Système urogénital

150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous-cutanées d'antigène associé à un adjuvant et trois prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus comme réactifs à des équipes de recherche. Le porteur indique que les immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et que le recours à l'animal vivant reste "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces immunoglobulines constituent des ressources largement utilisées dans des applications analytiques et thérapeutiques. Les AcP sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ils trouvent des applications en biologie et en biochimie, en tant que ligand de colonne d’immunoaffinité. Ils possèdent également de nombreux emplois en recherche tel que la détection de molécules dans les essais du type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), les révélations de Western Blot, les procédures immunohistochimiques et d'immunoprécipitation, en immunofluoromicroscopie et en immunoélectromicroscopie. Notre processus de production assure la production d’AcP pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les antisérums sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps ; lorsque le titre est suffisamment élevé, on prépare un antisérum en effectuant une prise de sang suivie de l'isolement du sérum puis, si nécessaire, de la purification des anticorps à partir du sérum

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux (AcP) seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. Les anticorps développés de cobaye dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe. L’utilisation du cobaye interviendra dans des projets particuliers pour lesquels, cette espèce présente un avantage par rapport à d’autres. En effet, les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Le cobaye étant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, il permet l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où les cobayes ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins.

Procédures

Six injections aux cobayes en sous-cutané de l’antigène associé à un adjuvant. Trois prélèvements sanguins seront réalisés, au niveau de la veine saphène sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné). Injection sous-cutanée : 8 minutes dont 4 minutes pour prendre avec délicatesse l’animal, le rassurer et le préparer, 30 secondes par injection et 30 secondes pour masser la zone injectée (4 injections), c’est-à-dire 4 min. Prélèvement : l’endormissement sous anesthésie gazeuse prend 10 minutes pour être effective. Le prélèvement sous anesthésie au masque est réalisé pendant 3 à 4 minutes. Le réveil de l’animal prend 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 cobayes par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Raffiner : L’environnement des cobayes est enrichi pour améliorer leur bien-être (tunnel de jeu, friandises, foin, jouets,…). Les animaux seront particulièrement suivis pendant les 24h suivant les injections, puis quotidiennement pour examiner leur état de santé. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Les prélèvements réalisés, sous anesthésie, concerneront de faibles volumes afin de ne pas induire de souffrance chez l’animal. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

Les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Etant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, ils permettent l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où ils ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins. Ils permettent également l’obtention d’anticorps ayant une forte capacité à fixer le système du complément. Ils permettent en comparaison des souris de Réduire le nombre d’animaux engagés dans chaque protocole à 3 individus. La production d’anticorps chez le cobaye nécessite de faibles doses d’antigène. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les cobayes entreront en protocole à l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine d’une semaine, sans incident durant ce temps, ils seront aptes à rentrer en protocole.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont nourries pendant six mois avec des croquettes contenant des pesticides, subissent des prélèvements et des mesures de fonction rénale, puis une chirurgie qui provoque une agression rénale aiguë et une détérioration de leur fonction rénale. Le porteur indique une perte de poids, une prostration ou une léthargie possibles, déclenchant la mise à mort au-delà de 24 heures. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet aujourd'hui de tenir compte de la physiologie d'un "organisme entier".

Objectifs

Les maladies rénales chroniques et aigues sont en augmentation constante dans le monde et représentent un problème important de santé publique. Les reins sont des organes sensibles à certaines molécules toxiques. Parmis celles-là, les pesticides sont largement utilisés en agriculture et peuvent parfois ne pas être totalement spécifiques des organismes nuisibles mais pourraient affecter aussi la faune et l’Homme. Nous voulons donc savoir si une exposition chronique à de faibles doses de pesticides modifie la fonction rénale et rend ces organes plus fragiles.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projets sont de mieux caractériser les effets rénaux des pesticides, afin de savoir s'ils fragilisent les reins et peuvent les faire évoluer vers une insuffisance rénale.

Procédures

Les animaux seront nourris pendant 6 mois avec des croquettes contenant des pesticides. Pendant ces 6 mois de régime, des prélèvement d’urine, de selles et de sang pourront être effectués à 2 reprises, chez les animaux vigiles. Des mesures de la fonction rénale seront réalisées 3 fois . Cette intervention nécessite une courte anesthésie d'environ 5 minutes suivie d'une mesure de 45 minute sur animal vigile grâce à un dispositif fixé sur le dos de l'animal qui est ensuite retiré. Enfin, à l'issue des 6 mois de régime, les animaux subiront une intervention chirurgicale d'environ 30 minutes (sous anesthésie générale et analgésie) pour induire une agression rénale.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une agression rénale aigue, résultant en une détérioration de leur fonction rénale.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin du projet.

Remplacement

Étant donné la complexité des mécanismes pathologiques mis en jeu, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants qui ne tiennent pas compte de la physiologie d’un organisme entier. Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives pour obtenir des résultats exploitables et pertinents par rapport à la pathologie humaine.

Réduction

les modèles expérimentaux sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 216 souris

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis: 1) Perte de poids supérieure à 20% du poids initial ; 2) Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après l’ARA ; 3) Signes de souffrances (comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront euthanasiés

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d'utiliser le moins d'animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est déjà l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines au début de l'expérience, à ces âges les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.