Recherche appliquée

Franchir une étape exigée par la réglementation avant tout développement clinique : 40 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement du côlon. Elles reçoivent huit injections sous anesthésie générale étalées sur 42 jours, dans un modèle d'inflammation chronique de l'intestin qui provoque diarrhées, pertes de sang et parfois amaigrissement. Le miARN testé a déjà montré une activité anti-inflammatoire sur des cellules intestinales en culture. Le porteur écrit que la vérification in vivo est "exigible réglementairement" et que le recours à l'animal est "indispensable", aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduisant selon lui la cancérisation dans son intégralité.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) qui regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH) se caractérisent par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif. Les MICI peuvent survenir à tout âge mais sont le plus souvent diagnostiquées chez des sujets jeunes et 15 % des cas concernent des enfants. Chez environ 20 % des patients, les crises sont sévères nécessitant l'hospitalisation, l'arrêt de l'alimentation et un traitement par voie intraveineuse pendant quelques jours. En outre, l’évolution de la maladie peut entraîner des complications comme le cancer du côlon. Même si la cause des MICI n’est pas encore bien élucidée, des facteurs génétiques et environnementaux ainsi que des facteurs associés aux altérations du microbiote intestinal sont suspectés. Les lésions de la muqueuse intestinale notamment durant les phases aigues des poussées impliquent un processus inflammatoire résultant de la réponse immunitaire dite innée du patient. Parmi les mécanismes de régulation de l’activité de cette réponse immunitaire, les microARN (ou miARN), qui sont des séquences d’ARN de petite taille, auraient un rôle permettant de les considérer comme de nouveaux outils thérapeutiques. L’objectif de ce projet est de tester, dans un modèle murin connu de MICI chronique/cancer, certains miARN précédemment identifiés comme jouant un rôle anti-inflammatoire afin d’évaluer leur potentiel effet inhibiteur du développement du cancer colorectal.

Bénéfices attendus

Notre stratégie de lutte contre l'inflammation chez des patients victimes de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin par un traitement préventif avec notre candidat miARN permettrait de prévenir le développement du cancer colorectal. Il n’y a pas de traitement préventif du cancer lié aux MICI à proprement parler. En effet, le traitement actuel cherche à réduire les poussées (crises) d’inflammation ce qui a terme permettrait d’éviter le développement de cancer colorectal. Les candidats thérapeutiques testés dans cette étude visent à atténuer les poussées inflammatoires et à terme, de prévenir le développement de cancer.

Procédures

Les interventions sur animaux consisteront à 8 injections de produits sous anesthésie générale, étalées sur 42 jours et de durée inférieure à 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle d'inflammation chronique de l'intestin nécessite des injections pouvant créer un léger stress pour l'animal. De plus le modèle induit des diarrhées et des pertes de sang légères et parfois une perte de poids.

Devenir

Le prélèvement du colon nécessaire pour différentes analyses nécessite l'euthanasie des animaux.

Remplacement

Plusieurs tests in vitro sur un modèle de cellules de l’intestin permettent de sélectionner les miARN présentant une activité anti inflammatoire intéressante. L'étape de vérification de leurs activités in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique de notre candidat anti-inflammatoire lors d'un processus de cancérisation et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.

Réduction

Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 40, tout en préservant la validité statistique de l'étude.

Raffinement

Les administrations s’effectueront sous anesthésie générale à l’isoflurane afin de réduire au maximum la douleur et le stress que pourraient subir les animaux lors des gestes techniques. Les produits injectés seront à température ambiante et l’aiguille sera changée entre chaque animal afin de réduire l’inconfort dû à l’injection. Les souris seront surveillées pendant toute la durée de la procédure. Une surveillance particulière sera mise en place après l’administration jusqu’au réveil complet des souris. Des points limites adaptés seront strictement appliqués en cas de souffrance avérée déterminée à partir de signes cliniques précis. Les animaux seront hébergés en groupes de 5 dans un environnement enrichi de tubes en carton et de matériaux de nidification (type sizzle nest ou cocon) afin de favoriser les comportements naturels tels que l’activité et la fabrication d’un nid pour se mettre à l’abri et seront surveillés quotidiennement. Leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture.

Choix des espèces

La souris mâle est le modèle animal qui reflète le mieux le développement du cancer colorectal à la suite d’une inflammation du tube digestif observé chez l’Homme Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle du cancer colorectal.

5 202 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue parce qu'elles auront été en contact avec une bactérie pathogène pour l'humain. Chacune subit une biopsie d'oreille par semaine pendant 42 jours, une prise de sang hebdomadaire pendant 42 à 92 jours, jusqu'à sept injections sous-cutanées et deux intramusculaires, et des piqûres de tiques dont les nymphes restent accrochées cinq jours. 216 souris sont utilisées uniquement pour produire des tiques infectées. L'infection par Borrelia peut provoquer des arthrites aiguës, une démarche anormale, une perte de tonicité et une paralysie des pattes, et le porteur écrit par ailleurs que les piqûres de tiques sont indolores pour l'animal.

Objectifs

La borréliose de Lyme (BL), maladie à transmission vectorielle prédominante en Europe, est causée par les spirochètes du complexe Borrelia burgdorferi sensu lato (sl). Cette maladie peut affecter divers tissus tels que la peau, le système nerveux, les articulations, le cœur, et occasionnellement, d'autres organes. La transmission des bactéries se fait par la morsure de tiques dures du genre Ixodes, parasites de nombreux hôtes, y compris petits et grands mammifères, oiseaux et reptiles. Les manifestations chroniques de la maladie incluent des complications neurologiques rares liées à l'infection par B. burgdorferi s.l. La pathogenèse de la maladie dépend de la génétique bactérienne, de la capacité de l'hôte à contrôler l'infection et des facteurs liés à la tique. 1. Objectifs Principaux du Projet : o Comprendre en détail les mécanismes de transmission de la maladie de Lyme par les tiques. o Identifier de nouveaux modèles murins d'infection à Borrelia reproduisant la gamme complète des symptômes humains en tirant parti de la diversité génétique de lignées murines pour mieux comprendre les mécanismes pathologiques et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. o Améliorer les connaissances pour une meilleure prise en charge des patients et des stratégies préventives. 2. Procédures Expérimentales : o Dans une première procédure, évaluer la sensibilité de 13 lignées murines après injection sous-cutanée de trois espèces de Borrelia burgdorferi européennes, choisies pour leur infectiosité élevée chez la souris de référence. o Dans une deuxième procédure, tester la réponse des souris à une infection naturelle par des tiques infectées par trois souches de la bactérie Borrelia. o Dans une troisième procédure, évaluer l'effet d'antibiotiques couramment utilisés dans le traitement de la borréliose de Lyme, ainsi qu'une combinaison de molécules agissant sur les formes persistantes de la bactérie. o Enfin, dans une quatrième procédure, évaluer l'effet protecteur de préparations vaccinales vis-à-vis de l'infection par des tiques infectées. Signification et Impact : • Contribuer à une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie de Lyme. • Proposer de nouveaux modèles murins reflétant davantage la diversité des symptômes humains. • Tester l'efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques et de prévention.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à combler les lacunes dans la compréhension de la borréliose de Lyme, en mettant l'accent sur des approches novatrices pour les modèles murins, les traitements et les préventions, avec un objectif ultime d'amélioration des soins aux patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à des biopsies d’oreille un fois par semaine pendant 42 jours. Cette procédure ne dure que quelques secondes. Des prélèvements de sang au niveau du sinus retro mandibulaire seront réalisés toutes les semaines (durée 30 secondes) pendant une période pouvant varier de 42 à 92 jours. Des injections par voie sous-cutanée (1 à 7 fois) et intramusculaire seront réalisées (2 fois). Chaque injection ne dure que quelques secondes. Les souris seront également soumises à des piqures de tiques. Les nymphes restent attachées pendant 5 jours et les larves 3 jours. Les piqûres de tiques sont indolores pour l’animal.

Impact sur les animaux

Douleur, lésion, maladie : arthrites aiguës (gonflement des articulations), atteintes neurologiques aiguës (mouvements limités, démarche anormale, manque de tonicité, paralysie des pattes) lors de l’infection par les bactéries Borrelia. Environnement non adapté. Il y aura isolement des animaux pendant la durée du gorgement des tiques, pour une durée inférieure à une semaine On peut observer une perte de poids éventuelle durant le gorgement des tiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été en contact avec un agent pathogène pour l’homme.

Remplacement

La transmission vectorielle est un phénomène complexe. Elle nécessite de bien comprendre les interactions entre le vecteur : la tique, le virus et l’hôte vertébré. La tique transmet l’agent pathogène lors d’un repas de sang au cours duquel le virus, une fois amplifié dans les glandes salivaires se transmet dans la salive de la tique. Or cette salive possède de nombreux rôles dont certains permettent de moduler la réponse immunitaire de l’hôte vertébré. L’agent pathogène est alors moins bien reconnu par le système immunitaire et peut donc mieux se développer. Il est donc très difficile voire impossible de mimer cette interaction in vitro sur des cellules. Le modèle animal est donc beaucoup plus pertinent.

Réduction

Nous envisageons lors de la première procédure de travailler dans le cadre de l’expérience 1 sur un petit nombre d’animaux par groupe (8 animaux des deux sexes) afin de déterminer les lignées les plus sensibles aux trois souches de Borrelia. Les 8 individus seront répartis en 2 cages par groupe (4 individus de sexe différent par cage). Dans le cadre de l’expérience 2, nous aurons 20 souris par groupe. Dans le cadre de la procédure 2, lors de l’expérience 1, le nombre de souris utilisées (216) pour l’obtention de tiques infectées est strictement lié à la biologie des tiques dont nous avons une excellente connaissance. Dans le cadre de la deuxième expérience, nous prévoyons d’utiliser 10 individus par groupe pour pouvoir faire des mises à mort à différents temps et disposer de 2 individus dans le cadre des analyses que nous souhaitons mener. Dans le cadre de la troisième procédure, nous utiliserons 12 souris par groupe. Ces trois procédures nécessiteront lors de leur analyse d’utiliser des tests statistiques non paramétriques. Dans le cadre de la quatrième procédure, nous avons choisi d’utiliser 20 souris par vaccins. Ce chiffre est issu d’expériences déjà menées et qui ont montré que la sensibilité des expériences qui seront menées afin de démontrer l’efficacité d’un vaccin nécessite ce nombre d’animaux. En supposant un effet cage d’un certain niveau, les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, un risque à 5% et une puissance à 80% de détecter des effets marqués ou forts.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Les atteintes neurologiques seront évaluées plus précisément par l’utilisation de tests comportementaux. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques. Dès que le score atteindra 1, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du gel hydrique sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement supérieur à 10% ou bien si leur mobilité diminue. Si un score égal à 2 est atteint, les animaux seront mis à mort. Un renforcement de l’enrichissement sera effectué notamment dans le cadre de la procédure 1 afin que les animaux soient dans une ambiance confortable. Dans le cadre des procédures au cours de laquelle les animaux seront infectés par des piqûres de tique, les souris devront être isolées et nous ajouterons dans la cage des objets pour les distraire : bâtonnets, balles, coton. Les cages étant totalement transparentes et filtrantes, un contact olfactif, visuel et acoustique sera possible entre les animaux.

Choix des espèces

La souris est reconnue comme une espèce qui développe au moins certains des symptômes de la maladie de Lyme. Nous avons mis au point chez la souris un modèle expérimental d'infection prenant en compte les différentes conditions qui seront testées ici (salive de tiques, infection par des tiques). C'est la seule espèce à posséder des lignées présentant une large diversité génétique telles que celles du Collaborative Cross. Les souris seront des femelles et des mâles âgés de 5 à 7 semaines. S’il s’avère que l’un des deux sexes est plus sensible que l’autre à l’infection, nous n’utiliserons alors qu’un sexe sur les deux. Nous souhaitons que le système immunitaire soit mature lors de l’infection. Par ailleurs, les souris seront observées pendant 42j et nous souhaitons que les souris aient au maximum un âge de 12 semaines à la fin de l’expérience pour pouvoir les comparer avec les données déjà obtenues sur d’autres souris.

Incapables de rejeter un greffon humain parce qu'elles sont immunodéficientes, 250 souris vont recevoir des fragments de tumeurs prélevées sur des patients opérés d'un cancer du rein. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tuées à l'issue pour prélèvement de la tumeur. L'opération de greffe dure une dizaine de minutes sous anesthésie générale, puis une échographie est pratiquée tous les sept à dix jours pendant quatre mois au maximum. Ces greffes ne testent aucun traitement : elles amplifient des tumeurs pour constituer un stock de matériel destiné à des projets ultérieurs d'imagerie et d'évaluation thérapeutique, le porteur écrivant que de nouveaux modèles sont "nécessaires".

Objectifs

Ce projet a pour but d’amplifier plusieurs modèles tumoraux de cancer du rein à partir de prélèvements de patients. Les prélèvements sont obtenus à l’issue de la chirurgie des patients et des échantillons choisis avec un anatomopathologiste sont greffés sur des souris immunodéprimées afin de constituer des modèles tumoraux pertinents, permettant de conserver les caractéristiques de la tumeur primaire du patient. Plusieurs modèles de cancer du rein ont déjà été greffés et amplifiés avec succès et conservés. De nouveaux modèles sont nécessaires pour des études scientifiques d’imagerie et d’évaluation thérapeutique ultérieures.

Bénéfices attendus

La plupart des modèles précliniques de cancers du rein utilisent des lignées cellulaires et leur mise en culture pendant des années est probablement à l’origine de modifications génétiques expliquant leur manque de fiabilité. Les modèles in vivo de carcinome rénal ont longtemps été limités à des xénogreffes issues de ces lignées cellulaires, ne permettant pas de prédire des résultats oncologiques en recherche clinique humaine. Les greffes de tissu tumoral dérivées des patients et directement implantées chez la souris ont révélé une plus grande fiabilité pour prédire les réponses aux traitements systémiques. Cela est lié à la préservation des caractéristiques histopathologiques et moléculaires du cancer d'origine, qui permettent d’avoir un modèle plus réaliste des conditions observées chez les patients, mais également d’avoir un potentiel métastatique pour l’étude des carcinomes avancés, indication usuelle des nouveaux traitements systémiques. Les modèles déjà identifiés et conservés nécessitent d’être amplifiés afin de pouvoir être utilisés ultérieurement pour des projets en imagerie moléculaire afin d’identifier de nouveaux biomarqueurs, et pour l’évaluation de nouveaux inhibiteurs par rapport aux thérapies existantes.

Procédures

Les souris auront une seule procédure chirurgicale pour greffer la tumeur. L’intervention d’une dizaine de minutes sera réalisée sous anesthésie générale. Les souris seront ensuite suivies par imagerie échographique, technique non-invasive et indolore, à raison d’environ 1 échographie tous les 7 à 10 jours pendant un maximum de 4 mois. Pour l’ensemble des procédures, chaque animal est placé sur une table thermostatée, permettant de maintenir sa température corporelle.

Impact sur les animaux

Lors du suivi des animaux post-chirurgie, aucune perte de poids significative n’a été observée (jusqu’à 8% maximum). A ce jour les douleurs post-opératoires ne s’observent plus dès le lendemain et aucun comportement anormal n’a été observé entre les animaux opérés. Les nuisances se limitent donc à la gène modérée générée par la présence de tumeurs (qui sont surveillées par échographie).

Devenir

A l’issue de la procédure expérimentale, tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement de la tumeur et utilisation future du matériel tumoral pour des recherches contre le cancer.

Remplacement

Le recours aux animaux est indispensable pour reproduire, à partir des prélèvements de patients, un modèle oncologique proche de l’homme et de retrouver tout le microenvironnement tumoral permettant le développement des tumeurs et de se rapprocher au plus près des résultats qui pourront être observées par la suite en recherche clinique. Les modèles ainsi amplifiés, issus de tumeurs de patients, constituent une base de travail tout à fait pertinente à la fois pour des projets précliniques mais également pour des études in vitro pour l’identification de protéines et de biomarqueurs. Pour l'étude en cours, l'organisme entier étant indispensable pour récapituler les communications humorales et cellulaires du micro-environnement tumoral avec le reste des effecteurs de l'immunité, les organoïdes ou d'autres systèmes de culture cellulaire 2D ou 3D ne sont pas adéquats.

Réduction

Au regard de la prise de greffe observée sur les 10 modèles sélectionnés (de l’ordre de 70%), de la croissance tumorale et donc du volume du matériel utilisable après prélèvement, nous avons déterminé statistiquement le nombre nécessaire d'animaux . En deçà de ce nombre, le volume de matériel tumoral de même passage serait insuffisant pour créer de nouvelles cohortes pour des études en cancérologie ultérieures. Les modèles seront uniquement amplifiés au fur et à mesure des besoins des études scientifiques pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les étapes de ce projet ont déjà été validées au cours d’études préalables et les modèles de cancer du rein issus de patients ont été choisis à l’issue d’expérimentations in vitro et in vivo. Les différentes étapes sont optimisées et maîtrisées par un personnel qualifié pratiquant les gestes techniques couramment. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec un anesthésique local au niveau de la peau et dans des conditions stériles bien définies. L’animal est placé sur une table thermostatée permettant le maintien de la température corporelle de l’animal. Une surveillance quotidienne, permettant d’apprécier l’état général des animaux, est faite pendant toute la durée de l’expérimentation. Des points limites précoces ont été définis et seront appliqués pour le bien-être de l’animal. Un enrichissement de l’environnement est prévu tout au long du projet.

Choix des espèces

Toutes les études préalables réalisées sur souris ont confirmé la faisabilité technique du modèle de greffe sur souris avec un taux de greffe élevé, ainsi qu’une grande fiabilité du modèle avec une reproduction fidèle des caractéristiques macroscopiques, immunohistologiques, génétiques et du potentiel métastatique de la tumeur primitive d’origine. Pour ce faire, les souris nécessaires au développement de ces modèles réalistes issus de patients, sont des souris immunodéficientes, âgées de 6 à 9 semaines minimum au début du projet, mâles ou femelles.

Achetées dans un même élevage, jamais sorties au pâturage et donc vierges de tout contact avec les strongles, 30 agnelles Romane de neuf mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit par la bouche jusqu'à 5 000 larves d'un ver hématophage, Haemonchus contortus, qui provoque une anémie. Suivent neuf prises de sang à la jugulaire et quatorze prélèvements de fèces par animal, la moitié du lot recevant en plus dix injections intramusculaires d'éprinomectine. Toutes seront tuées et autopsiées pour récupérer les vers adultes logés dans la caillette, le porteur indiquant que le cycle du parasite ne peut se boucler sans passer par un petit ruminant.

Objectifs

La résistance des strongles gastro-intestinaux aux anthelminthiques est une problématique croissante actuellement pour l’élevage ovin. Il est admis que la capacité d’un parasite à résister induit un coût pour celui-ci donc une faiblesse sur d’autres traits de vie (par exemple capacité à se reproduire). L’étude du fitness (capacité d'un individu à vivre et à se reproduire) et du coût de la résistance est donc essentielle d’autant plus qu’une des recommandations données aux éleveurs, pour limiter l’apparition et la diffusion des résistances, est basée sur la notion de refuge. Cette préconisation consiste à maintenir des animaux parasités par des populations de parasites sensibles non soumises à la pression de sélection. Pour ce faire, le recours au traitement ciblé sélectif (TCS) est recommandé. Cependant, l’efficacité du TCS repose sur l’hypothèse qu’il y a une différence de fitness entre les souches sensibles et résistantes et donc un coût de la résistance pour les nématodes. Nous avons réalisé une première étude de comparaison de la fitness de souches résistantes ou sensibles à l’éprinomectine. Lors de cette étude, nous n’avons pas mis en évidence des pertes de fitness systématique pour les souches résistantes. Nous nous demandons donc s’il existe un coût pour le vers au moment même de l’exposition aux anthelminthiques. Dans cette deuxième étude, nous souhaitons compléter l’expérience en comparant la fitness de la même souche résistante, soit en situation d’exposition à l’éprinomectine soit sans exposition ; ce qui n’a jamais été réalisé. Cela nous permettra également de récupérer des vers adultes dans un objectif d’analyse transcriptomique pour essayer d’identifier les mécanismes moléculaires de la résistance qui restent inconnus pour le moment.

Bénéfices attendus

Nous observerons s’il existe ou non un coût pour les vers en situation d’exposition à l’éprinomectine ce qui pourra nous orienter sur la compréhension des mécanismes d’action et sur les recommandations en termes de surveillance de la résistance et de l’utilisation des molécules dans les élevages. Cela nous permettra notamment d’indiquer aux éleveurs les conséquences de l'utilisation d'une molécule qui perd en efficacité. En fin d’expérimentation, des parasites seront prélevés pour analyses transcriptomiques afin d’essayer d’identifier les mécanismes de la résistance et adapter les moyens de lutte contre cette résistance. En effet, les mécanismes moléculaires et les supports génétiques de la résistance d’H. contortus à l’éprinomectine restent inconnus à ce jour.

Procédures

Pour tous les animaux (n = 30) : *infestation parasitaire par voie orale : 1 fois/animal, volume administré : 10 mL, durée : 2 minutes ; *prises de sang à la veine jugulaire : 9 fois/animal, volume prélevé : 5 mL/prélèvement, durée : 3 minutes maximum/prélèvement ; *prélèvements de fèces dans le rectum : 14 fois/animal, volume prélevé : 20 g environ/prélèvement, durée : 3 minutes maximum/prélèvement. Pour les animaux traités (n = 15) : injections intra musculaire d'éprinomectine : 10 fois/animal ; volume administré : 0,1 mL/10 kg de poids vif, durée : 1 minute maximum/injection.

Impact sur les animaux

H. contortus étant un nématode hématophage, la dose infestante administrée va induire une anémie modérée chez son hôte. Celle-ci est bien tolérée par l’animal. Néanmoins les animaux seront observés quotidiennement afin d'évaluer toute altération de l'état général (anorexie, prostration) et pouvoir si nécessaire, immédiatement intervenir par une gestion adaptée

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés à la fin du projet, afin de pouvoir étudier la population de vers adultes présents dans la caillette. Les prélèvements des vers adultes seront aussi utilisés pour faire des analyses transcriptomiques.

Remplacement

Le cycle biologique d’H. contortus passe obligatoirement par le mouton qui est l’hôte définitif au sein duquel la reproduction sexuée s’effectue ; le petit ruminant ne peut donc pas être remplacé. En effet, les stades libres, de l'oeufs à la larve de stade 3 se développe dans le milieu extérieur mais le cycle ne peut être complété sans passage dans un petit ruminant qui héberge les formes adultes.

Réduction

Le nombre d’ovins prévu dans ce projet a été calculé de manière à permette la mise en évidence, à l'aide de tests statistiques, d'éventuelles différences de fitness entre lots expérimentaux, tout en limitant au maximum les effectifs animaux au sein de ces lots. Les interactions entre hôtes et parasite sont complexes et variables d’un individu à l’autre, ce qui implique théoriquement de constituer des lots conséquents, afin de ne pas avoir à renouveler l’expérimentation. La stratégie que nous avons adopté pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires, consiste à homogénéiser certains facteurs liés à l’hôte et connus pour influer sur le cycle du parasite tel que le sexe, l’âge, la race et l’historique de contact avec les strongles gastro-intestinaux. Les animaux retenus seront donc des femelles de 9 mois, naïve vis-à-vis des strongles, de race romane, et provenant toutes du même élevage. Le fait d’avoir un lot le plus homogène possible permet de réduire l’effet hôte qui impacte fortement la variabilité du fitness. Les animaux retenus ne sont jamais sortis au paturage et n’ont donc pas pu s’infester avec des strongles gastro intestinaux dont H. contortus fait parti. C’est pour cette raison que nous considérons ces agnelles comme naïves vis-à-vis des strongles. Les lots seront constitués de manière aléatoire mais en tenant en compte de la valeur d’hématocrite et du poids à J-7 afin d’avoir des lots homogènes concernant ces 2 paramètres. Pour augmenter la probabilitéd’observer une différence de comportement de la souche tout en limitant le nombre d’animaux à inclure, nous avons choisi de n’utiliser que des femelles.Le nombre d’animaux prévus dans l’expérimentation est limité au maximum pour observer une différence de fitness intrinsèque des souches et non pas une différence liée aux capacités de l’hôte. Les lots seront constitués de manière à limiter au maximum l’effet « hôte » dans la part du fitness des parasites. Les lots seront tirés au sort mais en gardant deux lot équivalents en termes d’hématocrite de départ et de distribution dans les cases. Le calcul du nombre d’animaux nécessaires a été réalisé avec le site https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets# . La moyenne du premier lot et l’écart type sont issus des résultats de fitness de notre première étude. La moyenne du deuxième lot est une estimation. Nous obtenons ainsi un nombre d’animaux nécessaire de 15 animaux par lot.

Raffinement

Les agnelles seront hébergées sur une litière paillée et en lots de 15 animaux de manière à pouvoir exprimer leurs comportements sociaux. Elles auront accès à du foin à volonté et à du complément pour satisfaire leur besoin nutritionnel. Progressivement, elles s’habitueront à être manipulées et les prélèvements seront toujours réalisés par du personnel expérimenté. Elles seront surveillées quotidiennement. Le milieu sera enrichi avec des brosses. Le contact homme/animal sera favorisé afin de limiter le stress lié aux manipulations. L’accès à la mangeoire sera suffisant pour ne pas induire de compétition concernant l’alimentation ce qui induirait un stress pour les animaux et des biais dans l’interaction hôte/parasite. L'infestation expérimentale par Haemonchus contortus sera réalisée avec un nombre de larves devant permettre l'excrétion d'oeufs, tout en limitant l'intensité de l'anméie engendrée à un niveau ayant des répercussions minimes sur l'état de santé des animaux. Par précaution, l'intensité de l'anémie sera toutefois suivie de manière hebdomadaire grâce à des mesures d'hématocrite (Ht). En cas d'anémie modérée (Ht

Choix des espèces

L’espèce ovine est l’espèce cible d’H.contortus (application ensuite en élevage). Il n'existe pas d'autre espèce modèle ni de système alternatif que le mouton pour permettre au parasite H. contortus d’effectuer son cycle biologique. Le choix de l’espèce parasitaire repose à la fois sur sa fréquence, sa pathogénicité et sa capacité à développer rapidement une réponse immune chez son hôte mais aussi des multirésistances aux anthelminthiques. C’est pourquoi, l’espèce Haemonchus contortus a été choisie. A l’âge de 9 mois, les agnelles sont infestées en une seule fois avec 5 000 larves infestantes (L3) d’Haemonchus contortus maximum. Cette dose de larves doit permettre d’observer une différence de comportement entre les souches sans être trop délétère pour les animaux. A cette age, les agnelles sont sevrées. Elles sont également naives vis-à-vis d’Haemonchus contortus. Cela permet de limiter l’effet de l’immunité qui se met en place après un premier contact avec le parasite et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Les animaux utilisés seront de race Romane qui est une race qui ne montre pas de résistance particulière au parasitisme par les strongles gastro-intestinaux.

Pour étudier le rôle de gènes du métabolisme, 900 souris, dont des souris génétiquement privées d'un gène et nourries ou non d'un régime enrichi en graisses ou en sucre, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes. Pour les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline, les souris reçoivent un gavage de sucre ou une injection d'insuline et restent environ trois heures dans un tube de contention, le temps de cinq prélèvements de sang à la queue. Elles passent aussi 72 heures isolées pour une mesure de calorimétrie, et ces séries peuvent être répétées trois fois en 20 à 30 semaines, avec une évaluation cardiaque sous anesthésie dans certaines études et, depuis un amendement, l'injection d'un colorant dans la veine sous anesthésie terminale. Le régime enrichi fait prendre du poids et peut provoquer des lésions de la peau liées à un toilettage excessif, que le porteur dit traitées localement et vite résolues. Les éventuels médicaments chez l'humain sont renvoyés à plus long terme.

Objectifs

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de gènes potentiellement impliqués dans la régulation du métabolisme chez les mammifères. Chaque projet se focalisera sur un gène d'interêt disposant d'éléments de la littérature justifiant son analyse dans un modèle physiologique complet. Afin de déterminer ce rôle, nous disposons du modèle Souris qui permet des modifications génétiques capables d'annuler la présence de ce gène chez l'animal. En retirant le gène de l'organisme, nous pouvons ainsi étudier comment les réponses à différentes variables métaboliques sont impactées. Ainsi, nous souhaitons comparer des souris contrôles à des souris génétiquement modifiées pour un gène, en présence ou non d'un régime enrichi en graisses et/ou en sucre, selon les mécanismes d'actions supposés du gène ciblé. Le facteur sexe pourra aussi être étudié, selon le gène cible. La mise en place d'une obésité ou d'une affection du foie liée à ce régime enrichi sera suivie par différentes analyses au cours du temps, et les données générées permettront de déterminer l'impact de la modification génétique dans ce cadre. Pour chaque gène analysé, nous prévoyons de comparer des groupes de 9 animaux pour chaque condition, soit 36 animaux par gène étudié. Durant la durée de ce projet, nous anticipons 5 études par année, soit un total de 36 animaux * 5 projets * 5 ans, soit 900 souris au maximum. Chaque projet contiendra 4 groupes expérimentaux de 9 animaux : Deux schémas expérimentaux sont ainsi possibles : 1) étude de l'effet de la diète, en se focalisant sur un seul genre male ou femelle controle avec une diète classique / controle avec une diète enrichie / animal mutant avec diète classique / animal mutant avec une diète enrichie 2) étude de l'effet du genre : controle male avec une diète enrichie / controle femelle avec une diète enrichie / animal mutant male avec une diète enrichie / animal mutant femelle avec une diète enrichie. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de progresser dans la connaissance que nous avons sur les gènes étudiés, en recherche préclinique. Les données générées nous permettront de mettre en évidence des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux candidats médicaments dans le cadre des pathologies liées à la régulation de la glycémie (diabete) et de l'obésité ainsi qu'aux comorbidités cardiaques. A plus long terme, ces données pourront permettre le développement de médicament chez l'Homme.

Procédures

Durant ce protocole, des cohortes de 36 animaux suivront une série de protocoles qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un test de tolérance au glucose, dans lequel l'animal reçoit un gavage de sucrose suivi de 5 prélevement d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes) ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un test de sensibilité à l'insuline sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes). Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contension afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 72h, ce qui peut être un stress d'isolement. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. Enfin, des prélevements sanguins seront effectués pour suivre l'évolution des paramètres biochimiques. Ces prélevements se font en quelques minutes. Là encore, nous définissons des volumes réduits pour éviter un impact sur le bien-être des animaux. Et une durée de récupération d'au moins deux semaines est appliquée après un prélevement sanguin. L'ensemble des ces procédures expérimentales pourront être répétées au maximum trois fois durant la durée du protocole durant les 20 à 30 semaines de durée du protocole, en espacant chaque geste pour éviter un stress cumulatif et donc un effet négatif sur l'animal. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités. Cette évaluation cardiaque pourra être effectuée deux fois au maximum et implique une anesthésie gazeuse de 30 minutes environ. L'ensemble du protocole sera réalisé environ 5 fois par an sur des lignées différentes durant une période de 5 ans (soit un total maximal théorique de 900 animaux) Amendement: Pour tester la fuite vasculaire une l'injection en intra-veineuse d'un colorant, sous anestésie gazeuse terminale, sera réalisée.

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux subiront des prélevements sanguins, des mesures de la glycémie et de la sensibilité à l'insuline. Dans ce cadre, ils seront immobilisés durant quelques heures et prelevés de gouttes de sang. Durant la mesure de calorimétrie, les animaux seront isolés durant 72h ce qui peut créer un stress temporaire d'isolement. Les animaux prendront du poids du fait du régime enrichi, ce régime peut apporter aussi des lésions cutanées qui sont liées à un hypertoilettage des animaux. Ces lésions sont traitées localement et se résolvent rapidement. Si la fonction cardiaque est évaluée, les animaux seront anesthésiés durant environ 30 minutes et de fines électrodes seront piquées en surface de la peau des pattes pour obtenir le signal électrique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés histologiquement afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation sur les organes.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification génétique d'un gène sur des fonctions métaboliques complexes. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (homéostasie glucidique et lipidique et fonction cardiaque). Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Le modèle Souris nous permet d'accéder à une première approche de ces phénomènes physiologiques complexes afin de comprendre comment ceux-ci se transposent chez l'Homme. Par ailleurs, il permet des modifications génétiques ce qui facilite la compréhension du rôle des différents gènes que nous prévoyons d'étudier.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, consommation d'oxygène, paramètres cardiaques) qui seront analysées à l'aide d'analyses de variances à deux facteurs, répétées pour les mesures ayant lieu dans le temps (suivi du poids ou de la glycémie). Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seul cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Durant les prélevements sanguins, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Par ailleurs, nous nous efforcerons de fournir les meilleurs conditions d'hébergement possible avec la présence d'un enrichissement. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée, et adpatée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptiques..)

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement de modèles d'intérêt porteurs de modifications génétiques sur les gènes d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 6 semaines. A ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique qui est mise en place.

Tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, 66 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est maintenue éveillée dans un tube de contention pendant l'irradiation de la patte, l'autre reçoit la même irradiation sous vingt minutes d'anesthésie, l'objectif déclaré étant de vérifier si l'effet protecteur de la radiothérapie FLASH tient encore chez un animal conscient, comme le sont les patients. Suivent trois mois d'observation, avec douleur à la patte, perte de poids et baisse de mobilité pendant trois à cinq jours, puis dépilations, croûtes et parfois ulcérations au point d'irradiation. Le porteur affirme que les mécanismes inflammatoires et vasculaires ne s'étudient que dans un "organisme vivant intégré" et conclut qu'il lui est "indispensable" de développer des modèles animaux.

Objectifs

La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Au moins 50% des patients atteints d’un cancer sont traités par radiothérapie durant leur maladie. Le principal défi de la radiothérapie est de parvenir à déposer une dose curative dans la tumeur tout en s’assurant que les tissus sains environnants soient préservés dans leur intégrité. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes utilisant de nouvelles modalités de traitement qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale et une activation efficace du système immunitaire chez des rongeurs. Il s’agit de la thérapie FLASH, qui utilise un fort débit de la dose, ca veut dire les temps d’irradiation sont très courts (< 1 ms) Nous cherchons à améliorer encore la compréhension et utilisation optimale de ce techniques innovantes qui utilisent un fort débit de la dose. Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur . En particulier, l’objectif est de comprendre si la diminution d’oxygénation des tissus irradiés liée à l’anesthésie impacte ou non l’effet de l’irradiation des tissus environnants et évaluer la pertinence du modèle d’irradiation chez l’animal anesthésié alors qu’en clinique l’irradiation est faite sur patient vigile. Il est donc pertinent de réaliser une expérience avec des animaux éveillés afin de vérifier si l’effet FLASH se maintient ou pas du tout dans des conditions de traitement réalistes.

Bénéfices attendus

Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus normaux. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques dans des conditions réalistes qui aideront a établir ou dessiner des essais cliniques de façon moins risquée et qui pourront bénéficier à des patients qui actuellement reçoivent un traitement seulement palliatif et pour lesquels les conséquences sur les tissus sains sont très impactantes pour leur qualité de vie et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes. En outre, les connaissances biologiques acquises permettront d'améliorer l’utilisation de la radiothérapie FLASH et les protocoles de patients futurs

Procédures

Dans un premier groupe, les animaux vigiles seront maintenus en contention en vue d’être irradiés au niveau de la patte (durée du geste inférieure à 3 minutes). Dans un second groupe, les animaux anesthésiés seront irradiés au niveau de la patte (durée de l’anesthésie : 20 minutes). Les deux groupes seront ensuite suivis pendant 3 mois pour évaluer les effets de l’irradiation sur la peau (contrôle visuel).

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être (douleur à la patte irradiée)peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids transitoire et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours . Les souris seront maintenues dans un tube de contention adapté à l’irradiation de la patte (quelques secondes),

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains. De même, les mécanismes inflammatoires et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Il est donc impossible de faire nos d’études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'outils statistiques pour utiliser le moins d'animaux possibles tout en obtenant des résultats significatifs.

Raffinement

Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des souris sera mise en place avant toute expérimentation : les souris seront manipulées quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Les souris seront habituées au tube de contention dès la fin de leur acclimatation à leur nouvel hébergement. Dans un souci de raffinement, tout d’abord, nous veillerons quotidiennement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être (détail des points limites appliqués dans la description de la procédure). Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours) pour y remédier, des aliments appétants sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème apaisante-cicatrisante et des antalgiques seront administrés sur la peau pour permettre la cicatrisation (au minimum 1 semaine, application quotidienne). En cas d’atteinte d’un point limite, conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. De plus le modèle utilisé est pertinent pour une translation clinique future des résultats. Si l’anesthésie induit une perte d’effet FLASH, son utilisation sera déconseillée pour les futurs patients. Le modèle de souris est parfaitement adapté pour répondre à cette question. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 8-10 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

Greffées sous la peau avec des cellules tumorales, tondues au flanc, pesées jusqu'à sept fois par semaine, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Aucun médicament n'est évalué à ce stade. Le travail consiste à caler les conditions de greffe, lignée tumorale par lignée tumorale : taille de la tumeur, vitesse de croissance, moment où le traitement pourra commencer. Ces modèles serviront ensuite à tester des radiopharmaceutiques fournis par les clients du laboratoire, et le porteur précise qu'un modèle n'est monté que si le client ne le maîtrise pas déjà en interne.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la 2ème cause de décès dans le monde. Les modèles murins sont encore aujourd’hui indispensables en oncologie notamment pour comprendre la physiopathologie de ces maladies, trouver des thérapie innovantes et évaluer leur efficacité. L’utilisation de radiopharmaceutiques (molécules ciblant les cellules cancéreuses et entrainant ainso leur destruction par émission de rayonnement ionisant) est une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Une des approches de notre laboratoire est de caractériser la distribution tissulaire et sanguine, l’élimination de molécules fournies par nos clients dans le contexte de tumeurs sous cutanées. Cette distribution est rendue possible par le marquage du candidat médicament avec un élément radioactif non toxique aux doses utilisées, la radioactivité pouvant être suivie dans les tissus animaux après prélèvements ou par imagerie. L'approche suivante est de quantifier l’efficacité thérapeutique de molécules fournies par nos clients couplées à différents radioéléments (=élément radioactif) pour le traitement de différents modèles tumoraux greffés chez la souris en sous-cutanée et ainsi d’évaluer le retard de croissance tumorale ou sa régression. Ces molécules (=radiopharmaceutiques = molécules couplées à un élément radioactif) doivent viser spécifiquement les cellules tumorales pour permettre au radioélément d’y accéder. C’est le rayonnement ionisant de ces derniers qui doit aboutir à la destruction des cellules tumorales. L’objectif spécifique de ce projet est donc de déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur, leurs caractéristiques de croissance tumorale ainsi que les fenêtres de début de traitement à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales. Ces modèles ne sont mis en oeuvre que quand le client dispose d'un traitement le visant spécifiquement et uniquement si notre client ne les maîtrise pas déjà en interne auquel cas, un simple transfert de technologie est effectué.

Bénéfices attendus

Le cancer est une des principales causes de mortalité dans le monde. Malgré de nombreuses avancées, le besoin en thérapies innovantes reste majeur. L’utilisation de radiopharmaceutiques (ciblant les cellules cancéreuses et entrainant ainso leur destruction par émission de rayonnement ionisant) est une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Ce projet permettra donc de déterminer les conditions optimales de greffes de tumeurs et leurs caractéristiques de croissance tumorale afin de disposer de modèles fiables et robustes utilisables pour la sélection de candidats médicaments aussi bien pour étudier leur biodistribution dans le cadre de souris porteuses de tumeurs sous-cutanées que pour évaluer l'efficacité thérapeutique de candidats médicaments (radiopharmaceutiques).

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 secondes) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1 à 3 fois, 10 secondes) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injections, 15 secondes)

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère liés à l’administration des cellules tumorales en sous-cutanées ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ou les mesures de tumeurs au pied à coulisse ; douleur légère liée à la pousse tumorale

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : Prélèvement d’organes ou de tumeur au cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animal ; Fin de l’étude

Remplacement

Evaluer l’efficacité de molécules couplées à des radioéléments nécessite d’être en présence d’un système biologique complexe. En effet, il est nécessaire dans le cadre de notre projet de vérifier que le candidat cible les cellules tumorales et de suivre son évolution dans d’autres tissus où il n’est pas souhaitable qu’il soit en trop grande quantité. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser un modèle tumoral maîtrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. Il n’est donc pas possible aujourd’hui de faire ce suivi in vitro et l’animal reste encore le modèle le plus fin et le plus pertinent pour ce type de traitement.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10 souris maximum par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Les études menées dans le cadre de ce projet permettront ainsi de déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur, leurs caractéristiques de croissance tumorale ainsi que les fenêtres de début des traitements à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales qui constitueront nos modèles d’études. Ces modèles ne sont mis en oeuvre que quand le client dispose d'un traitement le visant spécifiquement et uniquement si notre client ne le maîtrise pas déjà en interne auquel cas, un simple transfert de technologie est effectué

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 6 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies anti-cancéreuses. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.

Les souris utilisées ici sont immunodéprimées par construction, seule condition pour que des tumeurs humaines prélevées sur des patients puissent pousser dans leur corps. 6 220 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur une durée pouvant atteindre huit mois par animal. Les greffes se font sous la peau, dans l'os par injection intra-osseuse, ou dans la capsule du rein après ouverture chirurgicale, et une partie des souris est castrée pour les cancers hormono-dépendants. Toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus, quatre souris étant greffées par prélèvement de patient afin de compenser un taux de prise que le porteur situe entre 30 et 35 %.

Objectifs

Le développement des modèles proposés dans ce projet va nous aider à mieux comprendre pourquoi certains traitements contre le cancer échouent chez les patients. Dans notre équipe, nous utilisons des techniques de pointe pour étudier ces mécanismes sur des modèles de souris, qui portent des tumeurs humaines. Lorsque nous ne pouvons pas réaliser ces analyses directement sur les patients, nous utilisons les données obtenues à partir de ces modèles. Ensuite, nous développons des cultures de cellules ou des mini-organes à partir de ces tumeurs pour des études plus poussées. Ces recherches nous permettent de mieux comprendre comment les cellules cancéreuses résistent aux traitements. Cela peut aider à améliorer les soins pour les patients atteints de cancer

Bénéfices attendus

Nos modèles seront disponibles pour d'autres chercheurs, ce qui leur permet de tester de nouvelles idées pour traiter le cancer. Par exemple, nous avons pu valider de nouveaux médicaments qui ont ensuite été testés chez des patients. En résumé, notre travail sur ces modèles nous aide à comprendre et à vaincre la résistance aux traitements du cancer, ce qui pourra conduire à de meilleurs traitements pour les patients dans le futur.

Procédures

Chirurgies : Greffe dans la capsule sous-rénale sous anesthésie générale, une seule, durée 15 minutes. Castration des souris, une seule, durée 5 minutes sous anesthésie générale. La majorité des modèles seront établis par injection sous-cutanée, sauf pour les échantillons osseux qui seront greffés dans l'os. Injection sous-cutanée, durée 2 minutes, sous anesthésie générale, nombre de 1 à 2. Injections intra-osseuses : durée 8 minutes, une seule sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Toutes les chirurgies seront effectuées sous anesthésie gazeuse dans des conditions stériles. La greffe dans la capsule sous-rénale sous anesthésie générale peut causer un stress et une douleur légère, mais ces effets sont temporaires et sont atténués par l'anesthésie et des analgésiques. Castration des souris : pratiquée uniquement pour certains types de cancers, cette chirurgie brève sous anesthésie générale peut causer une douleur légère, atténuée par des analgésiques. Injections sous-cutanées ou injection de cellules: pratiquées sur la majorité des souris, cette méthode est la moins invasive. Les effets sont temporaires, légers et sont atténués par l'anesthésie et par des analgésiques. Greffe intra-osseuse : réalisée sur des échantillons osseux pour reproduire l'environnement tumoral. Elle peut causer une douleur modérée, elle sera faite sous anesthésie suivie d'un traitement analgésique et d'une alimentation adaptée.

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour études sur les tissus et organes des animaux (anatomie pathologique, biochimie, métabolomique, protéomique, génomique).

Remplacement

La complexité biologique des organismes vivants est extrêmement élevée, et les interactions entre différents systèmes biologiques peuvent être difficiles à reproduire en dehors d'un organisme vivant. Les modèles animaux peuvent fournir des informations cruciales sur la physiologie, la pathologie et les mécanismes de la maladie qui ne peuvent pas être obtenues par d'autres moyens. De plus, ils peuvent souvent mieux représenter les processus biologiques humains que les modèles cellulaires ou informatiques. Pour l'étude en cours, l'organisme entier est indispensable pour récapituler les communications humorales et cellulaires du micro-environnement tumoral avec le reste des effecteurs de l'immunité, les organoïdes ou d'autres systèmes de culture cellulaire 2D ou 3D ainsi que les systèmes de modélisation mathématique et informatique ne sont pas adéquats.

Réduction

En parallèle du développement de modèles de tumeurs dérivées de patients, et afin de réduire le nombre d'animaux utilisés en expérimentation, nous développons des organoïdes et des lignées cellulaires. Ces modèles in vitro permettent des études mécanistiques et un large criblage de médicaments, limitant ainsi l'utilisation d'animaux en validant les résultats in vitro avec des modèles plus proches de la biologie humaine. Étant donné que le matériel provient de biopsies, nous greffons 4 souris par prélèvement, ce qui est très peu mais suffisant pour obtenir un modèle selon nos données antérieures indiquant un taux de prise de 30-35 % lors de la primo-implantation. L'utilisation de 4 souris assure une quantité adéquate de matériel pour caractériser et préserver les tumeurs . Le nombre d'animaux prévu au projet est un nombre maximal qui va dépendre du nombre de tumeurs de patients accessibles sur la durée du projet.

Raffinement

Après l'arrivée des souris, nous les laisserons une semaine en acclimatation pour qu'elles s'habituent à leur nouvel environnement. Pendant les opérations chirurgicales comme les greffes sous-cutanées, l'ajout de pellets de testostérone, ou les greffes dans la capsule sous-rénale et dans les os, les souris sont anesthésiées par anesthésie générale et reçoivent un médicament contre la douleur. L'examen clinique est quotidien. Cette observation permet de vérifier si l’animal est en bonne santé, sa posture, son comportement afin de déceler tout signe de détresse. Pour les animaux avec une greffe dans la capsule rénale, une délicate palpation deux fois par semaine est réalisée au niveau du rein. Les animaux avec greffe osseuse sont suivis en vérifiant régulièrement leur état ainsi qu’en procédant à une palpation de la greffe au niveau de l’os en mesurant la largeur de l’os. Des points lmites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris participant à l'étude restent pendant au maximum 8 mois. Les animaux bénéficient d'un enrichissement environnemental (maisons, tunnels, sizzlenests) et de matériaux pour construire un nid. Cette optimisation des conditions de vie permet aux animaux de s’exprimer, de se sociabiliser, de s’adapter à leur nouvel environnement mais aussi d’être moins stressés en restant actifs.

Choix des espèces

L'utilisation de souris est justifiée: par l'état de l'art des modèles murins pour le développement préclinique en oncologie et par la nécessité d’utilisation de modèles immunodéprimés afin de permettre la croissance tumorale de tumeurs humaines. Des souris âgées de 5 à 9 semaines seront utilisées pour standardiser la procédure et ainsi réduire la variabilité intra-expérience. Par ailleurs, l’utilisation de souris âgées de 5 à 9 semaines permet d’améliorer le taux de prise des greffes.