Système immunitaire
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Rôles des NKs lors de l’infection par une bactérie chez la souris déficiente en protéine IRF2
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Francisella novicida par voie intradermale, certaines après une injection dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine IRF2 dans la réponse immunitaire. Le porteur décrit des points limites, léthargie, prostration, détresse respiratoire, déclenchant la mise à mort, et affirme que la phase précoce de l'infection reste peu agressive. Il qualifie ces expériences d'"absolument indispensables" et justifie le recours à la souris par l'accès aux animaux génétiquement modifiés.
Objectifs
La tularémie est une maladie causée par la bactérie Francisella novicida. Elle touche les mammifères, particulièrement les lièvres et les rongeurs. Ceci permettra d’utiliser la souris comme modèle d’étude, afin d’avoir accès aux KO. La tularémie est une zoonose et peut être transmise à l’homme et causer des problèmes cutanés, digestifs ou respiratoires. C’est une maladie à déclaration obligatoire. Environ 50 cas de tularémie sont déclarés chaque année en France. La tularémie représente également une arme bactériologique. L’objectif de l’équipe est de mieux caractériser les réponses immunes induites lors d’une infection par Francisella, et notamment le rôle des Interferon Regulatory Factors (IRFs), facteurs de transcription impliqués dans la régulation de l’expression ainsi que la réponse aux interférons de type 1, cytokines essentielles pour la régulation de l’inflammasome mais dont le rôle n'est pas bien connu lors des infections bactériennes. Grâce à des travaux préliminaires dans l’équipe, un rôle d’IRF2 dans la régulation de l’inflammasome in vitro a été identifié. L'objectif serait donc de tester si IRF2 joue également un rôle in vivo dans la régulation de l’inflammasome. Pour ce faire, un modèle d’infection murin intradermal par la bactérie Francisella novicida sera utilisé. De plus, étant donné le rôle majeur des cellules Natural Killer (NKs) durant la réponse anti-bactérienne innée contre Francisella, les rôles des NKs et leur état d’activation lors de l’infection par Francisella novicida dans des souris WT ou déficientes pour IRF2 seront étudiés. Le ciblage d'IRF2 pourrait fournir de nouvelles modalités thérapeutiques pour le traitement de pathologies médiées par l'inflammasome. Les résultats attendus in vivo sont une susceptibilité à Francisella novicida conduisant à une mort prématurée des animaux IRF2 -/- infectés comparés aux WT. Le nombre d’UFC dans les organes des souris WT et IRF2 -/- sera quantifié. Les concentrations des cytokines IL-1b, IL-18 et IFN-g seront également dosées dans le sérum de ces animaux. Les résultats obtenus lors d’une infection par Francisella pourraient être extrapolés pour d’autres pathogènes intracellulaires. Des études préliminaires au laboratoire ont montré que l'expression de la Gasdermine D est régulée par IRF2. Des souris déficientes pour la Gasdermine D, protéine cytosolique qui médie la pyroptose, mort cellulaire programmée activée par l'activation de l'inflammasome, seront donc également utilisées.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux caractériser comment le facteur de transcription IRF2 affecte la réponse immunitaire de l’hôte. Une meilleure compréhension de ce système devrait aider au développement de nouveaux médicaments impliqués dans la réponse immunitaire chez l’hôte, notamment en ciblant la voie des IFN de type 1.
Procédures
Les animaux subiront une injection IV à J0 dans le sinus rétro-orbital une fois (2 minutes par injection), puis 3h après, à J0, ces mêmes animaux subiront une injection intradermale de Francisella novicida (2 minutes par injection) (Procédure #2). Les animaux seront sacrifiés 48h pi 51 minute par injection) avant la collecte des organes et du sang. Pour les Procédures #1 et 3, les animaux subiront une injection intradermale de Francisella novicida à J0 (2 minutes par injection) et seront mis à mort 48h post infection (1 minute par injection) avant la collecte du sang et des organes pour la procédure #1, et au plus tard une semaine après à J7 pour la procédure #3 (développement des symptômes).
Impact sur les animaux
Le transfert de NKs ne devrait créer aucun stress. Cependant, les injections en rétro-orbitale seront réalisées sous brève anesthésie à l'isoflurane après application d'un collyre anesthésique sur l'oeil. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroide et un antibiotique à large spectre (framycétine). Concernant l’infection, les animaux seront surveillés tous les jours avec des points limites parfaitement définis. La souche bactérienne utilisée est très bien caractérisée et les souris ne resteront pas plus de 48h en sa présence (Procédures #1 et 2), ce qui correspond à la phase précoce de l’infection, connue pour être moins agressive. Les animaux ne perdent pas de poids dans les 48 premières heures de l'infection. Pour la procédure #3, expérience de développemnt des symptômes, le nombre de CFU utilisé est moindre (1000 CFU) par rapport aux procédures #1 et 2 (5000 CFU) et les animaux seront surveillés une fois par jour dès 24h puis deux fois par jour à partir de 72h d’infection pour détecter toute forme de souffrance. Les animaux seront mis à mort en cas d'atteinte des points limites suivants: pas de mouvement de fuite lors de la saisie, prostration, dos vouté, poils ébourrifés, détresse respiratoire.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux
Remplacement
Les questions posées ici nécessitent un système complexe, et ne peuvent pas être investiguées dans des modèles in vitro ou dans des modèles in vivo utilisant des animaux invertébrés. Toutes les expérimentations préliminaires ont été réalisées in vitro, afin de valider notre hypothèse.
Réduction
De nombreux paramètres de l’hôte et de la bactérie seront étudiés sur chaque animal pour réduire au maximum le nombre de répétitions expérimentales. Une étude bibliographique a été réalisée pour utiliser les doses les plus adéquates de pathogènes au cours des expériences. Les expériences réalisées ici sont considérées comme absolument indispensables pour connaitre le rôle d'IRF2 et des NKs, in vivo. L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique, et a été réduit au maximum sans mettre en péril l'interprétation statistique de nos résultats. Ainsi, un minimum de 7 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Pour les conditions naives, 3 animaux par groupe seront utilisés. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximal d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra être diminué en fonction des résultats obtenus, notamment si le projet in vivo n’est pas concluant. Ainsi, si la procédure #1 ne montre aucun phénotype notable, les procédures #2 et #3 ne seront pas réalisées.
Raffinement
Avant les procédures, les animaux seront entrainés à être contentionnés pour éviter tout stress pendant la procédure. Lors des procédures, les points limites sont suffisamment prédictifs pour éviter l’utilisation des antalgiques et il sera toujours possible d'arrêter la procédure de manière anticipée pour qu’à aucun moment, un animal ne souffre. En effet, en cas de souffrance, l’animal sera mis à mort. Une surveillance journalière (à partir de 24h d’infection) sera réalisée pour détecter toute forme de souffrance pour les procédures #1, #2 et #3, et bijournalière à partir de 72h pour la procédure #3. Plus concrètement pour l'infection: les souris seront suivies une fois par jour pour les procédures #1 et #2 pour détecter l’apparition du moindre point limite défini plus bas. Les souris seront mises à mort par injection d’exagon en cas d’atteinte de l’un des points limites suivants : animal léthargique : pas de mouvement de fuite lors de la saisie, prostration, dos vouté, poils ébouriffés, détresse respiratoire. Pour l'injection de NKs, dans le cas où l'oeil montrerait des signes d'inflammation après l'injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticosteroide et un antibiotique (framycétine).
Choix des espèces
La pertinence physiologique d’IRF2 et de Gasdermine D dans la réponse immune à Francisella ne peut être investiguée dans des modèles in vitro ou dans des modèles utilisant des animaux invertébrés du fait de la nécessité i) de travailler dans un système intégré, et ii) d'utiliser les souris pour avoir accès aux souris KO. Par ailleurs, les invertébrés ne présentent pas d’inflammasome. De plus, la souris est un très bon modèle d’étude de la réponse immune contre des bactéries intracellulaires. Nous utiliserons des souris transgéniques IRF2 KO ainsi que des souris non transgéniques IRF2 WT issues de mêmes portées. Il ne s'agit pas d'un phénotype dommageable. Des études préliminaires au laboratoire ont montré que l'expression de la Gasdermine D est régulée par IRF2. Nous réaliserons donc les procédures #1 et #3 également sur des souris déficientes pour Gasdermine D. La Gasdermine D est une protéine cytosolique qui médie la pyroptose, mort cellulaire programmée activée par l'activation de l'inflammasome. Souris de 6 à 8 semaines. Système immunitaire mature à l’âge adulte.
Etude in vivo des propriétés analgésiques d’une nouvelle classe de ligands du récepteur 5-HT7 de la sérotonine
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de formaline et d'adjuvant de Freund dans la patte pour provoquer une inflammation douloureuse, puis subissent des tests de douleur, immersion de la queue dans l'eau à 50 °C et stimulation des coussinets au filament de Von Frey. Le porteur indique que ces tests ne provoquent pas de lésion et justifie le recours à l'animal par la nécessité d'un "organisme entier" pour étudier le circuit de la douleur. Les bénéfices annoncés, un antidouleur sans effets secondaires, restent formulés comme un objectif de développement.
Objectifs
L’objectif du projet est de valider l’efficacité, l’innocuité et les avantages thérapeutiques de nouvelles petites molécules qui ciblent un récepteur de la sérotonine, le récepteur 5-HT7. La sérotonine, également appelé 5-hydroxytryptamine, est un neuromodulateur impliqué dans de nombreux processus cognitifs tel que l’apprentissage et la mémoire, mais également dans la régulation de comportements comme l’humeur, l’anxiété, l’appétit et la thermorégulation. Le récepteur 5-HT7 de la sérotonine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) exprimé par plusieurs organes et particulièrement dans le système nerveux central et le système nerveux périphérique (ganglions de la racine dorsal, moelle épinière, cerveau). Par sa localisation, il est impliqué dans de nombreuses pathologies neurodégénératives et neuro-inflammatoires, ainsi que dans le circuit de la douleur. Les ligands actuels ciblant le récepteur 5-HT7 possèdent des limitations en termes de sélectivité et de biodisponibilité. C’est pourquoi, nous avons initié un programme de synthèse de nouvelles molécules. Des études pharmacologiques in vitro montrent que ces molécules sont plus sélectives et très affines pour le récepteur 5-HT7. L’objectif est maintenant d’évaluer leur efficacité pour le traitement de la douleur dans des modèles précliniques. Il existe des traitements de la douleur, basés sur l’utilisation d’antidépresseurs, antiépileptiques, ou bien sur l’utilisation de molécules plus fortes, tels que les opioïdes et les dérivés morphiniques. Cependant, seul 50% des patients répondent à ces traitements et la plupart du temps, les traitements qui soulagent les douleurs induisent des effets secondaires indésirables. Ainsi, notre objectif est de poursuivre le développement de nos molécules qui ciblent spécifiquement le récepteur 5-HT7 de la sérotonine, afin de développer un candidat médicament pouvant être utiliser dans le traitement de la douleur sans induire d’effet secondaires indésirables. Ce projet nécessite l'utilisation de l'animal afin de considérer un organisme entier et de confronter nos ligands à la complexité des mécanismes neurologiques mis en jeu dans la réponse de douleur. Les protocoles cellulaires, utilisés au préalable, ne sont pas assez complexes et représentatifs des interactions entre cellules cérébrales et périphériques ainsi que des chemins neuronaux impliqués dans le circuit de la douleur.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal attendu du projet est le développement de molécules thérapeutiques, visant le récepteur 5-HT7 de la sérotonine, décrit dans l’item 5.5.1, pour le traitement de la douleur sans induction d’effets secondaires indésirables. Le développement pharmacologique de nos candidats médicaments pourrait non seulement avoir un impact sur la santé et le bien-être des patients mais également avoir un impact économique considérable puisque les douleurs sont la cause de la plupart des arrêts maladies.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Une administration unique des ligands et composés par injection sous-cutanée dans la nuque des animaux - Une administration unique de Formalin (formaldéhyde) en sous cutanée sur le dessus de la patte arrière - Une administration unique d’adjuvant de Freund (CFA, émulsion d’huile minérale et de mycobactérie inactivées par chauffage) au niveau des coussinets plantaires - Prélèvement de sang par ponction intracardiaque Les tests comportementaux de classe modérée réalisés sur les animaux seront les suivants : -Test « tail immersion » : pour évaluer la sensibilité de l’animal à la température par une réponse spinale, le test d’immersion de la queue sera réalisé. La partie inférieure de la queue de la souris sera immergée dans un bain-marie dans lequel la température de l’eau est stable et maintenue à 50°C. L’expérimentateur relèvera le temps nécessaire à la souris pour relever la queue. A la fin de l’expérience, d’une durée maximale de 20 secondes pour éviter tout risque de brûlure, la queue sera soigneusement séchée. A la suite du test d'immersion de la queue, chaque animal est observé individuellement selon la grille d'évaluation critère n°3 (3.4.13). Nous avons constaté que le temps de 20 secondes à 50°C ne génère pas de lésion. Compte tenu de la classe modérée de cette procédure, les animaux seront observés selon la grille d'évaluation (3.4.13) pour une durée de 3 jours suivant le test. -Test de Von Frey : Avant la procédure, les animaux sont habitués aux boîtes tests posées sur une grille métallique permettant de visualiser facilement le dessous des pattes. La méchanoréception basale est évaluée. Des tiges plastiques calibrées (eg. Von Frey Hair) de diamètres croissants, sont appliquées sur les coussinets du rongeur en exerçant des pressions croissantes (0.007g à 2g). La pression exercée avec ces tiges ne peut en aucun cas provoquer une lésion de la zone testée. Le temps de réaction du retrait de la patte est observé, reflétant ainsi la sensibilité tactile du rongeur. Cette procédure sera reproduite 24 heures après l’induction d’une inflammation locale des coussinets suite à une injection plantaire sous-cutanée avec l’adjuvant complet de Freund (10µl). Lors de cette procédure, le test de « Von Frey Hair » sera réalisé 3 fois sur une durée de 4 jours.
Impact sur les animaux
Les procédures mises en œuvres seront de classes modérées. Notre stratégie est thérapeutique et a pour but de tester les propriétés anti-nociceptive de ligands du récepteur 5-HT7. Ainsi, aucun effet indésirable n’est prévu sur les animaux lors de l’administration des composés. Si des signes de souffrances apparaissent au-delà des tests (>2h), un score sera établi afin de définir la marche à suivre. L’administration de Formalin, induit une inflammation au niveau du site d’injection. L’adjuvant complet de Freund (CFA, émulsion d’huile minérale et de mycobactéries inactivées par chauffage) est un mélange classiquement utilisé en immunologie afin de déclencher une réponse inflammatoire non spécifique et durable (>5 jours). Son injection au niveau des coussinets plantaires induit localement un œdème et une sensibilité tactile accrue dans la zone affectée. Cette hypersensibilité est mesurée grâce au système « Von Frey Hair » permettant de vérifier la sensibilité tactile de type méchanoréception. Les prélèvements de sang par ponction intracardiaque sont réalisés sous anesthésie gazeuse d’isoflurane et entraînent le décès de l’animal. Les prélèvements d’organes sont ensuite réalisés.
Devenir
Afin de pouvoir récolter des échantillons (sang et organes) pour analyser l'effet des différents ligands , les animaux seront mis à mort par inhalation de CO2 à l'issue de chaque procédures.
Remplacement
L’objectif du projet, évaluer l’effet analgésique de différents ligands du récepteur 5-HT7, nécessite l'utilisation de l'animal afin de considérer un organisme entier et de confronter nos ligands à la complexité des mécanimses neurologiques mis en jeu dans la réponse de douleur. Les protocoles cellulaires, utilisés au préalable, ne sont pas assez complexes et représentatifs des interactions entre cellules cérébrales, entre cellules cérébrales et périphériques ainsi que des chemins neuronaux impliqués dans les mécanismes de douleur et d'anti-douleur.
Réduction
Les approches comportementales nécessitent une cohortes de 10 animaux minimun par groupe. Cette étude se focalisera sur 5 ligands à tester. Chaque expérience sera réalisée deux fois indépendamment afin d'assurer la validité statistique des résultats. cependant, si une molécule s'avère inefficace ou toxique elle sera abandonnée.
Raffinement
Les animaux seront suivis tout au long des procédures. En effet, l'aspect général extérieur de l'animal (posture, pelage, démarche, faciès, yeux) sera observ et associé au suivit des critères évalués par la grille de score adaptée aux procédures. Si des animaux présentent des signes de souffrance (point limite: score=2 pour un critère de la grille, ils seront mis à mort en accord avec le responsable du bien être animal de ce projet. Dans le cas où 2 animaux minimum sont mis à mort et font parti du même groupe experimental (même traitement), alors ce groupe entier sera retiré de la procédure en cours.
Choix des espèces
La souris de fond génétique C57BL/6 est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies du système nerveux central. L’existence de nombreuses lignées transgéniques sur fond C57BL/6 et la disposition d’outils moléculaires spécifiques (eg. anticorps spécifiques, sondes moléculaires …) ont apporté ces dernières années une meilleure compréhension des neuropathologies et ont conduit aux développements de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous souhaiterions par la suite approfondir notre étude en utilisant des souris inactivées pour le gène du récepteur 5-HT7 (5-HT7 KO) également sur fond C57BL/6, afin de déterminer la spécificité du rôle des ligands et discriminer l’implication des autres récepteurs de la sérotonine dans les résultats observés. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (8 à 14 semaines) afin de garantir un système nerveux central mature et un comportement adulte stable.
Impact de la protéine NCOA7 sur les réponses anti-virales, chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 765 modéré. Elles sont infectées par la grippe H1N1 par voie intranasale, certaines irradiées puis greffées de moelle osseuse, avec injections et prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que les doses peuvent être létales et provoquer jusqu'à 25 % de perte de poids, seuil au-delà duquel les souris sont mises à mort. Il justifie le recours à l'animal par la complexité de la réponse immunitaire antivirale, impossible selon lui à reproduire in vitro, et par l'accès à des souris génétiquement modifiées.
Objectifs
Les virus de la grippe (virus Influenza A, IAV) est un agent pathogène responsable de la mort de près de 500 000 personnes par an dans le monde. Une meilleure compréhension de la réplication du virus de la grippe, de sa propagation dans les hôtes infectés et de son inhibition par le système immunitaire est essentielle dans le développement de nouvelles stratégies prophylactiques et thérapeutiques. L’isoforme courte de la protéine NCOA7 (ici dénommée NCOA7) est une protéine présentant une activité antivirale contre le virus de la grippe au cours des réponses immunes innées. Les données de la littérature indiquent également que la protéine NCOA7 pourrait impacter les réponses immunes adaptatives. Ces données ont été obtenues in vitro. Dans ce projet, nous souhaitons étudier l’impact de NCOA7 sur le contrôle de la réplication du virus de la grippe ainsi que sur la mise en place des réponses antivirales de l'immunité innée et adaptative in vivo, dans un modèle murin. Pour cela, des souris C57Bl/6J WT et NCOA7-/- (que nous avons générées) seront infectées par voie intranasale avec le virus de la grippe (souche H1N1 A/WSN/1933). L’analyse du nombre, du phénotype et des fonctions des cellules immunitaires ainsi que la mesure de la charge virale dans le poumon et de la production de cytokines dans les organes et le lavage broncho-alvéolaire seront effectuées à différents temps post-infection.
Bénéfices attendus
Le virus de la grippe est un problème de santé publique majeure et les risques liés à l’émergence de souches virales responsables d’une pandémie sont très élevés. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme, contre une infection par le virus de la grippe et de caractériser l’importance de NCOA7 dans la mise en place des réponses immunitaires innée et adaptative.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Procédure 1 : - Injection intra-péritonéale (pour anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine Procédure 2 : - - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 1 fois par animal – durée 30 secondes - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes Procédure 3 : - Injection intra-péritonéale (pour anesthésie profonde) : 2 fois par animal– durée 30 secondes - irradiation (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 10 minutes maximum, 30 minutes avec transport vers l'irradiateur- 1 fois par animal (procédure 4 et 5) - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 1 fois par animal – durée 30 secondes - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine Procédure 4 : - Injection intra-péritonéale (pour anesthésie profonde) : 2 fois par animal– durée 30 secondes - irradiation (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 10 minutes maximum, 30 minutes avec transport vers l'irradiateur- 1 fois par animal (procédure 4 et 5) - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 2 fois par animal – durée 30 secondes - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 2 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine Procédure 5 : - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 2 fois par animal – durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur générée par les injections intra-péritonéales ou intraveineuses; ii) le stress généré par l’anesthésie et/ou la procédure d’inoculation du virus par voie intranasale ; iii) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang, l’irradiation et le transfert de moelle osseuse ; iv) le stress généré par le transport entre l’animalerie et l’irradiateur. L'infection par le virus influenza A est une procédure utilisée en routine dans le laboratoire et qui, aux doses sous létales utilisées, , ne génère pas de souffrance visible sur les animaux. Les doses utilisées dans la procédure 1 et 3 pouvant être létales, notre expérience a montré que les animaux pouvaient expérimenter une perte de poids allant jusqu’à 25% de leur poids initial entre jour 6 et 10 après infection, avant de revenir à leur poids initial entre jour 12 et 15 après infection. Dans ce cas, un point limite de 25% de perte de poids est fixé.
Devenir
Mise à mort des animaux pour analyse des organes, par dislocation cervicale ou surdose de pentobarbital. La méthode par surdose de pentobarbital sera utilisée sur des groupes d’animaux, pour permettre l’analyse des lavages broncho-alvéolaires.
Remplacement
Le role antiviral de la protéine NCOA7 a été mis en évidence in vitro, dans des cellules pulmonaires humaine. Nous souhaitons à présent mettre en évidence un rôle de NCOA7 in vivo, dans un contexte global d'infection par le virus de la grippe. De plus, des résultats préliminaires indiquent que NCOA7 pourrait égalemet jouer un rôle dans la mise en place des réponses antivirale adaptatives. La réponse immunitaire anti-virale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires a été estimé sur la base des expériences antérieures, afin d’assurer un calcul statistique précis et permettre une interprétation robuste des résultats.
Raffinement
Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, i) les infections intra-nasales seront réalisées sous anesthésie profonde et la température corporelle des animaux sera maintenue lors de l'anesthésie; ii) les prélèvements de sang seront réalisées sous anesthésie à Isoflurane et après application d'un collyre; iii) les injections intraveineuses seront réalisées sous anesthésie légère; iv) nous maintiendrons les animaux en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée) ; v) des points limites assez prédictifs et définis pour chaque procédure ont été établis afin d'anticiper toutes souffrances et tout mal être des animaux; vi) nous assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, comme décrit au sein de chaque procédure. vii) pour les procédures 1 et 3, les animaux serons surveillés et pesés quotidiennement (mêmes jours fériés et week-end) après infection.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de réaliser des expériences dans des animaux génétiquement modifiés. Dans ce projet, des souris WT (fond C57Bl/6J), des souris F5 (transgénique pour le récepteur à l’antigène des lymphocytes T et spécifique du peptide NP68) et des souris invalidées pour NCOA7 (fond C57Bl/6J CD45.2) seront utilisées. Adultes de 6 semaines à 3 mois : le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant au moment de l’infection (6 à 8 semaines) et certains animaux seront gardés jusqu’à 50 jours après infection afin d’étudier la mise en place des réponses immunitaires mémoires.
Rôle du stress mécanique dans l’activation de l’inflammasome NLRP3
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1332 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections déclenchant une inflammation, dont un modèle sévère au LPS qui altère fortement leur état général et peut entraîner la mort, la survie étant mesurée. Un modèle de maladie auto-inflammatoire porte sur des nouveau-nés dont l'espérance de vie ne dépasse pas quatorze jours. Le porteur affirme vouloir vérifier in vivo un mécanisme observé sur cellules et décrit le modèle murin comme déjà validé.
Objectifs
L’inflammation est la première réaction du système immunitaire à une agression externe (infection, traumatisme, brulure, etc…) ou interne (cellules cancéreuses) . C’est un processus universel qui concerne tous les tissus faisant intervenir l’immunité innée. L’inflammation est un processus de défense généralement bénéfique mais qui peut devenir délétère lorsqu’elle est dérégulée. Dans des maladies telles silicose, arthrite goutteuse, diabète de type 2, athérosclérose, maladie d'Alzheimer ou sepsis. ). Il existe également des pathologies génétiques spécifiques de l’inflammation appelées syndrome périodique associé à la cryopyrine (CAPS) dans lesquelles une mutation sur un gène entraine une dérégulation de l’inflammation. Ces maladies sont des maladies dites autoinflammatoires qui sont caractérisées par de l’urticaire, des atteintes oculaires, articulaires et neurologiques et qui peuvent engendrer de l’amylose (accumulation de protéines dans les organes). La cause de ces maladies est la mutation d’un gène codant pour une protéine clé dans le processus d’inflammation qui est appelée inflammasome. Cette mutation entraine un gain de fonction pour l’inflammasome dont la conséquence est une dérégulation de l’inflammation. Sur des cellules immunitaires en culture nous avons observé qu’en activant un type de protéines membranaires sensibles à la pression mécanique, nous les rendions plus sensibles aux stimuli déclenchant l’inflammation. Par ailleurs, toujours sur des cellules en culture mais porteuses d’une mutation de l’inflammasome analogue à celle retrouvée chez des patients atteints de CAPS, nous avons observé que la seule activation de ces protéines membranaires suffit à déclencher l’inflammation. Nous voulons maintenant confirmer ces observations dans un modèle murin in vivo afin de vérifier leur validité dans un contexte physiologique. Dans ce but, nous utiliserons une approche pharmacologique en administrant un activateur ou un inhibiteur de nos protéines d’intérêt sur des souris qui seront soumises à un modèle d’inflammation induite. Nous testerons également une approche génétique en générant des souris porteuses d’une mutation qui récapitule une maladie autoinflammatoire afin d’observer si le ciblage de nos protéines d’intérêt peut réduire l’intensité de l’autoinflammation.
Bénéfices attendus
L'industrie pharmaceutique fournit des efforts importants pour le traitement des maladies inflammatoires (silicose, arthrite goutteuse, diabète de type 2, athérosclérose, maladie d'Alzheimer ou le sepsis) et autoinflammatoires (Syndrome périodique associé à la cryopyrine - CAPS) médiées par un type particulier d'inflammasome. Lors de nos observations in vitro, nous avons montré sur des cellules immunitaires en culture, que des protéines membranaires sensibles à la pression mécanique jouent un rôle dans l’inflammation médiée par un type particulier d’inflammasome. Si nous confirmons cette découverte in vivo sur un modèle murin, alors ces protéines membranaires constitueront une nouvelle cible thérapeutique à explorer pour les maladies inflammatoires et autoinflammatoires.
Procédures
- Pour l’activation pharmacologique des protéines d’intérêt : au jour 1, les souris subiront une injection intrapéritonéale (IP) de l’activateur et une injection sous cutanée (SC) d’un antalgique puis, 1h après, une injection IP d’un facteur induisant une inflammation. L’injection d’antalgique est répétée toutes les 6h pendant la durée de l’observation (5j maximum) (252 souris). - Pour l’inhibition pharmacologique des protéines d’intérêt : les souris subiront, au jour 1, une injection IP d’un inhibiteur et une injection SC d’un antalgique puis, 1h après, l’injection d’un facteur induisant une inflammation. L’injection de l’inhibiteur est répétée 1x/jour pendant les 5 jours d’observation. L’injection SC de l’antalgique est répétée toutes les 6h pendant la durée d’observation (5 jours). La durée des injections n’excède pas 5 secondes (504 souris). Pour suivre les événements précoces de l’inflammation, nous avons prévus des cohortes qui subiront un prélèvement sanguin à la veine temporo-mandibulaire aux temps 3h ou 6h après induction de l’inflammation. La durée du prélèvement n’excède pas 15 secondes (504 souris). - Pour le modèle génétique de maladie autoinflammatoire : nous générerons des nouveaux nés qui subiront une injection IP d’un inhibiteur et une injection IP d’antalgique (si nécessaire) par jour pendant les 14 jours d’observation. La durée des injections n’excède pas 5 secondes (324 souris). - Pour le modèle génétique de maladie autoinflammatoire invalidé pour les protéines d’intérêt : nous générerons des nouveaux nés qui recevront une injection IP d’antalgique par jour. L’injection n’excède pas 5 secondes (108 souris)
Impact sur les animaux
Nous déclarons dans ce projet 2 modèles d’inflammation induite : - L’induction d’une péritonite : Dans ce modèle d’inflammation modéré, une inflammation localisée au niveau du péritoine (péritonite) apparaitra après l’injection d’une suspension de cristaux d’acide urique. Les souris sont mises à mort 6h après l’induction de l’inflammation pour analyse des marqueurs de l’inflammation. - Induction d’une inflammation systémique aigüe : un composant de la paroi de bactéries est injecté dans le péritoine et entrainera une inflammation systémique C’est un modèle d’inflammation sévère qui altère fortement l’état général des animaux pouvant aller jusqu’à la mort. La survie des souris sera mesurée pendant 5 jours après l’induction. Nous déclarons aussi la génération de souris modèles d’une maladie autoinflammatoire : les nouveaux nés portant une mutation sur un gène qui joue un rôle clé dans l’inflammation présenteront un syndrome inflammatoire important qui se traduit par une rougeur de la peau, un érythème, une inflammation des organes et un fort retard de croissance. L'espérance de vie de ces animaux ne dépasse pas 14 jours.
Devenir
A l’issue des procédures tous les animaux seront mis à mort : - induction d’une inflammation modérée : tous les animaux seront mis à mort pour analyses post mortem. - induction d’une inflammation sévère : Une partie des animaux est dédiée pour analyse post mortem à des temps précis après l’induction de l’inflammation. Une autre partie est dédiée pour les mesures de survie. Parmi ces animaux certains décèderont du fait de l’inflammation induite. Les survivants ne seront pas réutilisés et mis à mort. - Modèle de maladie autoinflammatoire : l’espérance de vie des nouveaux nés ne dépasse pas 14 jours. Les survivants ne seront pas réutilisés et seront mis à mort.
Remplacement
Nous avons observé sur des cellules immunitaires en culture qu’en agissant sur un type de protéines membranaires mécano-sensibles on peut moduler le processus inflammatoire qui est pourtant médié par un autre type de protéines dans ces cellules. Nous voulons maintenant vérifier que ce mécanisme observé in vitro, sur un type cellulaire isolé, est toujours présent in vivo à l’échelle d’un organisme ou de nombreux types cellulaires interagissent. Le modèle murin constitue un modèle déjà validé dans le domaine des recherches sur l’inflammation. Par ailleurs des lignées de souris génétiquement modifiées qui récapitulent les maladies autoinflammatoires sont disponibles et validés.
Réduction
Ce projet nécessitera un total de 1332 souris Nous avons prévu dans ce projet une approche pharmacologique et une approche génétique. Pour l’approche pharmacologique, des souris seront traitées par différents composés puis soumises à un modèle d’inflammation induite. Nous avons prévu deux modèles d’inflammation : Le premier est un modèle d’inflammation modéré (péritonite induite) dans lequel 18 souris par groupe seront nécessaires pour comparer statistiquement les niveaux des cytokines inflammatoires entre les groupes. Le deuxième modèle est un modèle d’inflammation sévère dans lequel 18 souris par groupe seront nécessaires pour pouvoir comparer statistiquement la mortalité entre les groupes. Dans ce modèle nous comparerons aussi, à 2 temps différents après l’induction, les niveaux sanguins des cytokines inflammatoires. Pour que la comparaison soit statistiquement fiable, les groupes seront composés de 18 souris. Par souci de réduction, si le modèle modéré nous permet de répondre à nos questions pour l’approche pharmacologique alors nous ne testerons pas le modèle sévère, évitant ainsi l’utilisation de 864 animaux Pour l’approche génétique, nous générerons dans un 1er temps, des souris invalidées pour nos protéines d’intérêt. Ces animaux seront soumis à un des 2 modèles d’inflammation décrits plus haut. Si le modèle modéré nous permet de répondre à nos questions, alors nous ne testerons pas le modèle sévère, évitant ainsi l'utilisation de 216 animaux. Dans un 2ième temps, toujours pour l’approche génétique, nous générerons des nouveaux nés présentant une maladie autoinflammatoire, traités ou non par un inhibiteur de nos protéines d’intérêt, ainsi que des nouveaux nés présentant la maladie autoinflammatoire dans lesquels nos protéines d’intérêt sont invalidées ou non. Pour que la comparaison de la mortalité entre les groupes soit staistiquement fiable, ils devront être composés de 18 animaux. Par ailleurs, les marqueurs sanguins de l’inflammation seront comparés entre les groupes à 2 âges différents. Ici encore, pour une comparaison statistique fiable, les groupes seront composés de 18 individus.
Raffinement
Pour l'approche pharmacologique, les animaux seront soumis à des modèles d'inflammation induites dont un induit une inflammation sévère. Afin de limiter autant que possible leur souffrance, des traitements antalgiques puissants (analogue de morphine) seront administrés préventivement et curativement aux animaux testés. Pour les mesures de survie, des points limites sont fixés en fonction de l'état général des animaux. Au-delà des point limites, l'état de l'animal sera considéré irréversible et il sera euthanasié. Nous avons prévu pour cette approche 2 modèles d'inflammation induite : un modèle modéré (induction par cristaux de MSU) et un sévère (induction au LPS). Si le modèle d'inflammation modérée nous permet de répondre à nos questions, alors nous ne testerons pas le modèle d'inflammation sévère. Pour l'approche génétique qui consiste en la génération de nouveaux nés présentant une maladie autoinflammatoire, nous avons établi une grille d'évaluation spécifique pour les nouveaux nés. Cette grille permettra d'établir un score en fonction des différents paramètres observés. Les nouveaux nés seront observés quotidiennement et, en fonction du score, différentes actions seront réalisées (réchauffage de la cage, réhydratation en injectant du NaCl 0.9%, traitement avec un analogue de morphine). Ce scorage spécifique nous servira également à déterminer le point limite au-delà duquel les nouveaux nés seront mis à mort. Par ailleurs, une attention particulière sera portée à la manipulation des souriceaux : passage dans la litière sale avant remise en contact avec la mère, matériel de nidification placé dans la cage, volumes injectés et aiguilles adaptés aux souriceaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal déjà validé dans le domaine de l’inflammation Par ailleurs, plusieurs lignées génétiquement modifiées sont disponibles : lignées de souris invalidées pour nos protéines d'intérêt et lignées de souris modèle d'une maladie autoinflammatoire (animaux exprimant une mutation analogue à celle retrouvée chez les patients). Pour les modèles d’inflammation induite les souris seront utilisées au stade adulte (à partir de 8 semaines). À ce stade, le système immunitaire est complètement développé. Si les souris sont trop jeunes, le système immunitaire ne sera pas mature. Si les souris sont trop âgées, le système immunitaire ne sera plus assez efficace. Pour les souris modèles d'une maladie autoinflammatoire les animaux seront utilisés dès la naissance.
Etudes des interactions hôtes-pathogènes appliquées à la recherche de nouveaux types d’antituberculeux.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
6704 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1676 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la tuberculose, parfois co-infectées par le SARS-CoV-2, la grippe ou le pneumocoque, et reçoivent des composés par gavage jusqu'à sept jours par semaine. Le porteur indique que les surinfections peuvent provoquer des signes cliniques graves pouvant aller jusqu'à la mort des animaux. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'infection et revendique la souris comme un "modèle incontournable".
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier l'effet de composés (médicaments, substances chimiques ou produits biologiques) à visée thérapeutique contre la tuberculose, et d'évaluer la pathogénicité de différentes souches bactériennes de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou mutantes, ainsi que la contribution de l'hôte à la pathogénicité des mycobactéries in vivo chez la souris. L'intéraction entre la tuberculose chronique et d'autres pathogènes pulmonaires étant encore mal caractérisée, un autre objectif de ce projet sera de caractériser et d'étudier l'évolution de la co-infection (tuberculose et agents pathogènes viraux/bactériens pulmonaires, tels que les virus SRAS-CoV-2 et Influenza H3N2/H1N1 et les bactéries Streptococcus pneumoniae Sérotype 1) dans un modèle de souris.
Bénéfices attendus
Selon les estimations de l’Organisation Mondiale de la Santé, 9,9 millions de personnes ont développé la tuberculose dans le monde, et 1,5 million de personnes sont mortes de la tuberculose en 2020 (dont 214 000 présentaient également une infection à VIH). À l’échelle mondiale, la tuberculose est la 13e cause de mortalité et la deuxième due à une maladie infectieuse, derrière la COVID-19 (et avant le sida). Cette évolution est principalement liée à la recrudescence de la tuberculose chez des patients immunodéprimés, ainsi qu'à l’émergence des souches résistantes aux antibiotiques. Dans ce contexte, nos projets visent (i) à identifier de nouveaux types d'antituberculeux efficaces sur les souches multirésistantes de Mycobacterium tuberculosis, (ii) à comprendre les mécanismes fondamentaux de l'interaction de l'hôte avec ces mycobactéries, afin de comprendre les mécanismes responsables de l’infection, et (iii) à caractériser et étudier l'impact d'une co-infection pulmonaire chez la souris atteinte d'une tuberculose latente.
Procédures
Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés quotidiennement (5 à 7 jours par semaine) par gavage ou voie intrapéritonéale ou une fois par semaine par voie intraveineuse (dans la veine caudale) aux souris non-anesthésiées, pendant 3 à 8 semaines. L’administration par voie endotrachéale ou intranasale peut également être utilisée 3 à 4 fois par semaine et pendant 1 à 3 semaines sur souris préalablement anesthésiées. L'infection des souris avec les différents agents pathogènes pulmonaires est réalisée par voie intranasale sous anesthésie ou par voie intraveineuse ou sous cutanée sur animaux vigiles. Dans le cadre des expériences de co-infections, les animaux seront infectés à deux reprises, (i) avec Mycobacterium tuberculosis, puis (ii) un des autres pathogènes pulmonaires étudiés. Pour l'imagerie, les animaux sont anesthésiés et placés dans une cassette de contention pendant une durée de 5 minutes pour permettre l'acquisition des images (1 à 2 fois par semaine).
Impact sur les animaux
Lors des expériences de surinfection, des signes cliniques graves pourraient etre observés, pouvant aller jusqu'à entrainer la mort des animaux.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d'expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.
Remplacement
Aucun modèle expérimental in vitro ne permet d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à la tuberculose pulmonaire évolutive, ni de reproduire la physiopathologie de l’infection respiratoire, ni d’étudier les mécanismes de défense contre l’infection. Seules les études in vivo permettent de déterminer l'efficacité de composés face à une épreuve virulente de M. tuberculosis. Et l’efficacité chez la souris constitue un pré-requis avant toute phase clinique sur l'homme. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable pour le suivi de la réplication du bacille tuberculeux in vivo et l’étude de l’interaction entre l’hôte et les mycobactéries. Les différentes stratégies innovantes de vaccination contre les mycobactéries pathogènes peuvent être évaluées et validées chez la souris qui, infectée efficacement par des souches de M. tuberculosis pathogènes humaines, développe une tuberculose pulmonaire active.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, une partie des organes est également utilisée et analysée par histologie ou par FACS, afin de visualiser la localisation des bactéries dans différents types cellulaires. Une approche par imagerie du petit animal, sous anesthésie, sera développée au sein du Laboratoire de Haute Sécurité pour permettre le suivi de l'infection d'un seul groupe d'animaux au cours du temps, sans avoir besoin de sacrifier les animaux. Nous espérons à terme que cela puisse réduite le nombre d'expériences.
Raffinement
De façon à réduire le stress, l'inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées avant l''infection ou le gavage. De plus, la surveillance sera accrue, 2 à 3 fois par semaine ou quotidienne, selon les procédures. L'apparence physique, l'alimentation et le comportement des anmaux seront surveillés, afin de détecter le plus tot possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques a été établie et est utilisée pour évaluer un "score" de douleur et permet d'évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables seront euthanasiés. Les souris seront sacrifiées au maximum 10 semaines post-infection, i.e. avant l'apparition des signes de morbidité, sur la base des connaissances de la souche de M.tuberculosis de type sauvage qui est la plus pathogène parmi les mycobactéries que nous étudions. Si des signes de morbidité étaient observés, les points de cinétiques serons revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocément par rapport à celles initialement prévues.
Choix des espèces
1)La possibilité d’induction d’une tuberculose chronique chez la souris par des souches de M. tuberculosis pathogènes pour l’homme et la pertinence de ce modèle expérimental en ce qui concerne l’évolution de la maladie, 2)L’existence de nombreuses similitudes de l’immunité anti-mycobactérienne entre l’homme et la souris, 3)Les nombreuses connaissances disponibles pour cette espèce, font de ce modèle expérimental un système de choix qui permet d’éviter le recours aux espèces plus sensibles. Les animaux (Balb/C et C57BL/6, wild-type et KO) utilisés sont âgés de 6 à 10 semaines au moment de l'infection par M. tuberculosis. Cet intervalle d’âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.
Caractérisation du rôle du recepteur CD169 et des macrophages CD169+ dans l’immunité pulmonaire au cours de l’infection par Mycobacterium tuberculosis
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
5 427 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. La plupart sont infectées par Mycobacterium tuberculosis au moyen d'instillations intranasales et reçoivent de multiples injections, une partie subissant une chirurgie de microscopie du poumon de deux à six heures menée sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique une possible perte de poids et des altérations respiratoires, avec des expériences de survie prolongées au-delà de cent jours, et justifie la mise à mort par le classement du pathogène en risque biologique de niveau 3. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne récapitule l'immunité anti-tuberculeuse et que la microscopie intravitale n'est applicable que chez la souris.
Objectifs
La tuberculose, causée par l’infection respiratoire de la bactérie Mycobacterium tuberculosis, est la deuxième pathologie infectieuse la plus meurtrière après COVID-19. Cela est partiellement dû à une forte résistance de la bactérie face aux traitements existants. C’est pourquoi dans la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, il est aujourd’hui important de mieux comprendre les interactions entre le pathogène et l’hôte. Ces interactions incluent notamment les mécanismes par lesquels Mycobacterium tuberculosis parasite les macrophages qui sont à la fois les premières cellules immunitaires impliquées dans la lutte contre le pathogène, mais aussi le principal réservoir cellulaire permettant sa survie. Les macrophages CD169+ (Sialoadhésine, Siglec-1) forment une sous-population de macrophages dans la rate et les ganglions lymphatiques. Dans ces organes, ils sont capables de piéger divers antigènes et d’activer la réponse immunitaire adaptative. Les macrophages CD169+ sont également présents dans les poumons humains, ainsi que dans ceux de macaques et de souris. Cependant, le rôle de ces cellules pulmonaires lors de l’infection par Mycobacterium tuberculosis reste inexploré. Notre projet s’attache à caractériser les fonctions biologiques de CD169, que ce soit en tant que molécule ou en tant que marqueur de sous-populations de macrophages. Il existe dans le poumon deux populations de macrophages distinctes qui expriment CD169 : les macrophages alvéolaires (AM) et les macrophages associés aux nerfs (NAM). Il existe également une population de macrophages exprimant CD169 présente dans l’espace pleural. L’hypothèse centrale de notre projet est que le récepteur CD169 et/ou les macrophages CD169+ jouent un rôle critique dans la pathogenèse de la tuberculose. Notre stratégie expérimentale se divise en trois axes. Ce projet a pour objectifs : 1/ de caractériser la biologie des macrophages pulmonaires CD169+ au cours de la tuberculose et le rôle de la molécule CD169 à la surface de ces macrophages, 2/ identifier les voies métaboliques impliquées dans le fonctionnement des macrophages pulmonaires CD169+, 3/ visualiser le comportement des macrophages pulmonaires CD169+ et leur capacité à interagir avec d’autres cellules dans leur environnement pulmonaire au cours de la tuberculose.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) évaluer le fonctionnement biologique des macrophages pulmonaires CD169+ au cours de la tuberculose et cartographier les principales voies métaboliques impliquées ; (ii) visualiser le comportement des macrophages pulmonaires CD169+ au cours de la tuberculose, (iii) caractériser les mécanismes de communication intercellulaire de ces cellules ; et (iv) identifier potentiellement une nouvelle cible cellulaire pour une thérapie ciblée sur l'hôte et à des fins de vaccination contre la tuberculose.
Procédures
Dans cet APAFIS, - 45 souris seront mises à mort sans autre intervention - 500 souris recevront une à cinq injections intranasales réparties sur une semaine - 360 souris recevront une injection intranasale et une injection intrapéritonéale tous les deux jours pendant 7 à 10 jours - 1584 souris recevront une à cinq injections intranasales espacées de 1 à 5 jours et une injection rétro-orbitale - 192 souris recevront des injections intranasales quotidiennement pendant une semaine, puis tous les deux jours pendant une semaine, puis elles recevront une injection rétroorbitale - 120 souris recevront 4 injections intrapéritonales espacées de 2 à 5 jours et une injection intranasale - 800 souris recevront 2 à 4 injections intrapéritonales espacées de 1 à 5 jours, une injection intranasale et une injection rétro-orbitale - 576 souris recevront une injection intranasale, sept injections intrapéritonéales (1 jour sur 2) et une injection rétro-orbitale - 410 souris recevront une à deux injections intranasales (ou une intranasale + une intratrachéale) et subiront une chirurgie pour effectuer de la microscopie intravitale sur le poumon pendant 2 à 6h - 840 souris recevront une à deux injections intranasales (ou une intranasale + une intratrachéale), sept injections intrapéritonéales (1 jour sur 2) et subiront une chirurgie pour effectuer de la microscopie intravitale sur le poumon pendant 2 à 6h Les injections intranasales sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animaux vigiles en contention. Les injection-rétro-orbitale sont effectuées sous anesthésie générale avec un analgésiant local. La chirurgie pour effectuer de la microscopie intravitale sur le poumon est effectuée sous anesthésie générale avec des antalgiques et des analgésiques. L’hydratation et la température de l’animal sont maintenus tout au long de la procédure. Les mises à mort seront réalisées par injection intrapéritonéale de pentobarbital, par disclocation cervicale sous anesthésie ou par asphyxie au CO2.
Impact sur les animaux
Dans cet APAFIS, les infections et les injections seront effectuées sous anesthésie afin d’améliorer le bien-être des animaux. La majorité des souris seront infectées par Mycobacterium tuberculosis. Pour les infections allant jusqu’à J42, aucun voire peu d’effets indésirables sont attendus sur les animaux (aucun signe indicateur d’un mal-être). Parfois, de légères altérations de l’aspect (état corporel, pelage) peuvent être observés ainsi que des altérations de la respiration et du comportement (posture et mobilité). Ces effets n’apparaissent généralement qu’à partir de J35. Pour les expériences de survie, de plus fortes altérations de l’aspect, de la respiration et du comportement peuvent survenir au-delà de J100. Une perte de poids peut également être observée (généralement
Devenir
Toutes les souris de cet APAFIS seront mises à mort à la fin des procédures. Les souris des procédures 1-7 seront infectées par la bactérie Mycobacterium tuberculosis qui est responsable de la tuberculose. Ce pathogène étant classé risque biologique de niveau 3, il n’est pas envisageable de garder les souris en vie à la fin de ces procédures. Dans la procédure 8, nous utiliserons une technique de chirurgie afin d’imager les cellules immunitaires présentes dans les poumons. Les souris seront anesthésiées et analgésiées, mais la procédure est trop invasive pour pouvoir les réveiller sans douleur. Enfin, nous avons besoin de récupérer les ganglions lymphatiques des souris à l’issu de la procédure 9 afin de déterminer si les cellules T de l’immunité adaptative ont été activées. Le prélèvement de ces organes ne peut avoir lieu sur souris vivante ce qui nécessite leur mise à mort.
Remplacement
Notre projet a pour but de mieux comprendre la réponse immunitaire contre la tuberculose. Afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire suffisamment proche de l’homme. Il est impossible de ne travailler que sur des modèles cellulaires qui ne récapitulent pas l’ensemble de l’immunité anti-tuberculeuse. En particulier, notre projet a pour but d’étudier une population cellulaire dans son contexte pulmonaire. Notre projet est basé sur l’étude de la dynamique et du comportement des ces cellules par une technique de microscopie intravitale qui n’est applicable que chez la souris. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation de souris vivantes. Elles seront infectées puis mises à mort afin d’analyser la réponse immunitaire pulmonaire, ou nous réaliserons de la chirurgie afin d’observation les cellules immunitaires pulmonaires par microscopie intravitale.
Réduction
Notre équipe a une expertise dans l’utilisation de modèles animaux d’infection par Mycobacterium tuberculosis et l’expérience des années précédentes nous a fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous avons notamment développé des approches expérimentales permettant d’analyser sur un même lot d’animaux, des paramètres qui étaient avant mesurés sur des lots d’animaux séparés (exemple : la préparation d’ARN, analyse de cytokines et charges bactériennes peuvent maintenant être réalisées sur le même échantillon).
Raffinement
Dans cet APAFIS, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. - Les instillations intranasales seront réalisées sous anesthésie générale fixe ou gazeuse. - Les injections rétro-orbitales seront réalisées sous anesthésie locale et gazeuse. - Pour la chirurgie (microscopie intravitale) nous utiliserons un analgésiant, un anesthésique local, un anesthésique fixe puis un anesthésique gazeux. La température corporelle et l’hydratation des animaux seront maintenues tout au long de la procédure grâce à une caisse chauffante et des injections régulières de solution saline. De l’ocrygel, sera appliqué sur les yeux afin de prévenir leur assèchement. - Les souris infectées par Mycobacterium tuberculosis seront monitorées quotidiennement jusqu’à J100 et biquotidiennement jusqu’à J120, le point le plus tardif. Les souris infectées par Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas pneumonie ou du lipopolysaccharide seront monitorées pendant 24h, durée maximale de l’expérience. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation (grille de score en pièce jointe de cet APAFIS et détaillée pour chaque procédure) et les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation. Les animaux présentant des signes de souffrance sur cette base seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Pour notre projet visant à explorer le rôle de CD169 dans l'infection par Mycobacterium tuberculosis, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'excellente caractérisation des fonds génétiques et de la variabilité de résistance à la pathologie, et ii) du fort degré de convergence des paramètres de l'immunité chez l'homme par rapport aux autres espèces envisageables. De plus, notre projet est basé sur l’étude de la dynamique et du comportement des macrophages CD169+ par une technique de microscopie intravitale qui n’est applicable que chez Mus musculus. Nous considérons l'utilisation de modèles animaux plus complexes comme le cochon d'inde et le macaque comme des modèles réservés à des étapes plus avancées dans l’émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques. De tels projets, s’ils s’avèrent nécessaires, seront réalisés au travers de structures de service impliquant des consortiums de recherche et dépassant le cadre de ce projet. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 10 semaines. A ce stade de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature pour étudier la réponse immunitaire à Mycobacterium tuberculosis.
Étude du rôle de Smurf1 dans la propagation du norovirus
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
162 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Après un gavage initial de norovirus, elles subissent des prélèvements quotidiens de selles pour mesurer la charge virale et le rôle d'une protéine dans la propagation du virus. Le porteur indique que l'infection peut provoquer diarrhée, saignements et perte de poids, une diarrhée de quatre jours ou une perte de 20 % du poids déclenchant la mise à mort par dislocation cervicale. Il précise avoir mené des travaux préalables sur cellules et présente l'étape animale comme une analyse "intégrée" de la réponse immunitaire.
Objectifs
De nombreuses études suggèrent un rôle important joué par l’autophagie dans la dégradation de divers agents pathogènes. Nos données préliminaires indiquent que le norovirus est capable d’empêcher le bon déroulement de l’autophagie. Nous cherchons maintenant à comprendre comment il parveint à le faire. Ainsi, nous étudions plus précisément le rôle joué par une protéine cellulaire, Smurf1, dans l'evitement de la dégradation.
Bénéfices attendus
À travers l’étude du dialogue moléculaire entre la protéine cellulaire Smurf1 et la capside virale nous cherchons à comprendre comment le norovirus murin parvient à accroître sa survie à l'intérieur de la cellule infectée. Nos données préliminaires indiquent que le norovirus est capable d’empêcher le bon déroulement d'un mécanisme de dégradation. Notre projet nous permettera de mesurer l’impact de l’inactivation génétique de Smurf1 sur la charge virale. Une réduction de celle-ci dans les souris KO ouvriait la voie vers une nouvelle piste thérapeutique pour limiter la propagation des norovirus.
Procédures
Au début de l'expérience un gavage initial avec du PBS (condition contrôle) ou avec les différentes souches de norovirus sera réalisé. Ensuite, des prélèvements quotidiens de selles seront réalisés pour mesurer la charge virale.
Impact sur les animaux
Diarrhée, saignements, perte de poids excessive.
Devenir
A la fin de l'expérience les anaimaux seront euthanasiés par dislocation cervicale conformément aux régles éthiques en vigeur sur le sacrifice des animaux lors de procédures expérimentales. De même, au cours de l'expérience, si les points limites définis pour chaque procédure sont atteints pour éviter une détresse et une souffrance excessive des animaux, ils seront également euthanasiés par dislocation cervicale.
Remplacement
Nos expériences in vitro avec une lignée de macorphage avec Smurf1 transitoirement inactivé, puis celles avec les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris KO vs WT nous ont permis de ne pas utiliser des animaux pour ces expériences prléiminaires. Nos futurs expériences in vivo permetteront de compléter ces études in vitro et de réaliser une analyse intégrée de la réponse immunitaire dans la prise en charge de l'infection norovirale.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux avec une puissance statistique suffisante, des lots de 6 souris seront utilisés. Ce nombre est justifié sur la base d’expériences préliminaires montrant la variabilité entre les souris et associant la dispersion des valeurs individuelles intra-groupes et la puissance des tests statistiques de comparaisons inter-groupes.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse ainsi que l’impact environnemental, les animaux seront observés quotidiennement par des personnes formées. Un suivi régulier du poids des animaux, de la consommation de nourriture et d'eau et de signe clinique mesurable (respiration...), sera réalisé. En parallèle, l’apparence physique externe de l’animal sera observée afin de déceler des signes de diarrhée, de perte de sang nous permettant de réaliser un score de sévérité de la maladie, ainsi qu'un éventuel changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe. Une diarrhée prolongée sur 4 jours, des saignements répétés au delà de 3 jours avec selles sanginolantes et/ou saignements au niveau anal, ainsi qu'une perte de poids supérieur ou égale à 20% du poids initial nous améneront à euthanasier les animaux concernés. Nos expérinces se focaliseront sur les souches virales S99 et MNV-1 qui sont respectivement persistente et aigue. Par ailleurs, nos expériences in vitro montrent des réponses cellulaires (signalisation) différentes entre ces deux souches. Par conséquence nous chercherons à mesurer dans nos expériences in vivo si la pathogénécité de ces deux souches dans nos souris WT et Smurf1 Ko est également différente. La dose virale que nous utiliserons est de 10e7 PFU. Elle a été validée par des expériences précédentes. La durée totale des expériences in vivo n'excédera pas 21 jours. Nos expériences précédentes montrent des effets de l'infection precepetibles entre 7 et 14 jours dans les souris WT. Les effets dans les souris Ko devraient être du même ordre. Le délai de 14 à 21 jours devrait nous permettre de détecter un eventuel décalage dans le temps entre les souris WT et Ko. Les effets de l'infection sont mesurables via une perte de poids progressive accompagnée ou non de diahrrées ou de saignements liée à une activation de l'inflammation intestinale. Ces effets sont résorbés en quelques jours avec la résolution de la phase aigue de l'infection et la prise en charge du virus par le sytème immunitaire inné. Dans le cas contraire, si l'inflammation persiste ou s'aggrave avec un ou plusieurs points limites atteints les animaux concernés seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le modèle animal ‘souris’ permet une analyse intégrée de la réponse immunitaire à l’infection norovirale. L’inactivation de Smurf1 nous permettra de comprendre plus particulièrement le rôle joué par celui-ci dans la clearance virale par autophagie. Les procédures seront réalisées sur des animaux âgés entre 6 et 12 semaines. Des expériences in vitro sur des cellules dérivées de souris WT ou KO nous ont permis d'établir cette fourchette d'âge. Les protocoles d'infection peuvent durer jusqu'à 3 semaines.
Effet préventif primaire d’un régime supplémenté par un extrait végétal standardisé dans l’apparition des dérèglements métaboliques et inflammatoires associés au surpoids chez le chien
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
30 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés vivants et replacés dans leur environnement d'étude à l'issue. Soumis à un régime gras, ils subissent cinq prélèvements de sang à la jugulaire et des prélèvements de selles, dont certains par écouvillon rectal ou isolement de vingt-quatre heures, pour tester un extrait végétal censé prévenir les troubles métaboliques du surpoids. Le porteur indique provoquer volontairement chez eux un surpoids et des désordres métaboliques, objet de l'étude. Il présente le chien comme l'espèce cible et affirme qu'il n'y a "absolument pas d'alternative" à son remplacement.
Objectifs
De nombreuses études ont révélé le rôle central de la dysbiose intestinale dans l’initiation et l’entretien des désordres associés aux maladies métaboliques (i.e. syndrome métabolique). Le premier objectif de ce projet sera d’explorer l’action prébiotique potentielle d'un extrait végétal standardisé (versus un composant majoritaire de l'extrait) et son impact sur le profil métabolique chez des chiens exposés à un régime hyperlipidique, par leur suivi clinique et biologique (analyse du microbiote intestinal, paramètres biochimiques, métaboliques). L’activité prébiotique potentielle de l’extrait végétal standardisé sera également évaluée en présence d’un probiotique spécifique, déjà développé et commercialisé chez le chien. Parmi les facteurs susceptibles de participer aux dérèglements métaboliques et inflammatoires, les protéines sirtuines, notamment les sirtuines 1 et 3, émergent comme des cibles potentielles pour des interventions nutritionnelles ou pharmacologiques. Les sirtuines, des désacétylases NAD- dépendante, sont des régulateurs importants de l’activité des protéines impliquées dans le métabolisme cellulaire et le contrôle de l’inflammation. Différents travaux ont démontré les effets positifs de la modulation des sirtuines 1 et 3 dans les maladies métaboliques et inflammatoires. Par exemple, la modulation des sirtuines 1 et 3 induit des effets bénéfiques sur les métabolismes (notamment glucidique) via partiellement le contrôle de l’inflammation (voie PPARs et le facteur NF-KB) et du stress oxydatif. Par conséquent, tout traitement visant à augmenter l’activité désacétylase des sirtuines 1 et 3 pourrait constituer une approche thérapeutique qui pourrait s’avérer très prometteuse. Le deuxième volet de ce projet sera consacré à explorer les effets de l’extrait végétal standardisé (versus un composant majoritaire de l'extrait) sur l’expression et l’activité des facteurs susceptibles de participer aux dérèglements métaboliques, oxydants et inflammatoires comme les sirtuines 1 et 3, les PPARs et le facteur NF-KB. Notre hypothèse est que la richesse de cet extrait végétal en flavonoïdes, en anthocyanines et en acides phénols, et surtout leur potentielle action synergique et/ou additive pourrait lui conférer une action anti-inflammatoire et régulatrice des métabolismes lipidique et glucidique plus efficace en impliquant notamment un rôle des sirtuines 1 et 3.
Bénéfices attendus
Notre hypothèse principale est que l’action synergique des composants majeurs (acides phénoliques, flavonoïdes, anthocyanes) de l’extrait végétal standardisé augmente la diversité microbienne, renforce la barrière épithéliale intestinale et améliore le profil métabolique en prévenant l’accumulation des graisses. Par ailleurs, une des stratégies visant à limiter ou réduire le processus inflammatoire associé au surpoids est également l’utilisation de probiotiques ayant la capacité de supprimer la production de facteurs pro-inflammatoires ou favoriser la synthèse de métabolites anti-inflammatoires comme les acides gras à chaîne courte (AGCC). Les protocoles mis en œuvre dans le cadre de ce projet devraient permettre de déterminer si l’extrait végétal standardisé étudié (comparativement à son principal principe actif) est apte à prévenir l’inflammation et les perturbations métaboliques associées au surpoids. Les composants de l'extrait végétal testé pourraient avoir une action synergique et/ou additive conférant une action anti-inflammatoire et régulatrice des métabolismes lipidiques et glucidiques plus efficace en impliquant notamment un rôle des sirtuines 1 et 3. Ce projet pourrait apporter la preuve de concept que l’intérêt thérapeutique de plante étudiée chez le chien ne dépend pas d’un principe actif mais d’une action synergique de ses principaux constituants. Ce projet pourrait également permettre de faire émerger chez le chien une nouvelle classe de produits thérapeutiques qui combine l’extrait bactérien et l’extrait standardisé végétal dans la prévention de l'inflammation et des dérèglements métaboliques associés au surpoids.
Procédures
3 interventions : 30 chiens suivront un régime hyperlipidique avec administration ou non d'une supplémentation en extrait végétal standardisé ou d'un composant majoritaire de l'extrait étudié avec ou sans un probiotique déjà développé chez le chien, 30 chiens auront des prélèvements sanguins, 5 fois sur une période de 3 mois avec un intervale de 2 semaines minimum ; 30 chiens auront des prélèvements de selles (4 fois). 1- Les prélèvements sanguins se feront au niveau de la veine jugulaire par une personne expérimentée. L'acte de prélèvement dure 2 minutes environ (contention par un tiers, rasage et désinfection du site de prélèvement). 2- Concernant les selles, deux approches de prélèvement seront envisagées : - Dans la première approche, les chiens doivent être individualisés. Ils seront maintenus en box individuel de 4m² durant 24h pour le recueil des selles destinées aux analyses du microbiote (équilibre des différents groupes et espèces d’intérêt). Cela sera répété 4 fois lors de l'étude efficacité. - Dans la deuximème approche, les selles seront recueillies sur animaux vigiles à partir d'un écouvillon (stérile) rectal. le chien est légèrement contenu, un écouvillon est délicatement introduit de 2 à 3 cm dans l'anus et tourné sur la paroi une dizaine de fois, puis retiré. L'animal est alors remis dans son box. Les deux mode de recueil des selles sont de nature légère. Dans le cas d'individualisation, les animaux seront isolés en box individuel mais avec un contact visuel avec leurs congénères. La méthode par écouvillonnage rectal permet de recueillir une petite quantité de selles qui devrait être suffisante pour l'analyse. L'objectif secondaire de ce mode de prélèvement est d’établir si les selles récoltées par ce biais sont représentatives du microbiote intestinal. Si c’était le cas, nous pourrions envisager de ne plus individusaliser pendant 24 h nos chiens pour le recueil des selles dans le cadre de l'étude du microbiote intestinal (dans le cadre de la règle des 3R, nous raffinerons ainsi notre procédure de recueil des selles).
Impact sur les animaux
Les animaux soumis au régime hyperlipidique vont développer des désordres métaboliques liés au surpoids, ce qui est l'objet de l'étude. Les traitements mis en oeuvre ont comme objectif d'atténuer les complications générées par le surpoids. Aucune nuisance n'est attendue de l'extrait standardisé étant reconnu pour ses vertus par la pharmacopée et déjà utilisé chez le chien, de même pour le probiotique utilisé. En cas de souffrance, l’animal sera mis en observation pour d’éventuels soins. Si la souffrance, pour des raisons inconnues, persiste, il sera exclu de l'étude.
Devenir
Les animaux sont replacés dans leur environnement d'étude après chaque procédure. Le comportement des animaux est surveillé après chaque procédure pour s'assurer de leur bonne santé.
Remplacement
Il s'agit de l'espèce cible des résultats du projet. Eu égard à la nature de ce projet (démonstration scientifique de l'efficacité et de la tolérance sur espèce cible), il n’y a absolument (et à l’évidence) pas d’alternative qui permettrait le remplacement le chien.
Réduction
Nous utilisons 6 chiens par groupes afin d'avoir un nombre suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélèvement étant répété sur chaque chien, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.
Raffinement
L'hébergement respecte les recommandations en vigueurs chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (balade et moments en liberté, jeux...). Un suivi régulier des animaux est assurés par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). La définition de points limites et une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur sont mis en place chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. Les protocoles expérimentaux sont optimisés pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.
Choix des espèces
Il s'agit de l'espèce cible des résultats du projet. Il n'y a donc pas d'alternative qui permettrait leur remplacement. Les chiens sont des adultes de 2 ans, en bonne santé et n'ayant pas reçu de traitement antibiotique ou tout autre traitement pouvant modifier le microbiote, depuis au moins 3 mois.
Importance du microbiote intestinal dans la production d’anticorps spécifiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
36 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, gardées vivantes à l'issue. Elles reçoivent trois à cinq gavages d'antibiotiques et quatre prélèvements sanguins sur 21 jours pour éliminer leur microbiote intestinal, avec un risque de déshydratation et de perte de poids. Le porteur indique qu'après vérification les souris rejoindront un programme de "maintien des compétences" du personnel. Il affirme que l'effet du microbiote sur la production d'anticorps ne peut pas être étudié hors d'un animal vivant.
Objectifs
L'objectif de notre étude est d'identifier l'origine de l'allergie, notre hypothèse est que le microbiote est l’élément déclencheur de la production d'anticorps dits "non protecteurs" qui pourraient jouer un rôle dans certaines pathologies, comme ici, l'allergie. Le but de cette étude est d'éliminer le microbiote grâce à des antibiotiques. Des dosages seront réalisés pour vérifier l'absence d'anticorps spécifiques et la durée de leur absence.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de choisir le meilleur protocole d'élimination du microbiote et de déterminer la durée de l'absence d'anticorps spécifiques. Nous souhaitons grâce à cette étude identifier le bon moment pour effectuer une transplantation du microbiote enrichi en protéines dites "protectrices", cela fera l'objet d'une seconde demande.
Procédures
Les souris vigiles subiront deux types d'intervention dans cette étude de 21 jours : 3 à 5 gavages d'une solution d'antibiotiques et 4 prélèvements sanguins à la veine mandibulaire. Les souris subiront également d'autres procédures non invasives : elles seront pesées 3 fois par semaine et leur niveau d'hydratation (léger pincement de la peau au niveau des omoplates) sera évalué 3 fois par semaine également.
Impact sur les animaux
Il y a risque de déshydratation des souris dans les groupes où les antibiotiques sont dans l'eau de boisson. L'administration d'antibiotiques peut également engendrer une perte de poids chez les souris.
Devenir
A la fin de ce protocole, les souris auront retrouvé un microbiote normal. Après vérification de leur état, ces souris pourront être inclues dans un programme de maintien des compétences du personnel (pas plus de 2 gestes par semaine, maximum 3 répétitions).
Remplacement
Nous souhaitons voir l'impact du microbiote sur la production d'anticorps spécifiques, cela ne peut pas être réalisé hors d'un animal.
Réduction
Le nombre de souris a été déterminé pour être nécessaire et suffisant pour répondre à notre hypothèse. Des groupes de 10 souris seront utiles pour identifier une différence entre les groupes tests, le groupe contrôle sera composé de 6 souris, nombre nécessaire et suffisant pour mettre en évidence une différence avec les groupes tests.
Raffinement
Les gestes effectués sur les souris (gavages et prélèvements sanguins) seront effectués par du personnel entrainé et tout sera mis en oeuvre pour assurer le bien-être des animaux. Les souris seront par groupe de 6 ou 10 dans des cages adaptées et leur bien-être sera évalué tous les jours. La température et l'hygrométrie ambiantes seront également suivies quotidiennement et maintenues respectivement entre 20 et 24°C et entre 35 et 75%. Leur milieu sera enrichi avec des objets en plastique rouge transparent et avec des bâtons de coton pour créer leur nid. Selon la bibliographie, il est possible que les animaux perdent du poids et se déshydratent, surtout dans les groupes où le cocktail d'antibiotiques est mis dans l'eau de boisson. L'eau de boisson devient moins appétente et les souris boivent moins, c'est pourquoi, il est conseillé d'ajouter des arômes de fruits dans l'eau de boisson. Le poids des souris sera vérifié 3 fois par semaine. En cas de perte de poids supérieure à 15% entre deux mesures, la souris sera sortie de l'étude, remise en cage avec une eau de boisson dépourvue d'antibiotiques. La bonne hydratation des souris sera également vérifiée. Si la souris semble faible, si sa fourrure est terne ou si sa peau met du temps à se remettre en place ou colle lorsqu'on la pince doucement entre les omoplates, la souris sera immédiatement sortie de l’étude. Un pack d’hydrogel sera mis à sa disposition dans une nouvelle cage, lui évitant ainsi l'effort d'aller boire au biberon qui se trouve en hauteur. Son poids sera suivi 3 fois par semaine et si son état ne s'améliore pas la souris sera mise à mort. Si son état s'améliore, la souris ne sera pas réintroduite dans cette étude mais pourra servir au maintien des compétences de notre personnel (programme détaillé en paragraphe 4.2.1).
Choix des espèces
Souris femelles adultes, agées de 6 semaines
Rôle de l’Interféron de type I dans la pathogénèse de la Sclérodermie Systémique.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées quotidiennes sous anesthésie, des prises de sang répétées et un adénovirus par voie intraveineuse pour induire une sclérodermie systémique, une maladie auto-immune, avant le prélèvement de la peau et des poumons. Le porteur indique que l'induction ne dégrade pas l'état général, mais qu'un fort dosage de l'adénovirus peut causer une perte de poids importante. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne reconstitue la complexité de la maladie.
Objectifs
La sclérodermie systémique (ScS), une maladie auto-immune rare (9/100000 habitants) et au pronostic vital sombre dans les formes sévères. Elle associe une atteinte des petits vaisseaux, des anomalies immunologiques (présence d’auto-anticorps) et une fibrose touchant la peau et les organes internes. A ce jour, il n'existe aucune stratégie thérapeutique efficace, notamment contre la fibrose qui est responsable d'une altération profonde de la qualité de vie des patients et qui grève leur espérance de vie. Ainsi il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourrait améliorer le devenir des patients atteints de ScS. Des études récentes montrent que 50% de patients atteints de ScS présentent une augmentation systémique de la molécule pro-inflammatoire : l’interféron de type I (IFN-I). La présence de d’IFN-I chez ces patients semble être associé à une sévérité plus importnante de la pathologie. Cependant, quelle est la fonction de l’IFN-I dans la dans le développement de la ScS n’est pas encore connu. Nous proposons de tester l’impact de la déficience en IFN-I ainsi que de sa surexpression sur le développement de la ScS dans deux modèles de souris représentatifs de la pathologie. Si nos résultats, montrent que l’IFN-I contribue et exacerbe la ScS, nous proposons également d’étudier l’intérêt thérapeutique du ciblage de l’IFN-I par des anticorps dans nos modèles de ScS.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de caractériser le rôle de l’interféron de type I dans la pathogenèse de la ScS et ces mécanismes d’action. En cas de résultats positifs ce projet permettra de proposer de nouvelles approches thérapeutique pour les patients atteints de ScS
Procédures
Les souris sont soumises à des injection sous cutanée journalière après anesthésie des animaux. Des prises de sang sous mandibulaires sont effectuées toutes les trois semaines après anesthésie des animaux. Des injections intraveineuses sont effectuée dans le sinus veineux retro-orbitaire après anesthésie des animaux. Des injections intrapéritonéales sont effectuées sur des animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L’induction de la ScS ne cause pas une détérioration de l’état général de l’animal. L’apparition de la fibrose sera suivie de manière quotidienne et les animaux seront euthanasiés 6 semaines après l’initiation de la ScS avant une possible détérioration de leur état général. Cependant les injections répétées sous cutané causent un inconfort des animaux du fait de leur anesthésie et manipulation journalière. Les gestes sont maitrisés par les personnes impliquées dans le projet, ce qui réduira leur temps de la manipulation et de l’anesthésie des animaux. L'Adénovirus (AV) qui permettent la surexpression de l’IFN-I est injecté par voie intraveineuse dans les animaux anesthésiés. Cette procédure très rapide (
Devenir
Procédure 1: A la fin de cette procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de prelever la peau et des poumons pour évaluer l’impact de l’IFN-I sur la ScS. Procédure 2: 12 animaux dans une expérience pilote seront mis à mort à la fin de cette procédure. Les autres animaux (180) seront gardés en vie et utilisés afin d’induire le développement de la ScS (procédure 1). Procédure 3 : Tous les animaux dans cette procédure seront mis à mort à la fin de la procédure afin de vérifier l’efficacité du traitement par l’anti-IFNAR sur le développement de la ScS
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle de souris récapitulant la maladie observée chez l'homme, peut apporter la preuve du rôle de l’IFN-I dans le développement de la ScS. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro ou ex vivo, qui ne reconstituent pas la complexité de la maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Nous utilisons les souris femelles pour notre projet, cependant les souris males issues de nos croisements ne seront pas mis a mort. Celles-ci sont utilisées dans le cadre d’un projet sur l’obésité (DAP 33484).
Raffinement
1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bienêtre (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang sous mandibulaires, les injections i.v et les injection s.c sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort leur douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons les souris C57Bl/6 pour cette expérimentation. Les souris génétiquement modifiées sont uniquement disponibles dans cette espèce et sur ce fond génétique. De plus, elles sont sensibles aux traitements par le HOCl et la Bléomycine qui induisent le développement de la fibrose cutané et pulmonaire respectivement, qui sont des traits caractéristiques de la ScS. Les animaux seront utilisés dès qu’ils atteignent l’âge adulte de 6 semaines pour l’expérimentation. C’est l’âge au quel les souris ont été décrites pour répondre au traitement et donc développer une ScS.
Evaluation de l’efficacité d’un inhibiteur de MEK dans un modèle de greffe de peau chez la souris NSG- Amendement N°1
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
207 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de peau humaine et une injection de cellules humaines qui déclenche une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids et mise à mort dès 20 % du poids perdu, pour tester un inhibiteur de MEK contre le rejet de greffe. Le porteur renvoie au conditionnel les arguments attendus pour l'humain. Il présente ces souris humanisées comme une alternative aux primates.
Objectifs
Les inhibiteurs de calcineurine permettent de prévenir le rejet aigu précoce néanmoins après quelques années survient une dysfonction chronique du greffon liée à la néphrotoxicité des inhibiteurs de la calcineurine et à un mauvais contrôle de la réponse immune. La fibrose interstitielle et l’atrophie tubulaire en elle même participent aussi à la dysfonction chronique du greffon. Ainsi l’amélioration de la survie des greffons nécessite de nouvelles stratégies immunosuppressives contrôlant mieux la réponse immune et la progression de la fibrose. Dans cette optique, les inhibiteurs de MEK sont une piste encourageante. Les mutations de la voie MAPK (mitogen-activated-protein-kinase) classique sont parmi les plus rencontrées en cancérologie. Ainsi des inhibiteurs de cette voie (inhibiteur de MEK) ont été développés, dont le trametinib, qui depuis 2013 a une autorisation de la FDA (Food and Drug Administration) dans le traitement du mélanome. La voie MAPK classique étant située en aval du TCR (T Cell Receptor), les inhibiteurs de MEK ont un effet immunosuppresseur. En transplantation, ce dernier a été décrit dans des modèles murins de Graft versus Host Disease et de greffe cardiaque et dans un modèle de transplantation pulmonaire chez le rat. Dans ces modèles les inhibiteurs de MEK s’opposent à l’activation des CD8 et favorisent l’épuisement des lymphocytes CD4 allo-réactifs. Par ailleurs les inhibiteurs de MEK favorisent le développement des lymphocytes T régulateurs. Enfin, dans des modèles murins, les inhibiteurs de MEK permettent de prévenir la fibrose rénale. Avec un très bon profil de tolérance, ces molécules apparaissent comme une bonne alternative aux anti-rejets conventionnels. C’est pourquoi nous souhaitons étudier l’effet d’un inhibiteur de MEK sur la prévention du rejet de greffe de peau humaine chez la souris NSG (Nod Scid Gamma) humanisée. Dans un 1er temps, nous étudierons l'effet de l'inhibiteur de MEK sur l'humanisation (105 souris) des souris.Dans un 2nd temps,nous étudierons l'effet des inhibiteurs de MEK sur la greffe de peau (102 souris)
Bénéfices attendus
Les inhibiteurs de MEK ont montré une bonne efficacité pour prévenir le rejet de greffe et un effet anti-fibrotique dans des modèles murins. Cependant, ces modèles ne peuvent valider l’efficacité d’une molécule sur les cellules du système immunitaire humain. Le passage dans un modèle in vivo mimant la situation complexe que constitue le système immunitaire humain apportera des arguments supplémentaires quant à leur efficacité pour prévenir le rejet de greffe chez l’homme.
Procédures
Une greffe de peau sous anesthésie générale, durée de l’opération 1 heure. Une injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, 5 min. Administration quotidienne du traitement par voie orale, 1 min. Prélèvement de sang , 1 fois par semaine, 5 min.
Impact sur les animaux
La greffe de peau humaine chez la souris NSG n’entraîne pas de signe clinique chez la souris. L'humanisation des souris avec des cellules hPBMC entrainera des signes cliniques liés à l’apparition d’une xéno-GVHD (graft versus host disease) lorsque la quantité de cellules humaines sera suffisamment importante, notamment des lymphocytes T. Les souris seront surveillées quotidiennement au niveau comportemental et pesées 3 fois/semaine puis tous les jours lorsque les premiers signes cliniques apparaîtront ; chute de poids notamment. L'animal sera euthanasié si le poids atteint une perte de poids de 20% du poids initial. Le comportement général de la souris sera observé et l’animal sera euthanasié si un comportement anormal est constaté (par exemple, animal isolée du reste de ses congénères, dos vouté, poils hérissés).
Devenir
Toutes les souris de la procédure 1 seront utilisées pour la procédure 2. A l’issue de la procédure 2, les souris seront euthanasiées.
Remplacement
La molécule que nous souhaitons tester chez la souris NSG humanisée a déjà été étudiée in vitro et in vivo dans des modèles murins. Le passage dans un modèle in vivo mimant la situation complexe que constitue le système immunitaire humain apportera des arguments supplémentaires quant à son efficacité pour prévenir le rejet de greffe chez l’homme.
Réduction
Les données issues de ce projet devront donc être suffisamment robustes (c'est-à-dire validées avec tests statistiques). Nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques (Test de Mann- Whitney) car nous ne pourrons pas nous assurer d’une distribution normale (non gaussienne) (n < 30). (Nombre total d’animaux 207).
Raffinement
Lors des manipulations pouvant générer une douleur les animaux bénéficieront en amont d’une analgésie adaptée. Les souris seront hébergées sur des portoirs ventilés, avec un enrichissement adapté. Elles seront suivies quotidiennement lorsque les cellules humaines seront injectées et les signes cliniques notables et sévères décrits dans le tableau en annexe de cette saisine seront notés. Lorsque 3 signes cliniques notables ou un seul signe clinique sévère seront notés alors les animaux seront sortis du protocole et euthanasiés. Tous les animaux seront analysés post-mortem avec des prélèvements d'organes en vue d'études immunohistochimiques ou histologiques permettant de caractériser au mieux l’effet de la molécule testée.
Choix des espèces
Les souris immunodéficiences NSG sont des souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre. Il est possible de reconstituer un système immunitaire humain dans ces souris, par injection de PBMC humains. Ces souris ainsi humanisées offrent une alternative à l'utilisation de primates en recherche clinique. Nous choisissons volontairement de tester notre modèle sur les souris NSG ne connaissant pas à ce jour l’impact des anti-MEK dans l’humanisation de ces deux types de souris immunodéficientes. Lors des greffes de peau les souris NSG seront adultes (âgées de 6 à 8 semaines). Le modèle d'humanisation avec des hPBMC se réalise sur des souris adultes de 8 à 15 semaines (par expérience et sur les données de la littérature). La prise des greffes de peaux, après une phase de rétractation/asséchement, n'est effective qu'après 4/5 semaines ce qui justifie l'âge des souris lors de la greffe et de l'humanisation. Au moment de l’humanisation avec des hPBMC elles seront agées de 11 à 13 semaines pour permettre à ces cellules humaines de se développer et nous permettre d'utiliser ces animaux humanisés vers 2-3 semaines post humanisation avec les hPBMC.
Impact du ciblage des cellules sénescentes sur la longévité et l’espérance de vie en bonne santé
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Laissées vieillir jusqu'à 18 à 24 mois, elles reçoivent un anticorps ou un composé sénolytique par injection ou gavage tous les quinze jours, avec prélèvements de sang et d'urine, pour étudier l'élimination des cellules sénescentes dans le vieillissement. Le porteur anticipe la mort d'environ 20 % des animaux avant la fin, et la mise à mort de ceux qui perdent 15 % de leur poids. Il justifie le recours à la souris par la nécessité d'étudier un "organisme entier".
Objectifs
Ce projet fait partie d'une étude plus globale de caractérisation du rôle de la surveillance immunitaire des cellules sénescentes dans le vieillissement, les maladies liées à l’âge et le cancer. Ce projet est basé sur les résultats obtenus au sein du laboratoire qui démontrent un lien entre la surexpression d’un glycolipide à la surface des cellules pulmonaires sénescentes et leur échappement au système immunitaire. L’objectif du projet est de déterminer l’effet du blocage de glycolipide par un anticorps sur la réponse immunitaire et le développement de maladies liées à la senescence chez la souris âgée. L’interaction et la communication entre les cellules sénescentes et les cellules immunitaires seront étudiées pour établir le mécanisme par lequel ces cellules exercent des pressions d’adaptation mutuelles observée in vitro. Le développement et l’avancement de diverses maladies liés à l’âge (Fibrose pulmonaire, fibrose rénale, fibrose hépatique, arthrose, ostéoporose, cancer) seront également suivis afin d’évaluer l’effet thérapeutique de l’anticorps comparé à un sénolytique connu (une combinaison de molécules éliminant les cellules sénescentes). Nous voulons évaluer si cette approche immunothérapeutique pourrait augmenter la durée de vie des souris ainsi que diminuer leur état de fragilité générale. La finalité de ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement des molécules de surfaces associées aux cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âges incluant le cancer. Les résultats de cette étude devraient nous permettre de mieux développer l’anticorps et d’envisager des essais cliniques de phase précoce chez l’homme.
Bénéfices attendus
Par cette étude on s’attend à avoir une meilleure compréhension mécanistique des interactions entre le système immunitaire et les cellules sénescentes au cours du vieillissement mais également de déterminer le rôle et l’importance des point de contrôles immunitaires associés à la sénescence dans l’élimination des cellules sénescentes. Nous nous attendons également à comprendre si une approche immunothérapeutique visant ce ganglioside pourrait être envisagée afin de traiter et prévenir les maladies liées à l’âge et la comparer à un traitement déjà connu.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Administration de l’anticorps ou le sénolytique de référence ou les solutions contrôles (PBS ou isotype contrôle) par injection intrapéritonéale ou par gavage, pour tous les animaux, une fois tous les 15 jours pour 6 injections/gavages; durée d'environ 3 minutes par animal par injection/gavage - Pesée (toutes les semaines pour tous les animaux; durée moins d'une minute par pesée - Prélèvement sanguin (200µl une fois par mois pour tous les animaux) ; durée d'environ 5 minutes de manipulation (dilatation de la queue puis incision etrécupération, coagulation par pensement coagulant) par animal par injection - Collecte d’urine (tous les mois pour tous les animaux) sur animal vigile; durée moins d'une minute par anaimal - Imagerie µCT sur animal anesthésié (5 par groupe), durée d'environ 7 minute par animal.
Impact sur les animaux
Le phénotype âgé est un phénotype dommageable car il peut induire l’apparition de nombreuses maladies. Entre 18 et 24 mois nous nous attendons à avoir 20% de perte d’animaux par mort « naturelle ». Une feuille de score adaptée au vieillissement sera faite pour suivre le bien-être des animaux. On notera que les souris seront systématiquement pesées chaque semaine. Une baisse de 15% du poids de la souris par rapport à la précédente pesée conduira à sa mise à mort.
Devenir
Pour les 2 procédures, nous voulons déterminer l’état physiologique de l’animal et sa durée de vie. Pour cela, nous devons analyser sa survie globale sans souffrance et mettre à mort tous les animaux qui ne seraient pas décédés de causes naturelles pour pouvoir prélever les organes et les analyser en histologie, cytométrie et RNAseq mais aussi de tester les capacités fonctionnelles des cellules ex vivo. L’analyse concernant les tissus ne peut se faire autrement que ex vivo. La mise à mort de l’animal est donc nécessaire afin de pouvoir prélever les organes. Un maximum de tissus seront récupérés afin que de tirer le plus d’information possible de cette expérience. Ainsi, l’objectif scientifique de ce projet nécessite la mise à mort (ou la mort naturelle) de tous les animaux.
Remplacement
La sénescence et le système immunitaire étant un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, ce projet nécessite une étude à l’échelle de l’organisme entier. Notre projet vise à étudier les mécanismes biologiques à l’origine du vieillissement et en particulier à l’origine du vieillissement pathologique. Nous voulons comprendre comment un organisme peut vieillir et déterminer si de nouvelles stratégies thérapeutiques peut empêcher le vieillissement pathologique et l’incidence de nombreuses maladies liées à l’âge. Ces mécanismes reposent sur de nombreuses interactions entre différentes cellules telles que les cellules âgées dites « sénescentes » ou les cellules immunitaires mais également sur la communication entre différents organes. À la vue de la complexité des mécanismes étudiés aucun modèle in vitro ou synthétique ne peut mimer le niveau de complexité de ces interactions ni remplacer l’étude sur l’animal. Seul l’analyse au niveau d’un organisme vivant pourra nous permettre de déterminer si le ciblage des cellules sénescentes par notre anticorps permet de limiter la présence des cellules sénescentes dans les tissus, d’évaluer l’état d’activation du système immunitaire, les conséquences sur l’incidence de maladies liées à l’âge, l’effet sur la longévité et sur l’espérance de vie en bonne santé. En revanche, lorsque les mécanismes principaux seront identifiés, leur étude mécanistique sera réalisée le plus possible par des méthodes de remplacement en réalisant des expériences in vitro de coculture.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre minimum de souris pour les 2 approches expérimentales (longévité globale et vieillissement en bonne santé). L’ensemble du projet a donc été conçu pour REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une puissance statistique robuste. Pour cela nous avons utilisé 3 approches complémentaires. - Tout d’abord une analyse complète des données de la littérature sur les agents sénolytiques pour connaitre la taille des effets biologiques et connaitre les nombres d’animaux et les effets statistiques déjà observés. - Ensuite, nous avons choisi de coupler nos analyses avec un suivi longitudinal des animaux par utilisation de l’imagerie par scanner (microCT ; technique équivalente au PET-Scan utilisé en clinique pour l’évaluation de la fibrose chez l’homme mais adaptée au petit animal). Ceci a pour effet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en procédant à un suivi individualisé de chaque souris. - Nous avons « croisés » les contrôles pour les 2 procédures. Ainsi, le groupe contrôle recevra 6 IP d’anticorps isotype contrôle et 6 gavages contrôles, le groupe expérimental D+Q recevra 6 gavages de D+Q et 6 IP d’isotype contrôle et enfin le groupe anti ganglioside recevra les 6 IP d’anticorps anti ganglioside et 6 gavages contrôles. Ceci est exactement identique pour les 2 procédures. Cette stratégie a permis de supprimer complètement un groupe contrôle et donc de réduire le nombre d’animaux utilisé. - Nous réaliserons les 2 procédures en parallèle puisque les animaux sont issus du même lot chez le fournisseur et seront stabulés initialement et traités exactement de façon identique. Ceci permettra de comparer les résultats entre les 2 procédures, d’utiliser les mêmes animaux contrôles de 18 mois (les 15 animaux t0) et donc de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés en évitant de reproduire des contrôles inutilement. - Enfin, nous avons calculé précisément la grandeur de l’effectif nécessaire pour notre étude grâce au logiciel Gpower avec un test ANOVA oneway de puissance statistique de 0.8 associé à un effet taille moyen calculé sur les données déjà publiées d’effet de sénolytique (0.5) pour p≤0.05.
Raffinement
Les procédures de ce projet comprennent les éléments de raffinement suivants : Suivi quotidien des animaux, à l’aide d’une fiche de suivi appuyée par une grille de score clinique comprenant des points limites précoces et adaptés. Les animaux sont hébergés dans des pièces spécifiquement dédiées aux expériences sur le vieillissement permettant d'exercer un suivi plus précis et de limiter le stress et les risques de contamination en réduisant le passage dans ces zones. La conservation d’une cohésion sociale durant la durée de vie de l’animal. L’ajout d’éléments supplémentaire d’enrichissements incluant des maisons à ronger et des twists pour modifier la nidification en complément de l’enrichissement standard incluant des maisons rouges solides et des cotons carrés. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs afin de les habituer et de limiter le stress lors des procédures. Les protocoles d’imagerie non invasive permettant un suivi longitudinal sont menés sous anesthésie gazeuse. L'ensemble de ces mesures de raffinement visent à assurer le bien-être des animaux et assurer des résultats scientifiques de qualité pour éviter toute reproduction expérimentale inutile.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix avec une physiologie proche de l’homme (squelette osseux, poumons) et un cycle de vie relativement court (animal âgé à 18 mois). Chez la souris, les mécanismes de réparation et de dérégulation de la physiologie des tissus sont très bien décrits. Ils permettent une analyse précise de l'ensemble des phases mises en jeu au cours de ces évènements biologiques. Le modèle murin choisi est le seul nous permettant une approche intégrative des processus impliqués dans les maladies liées à l’âge. En effet, il permet d’étudier de façon concomitante les cellules immunitaires, les cellules sénescentes, l’avancement des maladies et l’expression du ganglioside. La physiopathologie des tissus est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour en tirer des données exploitables. La souris est le seul modèle accessible pour ce genre d’étude afin de répondre au questionnement scientifique de ce projet. Des souris âgées de 18 mois au début des expérimentations seront utilisées. Voulant étudier un large panel de maladies liées à l’âge et à la sénescence, le modèle le plus pertinent est donc d’utiliser des souris en vieillissement, soit ici 18 mois d’âge équivalent à 60 ans chez l’Homme. Les deux procédures décrites ici utiliseront donc des animaux au même stade de développement. Les données de la littérature montrent que certains phénotypes liés à l’âge émergent à partir de 12 mois mais que leur incidence est significativement plus élevée à partir de 18 mois. Pour analyser les capacités thérapeutiques de l’anticorps anti ganglioside et les conséquences de celui-ci sur l’émergence de ces maladies liées à l’âge et la longévité des animaux, nous allons utiliser donc des souris adultes âgées de 18 mois. Ceci nous permettra d’étudier comment le traitement fonctionne dans un organisme déjà vieillissant. D’autre part, en démarrant l’étude avec des animaux issus des mêmes croisements et directement âgés, en provenance du même fournisseur et avec un statut sanitaire SOPF très contrôlé, nous limiterons les effets de variabilité expérimentale.