Recherche appliquée

Jusqu'à 25 injections intrapéritonéales par animal, et une prise de sang tous les quinze jours pendant huit semaines : 612 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés. Elles reçoivent du busulfan pour préparer leur moelle osseuse, une greffe de cellules de leucémie aiguë myéloïde issues de patients, puis des chimiothérapies. L'objectif déclaré est de vérifier chez la souris qu'un test de séquençage de l'ADN mitochondrial, le mitoscore, permet d'ajuster les combinaisons de médicaments patient par patient. Le choix s'est porté sur des souris NOD-SCID, immunodéprimées par construction pour que la greffe humaine prenne, et dont le porteur reconnaît le phénotype dommageable.

Objectifs

La leucémie aigüe myéloïde est une maladie du sang dont l'incidence augmente avec l'âge. Son pronostic est mauvais (environ 35 % de survie à 5 ans). Au diagnostic, une classification du pronostic est effectuée (classification ENL 2017). Cette classification permet de catégoriser le pronostic en 3 groupes (favorable, intermédiaire ou défavorable). Cette classification est complexe, coûteuse et également imparfaite. Une nouvelle classification a récemment été inventée : le mitoscore qui se base sur le séquençage de l'ADN mitochondrial. Ce test est moins couteux, plus rapide à mettre en œuvre et permet une meilleure stratification des groupes (notamment pour le groupe favorable). L'objectif du projet et de faire du mitoscore un compagnon pour la médecine de précision. Le test va mettre en avant des gènes mutés ce qui va permettre d'ajuster les combinaisons de drogues à utiliser en fonction de chaque patient. Dans un premier temps, plusieurs drogues seront testées in vitro sur des lignées cellulaires leucémiques de manière à déterminer une matrice de sensibilité en fonction du mitoscore. Dans un second temps, la matrice de sensibilité sera confirmée sur des cellules de patients atteints de LAM. C'est dans un troisième temps que nous confirmerons la stratégie sur un modèle in vivo. A la suite de ça, nous metterons au point une procédure d'imagerie non invasive pour le suivi de l'effet thérapeutique.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de cette étude est de confirmer sur modèle animal que la classification mitoscore nous permet d'ajuster la combinaison de différentes chimiothérapies à chaque cas et ainsi augmenter la réponse au traitement.

Procédures

injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse (2 fois 5minutes) prélèvements de sang sur animaux vigiles (touts les 15 jours pendant 8 semaines, 5 minutes) injection intra péritionéale sur animaux vigiles (maximum 25 fois 1 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux dans cette étude sont le phénotype dommageable des souris, les effets secondaires de l'injection de Busuflan (conditionement de la moelle osseuse pour la prise de greffe), les effets de la leucémie aigue myéloïde, les effets secondaires de la chimiothérapie de référence et les prises de sang pour le suivie de la maladie.

Devenir

Les animaux issus des procédures seront mis à mort, afin de prélever leurs organes pour des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

À partir des gènes identifiés pour le mitoscore, 6 molécules d'intérêt ont été identifiées. Par la suite, une matrice de sensibilité sur lignée cellulaire de cellules leucémiques sera établie in vitro pour toutes les molécules candidates. Cette matrice de sensibilité sera ensuite testée ex vivo sur cellules de patients atteints de leucémie aigüe myéloïdes. Grace à cela, seulement les 3 molécules les plus prometteuses seront sélectionnées pour l'étude in vivo. Les paramètres de toxicité et d'efficacité thérapeutique sont obtenus uniquement par l'emploi d'animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l'homme. Il n'existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d'information scientifique.

Réduction

Des tests in vitro permettront de réduire le nombre de molécules et ne seront testés sur animal que les molécules ayant montré une efficacité au préalable. Concernant les tests sur animaux, nous nous efforcerons de faire en sorte que l’effectif utilisé soit minimal. Cela permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux employés autant que possible tout en obtenant des informations scientifiques avec une validité statistique suffisante. Nous avons prévu un minimum de 30% de prise de greffe mais si ce chiffre est meilleur, nous diminuerons d'autant le nombre de souris dans ce projet. Par ailleurs, s'il s'avère que le taux de prise de greffe est inférieur à 30% le projet sera stoppé et nous réévaluerons notre étude. Dans la procédure expérimentale 2, si le véhicule des molécule candidate est le même pour toutes, nous ne ferons qu'une seule fois le groupe "chimio de référence + véhicule molécule candidate". Ce qui nous permettrai de diminué au maximum de 72 le nombre de souris. Les groupes expérimentaux sont constitués de n = 12 individus afin de disposer d’une puissance statistique suffisante pour l’évaluation de l’effet du traitement.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales seront réalisées dans un établissement autorisé et en stricte conformité avec le comité local de protection des animaux, les lignes directrices de l'UE (directive 2010/63/UE) et le Comité national français (2010/63). Les animaux seront hébergés et surveillés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément. La conception et l’application des procédures expérimentales, le soin et l’hébergement des animaux seront effectuées par du personnel compétent et formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, enrichi avec des tunnels en carton et morceaux de papier pour y faire un nid. La nourriture et l’eau de boisson stérile sont fournies ad libitum. Les souris utilisées dans ce projet ont un phénotype dommageable, des mesures de compensatoires de raffinement ont donc été prises pour leur hébergement : les circuits sale/propres sont séparés, le box est en surpression, les cages sont stériles et jetables, la litière, les croquettes et l'enrichissent sont également stérilisés. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux garantiront leur bienêtre, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (administration d'un analgésique si besoin). Toutes les injection IV et les imageries seront faites sous anesthésie gazeuse. Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées lors de l'observation des animaux. Ces effets indésirables sont listés parmi les points limites de chaque procédure. Nous utiliserons des souris immunodéprimées qui permettent l'étude de lignées cancéreuses humaines sans phénomène de rejet.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées (NOD-SCID) permettrent la prise de la greffe et le développement de la leucémie aïgue myéloïde issue de patient. Souris NOD-SCID de 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes, de taille et de poids suffisants pour être facilement manipulables.

Trois prises de sang de 15 ml par semaine pendant trois semaines sous anesthésie générale, puis des injections sous-cutanées de cellules tumorales humaines, puis la surveillance de la pousse des tumeurs, puis un transport vers un second établissement pour deux anesthésies de deux heures et l'exérèse. 10 miniporcs vont être utilisés dans ce volet du projet, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sous immunosuppresseur pendant tout le protocole. Le porteur situe la douleur à l'endroit de la tumeur jusqu'à son retrait, puis sur les cicatrices pendant les 24 heures qui suivent la chirurgie. Il annonce une étude qui "permettra de passer rapidement à des essais cliniques chez l'Homme", quand l'objet immédiat est de calibrer une sonde de détection déjà essayée sur cultures cellulaires et tissus isolés.

Objectifs

Le but de ce projet est de mettre au point/valider des protocoles qui seront utilisés lors d'études cliniques. D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, le cancer est une cause majeure de décès dans le monde, 10 millions de décès en 2020. En moyenne, 20 à 50 % des patients opérés dans le cadre de résection tumorale subissent une récidive cancéreuse locale. Ces récidives locales sont principalement dues aux résidus tumoraux qui subsistent dans la plaie opératoire après la chirurgie. Détecter les cellules cancéreuses pendant la résection et garantir des marges nettes signifie assurer l'ablation complète des tissus tumoraux, tout en préservant les tissus sains environnants, afin de ne pas endommager les zones fonctionnelles. L'objectif de notre projet est de valider la détection des tumeurs avec une sonde peropératoire détectant les rayonnements bêta afin d’améliorer la résection tumorale. Plusieurs tumeurs seront implantées chez un même animal dans le but de pouvoir vérifier la précision chirurgicale du dispositif médical, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le dispositif détecte des radiotraceurs bêta in situ précédemment injectés. Ces radiotraceurs, actuellement utilisés pour le diagnostic en imagerie TEP (Tomographie par Émission de Positons) et la thérapie (radiothérapie interne) permettent une détection très spécifique et sensible. Cette technique consiste à utiliser un noyau radioactif entouré d’une matrice et qui a la particularité d’être spécifique à chaque tumeur. Ce nouvel outil chirurgical, sonde de détection des particules β, indépendante du type de cancer, couplée à un outil d’exérèse, permet de guider en temps réel le geste des chirurgiens en localisant les résidus de cancer à extraire tout en préservant les tissus sains environnants. Pour vérifier l'efficacité et calibrer in vivo ce dispositif, nous devons travailler avec un modèle proche de l’homme en termes de tissus et de taille importante tel que le miniporc.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à améliorer le traitement chirurgical des cancers. Ces essais in vivo vont permettre de mieux calibrer et affiner l'utilisation d'un dispositif médical qui aide les chirurgiens oncologues à l'exérèse totale des tumeurs. Cette étude permettra de passer rapidement à des essais cliniques chez l'Homme.

Procédures

Etablissement 1 : Les porcs recevront un médicament immunosuppresseur pendant toute la durée du protocole. Trois prises de sang de 15ml chacune seront faite chaque semaine pendant 3 semaines, c'est une intervention rapide de moins de 3 minutes, sous anesthésie générale. Par la suite, ils recevront des injections sous cutanées de cellules tumorales, sous anesthésie, qui durent moins de 10 minutes. Dans les jours qui suivent la pousse des tumeurs est survéillée. Etablissement 2 : Les porcs subissent deux anesthésies générales de 2h chacune pour imagerie médicale et retrait des tumeurs.

Impact sur les animaux

Premier établissement : Les porcs subiront plusieurs anesthésies de courte durée (moins de 15 minutes) pour la réalisation de prises de sang et l’injection de cellules tumorales. Ceci peut provoquer une douleur passagère à l’injection et une confusion temporaire au moment du réveil. Ils seront implantés avec des cellules tumorales qui provoqueront la pousse d’une tumeur sans métastase ou effet paranéoplasique, ce qui va provoquer une gêne mécanique à l’endroit de la tumeur ou une douleur ou inflammation localisée qui durera tout le temps de la présence de la tumeur jusqu’à l’exérèse. Les porcs seront transportés entre les deux établissements, ce qui va provoquer un stress d’une durée maximale d’une heure. Deuxième établissement : : Les porcs subiront deux anesthésie de moyenne durée (environ deux heures pour l’imagerie médicale ). Ceci peut provoquer également une douleur à l’injection des produits anesthésique et une confusion mentale au moment du réveil. Ils subiront aussi une intervention chirurgicale rapide, d’exérèse des tumeurs au cours de la deuxième anesthésie. Ceci peut provoquer une légère douleur à l’induction de l’anesthésie, mais surtout une douleur sur les cicatrices au réveil et pendant le 24h qui suivent la chirurgie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux des tissus pour l'analyse histologique.

Remplacement

Le dispositif médical que nous testons a déjà été essayé sur des cultures cellulaires et des tissus isolés. Il a montré sa sensibilité et son efficacité, mais ll faut désormais sur des tumeurs d'animaux vivants, tel que le Règlement Européen sur les dispositifs médicaux le demande.

Réduction

Le nombre d'animaux est déterminé par le nombre de tumeurs à traiter. Le Règlement Européen 2017/745 demande un minimum de preuves d'efficacité en nombre de traitement. Le produit est considéré efficace s'il fonctionne 10 fois sur chaque tumeur. Nous avons déterminé qu'il est possible d'implanter 6 tumeurs par miniporc à raison de 2 tumeurs de chaque nature par porc. Il faut donc un minimum de 5 porcs pour obtenir les résultats. Au maximum, 10 animaux seront prévus à cause des aléas de mise en place du modèle (1 – étude pilote, 4 - étude expérimentale et 5 – deuxième étude sera réalisée si nécessaire pour confirmer les résultats ou pour évaluer l'efficacité sur d'autres types de cancer). Un nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisamment fiables, afin d’évaluer une nouvelle sonde de détection peropératoire du rayonnement bêta pour la résection de tumeurs en "conditions réelles".

Raffinement

Etablissement utilisateur 1 : Les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation de 8 jours avant le début du traitement immunosuppresseur. Tout au long de leur hébergement, ces miniporcs, qui sont assez jeunes à leur arrivée, sont hébergés en groupes, dans des boxes bien plus vastes que ce qui est recommandé par la règlementation, avec des possibilités de se cacher, de jouer, et de fouisser dans la litière pour rechercher leur nourriture, ce qui évite l’ennui. Ils sont suivi par un personnel qui connaît très bien les cochons et enregistre quotidiennement leurs progrès en matière de socialisation. Ils sont récompensés pour leur collaboration après chaque geste invasif et ont un entrainement médical. La ciclosporine est amère, elle est distribuée avec un masqueur de goût pour éviter l’aversion. Les prélèvements sanguins sont faits sous anesthésie. Le suivi des tumeurs est fait par du personnel formé et en cas de signe clinique des traitement antalgique et tout traitement symptômatique est accepté. Toutes les précautions sont prises, en matière d’hygiène pour empêcher les infections intercurrentes consécutives du traitement immunosuppresseur. Etablissement utilisateur 2 : les animaux sont suivis et hébergés dans les mêmes conditions. L’imagerie et la chirurgie d’exérèse sont réalisées sous anesthésie avec une analgésie adaptée. Le suivi post-opératoire tout le lendemain et réalisé par du personnel formé dans un hébergement confortable et chauffé. A chaque phase du protocole, des points limites adaptés permettent d'exclure les animaux avant que des souffrance trop importantes n'apparaissent.

Choix des espèces

Pour ce projet nous avons besoin d’un animal chez qui il est possible de greffer des cellules de tumeur d’origine humaine, pour obtenir des tumeurs d’une taille comparable aux tumeurs des patients humains pour essayer notre dispositif dans des conditions comparables. Le porc a été choisi par qu’il est possible de réaliser ces greffes chez ce modèle et qu’il est de taille suffisante pour supporter la greffe de plusieurs tumeurs. Les porcs utilisés en étude sont les animaux jeunes adultes, leur poids (vers 40- 50kg à l’arrivée en étude) est proche d’un poids humain et permet de travailler avec des doses humaines. Enfin, ce poids est compatible avec une bonne manipulation des animaux par les opérateurs.

Au premier jour de leur vie, des souriceaux reçoivent une injection de virus dans le cerveau sous anesthésie générale, avant un prélèvement de queue à quatre semaines. 448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À quatre mois, elles passent quatre tests comportementaux, dont la reconnaissance d'objet et l'interaction sociale, censés mesurer mémoire et anxiété, puis sont tuées à cinq mois pour prélever sang et cerveau. Le porteur admet que la manipulation des nouveau-nés peut conduire la mère à rejeter un ou deux petits, avec absence de tétée ou cannibalisme, atteintes qu'il classe pourtant dans un niveau de souffrance modéré.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer MA est une maladie neurodégénérative, au cours de laquelle les cellules du cerveau dégénèrent. Elle affecte environ 1 million de personnes en France et il n’existe aucun traitement efficace à ce jour. Notre activité de recherche est dédiée à l'étude des mécanismes cellulaires impliqués dans la MA. L’objectif est de comprendre le fonctionnement de cette maladie, afin de trouver des moyens d’action dans le système nerveux qui permettront de ralentir le développement de la MA.

Bénéfices attendus

L’objectif final est d'améliorer la qualité de vie des personnes atteintes par la maladie d'Alzheimer. Les bénéfices à plus court terme, concernent d'une part la compréhension des mécanismes de fonctionnement de la MA et d'autre part de trouver des moyens d’action sur le système pour réduire le développement et l’agressivité de la MA.

Procédures

Les nouveaux-nés subiront au premier jour post-natal une injection de virus dans le cerveau sous anestésie générale et à 4 semaines un prélèvement de bout de queue (

Impact sur les animaux

Les nouveaux-nés subiront au premier jour post-natal une injection de virus dans le cerveau. Compte tenu de la manipulation des bébés, il est possible que la mère rejette un ou deux petits, se traduisant par l'absence de tétée et /ou du cannibalisme. Un prélèvement de bout de queue est réalisé pour le génotypage à l'âge de 4 semaines. A l'âge de 4 mois tous les animaux subiront 4 tests comportementaux tels que la reconnaissance d'objet et l'interaction sociale, destinés à explorer leurs capacités de mémorisation et leur niveau d'anxiété. A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie profonde et analgésie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure. Le sang et le cerveau sont prélevés pour effectuer des explorations biochimiques et histologiques.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, nous développons aussi des approches expérimentales in vitro dont les résultats doivent dans tous les cas être confortés in vivo. L’efficacité de futurs traitements originaux doit se traduire par une amélioration biologique/histologique et comportementale dans des modèles murins, notamment le modèle souris de la maladie d'Alzheimer. Ces souris représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie car elles développent rapidement une MA expérimentale (dès 2 mois), laquelle est très similaire à celle observée chez l’homme, comparée à la MA développée par d’autres modèles des souris (9-12 mois).

Réduction

Le nombre de lots expérimentaux et d'animaux au total est décrit en détail au paragraphe 4.2. - souris sauvages (mâles+ femelles) n= 7 groupes x32 souris = 224 -souris modèle de MA (mâles+ femelles) n= 7groupes x32 souris = 224 Soit 448 animaux Ce nombre d'animaux a été réduit au minimum pour pouvoir être validé d’un point de vue statistique notamment pour les études comportementales, d'autant que nous travaillons sur des souris issues de plusieurs reproductions.

Raffinement

Tous les petits de la même fratrie seront injectés. Le génotypage permettra 4 semaines plus tard de les identifier. Les nouveau-nés opérés sont réchauffés sur une couverture chauffante de type bouillotte, et remis à leur mère. Les mères et leur nouveau-nés opérés seront hébergés dans des armoires ventilées, sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (nids végétaux à base de fibres courtes de coton). Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Afin d'éviter un maximum la manipulation des petits et le possible rejet par leur mère nous éviterons de les peser, mais nous observerons tous les jours leur comportement, s'ils sont vigoureux, s’ils tètent, ainsi que leur taille en comparant tous les petits de la même fratrie.

Choix des espèces

Les souris constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que, comme modèle pré-clinique pour tester les effets in vivo de molécules thérapeutiques potentielles. Pour nos études, nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées modèle de la maladie d’Alzheimer. 1) Stade premier jour post-natal, dans lequel les injections de virus seront faites, permettant ainsi l’expression des variants de protéines d’intérêt dès les premiers jours de vie post-natale dans les neurones. 2) Stade juvénile 1 mois et adulte 2 mois, afin de tester des stades intermédiaires 3) Stade adulte à l’âge de 4 mois. Cet âge représente une phase précoce de la maladie dans laquelle nous observons des marques évidentes de la pathologie, aussi bien au niveau comportemental que biochimique et histopathologique. Le comportement des animaux sera testé à partir de 4 mois, et ce pendant environ 15 jours. 4) Stade adulte à l'âge de 5 mois. A ce stade les animaux seront mis à mort. Tous les animaux reçoivent une injection de virus à la naissance mais certains d'entre eux seront mis à mort à 1 et 2 mois sans participer aux tests comportementaux.

150 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une seule injection leur est faite, dans l'abdomen, avec du matériel infectieux d'Echinococcus multilocularis qui provoque la formation de kystes péritonéaux chroniques. Ces kystes servent de matière première à des antigènes vendus aux laboratoires d'analyses médicales pour le diagnostic sérologique de l'échinococcose, et le porteur décrit une évolution "sans altération de l'état général" tout en listant une mobilité réduite et une douleur parmi les atteintes possibles. Il écrit que "la volumétrie d'animaux utilisée pour la production d'Ag sera fonction du volume de commercialisation des tests".

Objectifs

Le diagnostic de maladies infectieuses repose sur différents critères : signes cliniques, radiologiques, facteurs de risque associés… et sur les résultats de tests biologiques. L’utilité des tests biologiques est d’autant plus grande que certaines infections présentent peu ou pas de signes cliniques caractéristiques. Un large panel de tests biologiques existe de la culture de prélèvements à la recherche d’anticorps spécifiques dans le sang des patients. Cette recherche d’anticorps spécifiques est dans de nombreuses maladies infectieuses le seul moyen de diagnostiquer et secondairement de traiter certaines maladies. C’est dans ce but qu’une collaboration entre un laboratoire Hospitalo-Universitaire et une entreprise française a été mise en place avec l’objectif de développer des tests diagnostiques de maladies pour l’homme et/ou les animaux. Nous avons mis au point des tests fiables, spécifiques et sensibles de recherche d’anticorps de pathogènes parasitaires d’origine alimentaire comme Echinococcus granulosus et Echinococcus multilocularis, responsables de maladies graves et parfois mortelles chez l’Homme avec 1 million de personnes concernées. L’utilisation d’antigènes de ces parasites est la clé de voute de la mise au point de tests sérologiques. En l’absence d’alternative de bonne qualité, l’obtention de tels antigènes passe par l’expérimentation animale. Suite à l’injection d’agents infectieux de E. multilocularis, l’animal va développer un ou plusieurs kystes péritonéaux d’évolution chronique sans altération de l’état général. Ces kystes permettront de produire des antigènes de grande qualité pour développer des tests sérologiques permettant de réaliser le diagnostic de patients infectés. L’objectif de ce projet est donc de permettre la production d’Ag de E. multilocularis pour pouvoir continuer de rendre accessible aux professionnels de santé les tests de diagnostic correspondants et ainsi améliorer la prise en charge et le bien-être des patients.

Bénéfices attendus

La production d’Ag d’échinococcose est un élément essentiel à la fabrication de nos tests de diagnostic médicaux. Ces tests, parce qu’ils sont reconnus comme des réactifs de référence, sensibles et spécifiques, sont utilisés par les laboratoires des CHU et des plateformes d’analyses médicales de France et du monde entier. Ils sont destinés aux professionnels de santé dans le cadre de diagnostic de dépistage et de confirmation de la sérologie parasitaire. Les bénéfices attendus du projet sont donc directs et immédiats : permettre de maintenir la production de tests de diagnostic de la toxoplasmose et ainsi améliorer la prise en charge et le bien-être des patients.

Procédures

Un seul geste technique sera réalisé sur animal vivant : il s’agit de l’inoculation inaugurale par voie intrapéritonéale. Cela nécessite la contention de l’animal de quelques secondes par un personnel qualifié afin d’éviter au maximum le stress et la douleur des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les nuisances possibles sur les animaux sont les suivantes : stress physique, mobilité réduite, douleur dus à une complication infectieuse. Le projet a été conçu de manière à minimiser les dommages causés aux animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’unique procédure expérimentale afin de réaliser des prélèvements post-mortem.

Remplacement

Pour pouvoir ainsi répondre à l’exigence qualitative et quantitative de la demande, l’utilisation d’animaux est essentielle pour la réalisation du présent projet et la gerbille reste le modèle le plus adapté. L’obtention d’un profil antigénique complet ne peut pas se faire par clonage et génie génétique. De même, la possibilité de mettre en culture in vitro E. multilocularis n’a pas permis de produire un antigène complet et de quantité suffisante (diagnostic couplé et différentiel des 2 types d’échinococcoses impossible). Ainsi, pour ces raisons majeures de volume de production, de défaut de reproductibilité et de qualité médiocre de l’antigène obtenu, la culture in vitro d’échinococcoses ne permet pas une production d’antigène compatible avec le développement et la production des tests de diagnostic présentant des performances au niveau des tests actuellement commercialisés, soumis au marquage CE, à la conformité avec la norme ISO 13485 et à l’attestation CE de conformité délivrée par un organisme notifié et devant répondre aux exigences du règlement européen IVDR 2017/746. En conséquence, ces expérimentations ne peuvent être conduites qu’in vivo.

Réduction

La volumétrie d’animaux utilisée pour la production d’Ag sera fonction du volume de commercialisation des tests. Malgré une croissance de la demande des produits, la réévaluation du nombre d’animaux nécessaires à la production d’Ag par rapport au précédent projet permet de significativement le diminuer. Ceci s’explique par l’expérience acquise sur ce modèle et par les analyses réalisées par le laboratoire pour augmenter la qualité des échantillons récoltés.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. Les gerbilles seront hébergées par groupes d’individus compatibles, dans des conditions contrôlées et avec la mise en place d’un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Aucun des animaux ou groupe d’animaux ne sera traité différemment de ses congénères. Une fiche de suivi sera rédigée pour chaque cage avec un suivi de signes comportementaux, physiques et physiologiques. Chacun de ces critères étant évalué fréquemment, la détermination de point(s) limite(s) bien définis, suffisamment précoces et prédictifs, permettra immédiatement de déterminer un animal en souffrance. Nous attacherons une grande importance à l’apparence physique externe et aux changements comportementaux des animaux. Dès lors que l’animal montre des signes de positivité à l’infection, il est mis en armoire ventilé afin de ne pas stresser ses congénères. En cas de gêne dans ses déplacements, l’accès à l’alimentation lui est facilité (dépôt d’une coupelle au sol). Les soins et les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel qualifié et permanent. En effet, les gerbilles ont le temps de se familiariser avec les manipulateurs spécialement affectés à leur suivi.

Choix des espèces

La gerbille est l’espèce qui présente un cycle naturel de l’infection parasitaire sans développement d’autres signes cliniques avant l’atteinte d’une taille de kyste significative. En conséquence, la production d’antigène d’E. multilocularis est réalisée in vivo sur ces animaux. Les gerbilles utilisées seront de jeunes adultes, mâles ou femelles.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun anesthésié sept fois en deux mois. Une chirurgie oculaire d'une heure permet d'injecter sous la rétine des vecteurs de thérapie génique, complétée par des examens du fond de l'œil d'une heure et des électrorétinogrammes de deux heures. Les singes retenus ont entre 8 et 15 ans, le porteur indiquant que seul un primate non humain possède une région maculaire comparable à celle de l'être humain. Le bénéfice annoncé, un traitement de la rétinite pigmentaire de type 28, reste au stade de la validation d'une construction de vecteur, alors que les six macaques sont tués pour l'analyse histologique de leurs tissus.

Objectifs

La rétinite pigmentaire (RP) est un groupe de maladies génétiques qui affectent la rétine, la couche de tissu sensible à la lumière située à l'arrière de l'œil. La rétine contient des cellules photoréceptrices qui détectent la lumière et permettent la vision. La rétinite pigmentaire est causée par des mutations dans des gènes spécifiques impliqués dans le fonctionnement des photorécepteurs de la rétine. Cette maladie peut être causée par un gène en défaut, essentiel pour la structure et la fonction des photorécepteurs. Ce défaut du gène entraîne la dégénérescence progressive des photorécepteurs et conduit à la rétinite pigmentaire RP28, pour laquelle à ce jour aucun traitement connnu. L’analyse génétique de 100 patients atteints de RP28 a permis de découvrir que certaines parties de leur rétine restaient intactes pendant 30 à 40 ans. Cette découverte ouvre une possibilité de traitement par thérapie génique en introduisant une copie permettant de restaurer la fonction du gène dans les cellules de la rétine. Des essais préliminaires chez la souris ont montré des résultats prometteurs. L'objectif général de notre étude est de tester des vecteurs de thérapie génique chez des macaques, en vue de futurs essais cliniques chez l'homme. Les tests incluent l'évaluation de l'expression de différents vecteurs de ce gène chez les macaques.

Bénéfices attendus

Les stratégies de développement de thérapies géniques des photorécepteurs constituent une issue thérapeutique majeure. L’évaluation de l’expression de différentes constructions de vecteurs de thérapie génique contenant le gène en défaut dans les photorécepteurs de macaque permettra de valider la construction de vecteur qui mime au mieux la situation physiologique. Cette étude permettra aussi de réduire le nombre de singes à utiliser en sélectionnant au plus tôt la bonne construction de vecteur. La connaissance de la dose et du vecteur permettront d’établir les conditions pour les tests de pré-toxicologie chez le macaque. Notre ultime but est de caractériser précisément la sécurité d’emploi de ce vecteur de thérapie génique et son efficacité pour initier des tests cliniques chez des patients atteins par la rétinite pigmentaire de type RP28.

Procédures

Tous les animaux de ce projet seront anesthésiés pour procéder à des interventions chirurgicales et des examens longitudinaux. Chaque animal aura une chirurgie d’une durée de 1h. Les examens longitudinaux, imagerie du fond de l’œil et électrorétinogramme (ERG) durent respectivement 1 et 2 heures. Les animaux seront anesthésiés 6 fois le premier mois (examens fond d’œil, ERG et chirurgie) et une fois à 2 mois pour l’ERG et imagerie fond d’œil.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable pouvant se manifester est une inflammation oculaire post chirurgie. Cette inflammation est transitoire et, si elle a lieu, peut durer 2 à 3 jours. Nous nous basons sur les effets indésirables constatés en clinique humaine. De même, en clinique humaine aucune douleur liée à la dégénérescence rétinienne n’est rapportée. Du stress peut être associé lors de la phase d’initialisation et du réveil des différentes anesthésies (chirurgie et examens longitudinaux). La répétition des anesthésies relativement longues pourrait entrainer des nuisances également pour l’animal (mise à jeûn, temps de réveil post anesthésie désagréable).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des études histologiques (de tissus et organes) pour évaluer l’expression et l’effet des vecteurs ainsi que la réponse inflammatoire.

Remplacement

Le recours à l’animal est nécessaire, car aucun milieu de culture ou système synthétique ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale des cellules de la rétine, en particulier les interactions structurelles et fonctionnelles de ces cellules, ainsi que la réponse immunitaire potentiellement induite par l'administration sous-rétinienne des vecteurs de thérapie génique.

Réduction

La mise en œuvre d’un suivi par imagerie in vivo sur les animaux anesthésiés, ainsi que par électrorétinogramme permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés ainsi que la contrainte imposée aux animaux. Différents marqueurs de cellules inflammatoires seront utilisés lors des analyses histologiques.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale renforcée par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. L’acuité visuelle des animaux sera évaluée par des tests d’électrorétinogramme (ERG). Plusieurs marqueurs indiqueront l’état inflammatoire, la qualité des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires. Leur état de santé sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille d’observation postopératoire, nous permettant d’intervenir immédiatement s’il y a signe de souffrance et de veiller au bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le macaque est retenu comme modèle d'étude sur les critères suivants : - cette étude fait partie d'un projet qui vise à valider à restaurer les photorécepteurs de la rétine. Seul le primate non-humain possède une anatomie de l'œil proche de l'homme, avec notamment la présence d'une région maculaire dans la rétine centrale. - le macaque permet d'intégrer des méthodes d'évaluation fonctionnelle, telles que l'imagerie du fond de l’œil, et l'électro-rétinographie, qui peuvent être directement extrapolées à l'homme dans une démarche translationnelle. Uniquement des animaux adultes entre 8 et 15 ans seront utilisés. La rétine de ces animaux est comparable à celle de l’homme à l’âge adulte.

Six tumeurs d'origine humaine sont greffées sous la peau d'un même miniporc, sous couvert d'un traitement immunosuppresseur maintenu pendant tout le protocole. 10 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec trois prises de sang de 15 ml par semaine pendant trois semaines, un transport entre deux établissements et deux anesthésies de deux heures pour l'imagerie et l'exérèse. Le porteur décrit des boxes "bien plus vastes que ce qui est recommandé", des animaux qui fouissent, jouent et sont "récompensés pour leur collaboration après chaque geste invasif", tout en indiquant une gêne mécanique ou une douleur qui dure tant que les tumeurs sont présentes. Les cochons sont tués pour des prélèvements terminaux de tissus, l'effectif étant calé sur une exigence réglementaire de dix traitements par tumeur.

Objectifs

Le but de ce projet est de mettre au point/valider des protocoles qui seront utilisés lors d'études cliniques. D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, le cancer est une cause majeure de décès dans le monde, 10 millions de décès en 2020. En moyenne, 20 à 50 % des patients opérés dans le cadre de résection tumorale subissent une récidive cancéreuse locale. Ces récidives locales sont principalement dues aux résidus tumoraux qui subsistent dans la plaie opératoire après la chirurgie. Détecter les cellules cancéreuses pendant la résection et garantir des marges nettes signifie assurer l'ablation complète des tissus tumoraux, tout en préservant les tissus sains environnants, afin de ne pas endommager les zones fonctionnelles. L'objectif de notre projet est de valider la détection des tumeurs avec une sonde peropératoire détectant les rayonnements bêta afin d’améliorer la résection tumorale. Plusieurs tumeurs seront implantées chez un même animal dans le but de pouvoir vérifier la précision chirurgicale du dispositif médical, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le dispositif détecte des radiotraceurs bêta in situ précédemment injectés. Ces radiotraceurs, actuellement utilisés pour le diagnostic en imagerie TEP (Tomographie par Émission de Positons) et la thérapie (radiothérapie interne) permettent une détection très spécifique et sensible. Cette technique consiste à utiliser un noyau radioactif entouré d’une matrice et qui a la particularité d’être spécifique à chaque tumeur. Ce nouvel outil chirurgical, sonde de détection des particules β, indépendante du type de cancer, couplée à un outil d’exérèse, permet de guider en temps réel le geste des chirurgiens en localisant les résidus de cancer à extraire tout en préservant les tissus sains environnants. Pour vérifier l'efficacité et calibrer in vivo ce dispositif, nous devons travailler avec un modèle proche de l’homme en termes de tissus et de taille importante tel que le miniporc.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à améliorer le traitement chirurgical des cancers. Ces essais in vivo vont permettre de mieux calibrer et affiner l'utilisation d'un dispositif médical qui aide les chirurgiens oncologues à l'exérèse totale des tumeurs. Cette étude permettra de passer rapidement à des essais cliniques chez l'Homme.

Procédures

Etablissement 1 : Les porcs recevront un médicament immunosuppresseur pendant toute la durée du protocole. Trois prises de sang de 15ml chacune seront faite chaque semaine pendant 3 semaines, c'est une intervention rapide de moins de 3 minutes, sous anesthésie générale. Par la suite, ils recevront des injections sous cutanées de cellules tumorales, sous anesthésie, qui durent moins de 10 minutes. Dans les jours qui suivent la pousse des tumeurs est survéillée. Etablissement 2 : Les porcs subissent deux anesthésies générales de 2h chacune pour imagerie médicale et retrait des tumeurs.

Impact sur les animaux

Premier établissement : Les porcs subiront plusieurs anesthésies de courte durée (moins de 15 minutes) pour la réalisation de prises de sang et l’injection de cellules tumorales. Ceci peut provoquer une douleur passagère à l’injection et une confusion temporaire au moment du réveil. Ils seront implantés avec des cellules tumorales qui provoqueront la pousse d’une tumeur sans métastase ou effet paranéoplasique, ce qui va provoquer une gêne mécanique à l’endroit de la tumeur ou une douleur ou inflammation localisée qui durera tout le temps de la présence de la tumeur jusqu’à l’exérèse. Les porcs seront transportés entre les deux établissements, ce qui va provoquer un stress d’une durée maximale d’une heure. Deuxième établissement : : Les porcs subiront deux anesthésie de moyenne durée (environ deux heures pour l’imagerie médicale ). Ceci peut provoquer également une douleur à l’injection des produits anesthésique et une confusion mentale au moment du réveil. Ils subiront aussi une intervention chirurgicale rapide, d’exérèse des tumeurs au cours de la deuxième anesthésie. Ceci peut provoquer une légère douleur à l’induction de l’anesthésie, mais surtout une douleur sur les cicatrices au réveil et pendant le 24h qui suivent la chirurgie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux des tissus pour l'analyse histologique.

Remplacement

Le dispositif médical que nous testons a déjà été essayé sur des cultures cellulaires et des tissus isolés. Il a montré sa sensibilité et son efficacité, mais ll faut désormais sur des tumeurs d'animaux vivants, tel que le Règlement Européen sur les dispositifs médicaux le demande.

Réduction

Le nombre d'animaux est déterminé par le nombre de tumeurs à traiter. Le Règlement Européen 2017/745 demande un minimum de preuves d'efficacité en nombre de traitement. Le produit est considéré efficace s'il fonctionne 10 fois sur chaque tumeur. Nous avons déterminé qu'il est possible d'implanter 6 tumeurs par miniporc à raison de 2 tumeurs de chaque nature par porc. Il faut donc un minimum de 5 porcs pour obtenir les résultats. Au maximum, 10 animaux seront prévus à cause des aléas de mise en place du modèle (1 – étude pilote, 4 - étude expérimentale et 5 – deuxième étude sera réalisée si nécessaire pour confirmer les résultats ou pour évaluer l'efficacité sur d'autres types de cancer). Un nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisamment fiables, afin d’évaluer une nouvelle sonde de détection peropératoire du rayonnement bêta pour la résection de tumeurs en "conditions réelles".

Raffinement

Etablissement utilisateur 1 : Les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation de 8 jours avant le début du traitement immunosuppresseur. Tout au long de leur hébergement, ces miniporcs, qui sont assez jeunes à leur arrivée, sont hébergés en groupes, dans des boxes bien plus vastes que ce qui est recommandé par la règlementation, avec des possibilités de se cacher, de jouer, et de fouisser dans la litière pour rechercher leur nourriture, ce qui évite l’ennui. Ils sont suivi par un personnel qui connaît très bien les cochons et enregistre quotidiennement leurs progrès en matière de socialisation. Ils sont récompensés pour leur collaboration après chaque geste invasif et ont un entrainement médical. La ciclosporine est amère, elle est distribuée avec un masqueur de goût pour éviter l’aversion. Les prélèvements sanguins sont faits sous anesthésie. Le suivi des tumeurs est fait par du personnel formé et en cas de signe clinique des traitement antalgique et tout traitement symptômatique est accepté. Toutes les précautions sont prises, en matière d’hygiène pour empêcher les infections intercurrentes consécutives du traitement immunosuppresseur. Etablissement utilisateur 2 : les animaux sont suivis et hébergés dans les mêmes conditions. L’imagerie et la chirurgie d’exérèse sont réalisées sous anesthésie avec une analgésie adaptée. Le suivi post-opératoire tout le lendemain et réalisé par du personnel formé dans un hébergement confortable et chauffé. A chaque phase du protocole, des points limites adaptés permettent d'exclure les animaux avant que des souffrance trop importantes n'apparaissent.

Choix des espèces

Pour ce projet nous avons besoin d’un animal chez qui il est possible de greffer des cellules de tumeur d’origine humaine, pour obtenir des tumeurs d’une taille comparable aux tumeurs des patients humains pour essayer notre dispositif dans des conditions comparables. Le porc a été choisi par qu’il est possible de réaliser ces greffes chez ce modèle et qu’il est de taille suffisante pour supporter la greffe de plusieurs tumeurs. Les porcs utilisés en étude sont les animaux jeunes adultes, leur poids (vers 40- 50kg à l’arrivée en étude) est proche d’un poids humain et permet de travailler avec des doses humaines. Enfin, ce poids est compatible avec une bonne manipulation des animaux par les opérateurs.

Un rat qui ne se déplace plus, ou dont la plaie présente rougeurs et pus, est tué. 20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : un trou percé dans le condyle fémoral de la patte arrière, comblé par un matériau à tester, puis quatre passages au scanner sous anesthésie à 3, 15, 30 et 60 jours. Le porteur reconnaît une douleur et une difficulté à se déplacer les premiers jours, un risque de rupture des sutures et des désagréments liés aux anesthésies répétées. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'évaluer ces biomatériaux et que les produits destinés à l'humain doivent "nécessairement" passer par des animaux non-humains, d'abord petits, puis plus gros.

Objectifs

Les pertes d'os sont un problème en chirurgie dentaire et orthopédique. Souvent, on utilise des morceaux d'os du patient pour réparer ces pertes, mais cela nécessite une autre opération et peut causer des problèmes à l'endroit où on a pris l'os. C'est pourquoi il est important de développer de nouveaux matériaux (biomatériaux) pour aider à régénérer les os. Pour tester ces nouveaux matériaux, nous utilisons un modèle animal que nous maitrisons bien. On crée un petit trou dans l'os de la patte d'un rat pour voir si le matériau implanté peut aider l'os à se régénérer. Les animaux auront la chirurgie dans un premier établissement et le suivi de la régénération par imagerie sera fait dans un autre établissement. Le projet se fait sur deux EU, que le modèle est fait dans l'EU1 et l'imagerie dans l'EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement pour la régénération osseuse) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vu d'être utilisé en clinique.

Procédures

Les rats subiront une opération chirurgicale au niveau de l'os de la patte arrière (condyle fémoral), où nous créerons un petit trou et celui-ci sera comblé avec un nouveau matériau à tester. Chaque opération prend environ 30 minutes par rat (la chirurgie sera faite dans un premier établissement). Après l'opération, nous utiliserons un scanner pour suivre la régénération de l'os à différents moments : après 3, 15, 30, et 60 jours. Pendant les scanners, les rats seront anesthésiés, pour qu'ils restent endormis et immobiles. Chaque séance de scanner dure entre 20 et 30 minutes (les imageries scanner seront fait dans un deuxième établissement).

Impact sur les animaux

Les rats auront une opération sur un os de la patte (avec un petit trou) qui ne nécessitera pas de fixer l'os avec des outils internes. Cependant, cette opération causera de la douleur et les rats auront du mal à bouger pendant les premiers jours après l'opération. Il y a aussi un risque que les points de suture se rompent. De plus, les anesthésies répétées lors des scanners peuvent causer des désagréments.

Devenir

Les rats seront euthanasiés 60 jours après l'implantation pour qu'on puisse prélever et analyser leurs os régénéré. Cela nous permettra de vérifier la qualité de la régénération osseuse, notamment la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans l'os régénéré.

Remplacement

Les produits destinés à être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche en laboratoire (in vitro) permettant d'évaluer ces matériaux. Les matériaux doivent être d'abord testés chez le petit animal (modèle du rat). Si les résultats obtenus sont satisfaisants, ils devront être testés sur un plus gros animal, permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi par imagerie scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur le processus de régénération osseuse, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations. Le nombre d'animaux nécessaire a été determiné en utilisant un outils statistique.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront une dose d'antalgique afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite endormis. Après la chirurgie, chaque rat se réveille sur un tapis chauffant, dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Les animaux seront surveillés par l'expérimentateur le temps de leur réveil. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur 5 jours après opération pour surveiller les points limite (vérification de la démarche de l'animal, infection du site opératoire, comportement...). Un seul des points limites terminaux suivants entrainera un euthanasie de l'animal: L'animal ne se déplace pas, présence de rougeurs et de pus au niveau du site opéré ainsi qu'une réaction violente ou très faible réaction. Les expérimentateurs maîtrisent la manipulation et les injections nécessaires. Le personnel de l'animalerie est compétent pour assurer le bien-être et le suivi des rats au quotidien. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement: les animaux sont avec leurs congénères, présence de la litière en copeaux de peupliers et des jouets, ainsi que des bâtons à ronger sont mis régulièrement dans les cages.

Choix des espèces

Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau du condyle fémoral. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. Des rats adultes de 10 semaines et d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.