Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Effet de la supplémentation par un extrait d’algue dans l’aliment sur le contrôle de la coccidiose aviaire et sur la santé (hors contexte infectieux) : suivi de paramètres zootechniques, microbiologique, biochimiques, parasitaires et inflammatoires
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
240 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Les oiseaux reçoivent par voie orale le parasite de la coccidiose puis sont pesés et saignés avant leur mise à mort, pour tester si un extrait d'algue ajouté à l'aliment limite l'infection et améliore les "performances zootechniques". Le porteur relie le projet à la réduction des anticoccidiens et antibiotiques réclamée par les plans publics et les consommateurs, et vise une supplémentation utilisable en élevage industriel. Il indique avoir présélectionné l'extrait le plus prometteur par des tests in vitro et revendique une étape de validation sur animaux vivants.
Objectifs
Les coccidioses représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture conduisant à d'importantes pertes économiques (>1,5 milliards d’euros/an dans le monde). Ces maladies sont provoquées par des parasites à développement intracellulaire obligatoire, Eimeria qui appartiennent au phylum des apicomplexes. La prophylaxie repose sur l’utilisation d’anticoccidiens et sur la vaccination. Le coût élevé des vaccins, l’apparition de résistances aux anticoccidiens et la demande des consommateurs pour limiter l’utilisation des anticoccidiens et des antibiotiques nécessitent le développement de nouveaux moyens de lutte plus naturels. Ce type de demande au niveau national et Européen a été à l’origine du plan Eco-antibio mis en place par le ministère en charge de l’agriculture (2012-2017) qui se poursuit par un nouveau plan Ecoantibio 2 (plan national de réduction des risques d'antibiorésistance en médecine vétérinaire 2017-2021) dont le premier axe est de « Développer les mesures de prévention des maladies infectieuses et faciliter le recours aux traitements alternatifs ». Dans ce cadre, le test d’un supplément d’algue validé in vitro sera testé in vivo à l’homéostasie et lors de l’infection par Eimeria. Les paramètres zootechniques, parasitaires, microbiologiques et inflammatoires seront étudiés dans la perspective d’une amélioration de l’état des animaux.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, le bénéfice attendu est que : - Les animaux supplémentés présentent une amélioration de leurs performances zootechniques et de leur santé à l’homéostasie. - Les animaux supplémentés résistent mieux à l’infection (effet anticoccidien) et présentent par conséquent de meilleure performances zootechniques (indice de conversion optimal), moins de lésions, moins d’inflammation. S’il y a un bénéfice de cette supplémentation sur les animaux à l’homéostasie et lors de l’infection, c’est une supplémentation qui pourra être envisagée en situation de terrain puis en élevage. Si les algues ne présentent pas d’effet, les animaux supplémentés devraient présenter des charges parasitaires et des paramètres lésionnels similaires à ceux du groupe contrôle.
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite. L’objectif de créer une infection expérimentale per os (0.5ml à l’aide d’une seringue munie d’un embout en silicone (4mm de diamètre ; 2cm de long) ou pipette avec cône de 0.5ml) pour étudier l’effet de la supplémentation en algues à l’homéostasie et lors de l’infection par Eimeria. Les animaux contrôles recevront 0.5ml d’eau. L’inoculation est réalisée au fond de la cavité buccale de l’animal et n’est pas invasive comme le serait un gavage dans lequel l’embout serait inséré jusqu’à l’oesophage. L’inoculation est de courte durée (20s maximum). Aucune douleur n'est attendue suite au gavage. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée. Elle est effectuée par du personnel expérimenté. Tous les animaux seront régulièrement pesés au cours de l’expérimentation (7, 14, 21, 28 et 35j d’âge) et les animaux qui seront euthanasiés subiront un prélèvement de sang juste avant leur mise à mort. 5ml de sang seront prélevés . L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite. Cependant, une perte de poids pourra être observée chez les animaux infectés non supplémentés sans atteindre le point limite ni des signes cliniques sévères. L’effet attendu de la supplémentation est d’améliorer l’état des animaux comme par exemple de limiter la perte de poids causée par l’infection et les conséquences négatives de l’infection (lésions, inflammation), diminuer l’excrétion parasitaire. Dans le cas peu probable que l’état des animaux supplémentés et infectés soit pire que les animaux contrôles, l’observation des animaux (2 fois par jour) permettra de déterminer si ceux-ci atteignent le point limite (plumes ébouriffée, prostration, yeux mi-clos, …). Dans ce cas, les animaux seront euthanasiés avant la fin de l’expérimentation.
Devenir
euthanasie des animaux pour prélévements
Remplacement
Dans le but de réduction et remplacement, des expérimentations préliminaires in vitro par des tests d’invasion et développement parasitaires ont permis de sélectionner l’extrait d’algue le plus prometteur. Cependant, l’étude des paramètres zootechniques, parasitaires, inflammatoires, biochimiques, d’analyse du microbiote et du métabolome intestinal nécessitent une étape de validation in vivo.
Réduction
Les effectifs sont basés sur les études du laboratoire portant sur les scores lésionnels lors de supplémentation et pour lesquelles il faut en moyenne 14 animaux / groupe entre deux groupes pour avoir une différence significative avec une puissance de 93% avec un seuil alpha de 0.05 pour un test non paramétrique Wilcoxon Mann Whitney. Ces effectifs sont suffisants pour atteindre une saturation de la diversité du microbiote via des courbes de raréfaction dans des conditions d’élevage similaires et permettront donc les analyses microbiotes prévues.
Raffinement
Les poulets seront hébergés dans des conditions environnementales contrôlées, ils disposeront d’un enrichissement social et comportemental (dans les cages : petites rondelles en inox suspendues ce qui permet aux animaux de piquer dedans et un tapis avec des mailles serrées pour soulager les pattes).
Choix des espèces
Le poulet est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria. Des poulets de chair mâles et femelles de type conventionnel Ross 308 seront utilisés dans l’étude pour être dans les conditions les plus proches de celles des élevages industriels, et auront un statut sanitaire exempts d'organismes pathogènes spécifiés (EOPS). Les animaux seront utilisés dès l’éclosion et seront ou non supplémentés dès le début de vie de l’animal pour évaluer l’effet de la supplémentation alimentaire en extraits d’algues sur la croissance de l’animal, ses performances zootechniques, le développement de leur microbiote et de leur système immunitaire. Une coccidiose expérimentale sera ensuite induite à environ 2 semaines d’âge afin de reproduire expérimentalement la fenêtre d’infection de la coccidiose aviaire.
Evaluation thérapeutique, pharmacocinétique et pharmacodynamique d’une molécule prorésolutive dans un modèle inflammatoire cutanée ou de vaccination chez le primate à différentes doses.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Le projet prépare l'arrivée en essai clinique d'un anticorps monoclonal qui vise à accélérer la résolution de l'inflammation : doses minimales et maximales, toxicité, biodistribution et biomarqueurs à suivre ensuite chez l'humain. Après une première étude de cette molécule chez le primate, 42 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, ou menées sans réveil. Sous anesthésie, ils reçoivent des injections dans la peau pour provoquer une inflammation ou deux injections de KLH, une protéine employée pour tester la réponse vaccinale, puis la molécule par voie intraveineuse, jusqu'à six prises de sang dans une même journée et seize en 48 jours, trois ponctions de moelle osseuse et trois prélèvements de ganglions. Le porteur limite les groupes à trois macaques, "ce qui rend impossible tout test statistique", et juge ce nombre "essentiel" à la fiabilité des résultats. Le champ structuré déclare 40 macaques réutilisés, et le porteur prévoit leur réutilisation pour une nouvelle procédure légère ou modérée, sauf ceux de l'étude de biodistribution, tués pour prélever leurs organes.
Objectifs
Les traitements anti-inflammatoires actuels visent à éteindre une inflammation chronique préexistante mais cette atténuation de la réponse du système immunitaire n’est souvent que transitoire et s’accompagne très souvent de rechutes. Les études scientifiques visant à déterminer les mécanismes associés à l’inflammation ont mis en lumière un processus actif de l’extinction de l’inflammation s’appelant résolution de l’inflammation Nous avons déjà démontré dans notre laboratoire que le traitement prorésolutif constitué par notre molécule d'intérêt (anticorps monoclonal ciblant un des récepteurs de la résolution exprimé par les neutrophiles et les macrophages) est cliniquement actif chez la souris dans de nombreux modèles inflammatoires. En effet, dans des modèles de colite induite ou spontanée, nous avons pu apprécier un retour plus rapide ou une stabilisation/amélioration de la colite lorsque les animaux ont été injectés avec ce traitement prorésolutif. Par ailleurs nous avons chez l’Homme, observé in vitro un effet de cette même molécule sur les neutrophiles et les macrophages. En outre, dans une précédente étude chez le primate non humain, nous avons pu apprécier la pharmacocinétique ainsi qu’un effet biologique du produit sur un modèle d’inflammation réalisée par l’injection intradermique de bactéries inactivées aux UV. Ce projet sera dans la continuité du précédent pour évaluer les doses minimales et maximales requises pour observer un effet biologique et évaluer la toxicité du produit ainsi qu’identifier des biomarqueurs d’activité permettant de suivre la pharmacodynamique du produit et orienter les analyses chez l’Homme lors d’essai clinique. En outre, l’étude de biodistribution du traitement n’a pas été réalisée et pourra être évaluée dans cette étude, paramètre indispensable pour l’évolution du produit vers la clinique. Enfin, de manière complémentaire, un modèle de vaccination et rechallenge sera évalué pour répondre à la question d’un éventuel impact du traitement sur la vaccination, notamment la réponse humorale liée aux anticorps.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’une part d’évaluer la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’un produit destiné à la médicamentation humaine permettant ainsi d’anticiper un schéma d’administration et d’estimer d’éventuels effets secondaires liés à l’injection de ce médicament. En outre, la réalisation en parallèle d’un modèle inflammatoire intradermique permettra d’apprécier un effet biologique de la molécule sur un modèle déjà utilisé dans une phase I lors d’essais cliniques et pour lequel nous avons obtenu des résultats préliminaires encourageants nécessitant d’être confirmés. Enfin, l’étude sur la capacité vaccinale après injection de la molécule permettra de mieux appréhender les mécanismes d’action du médicament et s’assurer que l’administration d’une telle drogue de manière concomitante à une vaccination de trouble pas la réponse immunitaire primaire et/ou secondaire.
Procédures
Certains animaux seront soumis sous anesthésie à l’induction d’une inflammation suite à des injections intradermiques (sur 5 min) sur une seule journée. D’autres animaux seront soumis sous anesthésie à une injection intramusculaire (5 min) de KLH puis une injection sous-cutanée de KLH (5 min) à 8 jours d’intervalle. Les animaux seront soumis également, sous anesthésie, après injection intraveineuse de la molécule thérapeutique d’intérêt (15 min), à plusieurs prélèvements sanguins (au maximum 6 dans une même journée, 16 sur la totalité de la procédure expérimentale sur 48 jours), notamment lors d’une anesthésie prolongée de 2h, quelques prélèvements de moelle osseuse (N=3, avant traitement, j10 et j21) et de ganglions (N=3, avant traitement, j7 et j21).
Impact sur les animaux
Les protocoles d’anesthésie répétés sur 24h lors de l’injection de la molécule pour évaluer la pharmacodynamique seront inconfortables et à ce titre, les animaux spécifiquement lors de cette journée seront suivis de manière accrue et l’inconfort le plus adéquatement maîtrisé. Les modèle d’inflammation pourrait créer une démangeaison locale qui sera alors protégée si tel est le cas.
Devenir
Les protocoles utilisés dans cette étude permettent une réutilisation de l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet après accord du vétérinaire pour une nouvelle procédure légère ou modérée exceptés ceux utilisés pour évaluer la biodistribution de la molécule qui nécessite un prélèvement de différents organes après euthanasie.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule. Les résultats obtenus lors d’études préliminaires in vivo chez la souris nous permettent maintenant d’étudier la molécule de façon plus précise chez le primate non humain.
Réduction
Ce genre de protocole chez le macaque ne peut être réalisé comme une étude statistique, en effet, dans le respect de la règle des 3R et d’un point de vue éthique, nous limitons le nombre d’animaux au strict minimum, à savoir 3 animaux par groupe, ce qui rend impossible tout test statistique. Cependant, compte tenu de la variabilité individuelle, le nombre de 3 animaux/groupe est essentiel pour obtenir une relevance scientifique quant à l’interprétation des résultats obtenus et l’identification d’un éventuel effet thérapeutique tout en réalisant de manière fiable une étude PK/PD de la molécule. De plus, si le modèle d’inflammation cutanée (injection bactéries inactivées) n’a pas d’impact sur la PK/PD, l’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé. D’autre part, de façon à réduire le nombre d’animaux, il s’agit de réutilisation d’animaux dans le cadre strict de la loi après avis vétérinaire.
Raffinement
Toutes les procédures sont réalisées chez le macaques sous anesthésie. La douleur sera dans la mesure du possible évitée par injection d’analgésique qui devra toutefois ne pas être dans la catégorie des anti-inflammatoires pour ne pas perturber ou annihiler l’effet de la molécule thérapeutique injectée et évaluée. Les animaux sont hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Au cours du protocole expérimental les individus traités sont hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. Il est en effet fondamental pour ne pas stresser davantage aussi bien l’animal traité que les autres animaux, de pouvoir lui faire facilement (sous anesthésie légère) des injections ou prélèvements qui seraient impossibles dans un environnement commun. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.
Choix des espèces
Les primates non humains, et plus précisément les macaques dans cette étude, représentent l’espèce animale de choix comme modèle préclinique étant donné leur morphologie, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’Homme. Différents modèles chez le macaque peuvent être ainsi développés pour mimer des situations cliniques connues, voire des protocoles similaires déjà existants chez l’Homme comme c’est le cas pour cette étude tout en étant moins douloureux, et tester différents protocoles thérapeutiques innovants en conditions précliniques. La constitution du système immunitaire est dépendante de l’âge des animaux donc il s’agira de préférence d’animaux jeunes adultes (3 à 4 kg) dont le système immunitaire est alors mature. La constitution du système immunitaire est dépendante de l’âge des animaux donc il s’agira de préférence d’animaux jeunes adultes (3 à 4 kg) dont le système immunitaire est alors mature.
Etude de la douleur et des mécanismes inflammatoires associés, dans le développement des neuropathies inflammatoires et toxiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
1 340 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Une neuropathie est provoquée par immunisation, modèle du syndrome de Guillain-Barré, ou par injection de Vincristine, puis la douleur est mesurée par filaments de Von Frey, plaque chauffante et rotarod, jusqu'à dix à quatorze fois sur deux mois. Le porteur décrit une évolution vers une paralysie partielle puis totale des pattes arrière et indique ne pas administrer d'analgésiques, au motif qu'ils fausseraient les résultats. Il précise aussi que le projet n'a été évalué par aucune autre instance scientifique et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'atteinte nerveuse sur l'"organisme entier".
Objectifs
Ce projet vise à étudier des mécanismes responsables de l’apparition des douleurs neuropathiques, en particulier dans la cadre de neuropathies inflammatoires comme le Syndrome de Guillain Barré et de neuropathies toxiques comme dans les traitements chimiothérapeutiques à la Vincristine. Ce projet est justifié par la mauvaise compréhension actuelle des mécanismes à l’origine de ces douleurs qui altèrent considérablement la qualité de vie des patients. Ce projet permettra d’étudier les réponses immunitaires mise en jeu, d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de transposer ensuite les résultats sur les humains avec une approche clinique. Ce projet n’a pas été évalué pas d’autres instances scientifiques.
Bénéfices attendus
Le laboratoire et l’équipe dans laquelle se réalise le projet possèdent une expertise reconnue dans les modèles de développement de neuroinflammation chez la souris. Cette étude comparative, s’intéresse aux développements de neuropathies inflammatoires et toxiques, dont les mécanismes impliqués sont encore très mal compris. Nous anticipons donc la production de résultats de hautes qualités et la rédaction d’articles scientifiques qui contribueront à améliorer nos connaissances et offriront de nouvelles possibilités de biomarqueurs et stratégies thérapeutiques.
Procédures
Pour les deux procédures, les douleurs neuropathiques des animaux seront évaluées par des tests de la sensibilité tactile avec les filaments de Von Frey, de la sensibilité thermique avec la plaque chauffante et de la coordination motrice avec le rotarod. Chaque test sera réalisé 10 fois minimum et 14 fois maximum tout au long des 2 mois de suivis de l'animal. Des mesures d'électro-neuromyogramme seront également réalisées par l’utilisation d’un dispositif de stimulation et de recueil dédié aux mesures électrophysiologiques. Pour cela l’animal sera maintenu endormi sous isoflurane tout au long de la mesure. Les stimulations seront réalisées à des voltages progressifs de 4mV à 10mV. Les mesures seront brèves, 10 minutes par animal en intégrant l'installation des électrodes et les stimulations. Comme pour les tests comportementaux, les mesures électrophysiologiques seront réalisées 10 à 14 fois tout au long des 2 mois de suivi des animaux.
Impact sur les animaux
Les deux modèles de développement de neuropathies inflammatoires (EAN) ou toxiques (Vincristine), avec respectivement l’administration sous-cutanée d’un cocktail immunologique (immunisation) et l’injection intrapéritonéale d’une solution de Vincristine, vont conduire à des inflammations périphériques et centrales, associées à une atteinte des nerfs périphériques. Cette atteinte nerveuse périphérique est responsable de perte de sensibilité tactile et thermique, de capacité motrice, voire même de paralysie des membres inférieurs pour le modèle EAN exclusivement. Ces symptômes des neuropathies, similaires à ceux observés chez l’Homme, se maintiendront environ 2 à 3 semaines après le début des injections, puis vont se résorber spontanément en une à deux semaines jusqu'à ce que les animaux retrouvent une mobilité normale et une disparition des symptômes cliniques.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements tissulaires nécessaires aux analyses de dosages et d'immunomarquages nécessaires à la compréhension des mécanismes biologiques impliqués.
Remplacement
Le modèle animal est fondamental afin d’étudier l’inflammation et la pathologie nerveuse (destruction des gaines de myéline, paralysies) au niveau de l’organisme entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico.
Réduction
Notre objectif est de conserver une analyse statistique robuste tout en réduisant le nombre d’animaux par lot. - L’étude comportementale est l’approche qui nécessite le plus d’animaux afin de valider la significativité de nos résultats : le groupe de souris traitées (EAN ou Vincristine) comportera n=20 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux pour le groupe contrôle (souris naïves) à n=10. -L’étude par dosages immunologiques sera réalisée à différents temps stratégiques tout au long des 2 mois : 14 dates de prélèvements sont prévus afin d’obtenir un profil immunologique recouvrant toute la période d’expérimentation. Nous réduisons le nombre d’animaux par prélèvement à n=10 souris/chaque groupe. -L’étude histologique, comme pour les dosages, sera réalisée à différents temps de l’expérience : 9 points de prélèvements sont prévus afin de comprendre la dynamique histologique dans les deux modèles. De même, nous réduisons le nombre de prélèvements à n=10 souris/chaque groupe. -L’étude d’isolement et caractérisation cellulaire par cytométrie en flux sera également réalisée à différents temps de l’expérience : 9 points de prélèvements sont prévus afin d’identifier des mécanismes cellules spécifiques. De même, nous réduisons le nombre de prélèvements à n=10 souris/chaque groupe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage à cap standard au nombre maximum de 6 souris par cage. Nous disposerons dans les cages dès le début de l'expérience, des boules de coton compactées comme enrichissement du milieu. Selon nos expériences antérieures, soutenues par les données de la littérature, les animaux injectés avec la Vincristine ne présenteront pas de phénotype de douleur comme la prostration, les poils hérissés et la paralysie. Les animaux EAN présenteront quant à eux l'apparition des premiers signes comme la prostration, les poils hérissés à partir du 8-9ème jour post-immunisation. Par la suite nous observerons graduellement, une hypotonie, une boiterie légère, une paralysie partielle des pattes arrière, jusqu'à une paralysie totale. Pour ces animaux spécifiquement, une surveillance quotidienne sera réalisée et des croquettes mouillées seront disposées au fond des cages pour faciliter leur accès à la nourriture. A partir d'un score égal à 3, correspondant à la paralysie totale d'au moins un membre, les animaux concernés seront surveillés deux fois par jour. Un registre détaillé sera élaboré afin de suivre quotidiennement chaque animal. Nous ne prévoyons pas d’administrer des analgésiques car ils pourraient influencer et donc invalider les résultats expérimentaux. Une grille de score clinique sera renseignée et un point limite sera fixé (score de 4.5 pour la procédure EAN, score cumulé de 3 pour la procédure vincristine) afin d’évaluer les éventuels signes de souffrance (prostration, poils hérissés, perte de poids...). Les animaux seront mis à mort dès que le point limite sera atteint.
Choix des espèces
La souris de fond génétique C57BL/6 est un modèle reconnu dans le cadre des études des pathologies neurologiques. L’existence de nombreuses lignées transgéniques et la disposition d’outils moléculaires spécifiques (eg. Anticorps spécifiques, sondes moléculaires…) ont apporté ces dernières années une meilleure compréhension des neuropathologies et ont conduit aux développements de nouvelles pistes thérapeutiques. Les animaux utilisés seront âgés de 8 à 12 semaines afin d’avoir un système immunitaire et un système nerveux matures et des comportements adultes.
Exploration fonctionnelle de la contribution de la flore intestinale dans la mise en place des douleurs chroniques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
525 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une lignée génétiquement modifiée sans myosine 1A subit des chirurgies reproduisant une douleur post-opératoire ou neuropathique, une injection inflammatoire dans la patte et des mesures de sensibilité mécanique suivies jusqu'à soixante jours, pour relier flore intestinale et douleur chronique. Le porteur précise que seuls les mâles développent le phénotype et que les animaux sont tués au CO2 ou par surdose d'anesthésique à plusieurs moments de la cinétique. Il affirme que l'étude de la physiologie de la douleur ne peut recourir à des méthodes in vitro et que le recours aux souris est "indispensable".
Objectifs
Le but de notre projet est d’élucider les mécanismes au travers desquels, les perturbations de la flore intestinale influencent la susceptibilité aux douleurs chroniques. Notre projet se base sur l’utilisation d'un modèle de souris génétiquement modifié qui n'exprime pas la MYOSINE 1A (Myo1a KO). En effet, les résultats obtenus au sein de notre équipe au cours des 5 dernières années démontrent que la souris Myo1a KO présente une prédisposition à développer des douleurs chroniques suite à différents types de blessures. Nous avons également apporté les premières preuves suggérant une forte implication de la flore intestinale dans ce phénomène de pédisposition aux douleurs chroniques. Par ailleurs, nous avons démontré que seuls les mâles Myo1a KO sont affectés, mettant en évidence une différence liée au sexe. Dans ce projet, nous envisageons d’adresser les questions suivantes : 1) Dans quelle mesure les perturbations de la flore intestinale des mâles Myo1a KO influencent-elles la mise en place de la douleur chronique ? 2) Quelles sont les différences liées au sexe dans ce phénomène ? 3) Quels sont les mécanismes neuronaux et non-neuronaux impliqués ?
Bénéfices attendus
Grâce aux résultats obtenus, nous allons démontrer que des altérations de la flore intestinale peuvent avoir un impact sur l'émergence de douleurs chroniques post-lésionnelles. Les douleurs chroniques affectent 1/5 ème de la population mondiale, donc l'impact socio-économique des douleurs chroniques est considérable. La prise en charge des douleurs chroniques demeure un enjeu majeur de santé publique. Dans ce contexte, les résultats apportés par notre étude pourraient améliorer les protocoles cliniques de prise en charge des douleurs post-lésionnelles, chez les patients humains, afin d'éviter qu'elles ne deviennent chroniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales afin de créer des lésions mimant une chirurgie ou bien une neuropathie. Ils recevront également une injection dans la patte arrière d'un agent inflammatoire pour mimer une douleur de type inflammatoire. Une partie des animaux fera partie d'une étude comportementale visant à déterminer la sensibilité mécanique post-lésionnelle. Le but de cela est d'observer la mise en place d'une hypersensibilité induite par la lésion et un retour à la normale. Ce paradigme expérimental nous permet de mettre en évidence des "douleurs chroniques". Dans ce contexte les animaux seront suivis jusqu'à 60 jours après lésion. Il s'agit de 65 animaux ayant subi une lésion de type post-opératoire, 35 une lésion neuropathique et 35, une inflammation de la patte. Un autre groupe d'animaux sera dédié à l'études des mécanismes moléculaires et cellulaires intervenant dans la modulation de la pré-disposition aux douleurs chroniques par la flore intestinale et ceux intervenant dans les différences liées au sexe (le phénotype douleur chronique est restreint chez le mâle Myo1a KO). Ces animaux subiront une procédure afin d'induire une lésion de type post-opératoire et seront sacrifiés avant lésion puis 1 jour, 4 jours, 10 jours et 30 jours post lésion, afin d'étudier le contenu en métabolites et cytokines circulants, ainsi que la nature de la réponse immunitaire associée. Un total de 390 animaux sera nécessaire pour ces expériences (78 animaux par point temporel).
Impact sur les animaux
Les animaux seront amenés à subir des traitements antibiotiques pouvant éventuellement causer de troubles gastro-intestinaux légers. De plus, ils subiront des modèles lésionnels mimant une douleur inflammatoire, post-opératoire ou neuropathique. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en oeuvre pour minimiser la nuisance provoquée.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort, soit par inhalation de dioxyde de carbone soit par sur-dosage d'anesthésique, pour répondre aux besoins expérimentaux. Etant donné que nous travaillons sur des souris génétiquement modifiées et sur des souris dégénérées, leur mise en liberté est inconcevable.
Remplacement
La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in-vitro. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.
Réduction
Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Nous allons tout mettre en oeuvre pour extraire un maximum d'informations scientifiques, tout en minimisant le nombre de souris utilisées. Par exemple, les mêmes souris permettront de déterminer nature et la quantité de cytokines circulantes et les profils transcriptomiques au sein des tissus d'intérêt.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal de l’animal. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. De plus, les stratégies d’optimisation suivantes seront mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la souffrance chez l’animal.: - Enrichissement des cages pour favoriser le bien-être animal. - Planification des procédures expérimentales (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) pour diminuer le stress des animaux et favoriser la validité des expériences. - Recours à l'anesthésie/analgésie lors du procédé chirurgical ; soins pré-, peri- et post-opératoires ; maintien de la température des animaux constante pendant l’acte chirurgical; application de gel ophtalmique pour prévenir le dessèchement des yeux; injection du sérum physiologique en sous cutané pour éviter la déshydratation. Les procédures chirurgicales utilisées dans ce projet sont très rapides (moins de 10 minutes par animal) et très peu handicapantes pour les animaux qui recouvrent une locomotion normale 1 heure après l’intervention. - Etablissement des points limites les plus précoces possibles en fonction des tests de comportements utilisés.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus des altérations de la flore intestinale identifiées chez la souris ont été également découvertes chez l'homme, dans des contextes pathologiques, tels le syndrome du colôn irritable, la dépression ou les troubles autistiques. Toutes nos expériences sont réalisées sur des souris âgées de 8 à 12 semaines car nous étudions la physiologie de la douleur chez l'adulte. Néanmoins, des traitements antibiotiques seront administrés également chez des souris jeunes (âgées de 4 semaines et de 6 semaines), afin d'étudier l'impact de la flore intestinale sur la mise en place des douleurs chroniques, à différents stades développementaux.
Evaluation de l’efficacité de vaccins ARNm anti-cancer ciblant les cellules dendritiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Pour optimiser des vaccins à ARNm contre des antigènes tumoraux et choisir leur voie d'administration, 828 souris C57BL/6J vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont vaccinées dans la veine de la queue ou par le nez sous anesthésie, ou dans le muscle sans anesthésie, et une partie est rendue porteuse de tumeurs de la joue, par injection, ou du poumon, par un moyen que le RNT ne décrit pas. Ces souris peuvent perdre du poids, s'isoler, avoir du mal à respirer ou présenter une tumeur de la joue nécrosée et ulcérée, et leur mise à mort anticipée dépend de points limites que le porteur ne détaille pas. En fin d'expérience, sous anesthésie, les souris subissent une prise de sang, un lavage broncho-alvéolaire et une perfusion intracardiaque, pour des vaccins dont le porteur écrit qu'ils "pourront à terme être utilisés chez l'homme".
Objectifs
Le cancer demeure la principale cause de mortalité au monde malgré de réels progrès dans les traitements médicaux. Actuellement les traitements les plus prometteurs reposent sur l’immunothérapie, qui consiste à stimuler et/ou réactiver le système immunitaire afin d’induire des réponses anti-tumorales efficaces et spécifiques. Une des stratégies d’immunothérapie consiste à vacciner avec des antigènes tumoraux. L’efficacité de ces vaccins anti-cancer peut être optimisée en travaillant sur leur composition afin de diminuer la dose injectée et sur la voie d’immunisation la plus adéquate. En effet, la majorité des vaccins est administré par voie systémique (sous-cutanée, intramusculaire ou intradermique). Mais dans le cas de cancers localisés dans les muqueuses comme le cancer du poumon ou de la sphère ORL, des travaux ont montré que la vaccination par voie muqueuse (ex :intranasale) est plus efficace pour d’induire localement une réponse immune plus importante. Dernièrement, le succès des vaccins ARNm dans la lutte contre la Covid-19, a suscité un nouvel engouement pour ce type de vaccin. Et une des premières applications cliniques des vaccins ARNm a été pour traiter le cancer. L’objectif de ce projet est d’optimiser des vaccins à ARNm contre des antigènes tumoraux et d’évaluer leur efficacité chez la souris. Pour cela, les souris seront vaccinées avec différentes formulations de vaccins ARNm et différentes voies d’immunisation et nous analyserons la réponse immune. La meilleure formulation sera ensuite testée chez des souris porteuses de tumeurs du poumon ou de localisées dans la sphère ORL afin de voir si le vaccin peut inhiber la croissance tumorale. Ce projet permettra de développer de nouvelles thérapies innovantes pour traiter le cancer.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer et de valider un nouvel outil thérapeutique dans le traitement contre le cancer basé sur la technologie innovante des vaccin ARNm avec une optimisation de : - la formulation de l’’encapsulation de l’ARNm - la voie d’immunisation - la vectorisation de l’antigène Ces vaccins pourront être administré en association avec des traitements actuellement utilisés en clinique ( ex : les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires négatifs comme anti-PD-1) pour en maximiser les effets. Ces vaccins pourront à terme être utilisés chez l’homme pour le traitement des tumeurs localisés dans les voies muqueuses (cancer du poumon, de la sphère ORL).
Procédures
Injection par voie intraveineuse sur animaux sous anesthésie gazeuse : 2 injections à 2 semaines d’intervalle ou 3 injections à 1 semaine d’intervalle; durée totale environ 5 min. Injection par voie intramusculaire sur animaux vigiles : 2 injections à 2 ou 1 semaines d’intervalle; durée totale du geste 1-2 min. Injection par voie intranasale sur animaux sous anesthésie générale : 2 injections à 2 ou 1 semaines d’intervalle; durée totale environ 30 min. Injection de cellules tumorales dans la joue sur animaux sous anesthésie générale : 1 injection; durée totale environ 30 min. Injection par voir intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : 4 injections (2 fois/semaine sur 15 jours);durée totale du geste 1-2 min. Sur animaux sous anesthésie générale : Prélèvement de sang ( 500μl), Lavage broncho alvéolaire (5x 1ml), perfusion intracardiaque;durée totale environ 30 min.
Impact sur les animaux
La vaccination par voie intranasale peut induire une gêne respiratoire transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections par voie intraveineuse, intramusculaire et intrapéritonéale ne sont pas connus pour engendrer des nuisances ou douleurs. Sur la durée entière de l’expérience (soit environ 3 semaines), les souris avec les tumeurs peuvent perdre du poids pu présenter des signes évocateurs de souffrances tels que des troubles du comportement (immobilité, isolement...) et de l’aspect physique (dos vouté, apparence du poil...). Pour les tumeurs du poumon les souris peuvent présenter des difficultés à respirer ( bien que dans la littérature ces signes sont généralement décrit à partir de 4 semaines). Pour les tumeurs de la joue, une nécrose, ulcération de la tumeur peuvent apparaitre.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes pour l'étude des réponses immunes
Remplacement
Le microenvironnement tumoral est complexe, de même que les réponses immunitaires impliquées dans la réponse immune antitumorale. L’efficacité d’un vaccin ne peut être évalué que dans des organismes entiers et les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement tumoral. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme.
Réduction
Les paramètres expérimentaux ont été déterminées selon des données déjà publiées (cinétique de vaccination, doses, nombre de cellules tumorales à injecter). Nous avons pu déterminer un nombre d’animaux minimum pour avoir assez de matériel pour garantir une analyse statistique fiable. Des groupes de 10 animaux pour tester l’efficacité des vaccins, et pour le groupe vacciné avec notre vaccin de référence le nombre est réduit à 6. Pour les souris porteuses de tumeurs des groupes de 12 sont nécessaires puisqu’il existe une certaine hétérogénéité de la croissance tumorale. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.
Raffinement
Les injections intranasales et les injections de tumeurs dans la joue sont réalisées sous anesthésie générale pour le confort de l’animal. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillées jusqu’à leur réveil. Les injections par voie intraveineuse, via la veine de la queue, sont réalisées sur animaux sous anesthésie gazeuse placés sur tapis chauffant. Les injections par voie intramusculaire et intrapéritonéales ne sont pas connus pour engendrer de douleurs particulières et sont réalisées sur animaux vigiles après désinfection à l’éthanol 70% de la surface d’injection. Tous les vaccins et traitements sont préparés dans des formulations déjà utilisés en clinique ou pré-clinique. Les animaux sont élevés en cages enrichies, et regroupés en groupes sociaux afin d’éviter leur isolement ( 5 souris maximum/cage). Les animaux seront acclimatés au minimum 1 semaine avant le début de toute expérimentation. Pour les animaux le nécessitant, la prise alimentaire et l’hydratation seront facilités avec un enrichissement dans la cage de croquettes humidifiées et de gelée hydratante. La croissance tumorale est mesurée 2fois/semaine à l'aide d'un pied à coulisse par les expérimentateurs. Une évaluation quotidienne de l’état général de l’animal basée sur des points limites sont établis. Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie, en cas de comportement anormal le responsable du projet est alors averti. L’observation de point limite induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.
Choix des espèces
Cette étude sera réalisée avec des souris C57bl/6J. Ce modèle est parfaitement maitrisé dans l’équipe qui dispose de nombreux outils (lignées tumorales syngéniques, vaccins) Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 8 semaines. Cela permet d’avoir un système immunitaire entièrement développé et à cet âge les souris tolèrent bien une anesthésie générale.
Modulation de la réponse immune antivirale humaine après transfert de gène à l’aide d’AAV recombinant dans un modèle de souris humanisées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
240 souris dites humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules immunitaires humaines puis un vecteur de thérapie génique AAV, avec prélèvements sanguins hebdomadaires à la jugulaire pendant douze semaines, injections répétées de LPS, pompes implantées chirurgicalement sous le dos et anticorps injectés trois fois par semaine. Le porteur indique que les souris sont mises à mort par décapitation ou pentobarbital après un prélèvement terminal de sang et d'organes. Il affirme que les méthodes in vitro ou in silico ne rendent pas compte de la réponse immunitaire dans son ensemble et conclut que l'emploi d'un organisme vivant est "nécessaire".
Objectifs
La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. Au laboratoire, nous avons récemment développé un modèle animal pour mimer la réponse préexistante anti-AAV. Ce modèle semble reproduire la réponse immune anti-AAV observée chez l’humain. La génération de ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de souris humanisées, 2 stratégies pour moduler la réponse immunitaire anti-AAV préexistante et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. La première stratégie consistera à utiliser l’interleukine 34 (IL-34) pour favoriser l’émergence de cellules immunitaires impliqués naturellement dans la modulation des réponses immunitaires. Dans la seconde stratégie, un anticorps anti- CD45RC sera utilisé pour moduler l’action des cellules exprimant fortement le marqueur CD45RC. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de développer une stratégie pour moduler la réponse immune préexistante dirigée contre le vecteur de thérapie génique.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de développer une méthode pour prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur et permettre ainsi d’améliorer les traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr.
Procédures
Un prélèvement sanguin par semaine sera réalisé pendant 12 semaines. Les animaux seront anesthésiés et le sang sera prélevé au niveau de la jugulaire. La durée totale d’intervention est estimée à environ 3 mn. Chaque animal sera injecté 2 fois en intraveineuse dans la veine caudale sous anesthésie gazeuse. L’une pour l’injection d’AAVr à J 0, l’autre pour les cellules immunitaires humaines à J+1. La durée totale d’intervention est d’environ 5 mn. Les animaux recevront 3 injections en intra-péritonéale de LPS à J+1, J+2, J+3 après l’injection IV du vecteur. Une injection en IP se fait en moins d’une minute. Des injections IP d’IL-15 seront réalisées 2 fois par semaine pendant les 12 semaines de suivi du projet. Pour les animaux inclus dans la première stratégie d’immunomodulation. 48h avant injection de l’AAVr, des pompes Alzet rechargeables-iPrecio seront placées chirurgicalement sous la peau du dos des souris permettant de diffuser de l’IL-34 sur plusieurs jours. Le temps d’anesthésie, de préparation du champ opératoire et de la chirurgie est d’environ 30 mn. La recharge en IL-34, s’effectuera tous les 15 jours après palpation de l’orifice de la pompe rechargeable à travers la peau. La recharge s’effectue en moins de deux minute. Pour les animaux inclus dans la deuxième stratégie d’immunomodulation B, l’anticorps anti-CD45RC ou l’anticorps contrôle seront injectés par voie intraveineuse dans la veine caudale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. Compte tenu de la fréquence, les animaux ne seront pas anesthésiés. Les souris seront placées dans un tunnel de contention pendant 2 minutes le temps de l’injection. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés en gazeuse.
Impact sur les animaux
Les différents produits ont tous déjà été administrés chez la souris à des doses supérieures ou égales à ce qui est envisagé dans ce projet, sans observation de signe clinique notable. L’utilisation de seringue à insuline équipée d’une petite aiguille de 30 G permet de limiter le désagrément de la piqûre. L’installation d’une pompe rechargeable-iPrecio nécessite une petite chirurgie pour la placer en sous-cutanée. L’animal sera sous analgésie en pré et post opératoire pendant 24h. Au-delà, aucune douleur n’est attendue.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (entre 1 et 3 mois maximum post-injection selon les réponses aux stratégies d’immunomodulations), jour de l’euthanasie et de la réalisation des prélèvements de tissus et d’organes. En ce qui concerne les animaux des différents groupes expérimentaux, notre protocole requiert un prélèvement terminal d'une grande quantité de sang sur lequel s'appuiera certaines analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques, mais également pour éliminer la plus grande majorité de sang des organes ou tissus tels que le foie, le cœur, la rate, les poumons, le cerveau, les reins ou encore les muscles squelettiques qui seront prélevés pour analyses. Les animaux subiront donc une anesthésie gazeuse préalable (isoflurane : induction 5%) suivie d’une décapitation qui sera systématiquement réalisée par du personnel compétent pratiquant cette technique en routine. Tous les animaux sont concernés par cette procédure exceptés les animaux inclus qui entrent dans le cadre de la procédure de perfusion du foie pour isolement des cellules. Dans le présent cas, le sang ne sera pas récupéré après perfusion hépatique, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane et mis à mort par injection de pentobarbital (Euthasol vet à la dose de 140 mg/kg en IV ou IC).
Remplacement
L'utilisation de méthodes alternatives tels que des techniques in vitro ou in silico ne permettent pas de rendre compte de la réponse immunitaire dans son ensemble, l'emploi d'un organisme vivant est donc nécessaire. La souris est un modèle de choix par sa petite taille, ses performances de reproduction et sa durée de vie. Jusqu’à présent aucun modèle animal n’a pu prédire une réponse immune préexistante contre le vecteur AAV car la plupart ne sont pas des hôtes naturels de l’AAV. Néanmoins, dans plusieurs essais cliniques cette réponse a été mise en évidence et a conduit à la perte de l’efficacité du traitement. Le récent développement d’un modèle de souris humanisées nous a permis de reproduire cette immunité préexistante en laboratoire. Ce modèle animal pourra nous permettre de développer des stratégies pour moduler la réponse immune et permettre le maintien de l’expression du gène thérapeutique à long terme.
Réduction
Chez l’humain, l’intensité de la réponse immune est variable, ainsi pour que les résultats soient statistiquement interprétables nous envisageons au maximum d’injecter les cellules de 10 donneurs humains. Au maximum, 240 animaux seront utilisés dans le projet. Si la variabilité de réponse est faible entre les donneurs et donc que les résultats sont statistiquement interprétables avant d’atteindre les 10 donneurs, le protocole sera arrêté pour ne pas mettre à mort des animaux supplémentaires. Ce nombre a été calculé statistiquement et permet de réduire le nombre d'animaux au maximum tout en obtenant des résultats probants.
Raffinement
Le souci du bien-être animal passera par : (i) De bonnes conditions d’hébergements. Par exemple pour les cages comportant plus de 2 souris, une bonne quantité de frisottis en carton est ajouté dans chaque cage pour enrichir l’environnement des animaux. Pour les cages comportant moins de 3 animaux, en plus des frisottis, est ajouté un igloo en cellulose. Des petits morceaux de bois à ronger sont distribués. Les litières sont changées 2 fois par semaine. Un suivi régulier des animaux, chaque cage est inspectée quotidiennement pour vérifier que les animaux se portent bien ainsi que pour contrôler le niveau de nourriture et d’eau. (ii)L’instauration de points limites pertinents et précoces. La détermination des points limites se basera sur la grille d'évaluation ci-dessous, adaptée aux procédures envisagées. En cas de 3 signes cliniques notables ou 1 signe clinique sévère, l'euthanasie sera décidée. -Signes cliniques notables : lésion sans effraction cutanée, agitation, hypomobilité, hyperréactivité, résistance à la manipulation, stéréotypie, poil piqué, gonflement abdominal, perte de 10% à 20% du poids, diminution ou absence de prise de nourriture/d'eau... -Signes cliniques sévères : lésion sévère, saignement incontrôlable, akinésie, convulsions, respiration difficile ou suffocation, absence de fèces ou fèces liquides, déshydratation, perte >20% du poids, douleur à la palpation… (iii)La mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie ou mise à mort par des méthodes reconnues).
Choix des espèces
Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée à la fois par l'existence de plusieurs modèles murins humanisés ainsi que par la possibilité de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Le modèle murin (NOD/SCID/HLA-A2) est couramment utilisé en transfert adoptif de cellules humaines, car il permet une bonne survie des cellules transférées. L'expression de l'allèle du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I HLA-A2.1 est indispensable car les cellules humaines transférées ont un répertoire restreint à cet allèle. La preuve de concept de modélisation de la réponse immune anti-AAV préexistante étant faite chez la souris NSG HLA A2, le développement de stratégies d’immunomodulation dans ce modèle est privilégié. Les souris seront injectées entre 6 et 14 semaines d’âge. À ce stade, les tissus de soutien et les niches nécessaires au support et à la survie de transfert adoptif de cellules sont suffisamment développés pour permettre le succès du transfert adoptif.
Étude des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le rejet de greffe rénale chez la souris
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1596 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du sans réveil au sévère. La moitié, donneuses, sont opérées sous anesthésie pour prélever un rein et la rate puis tuées sans réveil, l'autre moitié reçoivent une greffe de rein, l'ablation de leurs propres reins et des injections d'anticorps, pour étudier le rejet de greffe rénale. Le porteur indique que les receveuses peuvent développer une insuffisance rénale avec perte de poids, fatigue, œdèmes et troubles cardiaques, et sont tuées au plus tard 67 jours après la greffe. Il affirme que l'étude ne peut se limiter à une approche cellulaire, faute de reproduire les interactions entre cellules immunitaires et vaisseaux.
Objectifs
Le rejet humoral, ou rejet causé par les anticorps, est la première cause de lésions des organes greffés puis de l’arrêt de leur fonction. Ce phénomène concerne environ 2/3 des greffes. Malheureusement à ce jour, il n’y a aucun traitement efficace pour traiter le rejet humoral. C’est donc un enjeu majeur de santé publique. Dans le rejet humoral, les anticorps synthétisés par le patient receveur de la greffe sont dirigés contre les protéines CMH portées par les cellules tapissant les parois des vaisseaux du greffon, appelées « cellules endothéliales ». Comme tous les anticorps, ils comportent une partie protéine et une partie composée d’une chaîne de plusieurs sucres. Ces sucres sont appelés glycanes. Dans les maladies auto-immunes, il a été montré que la nature des glycanes présents sur les anticorps impacte leur fonctionnalité en les rendant plus ou moins inflammatoires et donc plus ou moins agressifs. Lors d’un travail in vitro préliminaire, nous avons montré que seuls certains glycanes sont capables de causer des dommages aux cellules endothéliales. Cependant, ce modèle in vitro, trop éloigné des conditions physiologiques, ne prend pas en compte l’influence des anticorps et de la nature de leur glycane sur les cellules immunitaires du patient receveur. Ces interactions entre anticorps et cellules immunitaires sont pourtant au cœur de la physiopathologie du rejet. Nous souhaitons mettre au point un modèle de greffe rénale chez la souris qui nous permettra d’étudier directement l’impact de la nature chimique de la chaîne de glycane sur la virulence des anticorps du receveur dirigés contre les molécules CMH du donneur lors de la greffe rénale. L’objectif de cette étude est d’identifier si un ou plusieurs glycanes orientent la réponse immunitaire du receveur vers le rejet ou au contraire protègent du rejet.
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient ouvrir la voie à des essais thérapeutiques utilisant des modificateurs de la chaîne de sucres des anticorps anti-CMH lors de la greffe rénale, mais aussi lors de la greffe d’autres organes afin de diminuer les taux de rejet chez les patients. Du fait du caractère vital de ces organes, mais aussi de la pénurie actuelle de greffon, la préservation de leur fonction et l’amélioration de leur durée de vie sont primordiales.
Procédures
Des procédures chirurgicales seront réalisées sur deux lots principaux d'animaux. Le premier lot correspond aux 796 animaux donneurs d'organe. Un prélèvement de la rate et du rein gauche de ces souris donneuses sera réalisé sous anesthésie générale, en une seule fois, en environ 20 à 25 min. Ensuite, les souris seront euthanasiées pendant l'anesthésie. Le second lot correspond aux souris qui vont bénéficier de la greffe du rein des souris donneuses. Ces 796 autres souris receveuses subiront une chirurgie d'environ 35 à 45min visant à transplanter le rein d'une souris donneuse sous anesthésie générale et à retirer un de leur rein natif. Après 4 jours, les souris receveuses subiront à nouveau une opération chirurgicale de 5min visant à retirer le second rein natif pour que la fonction rénale de la souris ne dépende que du greffon et permette d'avoir une estimation fiable du rejet s’il y en a un. Sept jours après la transplantation, si les souris ne montrent pas de signes importants de douleurs, souffrance ou d'insuffisance rénale, une injection unique d'une forme particulière d'anticorps dans la veine caudale sera réalisée sur les animaux vigiles restants. Puis un prélèvement sanguin par la veine caudale sera réalisé tous les 3 jours pendant pendant 10 jours puis 1 fois par semaine pendant 3 semaines sur tous les animaux vigiles afin de suivre l'évolution de la fonction rénale des animaux. Les animaux seront ensuite euthanasiés 67 jours après la greffe de rein ou bien dès lors qu'ils montreront des signes de souffrance, de douleurs trop importantes ou une insuffisance rénale. Les greffons seront ensuite prélevés sur les animaux euthanasiés pour les analyses du rejet humoral médiés par les différentes formes d'anticorps.
Impact sur les animaux
Pour les souris donneuses, aucune nuisance ou effets indésirables ne sont attendus. Ces animaux sont élevés et hébergés en conditions standards et ne subissent qu’une seule procédure de classe sans réveil consistant à prélever leur rein gauche et leur rate. Concernant les souris receveuses, des nuisances sont attendues sur ces animaux. Nous prévoyons que les animaux seront atteints d'insuffisance rénale pouvant provoquer des pathologies et différents symptômes comme de la perte de poids, de la fatigue, des vomissements, des oedèmes, des troubles du rythme cardiaque, de l'hypertension artérielle. Cependant, grâce à notre expérience acquise auprès des patients présentant ce type de pathologie, et dans un souci de respect du bien-être des animaux, nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des procédures expérimentales basés sur des paramètres mesurables non invasifs. Ainsi, nous pourrons éviter des souffrances non nécessaires aux animaux. De même, les souris receveuses ayant un phénotype dommageable car immunodéficientes, elle ont des risques accrus d'infections. Néanmoins, celles-ci seront euthanasiés avant l’apparition de ce phénotype dommageable si celui-ci survient. Tout est mis en oeuvre pour limiter les risques d'infections. Pour cela, nous avons mis en place une grille d'évaluation de la douleur et des points limites afin d'euthanasier les animaux si des symptomes infectieux se déclarent.
Devenir
Les souris donneuses seront euthanasiées pendant l'anesthésie générale visant à prélever le rein gauche pour la transplantation et la rate pour l'extraction des splénocytes. Les souris receveuses seront quand à elles euthanasiées après la transplantation rénale si elles montrent des signes de souffrance et de douleurs trop importants ou des signes d'insuffisance rénale. Au plus tard, elles seront euthanasiées 67 jours après la transplantation rénale.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être limitée à une approche cellulaire qui ne prend pas en compte les interactions multiples qui existent entre divers types cellulaires et notamment entre les différentes cellules immunitaires et les cellules des vaisseaux sanguins du greffon.
Réduction
Effectif calculé au plus juste à partir des tests de comparaison de moyennes qui permettent de définir le nombre d'individus nécessaires. Pour toutes les procédures expérimentales qui seront mises en œuvre, le nombre de souris par groupe sera de 57 souris analysables après l’opération chirurgicale.
Raffinement
Les animaux recevront une anesthésie pendant la chirurgie, ainsi qu’une analgésie pendant et après la chirurgie de façon systématique. Les animaux seront surveillés au quotidien avec des critères définis et le recours à des doses supplémentaires d’analgésiques est prévu pour éviter toute souffrance. Les animaux disposent également d'un enrichissement du milieu adapté aux conditions post-opératoires avec notamment un accès facilité à l’eau et à la nourriture.
Choix des espèces
Il s’agit d’une espèce chez laquelle la greffe de rein a été décrite depuis 1978, avec de nombreuses descriptions ultérieures d’amélioration de la technique. Ainsi, la procédure de greffe est très bien détaillée dans la littérature. Mus musculus est une des seules espèces pour laquelle il existe des souches agammaglobulinémiques. L'utilisation de souris est justifiée pour la génération d'un rejet par transfert passif d'alloanticorps caractérisés au préalable. L’immunologie de la souris est également très bien décrite puisqu’il s’agit d’une espèce très utilisée dans ce domaine.
Role de Foxk1 dans la lutte anti-tumorale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales par injection intradermique et intraveineuse, puis des lymphocytes T modifiés, pour étudier le rôle de la protéine Foxk1 dans la réponse anti-tumorale. Le porteur indique que la croissance tumorale peut entraîner perte d'appétit, perte de poids et perte de sociabilité, et que les animaux dont les atteintes persistent au-delà de huit jours sont mis à mort. Il affirme qu'il n'existe "aucune alternative" à l'expérimentation animale et que le recours à la souris est "crucial".
Objectifs
Les réponses immunitaires efficaces contre les cellules malignes et les pathogènes sont le résultat de processus cellulaires complexes et hautement coordonnés. Au cours des dernières décennies, d'importants efforts de recherche ont montré que des cellules immunitaires appelées cellules T jouent un rôle central dans le développement de ces processus. Le développement de drogues qui ciblent les cellules T est apparu comme un mode d'action efficace pour renforcer l'activation des lymphocytes T contre les cellules cancéreuses. Les thérapies basées sur des modifications génétiques qui ciblent les cellules T constituent une deuxième approche fructueuse et offrent un moyen unique d'armer les lymphocytes T pour éliminer certaines tumeurs. Cependant, malgré le succès remarquable de l'immunothérapie du cancer, tous les patients ne répondent pas à ces nouveaux traitements et certains développent des signes cliniques liés à des effets secondaires nocifs. L'activation des lymphocytes T est intimement liée aux activités métaboliques qui dictent l'ampleur de la réponse immunitaire. À cet égard, le ciblage des composants moléculaires impliqués dans l'aptitude métabolique des cellules T est très prometteur pour améliorer les fonctions anticancéreuses de ces cellules. Un de ces composants moléculaires appelé Foxk1 a été identifié comme étant un acteur clé du métabolisme des cellules T et constitue en ce sens une cible intéressante pour moduler les fonctions effectrices des cellules T contre les cellules cancéreuses. Le projet vise donc à caractériser le rôle de Foxk1 dans les cellules T, et à réguler ses fonctions dans le contexte des réponses anti-tumorales.
Bénéfices attendus
Un défi important dans la recherche biomédicale actuelle et son application pharmaceutique en immuno-oncologie est d'identifier les mécanismes moléculaires qui peuvent être ciblés pour reprogrammer les cellules T, et modifier leurs fonctions et leur devenir, afin de mieux contrôler les réponses anticancéreuses. Dans ce contexte, la reprogrammation du métabolisme des cellules T apparaît comme une voie alternative et prometteuse pour moduler les réponses des cellules T. Ainsi, le projet présenté ici explore cette possibilité en se concentrant sur Foxk1 qui constitue un candidat prometteur pour contrôler le métabolisme des cellules T et qui pourrait donc faire l'objet d'une intervention pharmaceutique visant à augmenter ou à diminuer les fonctions des cellules T. Par ailleurs et au-delà du facteur de transcription Foxk1, ce projet constitue une preuve de principe pour cibler les effecteurs impliqués dans les programmes métaboliques, offrant de nouvelles opportunités thérapeutiques pour reprogrammer les cellules T dans les réponses anticancéreuses.
Procédures
Les animaux impliqués dans cette recherche seront greffées avec des cellules tumorales (par injection intradermique et injection intraveineuse). Des cellules T modifiées seront subséquemment injectées par voie intraveineuse afin de déterminer leur effet sur dans la réponse anti-tumorale. Chacune de ces 3 types de procédures se déroule sur plusieurs minutes.
Impact sur les animaux
Du fait des protocoles envisagés, plusieurs nuisances sont attendues sur les animaux. 1. les animaux seront soumis à des anesthésies avec possiblement une conséquence de déshydratation. 2. l’injection et la croissance tumorale pourra conduire à une perte d’appétit, une perte de poids et perte de sociabilité vis-à-vis des congénères.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin d'analyser les tailles de tumeurs, les infiltrats cellulaires aux seins de ces tumeurs et des ganglions drainant. De manière générale, le suivie de la réponse immunitaire et en particulier des lymphocytes T, objet de l'étude, nécessite l'euthanasie des animaux à l'issue des procédures.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucune alternative à l’expérimentation animale lorsqu’il s’agit de modéliser les processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un contexte tumoral. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est cruciale.
Réduction
Nous souhaitons étudier des populations cellulaires dont certaines sont rares mais dont la distribution suit une loi normale N ( μ = 15, σ = 3). Sur la base de nos expériences antérieures et des données de littérature traitant du suivi de la croissance tumorale, nous savons que des groupes de maximum 5 animaux (suivi immuno) et 10 animaux (croissance tumorale), analysés avec le test two-tailed student’s test with welch’s correction nous permettent d’obtenir des résultats significatifs et doivent être réalisés en duplicat pour être publiables. La validité statistique des résultats (différence significative entre les groupes) sera évaluée par les tests statistiques suivants : two-tailed student’s test with welch’s correction ANOVA et/ou Mann Whitney.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animale de notre établissement. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les souris afin d'obtenir des données qui soient le moins biaisées possible par le "mal être" de l'animal. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (transplantation de cellules tumorales, injection intraveineuse). Nous allons implanter des cellules tumorales par injection sous cutanée puis traiter les animaux pour réduire le développement tumoral. Nous porterons une attention particulière à la taille de la tumeur et au poids de l’animal mais aussi à leur posture et leur comportement en groupe. Les animaux seront observés 1 à 2 fois par semaine post injection des cellules tumorales et un tableau listant les points limites suivants sera utilisé. Si les points limites persistent au-delà de 8 jours, l’animal sera euthanasié. Pour toute expérience nécessitant une manipulation de l’animal, ceux-ci seront anesthésiés avec les méthodes autorisées. Le suivi des points limites sera réalisé par les expérimentateurs impliqués dans le projet (Chercheur, post doc, ingénieur, étudiant en thèse).
Choix des espèces
Il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin de mimer le plus fidèlement la pathologie cancéreuse humaine et d'étudier en détail l’infiltrat immunitaire associé au développement tumoral et le comparer à l’infiltrat immunitaire présent lors du rejet tumoral. Dans le laboratoire, nous avons choisi de travailler sur la souris comme modèle animal car nous pouvons facilement les manipuler génétiquement et aussi nous pouvons reproduire au mieux la complexité biologique du système immunitaire dans le développement tumoral.
Étude de la circulation des cellules ILC2s au cours de l’inflammation de type 2.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont jointes chirurgicalement deux par deux par parabiose, opération d'environ 45 minutes créant une circulation sanguine commune, puis reçoivent des injections et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital sous anesthésie. Le porteur décrit un protocole "parfaitement maîtrisé" et une "absence de signes quantifiables de souffrance". Il étudie la circulation de cellules immunitaires liées à l'asthme et renvoie les applications thérapeutiques au long terme.
Objectifs
Le système immunitaire permet de se défendre contre les agressions des pathogènes, mais sa dérégulation est aussi impliquée dans le développement diverses maladies telles que l’asthme. Le système immunitaire est partagé en deux grandes parties : la partie innée, préexistante, et reconnaissant des caractéristiques partagées entre différents pathogènes, et la partie adaptative, qui comme son nom l’indique s’adapte en fonction du pathogène rencontré, par des jeux de sélection et de prolifération de cellules extrêmement spécifiques du pathogène en question. Les cellules innées de groupe 2 (ILC2s) sont des lymphocytes innés résidents des tissus (poumons/intestin). Elles participent à la défense contre les parasitique, à la réparation tissulaire mais aussi aux processus physiopathologiques comme l’asthme. Les ILC2 se développent dans la moelle osseuse puis se maintiennent à long terme dans les tissus, avec la capacité de proliférer et répondre in situ en cas d’inflammation. Des résultats récents indiquent cependant qu’il existe des sous-populations ILC2s circulantes stimulées par l’inflammation et impliquées dans le maintien de l’intégrité d’un tissu, selon un axe intestin-poumon et/ou axe moelle osseuse-poumon. La fonction de ces ILC2s est encore peu connue (inflammation/régénération). Seules des expériences de parabioses peuvent permettre dans un même tissu de différencier les cellules ILC2s circulantes du sous-groupe des cellules résidentes. Les objectifs du projet sont donc 1- de déterminer les situations inflammatoires qui aboutissent à une circulation d’ILC2 2- comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette circulation 3- déterminer le stade de développement auquel les ILC2s circulent (progéniteur ou cellule mature) 4- déterminer l’importance physiologique de ce recrutement sur la situation inflammatoire et la régénération tissulaire. Cliniquement, il est important de comprendre ces processus car dans les cas d’allergies et asthme, la présence d’ILC2 en circulation corrèle avec une évolution défavorable ; déterminer leur rôle et mode de migration nous permettra d’envisager de bloquer leur migration chez les patients à risque.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit la circulation des ILC2 en détaillant les mécanismes moléculaires mis en jeu par cette population pour se propager dans les tissus en inflammation. Le mode de circulation de populations cellulaires initialement considérées comme résidentes est encore peu compris mais des données préliminaires indiquent que leur rôle serait crucial pour obtenir une réponse adaptée du tissu. A long terme, ces données moléculaires de la circulation de sous-populations d’ILC2s pourrait représenter une source importante de moyen d’actions supplémentaires pour lutter contre les crises d’asthme ou d’allergies non résolues par les corticoïdes. Ces cas sont nombreux et en constante augmentation au vu du nombre croissant d’allergies dans le monde. Il est clairement établi que ces ILC2 seraient « trop » inflammatoires dans le cas d’inflammation chronique de type 2 et donc qu’un moyen d’empêcher la mise en place d’un recrutement constant de cellules supplémentaires dans les voies aériennes des patients pourraient représenter une chance thérapeutique de deuxième intention.
Procédures
• Chirurgie de parabiose : 1 chirurgie par animal, environ 45 minutes d’anesthésie générale • Prélèvements de sang au sinus rétroorbital sous anesthésie, 1 fois 5 minutes. Si le chimérisme n’est pas effectif, les animaux pourront être prélévés de la même manière à 4 semaines et à 6 semaines • Des injections de molécules non toxiques seront réalisées dans l'abdomen des animaux anesthésiés à raison de 3 à 7 fois sur une semaine. Des administrations de molécules non toxiques seront réalisées en intranasale sur des animaux anesthésiés à raison de 2 à 3 fois. Pour ces interventions les anesthésies sont de l’ordre de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Le protocole de parabiose est parfaitement maîtrisé dans notre laboratoire tant au niveau réalisation qu'au niveau de la gestion de l'analgésie pré et postopératoire avec une absence de signes quantifiables de souffrance animale, sans réduction de la mobilité. Injections de cytokines et d’anticorps antagonistes. Toutes les injections sont réalisées par voie intrapéritonéale ou intranasale après anesthésie des animaux en utilisant l’isoflurane, le dépôt dans la première narine est réalisé en sortant la souris une minute de la chambre à induction suivi d’un retour et du dépôt dans la seconde narine de façon identique. Ces injections n’induisent pas de douleur perceptible chez les animaux traités (pas de perte de poids, pas de changement de comportement alimentaire, pas de perturbation du comportement social ou nerveux (mobilité, interactions, agressivité ou prostration).
Devenir
les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Aucune data préliminaire in vitro ne peut être réalisée pour motiver cette étude de circulation. La présence d’une fréquence de cellules ILC2s non négligeable dans le sang de patients asthmatiques contrairement aux contrôles sains est une motivation importante pour décider de comprendre ce qui génère des cellules circulantes à partir de populations résidentes et le mécanisme de circulation mis en place. La circulation des populations immunes à travers les différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules circulantes versus celles résidentes et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro n’existe pour obtenir des résultats préalables.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, l'étude des mécanismes moléculaires (anticorps bloquants) ne sera réalisée que si le taux circulation des ILC2s est significativement différent entre les conditions testées. De plus, les données de la littérature et celles déjà générées au laboratoire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement dans les conditions adéquates où l'augmentation du taux circulant des ILC2s est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations ILC2s bloquées avaient plutôt un effet inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.
Raffinement
Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de les habituer et de limiter leurs stress. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement lors de la première semaine post-chirurgie, puis deux à trois fois par semaine afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer régulièrement la souffrance des souris, et des points limites ont été définis. Une fiche d’observation tout au long des procédures permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer des antalgiques selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures.
Choix des espèces
Une circulation d’ILC2s chez l’homme est corrélée à la sévérité des allergies/crises d’asthme. La souris est un modèle de choix par la forte similitude des systèmes immunitaires humains/murins. Elles sont les plus facilement manipulables (chirurgie ici et génétiquement modifiées) pour comprendre la circulation (système sanguin/lymphatique et production des cellules immunes). Nous avons besoin de travailler avec différents types de souris depuis longtemps utilisées dans les laboratoires et qui ne présentent pas de signe de souffrance. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 10 semaines après la naissance, afin d’avoir un système immunitaire mature). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris. Cependant, des animaux plus âgés ont aussi une peau plus épaisse. Nous éviterons donc de les utiliser.
Impact d’une infection à Listeria monocytogenes du cerveau sur l’immunité cérébrale et la neurodégénérescence.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Infectées par la bactérie Listeria monocytogenes par gavage, par injection dans le cerveau sous anesthésie ou par voie intraveineuse, puis traitées par trois injections d'antibiotiques, 1 250 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes sont tuées à la fin pour l'étude de leurs organes. Dans un groupe, une encéphalite auto-immune est ensuite déclenchée par des injections, et des souris transgéniques 5xFAD, qui développent des troubles proches de la maladie d'Alzheimer, passent tous les quinze jours pendant sept mois un labyrinthe de Barnes et un test sur cylindre rotatif. Le projet cherche comment les cellules immunitaires du cerveau, après une infection, favorisent ou freinent des maladies neurodégénératives, et n'évoque des cibles thérapeutiques qu'au conditionnel. Le porteur déclare un niveau léger à modéré, et décrit une infection qui peut paralyser les pattes et une encéphalite qui peut priver les souris de mobilité pendant 7 à 15 jours.
Objectifs
Nous cherchons à définir l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur la santé cérébrale après l’infection. En effet, les altérations du système immunitaire cérébral sont susceptibles de favoriser ou au contraire protéger le cerveau contre des dommages ultérieurs, notamment les maladies neuronales et neurodégénératives telles que la sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson. Ce projet permettra à la fois d’étudier comment s’effectue la réparation du système immunitaire cérébral après la résolution d’une infection ainsi que les mécanismes menant à une sensibilité accrue ou diminuée aux futurs dommages neuronaux.
Bénéfices attendus
Sur un plan des connaissances scientifiques, nous chercherons à déterminer les rôles respectifs du système immunitaire cérébral (microglie) et périphérique (monocytes provenant du sang) dans la réponse aux infections du système nerveux central, ainsi que leur rôle dans l’apparition de troubles cognitifs après l’infection. La comparaison des séquelles neurologiques induites en présence ou absence de la microglie et/ou des monocytes permettra de mettre en évidence le rôle de chacune de ces populations immunitaires dans les séquelles neurologiques apparaissant après la guérison de l’infection. Nous chercherons à mettre en évidence les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’apparition de ces troubles cognitifs, pour comprendre comment les cellules immunitaires ayant joué un rôle dans la résolution de l’infection cérébrale (microglie ou monocytes recrutés) peuvent ensuite adopter un phénotype dommageable pour le bon fonctionnement cérébral. L’identification de ces mécanismes permettrait de mettre en évidence des cibles thérapeutiques utiles dans le traitement des séquelles neurologiques post-infectieuses.
Procédures
Procédure 1 : les animaux seront soumis soit à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), soit à une injection intracérébrale sous anesthésie générale (durée d’environ 10 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Procédure 2 : les animaux seront soumis à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils subiront 1 injection cutanée et intrapéritonéale sous anesthésie gazeuse (générale, durée des 2 injections : environ 5 minutes) pour induire la réponse auto-immune, et une dernière injection intrapéritonéale (durée d’environ 30 secondes) pour achever l’induction de la réponse autoimmune, sur animal vigile. Procédure 3 : les animaux seront soumis à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils seront soumis à des tests cognitifs tous les 15 jours pendant 7 mois, consistant en un test de mémoire (trouver la bonne sortie parmi plusieurs qui se ressemblent, un test durant environ 30 minutes) et un test moteur (rester le plus longtemps possible sur un cylindre rotatif, durée d’environ 15 minutes).
Impact sur les animaux
Dans l’ensemble des procédures l’infection induit un degré de souffrance : perte de poids, « sickness behaviour » et atteinte cérébrale qui peut parfois induire des paralysies des pattes des souris. Dans la procédure n°1, un niveau de douleur modéré sera à prendre en compte suite à l’inoculation intracraniale de bactéries, qui sera pris en charge par antalgiques. Dans la procédure n°2, l’induction d’encéphalite autoimmune est susceptible d’engendrer une perte de mobilité par paralysie des membres, d’une durée variable entre 7 et 15 jours selon la littérature. Dans la procédure n°3, au cours du vieillissement des souris de souche 5xFAD on notera l’apparition de signes associés à la maladie d’Alzheimer tels qu’une perte de mémoire et des capacités d’interaction sociale diminuée. Ces troubles apparaissent progressivement, à partir de 6 mois d’âge environ.
Devenir
Les procédures nécessitent toutes une mise à mort des animaux à la fin de la procédure afin d’étudier leurs organes par diverses techniques. Il n’y aura donc pas d’animaux laissés en vie à la fin du projet.
Remplacement
L’étude de l’interaction entre le système immunitaire et le fonctionnement du système nerveux central nécessite un hôte animal car les mécanismes d’interaction entre ces 2 systèmes cellulaires complexes ne peuvent pour l’instant pas être modélisés in vitro. En particulier pour comprendre les séquelles induites par une infection et les conséquences à long terme, il est absolument nécessaire de mener les études dans un hôte animal qui est capable de régénérer les tissus altérés.
Réduction
Pour l’observation du comportement des animaux, nous suivrons dans le temps les mêmes individus, ce qui permet 1) d’augmenter la puissance statistique de l’étude et 2) éviter de mettre à mort un animal après un unique test comportemental (sauf pour le test du labyrinthe de Barnes car les animaux s’habituent à ce test au fil du temps) . Pour les études de la réponse immunitaire au sein du cerveau, le cerveau des souris disséquées sera séparé en 2 hémisphères, un hémisphère étant utilisé pour l’analyse histologique par immunofluorescence et l’autre pour la cytométrie en flux. Cela permettra de diminuer par 2 le nombre de souris nécessaire pour ces expériences. Afin de vérifier que les 2 hémisphères cérébraux ne réagissent pas de manière différente à l’infection nous vérifierons l’absence de différence entre les analyses effectuées sur les hémisphères droits et gauches. Nous utiliserons également des souches de Listeria monocytogenes dites « fortement neuroinvasive » qui induisent de manière très reproductible une infection du système nerveux central après gavage. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux inoculés par rapport à l’inoculation des classiques souches de laboratoire de Listeria qui n’induisent une infection du système nerveux central que dans une petite proportion des animaux inoculés. Les effectifs des populations de souris auxquelles nous aurons recours sont établis en tenant compte des tests statistiques permettant d’obtenir une significativité du résultat obtenu (test de Mann-Whitney (deux groupes non appariés), Wilcoxon (deux groupes appariés) ou ANOVA (plus de deux groupes) pour les comparaisons de valeur avec faible effectif, se basant sur une distribution non gaussienne des résultats).
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe, avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. L’état général des animaux sera suivi. Les paramètres observés seront : poil ébouriffé, apparence corporelle/body condition, expression faciale/mouvement. Une aide à la thermorégulation sera mise en place dans toutes les cages pour éviter l’hypothermie : abri en carton, matériel de nidification (coton/papier) et chaufferettes. Une réhydratation par voie sous-cutanée (Ringer Lactate) et mise à disposition d’eau gélifiée sera entreprise pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané). Les animaux présentant un état pathologique trop avancé (score de 2 pour un paramètre de la grille proposée par le comité d’éthique, ou perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou un score d’encéphalite ≥ 4) seront mis à mort. La douleur induite par l’injection intracrâniale sera limitée en injectant les souris avec un antidouleur (buprénorphine) avant et après l’injection, qui se fera sous anesthésie gazeuse et en appliquant un anesthésique local sur la zone à injecter. Le stress induit par l’encéphalite autoimmune (paralysie → difficulté d’accès à la nourriture, de thermorégulation, de nettoyage) sera limité en multipliant les source d’accès à la nourriture et à de la gélose hydratante au niveau du sol de la cage, ainsi qu’en chauffant les cages avec des chaufferettes pour aider la thermorégulation des souris. Les animaux seront pesés le jour précédant l’infection puis, au minimum, à partir du jour 3 quand les animaux commencent à perdre du poids du fait de l’infection. La pesée aux deux premiers jours ne sera pas systématique et dépendra de l’état apparent de l’animal. Cela permettra de limiter les manipulations à un moment où les animaux ne perdent pas de poids d’après notre expérience.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de choix pour l’étude de la réponse immunitaire, un grand nombre d’outils et de lignées transgéniques ayant été développés pour étudier la réponse immunitaire des souris. Il s’agit également d’un bon modèle en neurosciences, les souris ayant certaines capacités cognitives suffisamment développées pour étudier l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur des fonctions neuronales ciblées pour ce mammifère. Nous utiliserons des souris adultes, pour ne pas interférer avec les phénomènes de neurodéveloppement dans notre étude. Les souris adultes seront âgées de 2 à 9 mois, les plus âgées (6 à 9 mois) seront utilisées pour 1) le suivi à long-terme des conséquences de l’infection, et 2) pour étudier le phénomène de neurodégénerescence dans les souris 5xFAD qui commencent à développer des troubles à partir de l’âge de 6 mois.
Etude du potentiel thérapeutique du blocage des protéines X et Y dans le lymphome T chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures classées en gravité modérée. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules de lymphome T sous anesthésie, puis trois à cinq injections intra-péritonéales de molécules ou de placebo, pour tester le blocage de deux protéines de surface. Le porteur décrit un modèle "sans phénotype dommageable" et une "angoisse légère et de courte durée", formulation en retrait de la gravité modérée déclarée. Il présente cette portée comme "translationnelle" et le recours à la souris comme la seule voie de validation faute de systèmes in vitro fiables.
Objectifs
Les lymphomes T constituent une famille de cancers hématologiques. Les patients atteints de lymphomes T sont traités par poly-chimiothérapies ; toutefois ces traitements sont peu efficaces et il n’existe que très peu d’alternatives thérapeutiques. L’utilisation des immunothérapies, qui ont révolutionné la prise en charges de nombreux types de cancers, est à ce jour quasi-inexistante dans les lymphomes T du fait de l’absence de cibles thérapeutiques bien établies. Nos travaux réalisés chez l’homme in vitro, suggèrent que deux molécules de surface exprimées par les cellules tumorales, nommées X et Y pourraient constituer des cibles intéressantes. Pour valider leur potentiel thérapeutique, nous souhaitons désormais évaluer l’effet de leur blocage dans deux modèles de lymphomes T chez la souris.
Bénéfices attendus
Ces travaux ont avant tout une portée translationnelle, puisqu’ils pourraient permettre d’établir X et /ou Y comme des cibles potentielles d’immunothérapie chez les patients atteints de lymphomes T.
Procédures
-1 injection de cellules (lymphome T) par voie intraveineuse, sous anesthésie isofluorane (30 secondes/souris) -3 à 5 injections par voie intra-péritonéale, de molécules thérapeutiques (ou de leur placebo) dans un volume total de 100µL. (3 à 5x30 secondes/souris)
Impact sur les animaux
Nos modèles murins ne présentent pas de phénotype dommageable. L’injection de cellules de lymphomes T n’induit pas d’effets secondaires détectables dans la fenêtre de temps de l’étude. Chez la souris, l’injection des thérapies que nous souhaitons tester n’induit pas d’effets secondaires délétères détectables. Les souris reçoivent au total 3 à 5 injections de médicament ou de placebo par voie intra-péritonéale. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité légère, susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale ; les rates, ganglions lymphatiques et foies seront prélevées pour pesée et analyse du phénotype immunitaire .
Remplacement
Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences dans un contexte physiologique pertinent, c’est-à-dire chez l’animal. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature. Nous avons ainsi calculé une taille d'échantillon de 5 souris par groupe. Un replicat expérimental sera réalisé si la première exépérience est concluante, afin de renforcer la signification statsitique des données, et de pallier à un problème technique éventuel (ce réplicat ne sera pas fait si les résutlats de la première expérience sont négatifs).
Raffinement
Certaines procédures peuvent induire une douleur légère (injections intraveineuses et intra-péritonéales). Les protocoles d’injection que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de lignées de lymphomes T et de réactifs bloquant nos cibles thérapeutiques d’intérêt, qui a notre connaissance n'ont pas été devéloppés dans d'autres modèles pré-cliniques. De plus notre laboratoire a développé une expertise unique dans l'analyse du système immunitaire chez la souris, et a tous les réactifs nécessaires à disposition. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 12 semaines.
Impaired organ repair after sepsis: role of tissue resident macrophages and recruited monocytes (ORISMO)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
570 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ligature-ponction du caecum destinée à provoquer une infection généralisée, une ablation partielle de rein et une injection de tamoxifène, pour étudier la réparation du rein après un sepsis. Le porteur indique une perte de poids de 10 à 15 % et une baisse d'activité de plusieurs jours, et annonce un traitement de la douleur au site opératoire. Les objectifs cliniques, de nouvelles thérapeutiques pour les patients survivant à une infection grave, sont formulés au conditionnel, tandis qu'il affirme que seul le modèle animal approche la complexité du sepsis humain.
Objectifs
Evaluer le rôle des cellules immunitaires dans la réparation rénale après une infection grave
Bénéfices attendus
La plupart des avancées récentes dans le traitement des infections graves se sont focalisées sur le traitement de la source infectieuse plus que le contrôle de la réponse immunitaire. A l'heure actuelle, on observe un surrisque de maladies cardiovasculaires, d'insuffisance rénale et de cancer chez les patients qui survivent à une infection grave (pneumonie, infection urinaire, infection abdominale). Mieux comprendre le role du systeme immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'infection pourrait permettre de dégager de nouvelles thérapeutiques et un meilleur suivi de ces patients.
Procédures
les animaux seront soumis à 3 procédures: - injection intra-péritonéale de tamoxifen (durée 2minutes) - Procédure chirurgicale de ligature ponction caecale (durée 10minutes)- procédure chirurgicale de nephrectomie, clampage du pédicule vasculaire rénal (durée 35minutes)
Impact sur les animaux
Les procédures chirurgicales peuvent s'accompagnées de douleur au niveau du site opératoire, celle-ci sera systématiquement recherchée et un traitement antalgique sera administré à tous les specimen, possiblement réitéré à plusieurs reprise en cas de persistence de signes d'inconfort. La perte de poids est une complication attendue de l'infection, celle-ci n'excède pas 10-15% du poids corporelle, et regresse en quelque jours après la guérison. La diminution de l'activité est également attendue et habituelle (composante du comportement maladie) et n'excède pas 5-7 jours au dela des différentes procédures
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort.
Remplacement
Le sepsis est une maladie complexe et multi-systémique qui associe une intense activation immunitaire, une défaillance circulatoire, des altérations endothéliales à divers degrés. A ce jour, seule l'utilisation de modèles animaux permet d'approcher la complexité du sepsis chez l'homme. Le modèle de ligature ponction caecale que nous utiliserons est largement étudié et le plus utilisé dans la littérature.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, les animaux seront leurs propres contrôles pour un suivi au cours du temps (analyse rein droit puis rein gauche), ceci afin de réduire leur nombre. Le nombre d'animaux par groupe à été déterminé par calcul de puissance necessaire à mettre en évidence une différence significative entre les groupes avec le minimum de specimens.
Raffinement
Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien être des animaux lors des procédures expérimentales les mesures suivantes seront prises: surveillance acccrue toute les 12h dans les 48h suivants la procédure. Administration systématique d'antalgique chez tous les specimen après chirurgie et réadministration à H24, h36, h48 chez les animaux montrant des signes de mal-être voire mise à mort dans les cas extrèmes (au moyen d'un scoring clinique, qui liste les points limites à partir desquels les antalgiques ou de mise à mort sont prises). Surveillance accrue 2 fois/jours pendant les 3 premiers jours après chirurgie.
Choix des espèces
Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle de sepsis comporte de nombreuses similitudes par rapport à un sepsis polymicrobien abdominal chez l’Homme. L'utilisation du modèle murin pour l'étude de la réponse immunologique au sepsis est le modèle le plus couramment utilisé. Souris mâles jeunes adultes de 4-8 semaines environ Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme