L'immunothérapie a permis de faire des avancées spectaculaires dans leur traitement. Des recherches précliniques et cliniques laissent espérer une augmentation du nombre de patients que nous pourront traiter dans le futur. Notre projet s’inscrit dans cette perspective. Il est maintenant clairement établi qu’une population de cellules du système immunitaire qu’on appelle lymphocytes T régulateurs, appelés plus simplement « Treg », a un rôle délétère dans les cancers en inhibant fortement les réponses immunes contre les tumeurs. Certains traitements efficaces en immunothérapie des cancers agiraient par destruction des Treg. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle joué par les Treg dans la physiopathologie des cancers et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Du fait de la complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies, nous devons avoir recours à l'animal pour mieux comprendre ces mécanismes et tester de nouvelles approches thérapeutiques. Le rôle fondamental du microenvironnement dans le développement tumoral ne peut être reproduit et analysé dans des modèles de culture cellulaire. Il est d'ailleurs important de rappeler ici que toutes les avancées récentes en immunothérapie des cancers proviennent directement de données obtenues d'abord chez la souris. On voit donc l'intérêt de pouvoir tester ces approches chez la souris avant de pouvoir les appliquer à l'homme. Nous allons travailler sur le rôle joué par certaines molécules exprimées par les Treg infiltrant les tumeurs ou impliquées dans la régulation du métabolisme de ces cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dans lesquelles l’expression de ces différentes molécules est éliminée dans les seuls Treg. Mieux comprendre le rôle de ces molécules dans les Treg permettra de mieux comprendre la physiopathologie des cancers. De plus, le ciblage de certaines de ces molécules dans les Treg pourrait amener à de nouveaux traitements des cancers. C’est l’objectif général de ce projet.

Bénéfices attendus

Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement de la physiopathologie des cancers, notamment concernant la régulation de ces maladies par les Treg. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme.

Procédures

Le projet comprend 2 procédures. Pour la première procédure, l’expérience débutera par l’injection de cellules tumorales sous la peau chez des souris anesthésiée et maintenues sur une plaque chauffante. L’injection en elle-même des cellules ne durera pas plus de 30 secondes et l’anesthésie durera moins de 5 minutes par souris. On effectuera ensuite un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal, la taille des tumeurs avec un pied à coulisse et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 90 secondes par souris. Pour la mesure de la taille des tumeurs, on fera une contention par la peau du cou et pour la mesure du poids des souris, on fera une contention par la queue. Certaines de ces souris seront également traitées 10 à 17 jours après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 18 ou 30 jours après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris). Pour la deuxième procédure, le début de l’expérience consistera à injecter un produit carcinogène. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Puis, on donnera dans l’eau de boisson un produit déclenchant une inflammation dans l’intestin qui va favoriser l’apparition d’un cancer du colon sur le long terme. Ce dernier produit sera administré 3 fois (à 1 semaine, 4 semaines et 7 semaines après le début de l’expérience) pendant 1 semaine. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Certaines de ces souris seront traitées pendant 1 semaine, 6 semaines ou 9 semaines après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 12 semaines après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

A l'état basal, aucun phénotype dommageable n'a été reporté ou observé au laboratoire pour les différentes lignées utilisées dans ce projet. L’inoculation des 3 lignées tumorales n’entraine pas de douleur systémique spécifique. L'induction du cancer colorectal provoque l'apparition de tumeurs dans le colon distal en 1 à 3 mois avec risque de prolapsus rectaux et une perte de poids inférieure à 10% du poids initial. Le traitement par le tamoxifène entraine une perte de poids modérée (

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, tumeurs, colon etc…) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.

Remplacement

Etant donnée la complexité du développement des cancers, seule l'expérimentation animale permettra une approche intégrée de la compréhension des mécanismes impliqués. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des cancers et que nous avons développé au laboratoire des modèles de souris génétiquement modifiées uniques qui permettent de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.

Réduction

REGLES GENERALES. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de maladie interindividuelle entre souris, nous utiliserons 7 souris par groupe pour les analyses de croissance tumorale, d’immunophénotypage par cytométrie de flux et d’analyse histologique. Les groupes seront constitués de 4 souris pour les analyses transcriptomiques. Les expériences seront répétées 3 fois. Nous ne pouvons descendre en dessous de ces valeurs. La taille des effectifs et le nombre de fois où les expériences seront reproduites ont été établis en tenant compte de l’expertise que nous avons développée depuis plus de 20 ans. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. STRATEGIE D’ANALYSES GROUPEES. Dans la plupart des cas, nos études portent sur des analyses multifactorielles. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est de réaliser les expériences sur différentes lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin les comparer entre elles et par rapport au même groupe témoin. STRATEGIE D'UTILISATION DE SOURIS GENETIQUEMENT MODIFIEES HOMOZYGOTES. Dès qu'il sera possible de le faire, nous maintiendrons nos souris génétiquement modifiées à l'état homozygote pour les transgènes. De cette façon, toutes les souris seront utilisables pour les expériences. STRATEGIE D’OPTIMISATION DES ANIMAUX EUTHANASIES. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons le maximum d’organes afin de collecter et conserver le plus de données possibles par animal. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire le nombre de souris utilisées à un total de 2259 pour l’ensemble du projet.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum dans des cages de Longueur 36,50 cm, largeur 20,5 cm et hauteur 12,5 cm). Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. L'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi pour permettre aux souris de faire un nid avec des lanières de papier Kraft. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie et par les expérimentateurs au moins 3 fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au vétérinaire responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. Une discussion sera engagée pour déterminer s'il y a lieu d'administrer un analgésique et si oui lequel. Le choix dépendra de l'intensité et de la durée de la douleur éventuelle. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, soit nous l'euthanasions et le sortons de l'étude soit on lui donne un analgésique. En général, on choisira plutôt de le sortir de l'étude car les analgésiques peuvent interférer avec le système immunitaire. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Le modèle d’induction de cancer du colon est un modèle préclinique mimant la pathologie humaine. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Pour l’ensemble des expériences, celles-ci seront initiées chez des jeunes adultes de 6 à 12 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature.

65 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres expériences. Chaque lapin subit une chirurgie d'environ vingt minutes sous anesthésie pour la pose d'un cathéter veineux central, dans le but d'offrir ce dispositif à des chercheurs dans le cadre de prestations ou de collaborations. Le porteur affirme qu'aucune douleur n'est attendue et que les animaux supportent très bien le cathéter et le gilet. Le projet installe le cathéter pour faciliter les prélèvements et injections des expériences ultérieures auxquelles ces lapins seront soumis.

Objectifs

Un cathéter veineux central (CVC) est un tube mince et flexible, introduit dans une veine de la base du cou (jugulaire) ou du thorax (sous clavière) jusqu’à atteindre la veine cave supérieure. Ce dispositif, couramment mis en place chez l’homme en clinique, peut permettre l’injection de traitements par voie intra-veineuse (IV), la perfusion de sang ou de plaquettes, le prélèvement d’échantillons sanguins ou encore la mise en place d’une nutrition parentérale (injection d’éléments nutritifs par voie IV). Le but de ce projet est d’offrir les mêmes possibilités à notre modèle animal qu’est le lapin dans le cadre de prestations ou collaborations avec d’autres chercheurs. 65 lapins cathétérisés sont prévus pour l’année 2022.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un CVC apporte plusieurs avantages : -réduction du nombre d’injections et de piqûres d’aiguille ; -atténuation de l’endolorissement/sensation de brûlure parfois causés par un traitement IV administré par une perfusion standard périphérique ; -accroissement du confort et réduction de l’anxiété chez les lapins nécessitant un traitement IV ou des prélèvements sanguins à répétition.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’environ 20min sous anesthésie et analgésie pour la pose d’un cathéter veineux central.

Impact sur les animaux

La nuisance la plus importante est lié à l’opération chirurgical en elle-même. Cependant, tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur des animaux (anesthésie + analgésie pré et post-opératoire). D’après notre expérience, les animaux supportent très bien le cathéter ainsi que le gilet. Aucune douleur n’est attendue.

Devenir

Au terme de la procédure, tous les animaux seront utilisés pour des expériences nécessitant des prélèvements ou des injections qui seront facilités par le cathéter limitant ainsi les effets néfastes pour les animaux.

Remplacement

Différents types d’étude seront réalisés chez les lapins cathétérisés : analyse pharmacocinétique d’un nouveau composé, tests de toxicité, évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies. L’ensemble de ces utilisations met en jeu l’organisme dans son entièreté et rend le remplacement du modèle animal difficile.

Réduction

Dans un objectif de Réduction, le nombre d’animaux choisi correspond au minimum de lapins qui nous est habituellement commandé sur une année. Cependant il est possible que ce chiffre varie à la hausse (demande d’industriels). Dans le cas d’une demande plus importante, une nouvelle demande d’autorisation de projet sera rédigée. Le nombre de lapins sera de 65 sur 1 an.

Raffinement

Dans un objectif de Raffinement, la procédure de pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale par du personnel qualifié. Le design du gilet utilisé pour le maintien du cathéter permet la libre circulation de l’animal dans sa cage sans risque d’arrachement. Les conditions d’hébergement ont également été optimisées par l’enrichissement du milieu. Enfin, l’utilisation de l’analgésique buprénorphine a été mise en place pour réduire la douleur liée à l’opération.

Choix des espèces

Le lapin est un modèle de choix pour les essais impliquant des actes chirurgicaux. Sa taille facilite la mise en place de matériel médical tels que les cathéters. De plus, le lapin est en certains points (notamment immunitaire), plus proche de l’homme que la souris, notamment pour les études s’intéressant aux infections bactériennes. Les lapins seront utilisés lorsqu’ils auront atteint un poids compris entre 2,8 et 3,3kg, soit environ 10-12 semaines. Le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux. En effet, l’état immunitaire de l’animal est dépendant de son âge et de son poids. Des animaux avec une immunité mature sont souvent nécessaires. Enfin, tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.

36 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Séparés de leur mère à deux jours et logés en cage individuelle, ils reçoivent une préparation pour nourrisson pendant dix-neuf jours puis sont abattus à vingt et un jours pour prélèvement des tissus digestifs et cérébraux. Le porteur reconnaît que la séparation maternelle et l'isolement peuvent être une source de stress, qu'il dit limitée aux premières heures. Il justifie le choix du porcelet par sa proximité physiologique avec le nourrisson humain.

Objectifs

L’enjeu de ce projet est l’amélioration des propriétés fonctionnelles des préparations pour nourrisson, pour mimer au mieux les effets bénéfiques du lait maternel. L’allaitement maternel est recommandé par l’Organisation Mondiale de la Santé pour les nourrissons en alimentation exclusive jusqu’à 6 mois. Cependant, moins de la moitié d’entre eux sont actuellement allaités par leur mère. Ainsi, les préparations pour nourrisson sont aujourd’hui l’alternative lorsque l’allaitement n’est pas possible ou souhaité. Il est donc essentiel que leur qualité soit optimale afin d’assurer une croissance et un développement adéquat du nouveau-né. Il reste à ce jour des différences entre le lait maternel et les préparations pour nourrisson, notamment au niveau des composés bioactifs retrouvés dans le lait maternel et peu ou pas présents dans les préparations pour nourrisson. Le présent projet s’intéressera à l’un de ces composés qu’est le microbiote du lait maternel. Ce dernier participe à la mise en place de l’homéostasie intestinale du nourrisson et il pourrait contribuer aux bénéfices santé associés au lait maternel. Cependant, la plupart des préparations pour nourrisson ne contiennent pas de composantes microbiennes et, quand elles en contiennent, celle-ci se limite généralement à l’ajout d’une ou deux souches probiotiques dans des concentrations non physiologiques (forte dose). Ce projet a donc pour objectif d'évaluer l'impact santé du microbiote du lait maternel pour le nourrisson. Une collection de bactéries issues du microbiote naturel du lait de femmes ne présentant pas de problèmes de santé, a été constituée. Sur la base de leurs propriétés immunomodulatrices, des consortia bactériens d’intérêt ont été retenus. L’impact de ces PPN avec une composante bactérienne variable sera étudié sur le développement physiologique de l’intestin et de son microbiote, en utilisant le porcelet mini-porc Yucatan comme modèle du nourrisson humain.

Bénéfices attendus

L’enjeu de ce projet est d’améliorer la fonctionnalité des préparations pour nourrisson en s’intéressant à la composante bactérienne du lait de femme pour mimer au mieux les effets bénéfiques de ce dernier sur la santé du nourrisson. Son objectif est d’évaluer l’impact de deux consortiums bactériens incorporées à une dose proche de leur concentration dans le lait de femme. Les propriétés immunomodulatrices de ces deux consortiums bactériens ont été testées au préalable par différentes approches in vitro sur des modèles cellulaires. Le présent projet d’expérimentation sur porcelets fait donc suite à une sélection drastique des souches d’intérêts qui a abouti à la constitution de deux consortiums d’intérêt. L’expérimentation sur porcelets pemettra d’évaluer le réel impact de ces consortiums bactériens d’intérêt chez un individu nouveau-né présentant des caractéristiques physiologiques proches du nouvean-né humain, dans un système plus complexe que les modèles cellulaires in vitro. Ce projet participera à la conception de probiotiques de nouvelle génération, plutôt utilisés en cocktails avec des espèces et des genres variés pour avoir un spectre d'activité plus étendu, et à dose physiologique proche de celle apportée par le lait humain.

Procédures

Aucun prélèvement biologique, ni intervention chirugicale ne seront réalisés sur les animaux vivants durant la période d’expérimentation. Les paramètres mesurés concerneront la consommation alimetaire et la croissance des porcelets. Tous les animaux concernés par la procédure (n = 36) seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour réaliser des prélèvements post-mortem de tissus et contenus digestifs et de zones cérébrales ciblées.

Impact sur les animaux

Les bactéries ont été isolées du lait de femmes ne présentant aucune pathologie (conditions d’inclusion des femmes définies dans le protocole de collecte de laits). Les bactéries sélectionnées ont été testées in vitro pour leurs propriétés immunomodulatrices bénéfiques ; à priori elles sont sans danger pour la santé du porcelet. Un effet indésirable sur l’appétit des animaux qui entrainerait une perte de poids, ne peut pas être totalement exclu. A noter que la préparation pour nourrissons (PPN) qui sera distribuée aux animaux dans ce projet est très proche d’une formule porcinisée utilisée dans un précédent projet et qui n’a engendrée aucun problème d’alimentation, ni de troubles digestifs chez le porcelet Yucatan. Les porcelets seront inclus dans le protocole à 2 jours d’âge. Ils seront placés dans des cages individuelles équipées de distributeurs automatiques de lait réparties dans deux salles. Ils seront alimentés avec une des 3 PPN porcinisées pendant 19 jours avant leur abattage à 21 jours d’âge et le prélèvement post-mortem d’échantillons. La séparation brutale de la mère et l’isolement relatif en cage individuelle pendant une période de 19 jours pourraient constituer une source de stress pour les porcelets. Cependant, les porcelets ne subissent pas de stress répétés (une séparation unique et définitive de la mère), ils sont hébergés dans une salle contenant 7 cages permettant des contacts olfactif, visuel et sonore avec leurs congénères, leur environnement est enrichi avec des jouets source d’interaction avec le milieu environnant et leur alimentation répond à leur besoin nutritionnel. L’ensemble de ces éléments, associé à des interactions régulières avec les animaliers se traduit par un comportement des porcelets qui ne traduit aucun état de stress au-delà des 12 premières heures post-séparation maternelle durant lesquelles les animaliers sont en permanence présents dans les salles.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par la procédure décrite (n = 36); ils seront tous euthanasiés à la fin de l’expérience.

Remplacement

Le projet s’intéressant à l’impact de l’alimentation sur les fonctions physiologiques du nourrisson, l’utilisation d’un modèle animal vivant reste indispensable pour une évaluation globale de l’effet des consortiums bactériens. Le porcelet a été choisi pour sa proximité physiologique avec le nourrisson.

Réduction

L’étape in vitro a permis de réduire le nombre de bactéries d’inétrèt et de définir deux consortiums, représentatifs du microbiote du lait de femme en termes de composition et ne présentant pas d’effets négatifs dans les tests utilisés (pas de cytotoxicité, pas de perte d’intégrité de l’épithélium, pas d’activité pro-inflammatoire aigüe). Ils seront additionnés à une PPN reconstituée et distribuée sous forme d’alimentation liquide aux porcelets. L’impact des deux consortiums bactériens sera comparé à celui d’une soultion probiotique disponible commercialement. L’effectif (nombre total = 36) a été fixé à minima afin de permettre une évaluation statistiquement significative des effets attendus (réponses physiologiques).

Raffinement

L’alimentation sera adaptée aux besoins nutritionnels des porcelets (formule « porcinisée »). Les compétences et l’expérience des expérimentateurs garantissent le respect du bien-être animal. Des points limites ont été établis, entraînant la sortie de protocole ou l’euthanasie anticipée de l’animal en cas de nécessité.

Choix des espèces

Le mini-porc Yucatan est un modèle animal beaucoup plus proche de l’Homme que les rongeurs, de par sa taille, l’anatomie de son tube digestif, sa physiologie digestive, son système immunitaire et son microbiote.. S’intéressant à l’alimentation infantile, il est à noter que la dynamique de croissance et de développement des organes digestifs chez le porc nouveau-né est très proche de celle décrite chez le nouveau-né humain. De plus, il s’agit d’un animal omnivore monogastrique, ce qui en fait un modèle très utilisé pour des recherches en nutrition humaine. Enfin, sa taille et sa maturité à la naissance sont compatibles avec un allaitement avec des PPN dès les premiers jours de vie. Les porcelets seront inclus dans le protocole à 2 jours d’âge. Ils seront placés dans des cages individuelles équipées de distributeurs automatiques de lait et répartis dans deux salles (7 cages/salle). Ils seront alimentés avec une des 3 PPN porcinisées jusqu’à leur abattage à 21 jours d’âge et le prélèvement post-mortem d’échantillons tissulaires et de contenus digestifs. Trois traitements alimentaires, à avoir une PPN différant uniquement par la composante bactérienne additionnée, seront testés dans le cadre de ce projet : une PPN avec un consortium bactérien A, une PPN avec un consortium bactérien B, et une PPN avec une solution probiotique (ce traitement sera considérée comme le traitement témoin).