Système immunitaire

402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dermatite atopique leur est provoquée par micropores au laser dans la peau puis application d'un allergène, une partie étant ensuite exposée à l'allergène par voie respiratoire pour déclencher une réaction de type asthme, et 104 recevant en plus de la toxine diphtérique pour détruire une sous-population de lymphocytes. Le porteur indique attendre une inflammation cutanée et pulmonaire légère et prévoit l'euthanasie selon des points limites. Il décrit la complexité de la réponse immunitaire comme rendant l'expérimentation in vivo nécessaire.

Objectifs

Les allergies (ou maladies atopiques), incluant la dermatite atopique (eczéma), l’asthme, la rhinite allergique et les allergies alimentaires sont des maladies inflammatoires complexes avec des caractéristiques communes, impliquant différents organes du corps. La dermatite atopique précède souvent le développement d’autres allergies, et sa sévérité aggrave le cours de l’allergie respiratoire. Cette évolution de la dermatite atopique vers d’autres maladies atopiques, et en particulier l’asthme, est appelée « marche atopique ». Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans la mise en place de la dermatite atopique est cruciale dans le but de développer de nouveaux traitements ou de nouvelles stratégies de prévention. Les lymphocytes T sont des cellules clés du système immunitaire permettant de se défendre contre les pathogènes. Cependant ces lymphocytes peuvent entraîner différentes maladies s’ils sont dérégulés, comme par exemple les allergies. Plus spécifiquement, deux sous-populations de lymphocytes T sont dérégulées dans la dermatite atopique et la marche atopique. Ces deux populations restent cependant mal définies à ce jour. C’est pourquoi nous nous intéressons au rôle et aux mécanismes impliqués dans la génération de ces populations de cellules immunitaires au cours de la dermatite atopique et de la marche atopique. Pour ce faire, nous utilisons un modèle mimant les caractéristiques de la dermatite atopique chez la souris. Dans ce modèle, nous utilisons une technologie permettant de générer des micropores dans la peau à l’aide d’un laser (technique également utilisée chez l’Homme dans la sphère médicale) puis nous appliquons un allergène sur la peau des souris. Cette étape engendre une dermatite atopique menant une sensibilisation de la souris à l’allergène. Pour étudier la marche atopique, nous appliquons ce même protocole pour induire la dermatite atopique, puis nous allons réexposer les souris à l’allergène au niveau des poumons, ce qui entrainera une réponse allergique similaire à un phénomène asthmatique. Ceci permettra d'étudier l'asthme.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre la pathogenèse de la dermatite atopique et de la marche atopique. Plus précisément, ceci nous permettra de déterminer les signaux induisant les différentes populations de lymphocytes dérégulés dans ces maladies, ainsi que le rôle de ces cellules. Elucider le fonctionnement de ces cellules pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans la dermatite atopique et la marche atopique. De plus, comprendre les signaux et cellules impliqués dans la génération des lymphocytes régulateurs pourrait permettre de trouver un traitement pour booster leur production et leur fonctionnement, ceux-ci ayant normalement pour rôle de contrôler les réponses immunitaires et donc par exemple les réponses allergiques.

Procédures

Pour étudier la dermatite atopique, 252 animaux seront anesthésiés au jour 0 pour la sensibilisation à un allergène au niveau de l'oreille (durée de la procédure : 20 minutes). Cette procédure est effectuée deux fois par semaine pendant deux semaines (durée totale de la procédure : 4x20 minutes = 1h20). Parmi ces 252 animaux, 74 seront également injectés avec de la toxine diphtérique (durée de la procédure : 10 secondes) pour éliminer une sous population de lymphocytes dans le but de déterminer leur rôle dans la dermatite atopique. Le nombre et les dates d'injections seront déterminé dans une expérience pilote. Tous les animaux seront euthanasiés au jour 13 pour collecter les différents organes pour analyses. Pour étudier la marche atopique, 150 animaux seront anesthésiés au jour 0 pour la sensibilisation à un allergène au niveau de l'oreille (durée de la procédure : 20 minutes). Cette procédure est effectuée deux fois par semaine pendant deux semaines (durée totale de la procédure : 4x20 minutes = 1h20). Ces animaux seront ensuite exposés à l'allergène au niveau des voies respiratoires (durée de la procédure : 30 minutes). Cette procédure est effectuée tous les jours du jour 9 au jour 12 (durée totale de la procédure : 4x30 minutes = 2 heures). De plus, les fluides bronchoalvéolaires seront collectés (procédure sans réveil) au jour 13 pour étudier l'inflammation des poumons. Parmi ces 150 animaux, 30 seront également injectés avec de la toxine diphtérique (durée de la procédure : 10 secondes) pour éliminer une sous population de lymphocytes dans le but de déterminer leur rôle dans la marche atopique. Le nombre et les dates d'injections seront déterminé dans une expérience pilote.

Impact sur les animaux

La sensibilisation à l'allergène au niveau de l'oreille des animaux conduira à une légère inflammation de type dermatite atopique sur l'oreille, se traduisant par une rougeur. Par le passé, nous n'avons pas observé d'autres effets avec ce traitement. De plus, nous avons déjà fait des injections de toxine diphtérique sur d'autres modèles, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. Les animaux traités par instillations intranasales d'allergène développeront une légère inflammation des poumons. Tous les animaux seront surveillés et tout effet indésirable sera traité selon les points limites énoncés dans le but de limiter la souffrance des animaux.

Devenir

Après la procédure "Modèle de dermatite atopique" et "Modèle de dermatite atopique + injection de toxine diphtérique" , les 178 et 74 animaux (respectivement) seront euthanasiés selon la procédure autorisée pour étudier les ganglions lymphatiques et la peau. Le dernier jour de la procédure "Modèle de marche atopique" et "Modèle de marche atopique + injection de toxine diphtérique", les 120 et 30 animaux (respectivement) seront euthanasiés pour analyser les voies respiratoires.

Remplacement

L'étude de la réponse immunitaire, et en particulier au cours de la dermatite atopique et la marche atopique, met en jeu différents organes et réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse immunitaire et le rôle de chaque cellule impliquée.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 402 souris, permettant de caractériser le rôle des lymphocytes Treg et Tfh dans les allergies, et en particulier au cours de la dermatite atopique et la marche atopique. Selon les expériences, les groupes comporterons 8 souris (modèle de dermatite atopique) ou 15 souris (modèle de marche atopique), ce qui permettra d'avoir des résultats statistiquement interprétables pour les différents paramètres étudiés, à l'aide d'un test de Student (t-test). Dans la partie 4 du projet, dans un but de réduction, l'oreille droite et l'oreille gauche des souris seront traitées différement et seront comparées entre elles. Trois études pilotes seront effectuées lors de ce projet, avec un nombre réduit d'animaux, dans le but de déterminer 1) l'allergène le plus approprié, 2) quand commencer les injections de DT en fonction de l'apparition des lymphocytes Tfh, 3) quand faire les injections de DT et leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupe dans leur cage pour préserver les interactions sociales. La sensibilisation est réalisée sous anesthésie gazeuse pour limiter la souffrance / stress des animaux. Après ces traitements, les animaux seront placés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Tout au long du protocole, les animaux seront surveillés de manière visuelle avec un suivi de l'aspect général des animaux (et en particulier des oreilles), de leur posture et de leur comportement. Une grille d'évaluation de la douleur sera utilisée. Si celle-ci est importante, ils seront retirés de l'étude et pourront bénéficier de soins. Si le cas est plus grave, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est le modèle choisi pour étudier la dermatite atopique et la marche atopique car le système immunitaire des souris est proche de celui de l'Homme avec une immunité innée mais également une immunité adaptative, ce qui permet l'étude de la réponse immunitaire spécifique d'un allergène et de la réponse mémoire. De plus, la peau des souris présente des similitudes (épiderme, derme, présence de cellules immunitaires) avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l'étude de la sensibilisation cutanée. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une ligature imprégnée de la bactérie Porphyromonas gingivalis est posée autour d'une dent et renouvelée tous les trois jours pendant 28 jours, pour provoquer une parodontite, suivie d'injections d'une molécule anti-inflammatoire. Toutes sont ensuite tuées par ponction du sang dans le cœur pour prélever les tissus. Le porteur affirme n'observer aucune modification de l'état de santé des souris et présente cette espèce comme la plus utilisée pour l'étude de cette maladie.

Objectifs

La parodontite est une maladie inflammatoire chronique très fréquente (47% de la population adulte américaine). Elle entraine une destruction des tissus de soutien des dents, générant des édentements précoces et une difficulté à la réhabilitation orale. Elle est déclenchée par un déséquilibre du microbiote (plaque dentaire) avec une infection par la bactérie Porphyromonas gingivalis. Les parodontites sont une source chronique de passage de bactéries dans le sang et d'une inflammation généralisée de faible intensité, favorisant des maladies inflammatoires à distance (ex : maladies cardiovasculaires). Il n'existe pas de cibles thérapeutiques de l'inflammation pour le traitement des parodontites, ni de biomarqueurs pour évaluer précocement et mieux suivre des malades, notamment ceux atteints d'autres maladies inflammatoires chroniques. Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans les lésions parodontales et semblent clés dans le développement des parodontites. Récemment, il apparait qu’il existe des sous types de neutrophiles aux fonctions pro-inflammatoires ou pro-résolutives de l'inflammation. Certaines drogues sont des inhibiteurs d'un facteur de la survie et l’activation du neutrophile, et permettent d’inhiber spécifiquement les neutrophiles pro-inflammatoires. Notre objectif est de déterminer si l’inhibition des neutrophiles pro-inflammatoires par administration d’une telle drogue permet de diminuer l’inflammation et la résorption osseuse dans un modèle de parodontite expérimentale chez la souris. La parodontite sera induite pendant 4 semaines, selon un protocole validé dans la littérature et maitrisé par notre équipe. Nous caractériserons la destruction du parodonte chez des souris injectées par cette drogue en comparaison de souris injectées avec l’adjuvant de la drogue et de souris contrôle (injectées avec un tampon neutre).

Bénéfices attendus

Notre projet est le premier à tester les conséquences d’une inhibition ciblée des neutrophiles pro inflammatoires par la drogue dans la pathogénie de la parodontite. Il pourrait ouvrir sur des pistes thérapeutiques régulant l’inflammation de la parodontite pour laquelle plus de 30% des situations échappent au traitement conventionnel (traitement qui repose actuellement exclusivement sur le contrôle de l’infection). De plus, une modification par lune drogue ciblant des neutrophiles circulants primés (activés) par l’inflammation parodontale et qui peuvent influer sur des processus pathogéniques à distance, tels que l’athérosclérose, sera recherchée et serait très prometteuse en prévention des comorbidités de la parodontite. Enfin, la parodontite est un modèle parfait de maladies inflammatoires choniques au cours de laquelle la régulation des neutrophiles est primordiale. Elle partage des mécanismes pathogéniques communs avec, par exemple, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la polyarthrite rhumatoïde : les résultats de ces travaux permetteraient donc d’ouvrir des perspectives dans l’étude de la pathogénie et de stratégies thérapeutiques d’autres maladies inflammatoires chroniques.

Procédures

Avant chaque expérimentation, les souris sont anesthésiées par une anesthésie générale par voie intra-péritonéale (IP) de Kétamine 100mg/kg-Xylazine 10mg/kg en solution injectable dans du sérum physiologique. L'intervention chirurgicale sera effectuée selon une procédure qui dure environ 10 min/souris. La procédure consiste en la pose répétée d’une suture de soie chirurgicale 6-0 imprégnée d’une solution de 109 CFU/mL de P gingivalis. Après chaque pose de ligature, les souris sont placées dans un environnement chauffé (tapis) et surveillées jusqu’à leur réveil. Cette procédure est répétée tous les 3 jours pendant 28 jours pour induire une inflammation chronique locale et une destruction du parodonte. Entre chaque renouvellement, les souris seront maintenues dans des cages dans un environnement enrichi avec nourriture et eau ad libidum. Au bout de 14 jours ; une destruction parodontale peut etre observée du coté ligature +/- P gingivalis pour tous les animaux. A 14 jours, les groupes recevront des injections de la solution diluante ou de la drogue pendant les 14 jours suivants, en parallèle de la poursuite du modèle de parodontite expérimental. Les groupes contrôles recevront un volume équivalent d’une solution neutre.

Impact sur les animaux

Notre expérience ne nous montre aucune modification observable de l’état de santé des souris suite à la réalisation des anesthésies par isoflurane et examen radiologique de précision micro-Computed Tomography (micro-CT), comme suite aux anesthésies générales et pose de ligature : aucune de perte de poids, de modifications comportementales, ni de modifications de l’apparence physique pour les animaux contrôles comme pour les animaux injectés avec la solution diuante n’ont été observées. Une prise de poids en accord avec les conditions d’élevage est observée démontrant que les souris se nourrissent correctement. La dose de drogue administrée est évaluée en accord avec la littérature scientifique). Une vigilance accrue sera mise en place pour les groupes d’animaux traités avec cette drogue.

Devenir

A l'issue de la procédure,tous les animaux sont mis à mort par exsanguination cardiaque sous anesthésie et analgésie profonde, permettant le prélèvement des tissus nécessaires à nos travaux.

Remplacement

Nous développons une recherche sur modèle expérimental chez le petit animal, car c'est le seul moyen à l'heure actuelle d’étudier les différents aspects de notre projet, c’est-à-dire analyser l’inflammation du tissu parodontal complexe. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives (in vitro, in silico) pour l’étude des parodontites, et la souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de cette maladie.

Réduction

Une publication sur la comparaison des modèles de parodontite expérimentale avec ligature +/- P gingivalis chez la souris montre une différence significative sur la perte osseuse et l'inflammation parodontale avec 5 souris/groupes (test statistique d’analyse de variance Turkey suivi d’un test t de Student). Le suivi longitudinal par micro- CT sur souris vivante de la perte osseuse induite nous permet aussi de rationaliser le nombre de souris. Une souris supplémentaire par groupe est prévue en cas de mort prématurée au cours de l’expérimentation. Le nombre d’animaux estimé et les tests statistiques sont également basés sur notre expérience pour ce type d’étude. Ce nombre minimum nous permettra d’être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet et de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes.

Raffinement

La procédure ne conduit pas à des altérations évidentes des souris. Le suivi quotidien des animaux et la mise en place de points limites permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par des antalgiques et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi pour minimiser leur stress.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de la parodontite et tout particulièrement pour l’approche moléculaire et histologique. De nombreux outils d’analyses, qu'ils soient commerciaux ou dans notre laboratoire, sont développés et adaptés à ce modèle. 3 mois – âge adulte avec croissance des maxillaires achevée

La buprénorphine est prévue à partir du score 2 de la grille de surveillance, et toute souris qui atteint le score 3 est tuée sur-le-champ par dislocation cervicale, les autres l'étant au cinquième jour de l'infection. 1 200 souris femelles adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, elles subissent soit une injection sous-cutanée de bactéries issues de la peau humaine, qui peut provoquer des abcès, une infection généralisée et de la douleur, soit une plaie de 4 mm faite au punch puis infectée, avant deux prélèvements de sang derrière l'œil, au deuxième et au cinquième jour. Il s'agit de comprendre comment ces bactéries colonisent durablement la peau de patients atteints de maladies génétiques de la peau, comme l'épidermolyse bulleuse, et de tester des molécules anti-inflammatoires et antibactériennes, un travail qui, selon le porteur, "pourra contribuer à mieux traiter les patients".

Objectifs

Il existe des maladies génétiques telles que les epidermolyses bulleuses ou le syndrome de Netherton caractérisées par une fragilité de la peau (génodermatoses). Les patients atteints de génodermatoses présentent des plaies qui sont infectées par des bactéries du microbiote cutané s. Les patients atteints des formes les plus sévères d’epidermolyse bulleuse présentent de larges décollements cutanés et développent des plaies infectées chroniques qui peuvent entraîner des cicatrices et une fibrose. Il est probable que la multiplication des bactéries sur la plaie, appelée "colonisation critique" dans la pratique clinique, entrave la cicatrisation et favorise l’inflammation locale et générale. En outre, les infections cutanées répétées favorisent les carcinomes spinocellulaires agressifs sur les sites exposés à des blessures continues. Les protéines (cytokines, chemokines, facteurs de croissance) exprimées au niveau de la plaie par les différentes populations cellulaires de la peau (kératinocytes, fibroblastes, cellules immunitaires) sont essentielles au processus de guérison et sont susceptibles d'être influencées par la colonisation par les bactéries du microbiote cutané. L'impact des différents types de souches bactériennes adaptées à l'hôte sur les signaux pro-inflammatoires et profibrotiques dans le contexte des plaies est mal connu. Les Objectifs scientifiques sont (i) comprendre pourquoi et comment les souches bactériennes issues de la peau humaine parviennent à coloniser de façon chronique la peau des patients atteints de pathologies de la barrière cutanée (ii) identifier les liens entre l'infection cutanée et les réponses pro-inflammatoires et profibrotiques de l'hôte. Les objectifs cliniques sont (i) tester l’impact de molécules anti-inflammatoires et antibactériennes sur la colonisation bactérienne des plaies et sur les réponses pro-inflammatoires et profibrotiques de l'hôte(ii) identifier les marqueurs de virulence bactérienne.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des infections chroniques de la peau chez les patients atteints d’altération de la barrière cutanée, comme les epidermolyses bulleuses ou le syndrome de Netherton, en exploitant des souches bactériennes issues de la peau humaines. Nous comparerons 2 modes d’infection pour évaluer l’impact local des souches (infection de plaies) et leur capacité à disséminer à partir d’un abcès (infection sous-cutanée). Ceci nous permettra de mieux comprendre le rôle des bactéries dans les lésions localisées et dans les lésions compliquées d’infection disséminée. Il est fondamental de comprendre l'impact des infections. Notre projet vise à identifier des marqueurs de sévérité des infections chroniques de la peau pour une meilleure anticipation et gestion des complications chez les patients. Notre projet prévoit aussi de tester des molécules visant à inhiber l'inflammation et la fibrose de la peau ce qui pourra contribuer à mieux traiter les patients. En outre, notre projet peut aider à fournir une compréhension physiopathologique plus large des mécanismes complexes qui sous-tendent les dermatites chroniques également associées à des infections cutanées, comme la dermatite atopique et les plaies chroniques non cicatrisantes des diabétiques.

Procédures

Au cours de l’ensemble des procédures, les interventions réalisées sur les animaux seront : (i) Procédure 1 : Inoculation bactérienne sous-cutanée (1minute par animal). (ii) Procédure 2 : Lésion artificielle et inoculation bactérienne (15minutes par animal). (iii) : Anesthésie (3 fois au cours de chaque procédure, 5minutes par animal). (iv) Prélèvement sanguin rétro-orbitaire (2 fois au cours de chaque procédure, volume de 30 à 60ul de sang, 3 minutes par animal). (v) mise à mort par dislocation cervicale (quelques secondes par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances infligées chez la souris sont (i) inoculation par injection sous – cutané, réalisée sous anesthésie gazeuse peut provoquer une infection profonde pouvant provoquer des abcès ou une infection systémique possiblement douloureuses (ii) la réalisation d’une plaie artificielle de 4mm par punch biopsy sous anesthésie peut entrainer une douleur. (iii) les prélèvements de sang rétro-orbitaire, réalisé sous anesthésie, à J2 et J5 peuvent engendrer une douleur. Pour le respect du principe des 3R la durée et les doses des infections seront réalisées selon les protocoles préétablis pendant une période d’infection de 5 jours ou la perception du stimulus qui causent la douleur sera surveillée par les critères relatifs au bien-être animal, selon une grille de score.

Devenir

Tous mis à mort par discolcation cervicale à J5 de l'infection.

Remplacement

Des expériences in vitro seront réalisées lorsque cela est possible pour démontrer le rôle précis de certains types cellulaires (keratinocytes, neutrophiles). Toutefois, les modèles animaux sont utilisés ici dans le but d’obtenir des modèles d’infection impliquant de nombreux types cellulaires interagissant les uns avec les autres et impossible à reproduire in vitro. En effet, au cours de l’infection les interactions entre les cellules de la peau (keratinocytes et fibroblastes) et les cellules immunitaires (neutrophiles, cellules de Langerhans, lymphocytes..) ont un rôle fondamental dans la capacité de l’hôte à éradiquer les bactéries pathogènes. De plus, l’infection est caractérisée par des symptômes uniquement observables chez l’animal (abcès). Il est donc impossible de reproduire efficacement un processus biologique aussi complexe impliquant le système immunitaire uniquement par des études in vitro. L’expérimentation animale est donc un élément clé de ce projet.

Réduction

Pour ce projet, nous utiliserons des souris femelles adulte s. Le nombre de souris qui sera inclus dans chaque groupe sera le plus faible possible pour pouvoir assurer la reproductibilité des expériences et répondre aux questions scientifiques . Le nombre d'animaux sera de 12 souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs. L’application de tests statistiques ( Student test, Anova) efficaces sur le nombre des échantillons collectés réduira l’utilisation des animaux dans les différentes conditions expérimentales.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation du décret n°2013-118 et adaptées. Nous veillerons à l’enrichissement de l’environnement des animaux par la mise à disposition de la nidification, de maisonnette et de bâtonnets en bois à ronger. Les animaux disposent de nourriture, d’eau et de litière. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux et de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance journalière et une durée limitée à 5 jours. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est sensibilisé à la détection des signes de souffrance des animaux et qualifié sur le plan réglementaire, technique en continu. Pendant la période de quarantaine les animaux seront familiarisés par la prise en main et la contention par l’expérimentateur. Pour limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie gazeuse. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée par le test des réflexes à la douleur (pincement du coussinet de la patte), les prélèvements sanguins rétro-orbitaire sont réalisés sur souris anesthésiées à l'isoflurane. La fréquence est de 2 prélèvements à J2 et J5 de l’infection en alternant les prélèvements des yeux. Afin de limiter la souffrance infligée lors des prélèvements sanguins, de l’ocry-gel sera appliqué en préventif sur l’œil prélevé, 5 min avant le prélèvement rétro-orbitaire. Des antalgiques sont prévus en pré-opératoire et en cas de souffrance en post -opératore si le score est égal à 2 (injection sous cutanée de 50ul de buprénophine à 0,05mg/kg). En cas d’atteinte de point limite égal à 3 , nous procèderons immédiatement à la mise à mort par une dislocation cervicale.

Choix des espèces

Au cours des quarante dernières années, la recherche sur les maladies infectieuses a fait de la souris un modèle de choix pour les maladies infectieuses humaines, permettant la mise au point de traitement efficaces et de réponses scientifiques. La pathologie de la peau développée suite à l’injection de bactérie chez la souris est très similaire à celle développée chez l’homme. Un autre facteur important la petite taille de l’animal, la courte gestation et la grande taille des portées rendent les souris facile à élever que tout autre mammifère actuellement utilisé pour la recherche sur les maladies infectieuses. Les souris adultes seront utilisées afin que le système immunitaire soit mature.

400 primates non-humains (300 macaques crabiers, 50 rhésus, 50 vervets) vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés après une période de repos. Ils reçoivent des candidats vaccins par voie intramusculaire ou sous-cutanée, avec des prélèvements sanguins pouvant être quotidiens et aller jusqu'à 20 % du volume sanguin, la contention étant obtenue par entraînement plutôt que par anesthésie. Le porteur indique que les animaux pourront être mis à mort pour prélever leurs organes si le commanditaire ne demande pas leur réutilisation. Il qualifie le "modèle primate" d'"incontournable" en immunothérapie du fait de sa proximité avec l'humain.

Objectifs

Ce projet porte sur l’évaluation de l’immunogénicité et de l’innocuité de candidats vaccins chez le PNH. Une étude d’immunogénicité consiste en: 1) l'administration d'un/plusieurs antigène(s) ou un candidat vaccin, 2) l'hébergement des animaux pendant la période nécessaire à l’obtention d’une réponse immunitaire et 3) au recueil du sang, des fluides corporels et/ou des organes afin d’analyser, par des méthodes in-vitro, la réponse immunitaire. L’objectif est d’analyser la réponse immune primaire (première en réponse à une infection) ou la réponse mémoire (secondaire à l'infection) ainsi que certains paramètres d’innocuité (réaction locale et systémique, suivi du poids et éventuellement de la température corporelle, etc).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet pourront être multiples : 1) sélection des antigènes et des adjuvants constituant le candidat vaccin, 2) définition de la dose humaine, 3) évaluation du mécanisme d’action du candidat vaccin, 4) évaluation de la performance du candidat vaccin au niveau préclinique avant les essais cliniques chez l’homme, 5) support au développement des procédés de production des antigènes et des adjuvants, 6) support au développement d'un test d’activité biologique. Ces différentes données précliniques ont pour but de sélectionner et d’optimiser les candidats vaccins en amont de leur évaluation clinique et en support à leur enregistrement réglementaire.

Procédures

Le projet consiste en l’administration d’un/plusieurs antigène(s) sous différentes voies d'administration et si nécessaire d’un adjuvant entre 1 et 4 fois. De façon générale, les voies d'administration de vaccin utilisées sont l'intramusculaire ou la sous-cutanée ; ces administrations peu invasives sont rapides (

Impact sur les animaux

Des réactions locales au niveau des sites d'administration et une réaction systémique de type fièvre peuvent apparaître les jours suivants les administrations du candidat vaccin. Les sites d'administration et la température corporelle seront donc suivis les jours suivants les administrations.

Devenir

Les animaux seront réutilisés après une période de repos et avis vétérinaire (revu du protocole de prélèvement sanguin: fréquences et volumes prélevés en fonction des recommandations). Si la réutilisation n'est pas envisagée (demande du sponsor) , les animaux pourront être mis à mort pour récolte d'organes.

Remplacement

L’évaluation de l’immunogénicité spécifique d’un antigène nécessite un enchaînement d’étapes impliquant de multiples organes et tissus évoluant sur plusieurs semaines. Cette succession d’évènements est difficile à reproduire in-vitro et pour cette raison, le recours à l'animal est requis dans la plupart des cas. Des essais in-vitro sur cellules animales ou humaines peuvent apporter des données complémentaires mais ne peuvent pas encore substituer les essais in-vivo à ce jour.

Réduction

Pour chaque procédure réalisée, il sera veillé à utiliser un nombre minimal et suffisant d'animaux pour que les résultats soient interprétables et transposables.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des dispositifs d'enrichissement dans des locaux appropriés, conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé. Une attention particulière sera accordée à l’enrichissement du milieu de vie des animaux. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. L'inclusion de paramètre hématologiques et biochimiques pour le suivi clinique, l'inclusion de prélèvement de fluides biologiques permettent un suivi précis du statut de l'animal. Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux entre les prélèvements ainsi qu’entre les administrations de la ou des molécule(s) étudiée(s). Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable. Avant tout acte techniques, les animaux bénéficieront d'entrainements avec récompenses, ce qui permettra de réduire leur stress durant les manipulations.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé chez le primate (macaque cynomolgus, rhésus ou vervet) du fait de sa proximité phylogénétique avec l’Homme et en particulier en raison des similitudes du système immunitaire et de la qualité des réponses immunes entre ces deux espèces. Le modèle primate est incontournable en immunothérapie où beaucoup de molécules montrent des résultats décevants dus à un manque de similitude avec d'autres modèles tels que les rongeurs. Il est donc légitime de penser que les résultats observés chez le PNH seront très utiles pour prédire les mêmes phénomènes physiologiques et comportementaux chez l’Homme. Pour le choix de l’espèce de macaque, les données de la littérature seront considérées lorsque disponibles, ainsi que des aspects techniques : taille, état sanitaire et disponibilité des animaux d'élevage. De jeunes adultes seront utilisés pour des raisons de poids et de maturité du système immunitaire.

416 rats et 444 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue par exposition au CO2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats sont infectés par le parasite S. ratti pour entretenir la lignée parasitaire, les souris vaccinées jusqu'à quatre fois puis infectées à deux reprises, avec trois prélèvements sanguins. Le projet teste si des biothérapies anti-allergiques nuisent aux défenses contre les vers parasitaires. Le porteur affirme que cette immunité complexe ne peut être reproduite in vitro et que le maintien du parasite impose le recours aux rats.

Objectifs

Les infections par les vers parasitaires touchent actuellement près de 1/4 de la population mondiale. A l’heure actuelle, les mécanismes innés et adaptatifs de défense contre ces parasites ne sont pas complètement compris. L’immunité « de type 2 » impliquant les IgE, les cytokines IL-4 et IL-13 et les mastocytes joue un rôle très important dans les pathologies allergiques. De ce fait, de nombreuses biothérapies développées actuellement pour traiter les allergies ciblent cette immunité de type 2. Cependant, les mêmes acteurs cellulaires et moléculaires sont également impliqués dans la défense contre certains parasites. Il est donc très important de tester l’effet de ces nouvelles biothérapies anti-allergiques sur les réponses contre des parasites, afin de s’assurer de la sureté de ces approches.

Bénéfices attendus

L'immunité adaptative (principalement la réponse anticorps) joue un rôle fondamental lors d’une réinfection avec le même parasite. Les mastocytes jouent un rôle important lors des infections primaires et secondaires, permettant l’expulsion des parasites. Cependant, les sous-populations de mastocytes (connectifs versus mucosaux) et les mécanismes permettant aux mastocytes de jouer ce rôle de défense ne sont pas bien connus. Notre laboratoire développe des stratégies vaccinales et des biothérapies pour le traitement de l’asthme et des allergies, ciblant principalement les cytokines de type 2 (IL-4 et IL-13), les IgE et les mastocytes. Il est très important de vérifier que ces biothérapies n’auront qu’un effet limité sur les défenses anti-parasitaires afin de s’assurer de la sureté de ces nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Un total de 416 rats sera infecté en sous-cutané avec le parasite S. ratti afin de collecter des larves dans leurs fèces. Les rats seront mis à mort par exposition au CO2 après 9 jours au plus tard (procédure 1). Un total de 192 souris sera immunisé un maximum de 4 fois aux jours 0, 7, 28 et 49 en intramusculaire dans la cuisse arrière avec une formulation de vaccin dirigé contre l’IL-4, l’IL-13 ou les IgE dans un volume de 50 µL (procédure 2). Un total de 96 souris sera injecté en intrapéritonéal deux fois par semaine pendant 3 semaines (6 injections au total) avec un conjugué SCF-doxorubicine (10mg/kg maximum dans 200 µL de PBS) (procédure 3). A l’issue des procédures 2 et 3, l’ensemble des souris ainsi que 156 souris additionnelles (soit un total de 444 souris) seront ensuite injectées en sous-cutané avec des larves de parasite S. ratti pour un total de deux fois à 28 jours d’intervalle. Nous réaliserons trois prélèvements sanguins à la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%) aux jours 0, 7 et 21 (procédure 4).

Impact sur les animaux

D’après les données de la littérature et notre expérience antérieure avec ce modèle, l’infection avec le parasite S. ratti n’induit pas de signes visibles de douleur ou de comportement anormal chez les animaux.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort par exposition au CO2. L’ensemble des animaux des procédures 2 et 3 seront utilisés dans la procédure 4. Et à l’issue de la procédure 4, l’ensemble des animaux sera mis à mort par exposition au CO2.

Remplacement

Les mécanismes de défense contre les nématodes (parasites) sont complexes et nécessitent l’action concertée de plusieurs types de cellules immunitaires et d'anticorps. Ceci ne peut être reproduit in vitro. De plus, le maintien de ces nématodes ne peut être fait in vitro et nécessite donc l’utilisation de rats pour maintenir la lignée parasitaire.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permettent d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 4 animaux par groupe de même âge et sexe pour chaque expérience. Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. Les tests statistiques seront effectués avec le logiciel Graph-Pad Prism. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs nous choisirons un des tests statistiques suivants : 1- way ou 2-way ANOVA, Mann-Whitney ou unpaired 2-tailed Student’s t test ; nous considèreront une valeur de P significative si elle est inférieure à 0.05.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux. Ce suivi permet d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (4 à 5 animaux par cage, pas d’isolement ni de changement de cage). De plus, un enrichissement sera rajouté aux animaux (carrés de coton pur ou du papier absorbant) permettant aux animaux de faire une nidation, selon la directive européenne 2010/63/UE. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Enfin, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sous un fond génétique bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Les rats Wistar sont utilisés pour la conservation de la souche S.ratti. Comme le rat est l’hôte naturel de S.ratti, les rats de Wistar permettent d’obtenir facilement la quantité de vers nécessaires pour les expériences qui seront réalisées chez la souris. Pour la majorité des expériences, les souris seront utilisées entre 8 et 12 semaines, ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les animaux seront utilisés à 6 semaines uniquement pour les procédures 2 et 3 (vaccination anti-IL4, anti-IL13 ou anti-IgE et déplétion des mastocytes).

304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de plaquettes dans le sinus rétro-orbital et subissent des prélèvements sanguins répétés à la queue, puis un prélèvement terminal à l'aorte abdominale sous anesthésie. Le porteur étudie l'élimination des plaquettes transfusées chez un receveur devenu réfractaire et affirme que ces processus "ne peuvent être étudiés qu'in vivo". Il croise deux lignées de fonds génétiques différents pour reproduire la différence entre donneur et receveur.

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle fondamental dans les processus d’hémostase. C’est ce qui nous permet d’éviter les hémorragies en cas de blessures ou de lésions. Quand le taux de plaquettes circulantes chute en dessous de 10.000 plaquettes par μL de sang chez un patient, le risque d’hémorragie interne devient important et une transfusion peut être envisagée. Une complication post transfusionnelle connue est la production d’anticorps anti¬plaquettes par le receveur dirigés contre les plaquettes du donneur. Ainsi, si receveur développe de tels anticorps de nouvelles transfusions seront inefficaces sur un plan thérapeutique puisque les plaquettes du donneur seront détruites par ces anticorps et très rapidement éliminées de la circulation : on dit alors que le patient est en état réfractaire. Cette problématique est particulièrement importante chez des patients dont les pathologies nécessitent des transfusions plaquettaires récurrentes. Objectif : Des études préliminaires ont permis d'avancer dans la compréhension du mode d'action des anticorps produits par le receveur et responsables de l'élimination des plaquettes transfusées. Ce projet nous permettra d'évaluer une approche pharmacologique ayant pour but d'éviter que les plaquettes transfusées soient éliminées trop rapidement de la circulation du receveur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont d'apporter des connaissances sur les mécanismes d'élimination des plaquettes transfusées lorsque le receveur rejette sa transfusion et qu'il y a donc une inefficacité thérapeutique transfusionnelle appelée également état réfractaire. Les perspectives de ce travail sont denvisager des solutions thérapeutiques chez l'homme et une meilleure prise en charge des patients multitransfusés.

Procédures

Les animaux subiront des prélèvements sanguins à l'aorte abdominale (prélèvement terminal sous anesthésie) ou des prélèvements sanguins à la queue (petits volumes prélevés, sous anesthésie ). Les prélèvements à l'aorte sont des prélèvement terminaux donc unique par définition. Prélèvements sanguins répétés sur animal anesthésié : Les prélèvements sanguins à la queue sont réalisés 5 min, 30min, 2h, 24h et 48h après la transfusion de plaquettes, soit 5 prélèvements de 10 µL sous anesthésie gazeuse sur le même animal.

Impact sur les animaux

Pour réaliser ce projet, 304 souris au maximum devront être utilisées et mis à mort à la fin du projet. Cependant, les procédures réalisées sont modérées et seront effectuées dans le strict respect des règles mises en place pour veiller au bien être des animaux. Les animaux subiront un stress au moment de l'anesthésie (contention de l'animal pour lui injecter l'anesthésiant) mais ce geste n'est pratiqué que par des expérimentateurs habilités à réaliser ce geste (donc rapidement). Une douleur peut être ressentie au niveau du site d'injection des plaquettes dans le sinus rétro-orbital d'où l'utilisation d'un collyre contenant de la tétracaine pour limiter la douleur.

Devenir

Les animaux de la PE n°1 seront soit mis à mort (lot n°1: prélèvement sanguin terminal à l'aorte abdominale) soit utilisés pour la PE n°2 (lot n°2) Les animaux utilisés dans les PE n°2 et n°3 seront mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

Les événements initiaux conduisant à la production d’anticorps anti-plaquettes et aux états réfractaires ne peuvent pas être étudiés chez des patients transfusés. Nous voulons évaluer l'effet d'une stratégie thérapeutique. Ces processus mettent en oeuvre simultanément des interactionsentre les vaisseaux, le sang et la circulation sanguine. Ces événements sont intégrés et ne peuvent être étudiés qu’in vivo.

Réduction

Les mises au point réalisées en amont pour vérifier que ce protocle d'alloimmunisaton conduit à un état réfractaire permettra de n’utiliser que le minimum de souris dans les groupes de souris immunisées. Les nombres d'animaux utilisés lors des expériences seront minimalisés avec la contrainte d'obtenir des observations suffisamment représentatives. Des expériences préliminaires au laboratoire nous ont permis de fixer à 5 le nombre de souris par conditions testées, ce chiffre tient compte de la variabilité inter-individus.

Raffinement

Les conditions d’environnement sont optimisées par l’enrichissement des cages avec du coton et de la frisure, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Ils ont un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. Les individus sont hébergées par groupe de 6 par cage. Un soin particulier sera apporté afin de diminuer le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet : - Hébergement dans des cages munies de particules de bois et enrichie avec un carré en coton compressé afin de permettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux.-Accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture -Anesthésie de l’animal afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés. -Injection d’analgésique le cas échéant. -Mise en place d’une fiche de suivi pour suivre l’état des animaux et veiller à leur bien être tout au long de l’expérimentation. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Ils veilleront au bien être des animaux grâce à l'utilisation d'une grille de scoring et à la défintion de points limites permettant d'éviter toutes douleurs ou souffrances inutiles de l'animal. Ce projet nécessitera 304 souris au maximum

Choix des espèces

Puisque nous souhaitons mimer la différence qui existe entre un donneur et un receveur qui conduit à la production d'anticorps par le receveur, nous devons travailler avec des souris de fond génétique différents et très bien caractérisés au laboratoire (C57BL6/J et BALB/c). De plus, le modèle d’alloimmunisation post transfusionnelle est bien caractérisé et maîtrisé au laboratoire ce qui rend l’utilisation de la souris dans ce projet très pertinente. Les animaux sont utilisés au stade adulte, pubère âgé de 7 à 12 semaines afin de pouvoir étudier l'effet des anticorps sur un individu au système immunitaire mature.