Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Rôle de la farine de krill dans la résistance au stress hypoxique chez la truite arc-en-ciel
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Nourries douze semaines avec quatre aliments expérimentaux contenant de la farine de krill, pesées cinq fois en lot, 720 truites arc-en-ciel passent de 30 à 200 grammes. La moitié est alors tuée dans un bain d'anesthésiant, sang, foie, muscle, fèces et carcasse prélevés. Les 360 restantes sont maintenues trois semaines de plus dans une eau appauvrie en oxygène, obtenue en baissant le niveau et le débit d'eau pour augmenter la densité, avant d'être tuées de la même façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur attend un pompage operculaire excessif, une nage désorientée et une remontée en surface avec tentatives de fuite, tout en écrivant qu'aucun signe de stress grave ne devrait apparaître, l'objet étant d'optimiser un aliment pour la première espèce piscicole produite en France.
Objectifs
Les salmonidés sont sensibles à un faible niveau d'oxygène dissous (OD), qui doit être supérieur à 7 mg/L dans les fermes piscicoles. Bien que les niveaux d'OD soient étroitement surveillés, des baisses soudaines et temporaires peuvent se produire pour de multiples raisons : hausse de la température de l'eau, de la densité de poissons dans les bassins mais également lors des manipulations des poissons. Une limite inférieure aiguë de 4,0 mg/L d'OD a été définie pour les systèmes de production de salmonidés. Ces baisses d’OD risquent de se produire plus fréquemment dans les années à venir en raison des températures extrêmes associées au changement climatique, ce qui peut poser des problèmes de bien-être et de performance. L’apport optimisé de micronutriments anti-oxydants tels que sélénium, la vitamine C et l’astaxanthine peut faire partie d'une stratégie de gestion préventive du stress dans les exploitations piscicoles. Des travaux ont montré qu’une supplémentation en sélénium, un anti-oxydant, dans un aliment à base de farines végétales améliorait la résistance au stress hypoxique des alevins de truite arc-en-ciel et des études ont suggéré une sensibilité au stress oxydant différente entre mâles et femelles. La farine de krill pourrait être un ingrédient fonctionnel intéressant du fait de sa richesse en anti-oxydants. Plusieurs études ont par ailleurs souligné les effets bénéfiques du remplacement de la farine de poisson par de la farine de krill sur la qualité de la chair, la croissance et la santé des poissons. Ce projet a donc trois objectifs : 1) étudier l'impact du remplacement de la farine de poisson par de la farine de krill sur les performances des truites arc-en-ciel juvéniles nourries avec un aliment à base de protéines végétales, 2) étudier l'impact nutritionnel de la farine de krill sur les défenses anti-oxydantes des truites en situation d'hypoxie, 3) étudier l’impact du sexe des poissons sur les performances de croissance et le métabolisme du stress.
Bénéfices attendus
Il est difficile d’éviter des baisses soudaines et temporaires des niveaux d'OD qui peuvent rapidement entraîner des mortalités massives, événements qui risquent de se produire encore plus fréquemment dans les années à venir en raison des températures extrêmes associées au changement climatique. Comme les poissons capturés ne peuvent échapper à des conditions d'élevage sous-optimales, cela peut poser des problèmes de bien-être et de performance avec des croissances et des consommations alimentaires plus faibles ainsi qu'une augmentation des paramètres liés au stress oxydant. Les micronutriments tels que le sélénium, la vitamine C et l’astaxanthine interviennent dans le métabolisme anti-oxydant et leur apport optimisé peut faire partie d'une stratégie de gestion préventive du stress. Les besoins en anti-oxydants nutritionnels dans les aliments piscicoles modernes à base d’ingrédients végétaux ne sont pas clairement identifiés par rapport aux aliments traditionnels riches en ingrédients marins où les farines et huiles de poissons sont progressivement remplacées par des ingrédients plus durables. En effet, cette transition crée de nouveaux défis car les recommandations nutritionnelles pour la plupart des vitamines et minéraux sont largement basées sur les aliments traditionnels et peuvent désormais s’écarter considérablement dans les nouveaux aliments alternatifs. Les données issues de ce projet devraient permettre de mieux caractériser le rôle de la farine de krill dans le métabolisme du stress chez les mâles et femelles de truite arc-en-ciel, première espèce piscicole produite en France. Les niveaux de remplacement de la farine de poisson par de la farine de krill ont été sélectionnés car décrits comme bénéfiques pour la chair, la croissance et la santé des poissons mais leurs effets sur la résistance au stress hypoxique ne sont pas connus. Une meilleure résistance au stress hypoxique des poissons d’élevage par une alimentation optimisée devrait permettre d’améliorer le bien-être et les performances de poissons.
Procédures
-Un total de 720 truites de 30 g sera nourri pendant 12 semaines avec 4 aliments expérimentaux contenant différentes teneurs de farine de krill couvrant tous les besoins nutritionnels des truites avec pesée en lot des 12 bassins toutes les 3 semaines, soit 5 pesées en tout sur animaux vigiles (conformes aux pratiques d’élevage). -Parmi ces 720 truites de 30 g nourries pendant 12 semaines, 360 seront euthanasiées au bout des 12 semaines à un poids d’environ 200 g par euthanasie dans un bain de tricaïne à 150 mg/L avec prélèvement de sang (1 mL) et de tissus : nageoires, foie, muscle, carcasses entières ainsi que les fèces. -Les 360 truites restantes de 200 g seront alimentées pendant 3 semaines supplémentaires avec les 4 aliments expérimentaux et soumises à un stress hypoxique chronique avec une teneur en OD de 5 ppm. Elles seront ensuite anesthésiées et euthanasiées dans les mêmes conditions que précédemment à l’issue des 3 semaines en conditions d’élevage hypoxique et les mêmes prélèvements seront réalisés.
Impact sur les animaux
Lors de l'essai nutritionnel, aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu du fait de la structure d'élevage adaptée et de la formulation des aliments utilisée. Lors du stress hypoxique réalisé dans les mêmes conditions d’élevage que l’essai nutritionnel mais avec une faible concentration d’OD (5 mg d’oxygène par litre, obtenu sur les 3 premiers jours par diminution du niveau d’eau dans les bassins pour augmenter la densité et diminution du débit d’eau), peu d'effets indésirables sont attendus car le niveau et la durée ont été définies de telle sorte à minimiser le stress. Cependant nous pourrions observer les comportements suivants qui ont été décrits dans la littérature chez des truites en situation de stress hypoxique aigu : pompage operculaire excessif, comportement de nage anormal (par exemple, perte d’équilibre), respiration près de la surface de l’eau avec ou sans tentative de fuite. Il convient de noter qu’aucun signe de stress grave ne devrait être observé chez les poissons car un niveau de 4 ppm est considéré comme la limite inférieure aiguë. Un niveau d’oxygène de 5 ppm est considéré comme un facteur de stress modéré lorsqu’il est testé pendant de courtes périodes.
Devenir
Après élevage des truites dans des conditions classiques optimisées avec des aliments fonctionnels contenant de la farine de krill pendant 12 semaines, la moitié (360 poissons) sera euthanasiée et prélevée pour analyse et l'autre moitié (360 poissons) sera remis en élevage pour 3 semaines supplémentaires en conditions d'élevage hypoxique (OD = 5 mg/L) avant euthanasie et prélèvement pour analyse.
Remplacement
S’agissant d’un essai nutritionnel chez des truites juvéniles et dans le but d’étudier le rôle de la farine de krill sur le métabolisme du stress chez les poissons d’élevage mâles et femelles, l’étude ne peut donc pas être réalisée sur des lignées cellulaires ou par des calculs et des modélisations informatiques.
Réduction
La réduction est un objectif réel, le nombre de poissons prélevé est calculé à minima, compte-tenu de la variabilité individuelle observée dans les essais nutritionnels et les analyses antérieurs, tout en maintenant des conditions d’élevage optimales pour les poissons avec une densité adaptée tout au long de l’essai (30-50 kg/m3). Ainsi le nombre de poissons mis en essai nutritionnel est de 60 poissons par bassin avec 3 bassins par régime alimentaire qui est le nombre standard de réplicats utilisé dans le domaine des essais d’alimentation des poissons. Le nombre de poissons par bassin correspond au minimum requis pour observer un comportement alimentaire normal et permettre d’avoir des nombres représentatifs dans l’analyse prévue. Le plan expérimental est défini de telle sorte qu’un seul échantillon tissulaire permettra d’explorer différents niveaux biologiques : analyse génétique (expression de gènes) et analyses enzymatiques et métaboliques.
Raffinement
Des conditions d’élevage classiques et optimisées seront utilisées : photopériode naturelle, température stable à 17°C +/- 1°C, qualité d'eau optimale avec dégazage (afin d’éliminer l’azote dissous) et niveau d’OD compris entre 8,5 et 9,5 ppm avec un débit adapté de 0,3 litre par seconde permettant un renouvellement de 5 à 7 fois par heure, taille et type de bassins adaptée à la taille des poissons (bassins extérieurs de 80 cm de diamètre et de 50 cm de haut pouvant contenir 150 à 220 L d’eau munis d’un couvercle et demi-couvercle occultant assurant la sécurité des poissons vis-à-vis des nuisibles (oiseaux) et limitant les perturbations liées à l’activité des agents de la pisciculture), densité optimale des truites, nettoyage régulier des bassins lors de chaque pesée toutes les 3 semaines. Les animaux seront nourris manuellement à satiété visuelle. Un suivi quotidien du bien-être animal sera évalué à l’aide d’une fiche d’évaluation quantitative du point limite. Lors du stress hypoxique, le comportement des poissons sera étroitement surveillé et des points-limites définis pour éviter toute souffrance grave. Cependant, aucun signe de stress grave ne devrait être observé chez les poissons car un niveau de 5 ppm peut être considéré comme un niveau de stress modéré.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est la première espèce piscicole produite en France et a donc un poids agronomique et commercial important, ce qui en fait un choix privilégié pour cet essai, en plus de son intérêt scientifique pour l’étude du métabolisme du stress et des défenses anti-oxydantes avec un nombre très important de protéines anti-oxydantes. Animaux au stade juvénile. Le but est de se placer dans des conditions de croissance optimales où l’effet de l’aliment sera le plus visible chez le poisson mais aussi de pouvoir récupérer différents tissus en quantité importante, ce qui justifie cette période et le poids moyen initial de 30 grammes permettant d'atteindre un poids moyen final de 200 grammes.
Conception et évaluation de nouveaux stents actifs pour réduire la resténose intra-stent et la thrombose aigue de stent.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Lapins : 80
Incisés, cathétérisés, munis d'un stent posé dans une artère iliaque puis recousus, 240 rats et 80 lapins subissent chacun une intervention d'environ une heure. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour prélever les artères stentées et mesurer la resténose et l'inflammation. Il s'agit de comparer un nouveau stent actif à un stent nu, alors que les méta-analyses citées par le porteur n'ont pas mis en évidence de bénéfice des stents actifs existants. Le RNT annonce une douleur "légère à modérée" au motif que la paroi interne des vaisseaux n'a pas de récepteurs de la douleur, puis décrit hyperthermie, perte de poids, troubles de la cicatrisation, mobilité réduite et hébergement individuel de trois à sept jours après l'opération.
Objectifs
Le traitement endovasculaire est le traitement de choix des lésions athéromateuses peu évoluées des artères coronaires et périphériques. Au niveau des artères coronaires, plus de 80 % des procédures de revascularisation endovasculaires comportent la pose d’un stent. Cependant, un processus chronique de resténose après la mise en place du stent (resténose intra-stent, RIS) par prolifération cellulaire excessive survient dans 20 à 30 % des cas à 6 mois, ce qui en fait un problème majeur de santé publique. Les stents actifs actuels ont permis une réduction de la RIS par libération d’agents cytotoxiques immunosuppresseurs qui inhibent le cycle cellulaire. Néanmoins, l’effet bénéfique de ces stents sur la limitation de la RIS est contrebalancé par un risque accru de thrombose aiguë tardive du stent, lié à la dé-endothélialisation et à l’absence de recouvrement des mailles par une néointima. Les méta-analyses réalisées jusqu’à présent n’ont donc pas mis en évidence de bénéfice lié à l’utilisation des stents actifs actuels. Plusieurs équipes de recherche tentent actuellement de mettre au point de nouveaux stents actifs libérant des drogues pro-cicatrisantes (drug-eluting stent, DES) afin de limiter et non d’inhiber la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires tout en permettant la ré-endothélialisation du stent, évitant ainsi les risques de thrombose aiguës. Malgré ces améliorations, un risque accru de thrombose tardive du stent a été observé avec la première génération de DES. Les travaux scientifiques dans ce domaine sont donc très demandés pour résoudre ces problèmes en optimisant les DES existants, tout en respectant la biocompatibilité avec le sang et les tissus. L'innovation et la recherche continuent pour améliorer tous les aspects de la technologie DES, tels que le matériau et la structure de la plate-forme, les polymères, la distribution de l'enrobage, l'enrobage supplémentaire et les médicaments antiprolifératifs, ce qui a conduit à des générations plus récentes et améliorées de DES. Pour cela, les différents axes de recherche exploités dans notre équipe sont : changer la plateforme du stent en elle-même, modifier la surface du stent et libérer localement des anticoagulants, des traitements antiplaquettaires ou antiprolifératifs pour inhiber la croissance néo-intimale.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche préclinique sur les nouveaux stents actifs de nouvelle génération offre de nombreux avantages potentiels en termes de compréhension de sa sécurité et de l'efficacité, de réduction des risques pour les patients et de développement de nouvelles approches pour prévenir la resténose. Les bénéfices attendus sont les suivants : 1. Compréhension de la réponse artérielle et aperçu mécaniste des processus biologiques : La réponse artérielle à l'implantation d'un stent est complexe, et les études chez l'animal sont essentielles pour prédire les performances chez l'homme. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la resténose et la thrombose, ce qui est crucial pour améliorer les traitements chez les patients. Les modèles animaux utilisés dans ce projet fourniront un aperçu mécaniste des processus biologiques fondamentaux, aidant ainsi à mieux comprendre ces mécanismes complexes. 2. Évaluation de la sécurité : L'évaluation préclinique des nouvelles technologies de stents est très importante pour comprendre leur sécurité potentielle. Il est essentiel de s'assurer que ces stents ne provoquent pas de complications ou de réactions indésirables chez les patients. 3. Potentiel d'efficacité : En plus de la sécurité, ces études peuvent également donner des indications sur l'efficacité potentielle des nouvelles technologies de stents actifs de nouvelle génération. Cela permettra d'identifier les stents les mieux adaptés à différentes situations cliniques. 4. Réduction des risques : Les stents actifs de nouvelle génération ont le potentiel de réduire les échecs de stent et les risques de thrombose aiguë en permettant la ré-endothélialisation du stent. Cela peut conduire à une forte réduction du risque de réintervention coronaire, améliorant ainsi la qualité de vie des patients. 5. Plate-forme d'essai préclinique bien définie : Les modèles animaux établis dans ce projet fournissent une plate-forme d'essai préclinique bien définie pour évaluer les cibles et les stratégies de prévention de la resténose. Cela permet de tester de nouvelles approches avant de les appliquer chez l'homme. 6. Bénéfices pour la recherche et l'industrie : Ces études profiteront à plusieurs communautés au sein de la chaîne de développement, d'essai et d'évaluation clinique. Les résultats de ces recherches peuvent être utilisés par les chercheurs, les cliniciens et l'industrie pour améliorer les dispositifs médicaux et les traitements.
Procédures
Les deux procédures seront réalisées sur les animaux (rats et lapins) sous anesthésie générale et avec une analgésie péri-opératoire. Les gestes techniques comprennent des incisions cutanées, l'implantation d'un stent par voie endovasculaire, et enfin, les sutures cutanées. Au total, 240 rats et 80 lapins seront utilisés pour ces procédures. Chaque intervention sur un animal prendra environ 1 heure et ne sera effectuée qu'une seule fois sur chaque animal. Les prélèvements de tissue vaisseau à la fin de procédure sont réalisé sur les animaux euthanasié, aucuns prélèvements sont prévus sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Le projet est attentif à plusieurs nuisances et effets indésirables qui pourraient survenir chez les animaux de l'étude. Les points suivants seront particulièrement analysés : 1. Douleur légère à modère : Étant donné qu'il s'agit d'une chirurgie cardiovasculaire standard, la mise en place réelle du stent à l'intérieur de l'artère ne provoque généralement pas de douleur, car la paroi interne des vaisseaux sanguins ne possède pas de récepteurs de la douleur. Donc animaux ne ressentent rien pendant cette partie de la procédure. Cependant, une légère gêne ou une sensation de pression lors de l'insertion du cathéter peut être ressenti, donc une anesthésie locale sera généralement administrée pour engourdir la zone où le cathéter est inséré. 2. Hyperthermie : La recherche de la température de l'animal sera effectuée pour détecter tout signe d'infection post-opératoire. Ce risque est présent au moins pendant les 15 premiers jours, pendant le temps de cicatrisation cutanée. 3. Perte de poids : La perte de poids peut être due à la difficulté de mobilisation causée par la chirurgie au niveau du membre de l'animal, entraînant une restriction alimentaire et hydrique. Cette diminution du poids est prévisible pendant environ 7 jours, les rats retrouvant leur mobilité habituelle après ce délai. 4. Anomalies de cicatrisation : Des problèmes tels que désunion, saignement, hématome, ou écoulement suspect (indiquant une infection) seront surveillés pendant les 15 premiers jours, pendant le temps de cicatrisation cutanée. 5. Limitation de la mobilité de l'animal : Bien que la chirurgie permette la déambulation, une diminution de la mobilité peut être observée chez les modèles similaires au cours de la première semaine post-opératoire. 6. Altération de l'état physiologique par stress post-opératoire : Des manifestations telles que des troubles de posture, de toilettage, de dépilation peuvent survenir chez l'animal en raison du stress post-opératoire. Cette altération est prévisible pour une durée de 7 jours après l'opération. Il est important de souligner que ces effets indésirables et nuisances sont surveillés de près dans le cadre de l'étude. Des mesures adéquates seront prises pour minimiser ces effets et assurer le bien-être et le suivi approprié des animaux pendant toute la durée de l'étude.
Devenir
À l'issue de l'étude en deux procédures, une euthanasie sera réalisée car il sera nécessaire de prélever les artères iliaques stentées pour les analyses comparatives. Ces prélèvements permettront de procéder à des analyses histologiques pour vérifier le degré de resténose, des analyses biochimiques pour évaluer l'inflammation et l'efficacité de la drogue libérée. Plus concrètement, une comparaison sera faite entre le degré de resténose, l'inflammation et la ré-endothélialisation entre le stent nu et le nouveau stent actif. Si le nouveau stent actif s'avère plus performant que le stent nu habituellement utilisé, cela signifierait qu'il pourrait prévenir la formation de resténose intra-stent et de thrombose, tout en favorisant une ré-endothélialisation adéquate et une durée optimale du régime antiplaquettaire. La méthode d'euthanasie employée sera le surdosage d'anesthésique, réalisé sur un animal préalablement sédaté avec de l'anesthésie gazeuse.
Remplacement
Les stents à élution médicamenteuse (DES) doivent démontrer des bénéfices cliniques en termes de sécurité et d'efficacité acceptables. La sécurité de ces dispositifs semble plus facilement prévisible à partir de modèles in vitro, même si l'efficacité des DES peut être difficile à établir à partir de ces études. Cependant, avec la complexité croissante de ces dispositifs, les données cliniques corrélatives ont été accumulées, ce qui souligne l'importance croissante des modèles précliniques. Actuellement, il n'existe aucun moyen d'étudier la resténose in vitro, ex vivo ou in silico, car cela met en jeu des mécanismes physiopathologiques complexes résultant d'une inflammation, d'une prolifération et d'une migration des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) du média vers la néointima, ainsi que d'une production excessive de matrice extracellulaire. Les modèles animaux de resténose sont donc essentiels pour comprendre ces processus physiopathologiques et évaluer la faisabilité, l'innocuité et l'efficacité des nouvelles cibles et des stratégies de prévention de la resténose. Il est donc nécessaire de développer des modèles précliniques simples, peu coûteux, rapides et précis pour étudier la resténose. Cependant, avant de réaliser des études sur des animaux, des analyses in vitro de cytotoxicité et de cytocompatibilité seront menées sur les matériaux sélectionnés pour remplacer la technique actuelle. Il est préférable d'avoir des données in vitro positives pour la ou les substances bioactives, en se concentrant sur des cibles cellulaires spécifiques, afin de prédire le succès biologique in vivo. Cela permettra de produire un équilibre favorable entre la croissance néointima, la couverture des cellules endothéliales, le remodelage des vaisseaux et le dépôt de thrombus, avec l'objectif de réduire au minimum le nombre d'animaux nécessaires pour les analyses in vivo. En somme, la recherche sur les stents à élution médicamenteuse nécessite des approches précliniques bien établies et appropriées pour comprendre la resténose et évaluer la sécurité et l'efficacité de nouvelles approches. Les modèles animaux jouent un rôle crucial dans cette évaluation, mais l'utilisation d'analyses in vitro pertinentes permet de limiter la nécessité d'expérimentations animales tout en garantissant des résultats prometteurs pour les futurs traitements.
Réduction
La détermination du nombre d'animaux pour l'étude est basée sur une analyse de la littérature portant sur le même modèle animal, à savoir 10 études sur rat et 14 études sur lapin, toutes traitant du même sujet d'étude. Le nombre moyen d'animaux par groupe analysé dans ces études est de 10. Une seule étude a réalisé une analyse de puissance basée sur les résultats histologiques, avec un niveau de puissance de 80%, et a trouvé un nombre minimal requis de 8 rats par groupe. En se basant sur ces différentes études et leurs résultats, un nombre de 10 animaux par groupe a été sélectionné pour cette étude. La stratégie de réduction du nombre d'animaux est également prise en compte dans le design de l'étude. Pour limiter au maximum le nombre d'animaux nécessaires, une première étape consistera à étudier la formation de néointima sur le modèle de rat. Cette première étape permettra de sélectionner les matériaux qui ont donné les meilleurs résultats à l'issue de ce premier modèle sur rat. Ainsi, la réalisation du deuxième modèle sur lapin se fera avec un nombre d'animaux réduit et ciblé, en se basant sur les résultats obtenus avec le modèle de rat. Cette approche permet d'optimiser l'utilisation des animaux et de réduire le nombre total d'animaux nécessaires tout en obtenant des informations pertinentes sur les effets des matériaux étudiés. Elle s'inscrit dans une démarche éthique et responsable pour la recherche préclinique, en minimisant autant que possible l'impact sur les animaux tout en préservant la validité scientifique de l'étude.
Raffinement
Le principe de raffinement sera mis en œuvre par divers moyens afin d'assurer le bien-être des animaux tout au long de l'étude. Voici les mesures prévues : 1. Conditions de vie : Les animaux seront soumis à un cycle de 12 heures jour/nuit en alternance. Ils seront logés dans une salle avec un flux d'air contrôlé et une température maintenue à 21°C. Ils auront un accès libre à l'eau et à une alimentation standard, sans modification de leur régime habituel. 2. Enrichissement du milieu : Le milieu de vie des animaux sera enrichi pour leur permettre de manifester leur comportement naturel. Des éléments tels qu'un sol dur avec une litière, des moyens d'exploration et de cachettes (tunnels en carton, petits dômes en papier mâché, etc.) seront mis à leur disposition. Des éléments favorisant la nidification, comme des cylindres de coton, des carrés de cellulose et des rondelles de peuplier compressé, seront également présents. Des objets à ronger, tels que des morceaux de bois, seront fournis pour répondre à leurs besoins de mastication. 3. Vie sociale des rats : Avant l'intervention, les rats seront placés en cages comportant 3 à 4 rats, de manière à respecter leur comportement social. Cependant, après la chirurgie et compte tenu des conditions post-opératoires restreintes, ils seront logés individuellement pendant une période minimale de 3 jours, pouvant s'étendre jusqu'à 7 jours. Cela permettra de leur offrir un environnement optimal pour récupérer sans douleur après la procédure. 4. Surveillance du bien-être : Plusieurs éléments seront analysés pour contrôler le bien-être des animaux. Leur poids sera mesuré quotidiennement pendant les 7 jours suivant l'opération, puis une fois par semaine. La température sera surveillée pour détecter tout signe d'hyperthermie, qui pourrait indiquer une infection post-opératoire. Une évaluation quotidienne de la plaie post-opératoire sera effectuée pour détecter toute désunion, saignement ou hématome. La capacité de déambulation de l'animal sera évaluée quotidiennement et devrait revenir à la normale en 7 jours. Enfin, des analyses comportementales seront réalisées, notamment en observant la posture, la position des oreilles, l'enfoncement des yeux et en vérifiant si le toilettage est effectué normalement. Toutes ces mesures sont mises en place pour garantir le bien-être et le confort des animaux tout au long de l'étude, en conformité avec les principes éthiques de la recherche préclinique.
Choix des espèces
Le modèle rat de resténose intra-stent (RIS) est bien décrit et validé dans la littérature. Il permet d'observer un remodelage vasculaire suffisant pour étudier les variations du ratio entre l'épaisseur de la néo-intima et l'épaisseur du média formées après 28 jours d'implantation du stent, en réponse à un traitement pharmacologique. Ce modèle présente l'avantage d'être relativement peu coûteux et permet une analyse approfondie des mécanismes cellulaires impliqués grâce à une large gamme d'anticorps disponibles sur le marché, notamment pour des analyses par western blot. En ce qui concerne le modèle de RIS chez le lapin, il est considéré comme le meilleur modèle pour étudier la ré-endothélialisation des mailles du stent. Il permet également d'obtenir une resténose plus importante que chez le rat. Après avoir réalisé une première étude chez le modèle murin, la confirmation des résultats obtenus dans le modèle lapin est indispensable. Dans la littérature, l'implantation d'un stent dans les artères iliaques du lapin et les artères coronaires du porc sont les modèles animaux les plus couramment utilisés pour étudier la resténose. Cependant, ces modèles ne sont pas toujours idéaux pour mener une étude physiopathologique approfondie. Ils ont des limitations telles que le nombre limité d'anticorps disponibles pour l'analyse des protéines cellulaires, l'impossibilité de travailler avec des souches transgéniques ou knock-out, et des coûts élevés liés aux matériels radiologiques et chirurgicaux nécessaires pour les opérations. En revanche, le modèle de resténose chez le rat offre un large éventail d'outils de recherche expérimentaux et permet de tester différentes nouvelles thérapies contre la resténose. Ce modèle est donc un outil important pour mener des recherches approfondies sur la resténose et développer de futures thérapies pour lutter contre ce phénomène. De plus, il présente l'avantage d'être simple, peu coûteux, rapide et précis, ce qui en fait un modèle de dépistage utile dans l'étude de la RIS. Les rats utilisés seront de la souche wistar, âgés de 10 semaines, et les lapins seront de la race New Zealand white, âgés de 130 à 150 jours, présentant une hypercholestérolémie. Ces âges ont été choisis pour correspondre à un stade adulte de développement chez le rat et le lapin, ce qui les rend représentatifs de la population clinique des patients adultes qui sont pris en charge pour la mise en place d'un stent.
Etude de la réponse immunitaire induite après administration nasale d’un candidat vaccin anti-paludique en modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Vigiles et maintenues en contention, 350 souris reçoivent trois instillations nasales et subissent quatre prises de sang en six semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le candidat vaccin nasal testé cible le paludisme, l'enjeu étant de mesurer la réponse immunitaire déclenchée dans la rate et le foie. Le porteur affirme qu'aucune vaccination ni aucune prise de sang n'a jamais produit d'effets indésirables au laboratoire, avant d'admettre dans la même rubrique que la contention peut stresser les souris et les prélèvements provoquer un hématome et une douleur. Toutes sont tuées au bout de six semaines pour prélever les organes où se joue cette réponse.
Objectifs
Le paludisme est une maladie parasitaire responsable de 241 millions de cas et de 627 000 décès estimés dans le monde en 2020. Les deux vaccins candidats recommandés par l'OMS, affichent une efficacité modérée et un calendrier de vaccination contraignant nécessitant le développement de nouveaux candidats vaccins affichants une efficacité protectrice d'au moins 75 % d'ici 2030 (OMS). Le paludisme a un cycle de vie complexe impliquant l'invasion et le développement à l'intérieur des hépatocytes et des érythrocytes de l'hôte mammifère. A chaque étape de son cycle de vie, le parasite à travers ses différentes formes exprime de nombreuses protéines qui peuvent être la cible de candidats vaccins contre le paludisme. Ces dernières années, l'équipe a développé un candidat vaccin sous-unitaire administré par voie nasale en utilisant des nanoparticules. Celui-ci induit des réponses immunitaires humorales et cellulaires aux niveaux systémique et muqueux assurant une protection. L’équipe souhaite sur la base de cette expertise développer un vaccin contre le paludisme qui induit des réponses humorales et cellulaires au niveau systémique, et hépatique. Des travaux récents, en modèle d’hépatite B, ont montré que seule la vaccination nasale avait la capacité d’induire une réponse cellulaire hépatique en comparaison d’une immunisation systémique renforçant l’intérêt de la voie nasale comme une solution pertinente. Pour ces raisons, nous proposons de développer un vaccin nasal contre le paludisme, et valider l’induction d’une réponse immunitaire protectrice systémique au niveau splénique et hépatique.
Bénéfices attendus
Les vaccins contre le paludisme actuellement les plus avancés et recommandés par l'OMS montrent une efficacité d'environ 45 % et 66% respectivement qui reste insuffisante notamment pour protéger les enfants âgés de 5 à 17 mois au cours de la première année après la vaccination. Il est donc urgent de développer un vaccin plus efficace, éventuellement pour compléter ces deux vaccins. Dans ce but, nous proposons d'utiliser une nouvelle plateforme vaccinale qui a montré des résultats prometteurs. La capacité du candidat vaccin à induire une forte réponse immunitaire humorale et cellulaire systémique et hépatique forte spécifique de Plasmodium pourrait être d'un grand avantage pour un vaccin antipaludique. De plus, si notre calendrier vaccinal à trois immunisations par voie intranasale montre des réponses immunitaires robustes, ce sera une grande avancée dans la recherche sur le vaccin antipaludique. En effet, les vaccins dénommés RTS,S et R21/Matrix-M™ sont proposés sous la forme d'un schéma à quatre doses chez l'enfant à partir de 5 mois ce qui est une organisation difficile dans les pays endémiques (aiguille stérile, personnel médical). De plus, cibler différentes étapes du cycle de vie du parasite pourrait aider à compléter des candidats vaccins plus avancés et permettre d'augmenter la protection si peu de parasites parviennent à échapper à l'immunité hépatique.
Procédures
Les animaux subiront tous 4 prises de sang à J0, J14, J28 et J42. 3 instillations par voie nasale à J0, J14 et J28. Les prises de sang et les instillations/injections ne durent que quelques secondes sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
A ce jour dans le laboratoire, aucune des expériences de vaccinations utilisant des antigènes, ni aucune prise de sang n'a produit d'effets indésirables sur les animaux d'autant plus que les gestes sont très bien maitrisés. Cependant, il est possible que les contentions engendrent du stress, les prises de sang peuvent entrainer un hématome ainsi qu’une douleur légère au niveau du site de prélèvement.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation à J42 de façon à pouvoir étudier les réponses immunitaires induites par les différents types de vaccination notamment les réponses immunitaires hépatiques.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucun modèle de remplacement capable de reproduire la complexité du système immunitaire et d'étudier l'ensemble des réponses immunitaires suite à une vaccination.
Réduction
Les résultats obtenus précédemment avec un extrait total du parasite supporte la preuve de concept qu'une immunisation par voie nasale est capable d'établir une réponse immunitaire hépatique. Afin de poursuivre cette étude, dans une stratégie de vaccin sous-unitaire nous allons dans un premier temps tester plusieurs protéines du parasite pour savoir lesquelles sont les plus immunogènes. Pour chaque protéine utilisée nous constitueront un groupe de 10 souris (5 mâles + 5 femelles). Cette première expérimentation permettra de récolter assez de données, notamment sur le choix des protéines à conserver et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la suite de nos expérimentations. Cette première expérimentation permettra de récolter assez de données notamment sur le choix des protéines à conserver et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la suite de nos expérimentations. Des tests statistiques ainsi qu'une analyse de normalité seront effectués.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Une surveillance accrue sera effectuée à la suite de chaque procédure afin de détecter au plus tôt les points limites définis pour chaque procédure. Un enrichissement positif sera mis en place en introduisant un enrichissement permanent de type igloo dès la semaine d’adaptation des animaux. Un enrichissement positif ponctuel, à leur entrée dans la structure puis après chaque procédure, de type carré en kraft pendant 48h pouvant être dépouillé et permettant la confection d’un nid.
Choix des espèces
Le modèle d'étude d'un candidat vaccin administré par voie nasale est déjà établi chez la souris dans le laboratoire. De plus, l'espèce de souris retenue est décrite dans la littérature comme le modèle de référence permettant l'étude des réponses immunitaires hépatiques. Tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire chez la souris. Des souris adultes sont utilisées car leur système immunitaire est complètement développé. Ce modèle murin permettra la preuve de concept de l’induction d’une réponse immunitaire systémique splénique et hépatique suite à une vaccination par notre candidat vaccin sous-unitaire par voie nasale avant de passer sur un modèle d’infection adapté.
Caractérisation de la composante neurodéveloppementale d’un nouveau modèle murin de l’Ataxie de Friedreich
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Sortis de leur cage et séparés de leur mère trois à quatre fois par semaine, des souriceaux porteurs d'une mutation de l'ataxie de Friedreich subissent trois à neuf tests comportementaux, à dix dates entre leur deuxième et leur vingt-cinquième jour de vie. Un morceau d'oreille leur est prélevé au dixième jour pour le génotypage. 346 souris sont utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, l'un des tests pinçant la patte du nouveau-né pour mesurer un réflexe d'extension croisée. Les souriceaux sortis à deux et dix jours sont tués pour un prélèvement de tissus, les autres à vingt-cinq jours, tandis que les reproducteurs et les porteurs sains restent en vie pour entretenir la lignée, seize animaux étant réutilisés ailleurs.
Objectifs
L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie génétique rare qui se caractérise par une maladie neurologique avec une dégradation progressive des fonctions motrices et sensorielles qui conduit à une perte des mouvements volontaires. La maladie est due à une diminution d'une protéine essentielle pour le bon fonctionnement des neurones. Les approches thérapeutiques pharmacologiques développées ciblant principalement les effets secondaires sont à ce jour faiblement efficaces et l’AF reste une maladie incurable. Un nouveau modèle de souris avec une mutation ponctuelle dans le gène responsable de l'AF a été généré, afin de mimer les effets d’une mutation présente chez certains patients. Ce modèle murin permet pour la première fois de reproduire les niveaux très faibles de la protéine d'intérêt dans tous les tissus, et ce depuis le développement embryonnaire. Ainsi, nous allons pouvoir déterminer si des symptômes précoces peuvent être détectés à des stades post-nataux clés. Nous travaillons en effet avec l’hypothèse que l’AF est due non seulement à une mort progressive des neurones, mais aussi à des défauts de formation du système nerveux pendant le développement de l'embryon. Ce projet est le premier à étudier la possibilité d’un défaut de développement des neurones dans l’AF et pourrait également permettre de changer la prise en charge des patients, en mettant en place des tests plus précoces pour détecter la pathologie.
Bénéfices attendus
Il y a plusieurs bénéfices attendus de ce projet. Le premier sera de continuer la validation de ce nouveau modèle de souris qui présente des faibles taux de protéine d'intérêt dans tous les tissus et reproduit donc la pathologie de façon plus fidèle que les autres modèles utilisés jusqu’ici. Ce modèle est le premier qui pourrait nous permettre de détecter des symptômes présents dès la naissance si ceux-ci existent. Les données recueillies pourront nous permettre de valider une nouvelle batterie de tests comportementaux sur les nouveau-nés, qui pourront par la suite être utilisés par d’autres groupes de la communauté scientifique. De plus, confirmer la présence d’un phénotype précoce d’AF pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients en commençant des traitements plus tôt dans la vie des patients.
Procédures
Les animaux utilisés en comportement seront sortis de leur cage et séparés de leur mère 3 à 4 fois par semaine. Les souriceaux subiront entre 3 et 9 tests comportementaux sur 10 dates entre leur 2ème et 25ème jour de vie. Ces tests dureront au maximum 15 minutes. Les animaux seront prélevés d'un morceau d'oreille pour effectuer le génotypage 10 jours après la naissance.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés pour l’élevage sont maintenus à un état ne présentant pas de phénotype. Ils ne présentent aucun phénotype dommageable et ne nécessitent pas de contrôle supplémentaires que les contrôles courants effectués en reproduction. Les animaux mutants utilisés pour la génération de nouveau-nés mutants présentent une taille réduite. Lors des tests comportementaux, les petits seront séparés de la mère, ce qui peut entraîner un stress. Certains tests peuvent entraîner une douleur légère, comme le test du réflexe d'extension croisée où la patte est pincée.
Devenir
Tous les animaux reproducteurs utilisés seront gardés en vie pour le maintien de la lignée. Les animaux sortis à 2 et 10 jours après la naissance pour prélèvement de tissus seront mis à mort. Les animaux sauvages et mutants seront mis à mort à 25 jours après la naissance pour prélèvement de tissus. Les animaux porteurs sains de la mutation seront rassemblés en groupes de sexe et d’âge pour le maintien de la lignée.
Remplacement
Ce projet vise à optimiser une approche de thérapie génique pour l’ataxie de Friedreich afin d’améliorer la vie des patients et de ralentir la progression de la maladie, voire la stopper de façon pérenne sans induire des effets secondaires invalidants. Tous les outils moléculaires utilisés ont été testés dans des cellules en culture mais il est indispensable de réaliser une validation in vivo sur un modèle murin de la maladie. Ce modèle souris présente une mutation homologue retrouvée chez les patients atteints de l’ataxie de Friedreich, est le premier qui présente des niveaux aussi bas de cette protéine. En effet, les autres modèles animaux n’expriment pas de niveaux aussi faibles de cette protéine et ainsi présentent des limites quant à l’étude des mécanismes de développement et d'évolution de la maladie suite à une diminution des taux de cette protéine.
Réduction
Nous n’avons pas pu effectuer de calculs de tailles de groupes en amont car aucune investigation du phénotype précoce de l’AF n’a été publiée à ce jour. Nous avons donc choisi de constituer des groupes de 30 animaux pour les études comportementales. Afin d’optimiser la production d’animaux, tous les animaux hétérozygotes seront réformés pour le maintien de la colonie. Aucune différence liée au sexe des animaux n’a été observée lors des études comportementales chez les souris mutantes adultes, et nous avons donc choisi de travailler sur des groupes mixtes afin de générer moins d’animaux.
Raffinement
A chaque session de comportement, les petits seront pesés individuellement et examinés rapidement afin de détecter au plus vite tout signe de mal-être (manque de nutrition, problème de croissance). Lors des tests comportementaux, les petits seront séparés de la mère et seront sortis de la cage avec leur nid, qui sera lui-même placé dans une couveuse disponible dans l’animalerie afin d’éviter un stress thermique. Les manipulations dureront au maximum 15 minutes par portée pour éviter un stress trop important de la mère et des petits. A chaque fin de session de tests comportementaux, de la nourriture gélifiée sera mise à disposition de la mère et des souriceaux dans la cage. Pour chaque nouvelle portée manipulée, une nouvelle paire de gants sera utilisée et frictionnée avec la litière de la cage correspondante pour garder une odeur familière lors du déplacement des souris.
Choix des espèces
Il n’existe à ce jour pas de méthodes alternatives pour évaluer in vivo la présence de défauts dans la formation du système nerveux périphérique dans l’AF au cours du développement néonatal précoce. Les modèles souris existants de l’ataxie de Friedreich reproduisent les symptômes de l’AF, mais ces modèles ont soit une absence totale de protéine dans un tissu spécifique, soit des niveaux trop hauts. Le modèle souris utilisé ici est porteur d’une mutation ponctuelle présente également chez les patients. C’est le premier modèle souris de l’AF présentant un aussi faible taux de protéine mutée dans tous les tissus. Il permet ainsi d’étudier les effets des niveaux bas de cette protéine sur la mise en place des différents tissus et organes durant le développement embryonnaire. De ce fait, ce modèle est le meilleur choix pour étudier les atteintes neuronales ainsi que des symptômes sensorimoteurs à des stades très précoces après la naissance. Les études aux stades postnataux débuteront à 2 jour après la naissance et se termineront à 25 jours, ou avant si les points limites fixés pour cette étude sont atteints. Afin de limiter au maximum le risque de cannibalisme des mères sur leur portée, les petits ne seront pas touchés pendant 2 jours après leur naissance. Les tests seront effectués jusqu’au sevrage des animaux et avant le début de l’adolescence considérée après 25 jours chez la souris.
THERAPIE GENIQUE DES CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Irradiées, puis greffées sous anesthésie avec des cellules souches sanguines de souris ou humaines, 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour que soit quantifiée la proportion de cellules greffées dans leur moelle et leur sang, chacune ayant subi jusqu'à trois prises de sang au cours de sa vie. Le projet vise à améliorer des protocoles de thérapie génique destinés à la drépanocytose et à la bêta-thalassémie, en testant des gènes thérapeutiques, de sélection, "suicides" ou activateurs de prolifération. Le porteur écrit que l'irradiation non létale n'est pas censée provoquer de douleur, et décrit par ailleurs une irradiation létale des souris immunocompétentes dont seule la greffe assure la survie.
Objectifs
Au laboratoire nous développons de nouveaux vecteurs thérapeutiques permettant de modifier plus efficacement les cellules souches sanguines pour optimiser les conditions de culture, de modification et de sélection des cellules « corrigées » qui seront injectées, afin d’améliorer les protocoles de thérapie génique chez l’humain dans le cadre de maladies génétiques. L’objectif de ce projet consiste à étudier l’effet de gènes thérapeutiques, de gènes de sélection, de gènes « suicides » ou de gènes activateurs de la prolifération cellulaire ayant un effet sur le processus physiopathologique des maladies de l’hémoglobine telles que la béta-thalassémie et la drépanocytose. Pour cela nous devons réaliser des études précliniques de transplantation dans des modèles murins de deux maladies (la drépanocytose et la béta-thalassémie), ainsi que dans un modèle murin immunodéficient (n’ayant pas de système immunitaire) qui permet la prise de greffe de cellules souches sanguines humaines.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont l’amélioration des protocoles de correction (des cellule souches sanguines défectueuses) et de transplantation des cellules souches sanguines corrigées pour des thérapies géniques qui pourront être appliqués à l’humain dans le cadre de maladies de l’hémoglobine ou de greffes de cellules souches sanguines.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe de cellules souches hématopoïétiques/sanguines (soit 3 min environ pour les souris immunodéficientes et 2 fois 5 min environ pour les souris immunocompétentes). Les animaux seront également transplantés avec des cellules souches hématopoïétiques/sanguines murines ou humaines. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes est réalisée sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin une fois par mois et trois fois maximun durant la vie de l’animal. Ce geste ne dure que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les souris immunodéficientes (sans système immunitaire) ont un risque de développer des infections diverses en lien avec des pathogènes (virus, bactéries). L’irradiation non létale de ces souris n’est pas censée provoquer de douleur ou d’altération majeure de leur santé. Une perte de poids peut être observée dans de rares cas mais elle est transitoire (une semaine environ). Seule une infection potentielle peut s’avérer dangereuse mais elle est limitée au maximum grâce au maintien des animaux dans un environnement stérile et à un traitement antibiotique. L’irradiation létale des souris immunocompétentes nécessite une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour assurer leur survie. Suite à l’irradiation, une perte de poids peut être observée mais elle est transitoire (une semaine environ). Les prélèvements sanguins peuvent générer du stress dû à la contention de l’animal ainsi qu’une légère et brève douleur au niveau de l’œil.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier la proportion de cellules souches sanguines murines ou humaines présentes dans la moelle et le sang des souris et de les caractériser.
Remplacement
La prise de greffe au cours de la transplantation des cellules souches sanguines/hématopoïétiques (CSHs) est un phénomène complexe pour lequel il n’existe aucune méthode alternative in vitro permettant de mimer les processus physiologiques de guidage, d’implantation, de survie et de différenciation de ces cellules. La transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs cultivées et modifiées par des vecteurs thérapeutiques à se loger au niveau de la moelle osseuse et reconstituer l’hématopoïèse (processus physiologique de production des cellules sanguines) à long terme. Par ailleurs il n’existe pas de protocole in vitro permettant de différencier les cellules érythroïdes humaines ou murines en globules rouges parfaitement matures. Les souris sont donc utilisées à la fois pour déterminer si des CSHs ont été génétiquement modifiées par les vecteurs de transfert de gènes mais également à terme, par l’étude de l’effet des vecteurs de thérapie génique sur la fonction des globules rouges.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, nous évaluerons d’abord l’effet des conditions de culture et/ou protocoles de modification des cellules dans des systèmes de culture in vitro afin de vérifier qu’ils ne génèrent pas de toxicité cellulaire. Le recours à l’animal est ensuite indispensable à l’étude de l’effet des procédures de culture sur la capacité des cellules à reconstituer le système hématopoïétique (de production de toutes les cellules sanguines). Notre expérience dans le domaine de la greffe des cellules souches sanguines dans le modèle murin ainsi que les résultats de la littérature nous indiquent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe est de 6 animaux pour rendre des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris immunodéficientes (sans système immunitaire) sont élevées en conditions stériles. Les changes des cages sont réalisés sous poste de sécurité microbiologique afin de réduire au maximum les risques de contact avec des agents infectieux. L'eau de boisson est une eau en bouteille du commerce et qui est stérilisée. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées avec des gants aseptisées à l'alcool. Les cages des animaux disposent de cotons (enrichissement) qui ont été au préalable stérilisés. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux, la greffe de cellules souches sanguines sera réalisée sous anesthésie grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Durant les 15 jours suivant la greffe cellulaire les souris seront examinées par le porteur du projet 3 fois par semaine et une grille de suivi sera remplie en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu. Des points limites ont été déterminés afin de mettre en place un traitement approprié ou d’envisager l’euthanasie si un des critères d’arrêt est atteint. Afin d’éviter toute infection, les souris seront traitées par antibiothérapie durant ces 30 jours. Au bout d’un mois, les souris seront observées par le porteur de projet une fois par semaine en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de cellules souches sanguines. Le projet porte sur quatre lignées murines. Deux lignées sont utilisées comme modèles de pathologies humaines du globule rouge, dans le cadre d’expériences de thérapie génique. Une lignée est utilisée comme lignée receveuse de transplantations effectuées à partir de cellules souches sanguines murines. Une autre lignée de souris immunodéficientes permet la greffe de cellules souches sanguines humaines qui sont capables de reconstituer le système sanguin. Ce système de greffe permet l’étude de l’efficacité de vecteurs de thérapie géniques sur les cellules souches sanguines humaines provenant de donneurs sains ou de patients atteints de drépanocytose ou de béta-thalassémie. Dans ce projet les animaux sont utilisés à l’âge de 10-12 semaines, moment où la prise de greffe est optimale.
Suivi de l’efficacité d’une molécule en suspension sur les souris modèle de progéria G609G
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Porteuses de la mutation de la progéria, ces souris dépassent rarement 17 grammes, présentent des anomalies du squelette et de la peau, et meurent en moyenne vers 117 jours de troubles cardiaques. 206 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures classées sévères, pour tester une molécule censée réduire la progérine, la protéine toxique en cause. Chacune reçoit une à deux injections intrapéritonéales par semaine pendant dix semaines, le porteur prévoyant en outre une inflammation légère des yeux au-delà de huit semaines de traitement. Elles sont tuées en fin de procédure pour que leurs tissus soient analysés, la maladie humaine dont elles portent la mutation emportant les enfants atteints vers 13 ans et demi.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de tester l’efficacité in vivo d’un traitement sur un modèle murin de la Progéria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS). Cette maladie génétique extrêmement rare se déclare dès l’enfance et conduit à l’apparition d’un vieillissement prématuré et à une mortalité précoce, vers l’âge de 13,5 ans, des suites d’infarctus du myocarde ou d’accidents vasculaires. Il existe donc un fort besoin médical pour ces patients. Cette pathologie est due à l’accumulation d’une protéine toxique dans le noyau des cellules de patients, appelée la progérine. La quantité de progérine présente chez les patients est directement corrélée avec la sévérité de la maladie. La réduction de la quantité de cette protéine toxique est donc une cible potentielle pour changer le cours de cette pathologie dévastatrice. Récemment une molécule avec un bon index thérapeutique sur un modèle d’étude in vitro a été sélectionnée pour poursuivre le développement. Cette molécule a été testée ensuite chez la souris. Le traitement hebdomadaire avec cette molécule a montré des signes d’efficacité mais ne remplit pas tous les critères thérapeutiques. Ainsi, dans ce nouveau projet nous testerons une nouvelle molécule dérivée de l’ancienne molécule. Le but sera ici d’évaluer : la diminution de la progérine en évaluant l’efficacité de cette nouvelle molécule, ainsi que sa pharmacocinétique, sa toxicité in-vivo et l’effet thérapeutique à long terme.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet nous permettra : - de démontrer que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur les symptômes de la pathologie humaine ; - d’établir une relation pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule testée. Un des effets attendus de cette utilisation est une meilleure tolérance et efficacité. A plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir une preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de Progéria.
Procédures
Injections intrapéritonéales (1X ou 2X/semaine, sur une durée maximale de 10 semaines). Les animaux seront injectés avec des anesthésiques (durée de l’injection moins d’une minute) avant que le sang soit prélevé par voie intracardiaque (durée 5 minutes).
Impact sur les animaux
Le modèle animal utilisé présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris homozygotes présentent des poids ne dépassant que très rarement 17g pour les mâles et 15g pour les femelles. La lignée est également caractérisée par une mortalité prématurée. En effet, la moyenne de survie basée sur l’ensemble des 7 publications utilisant ce modèle et présentant ce type d’étude est de 117 jours, soit 16,5 semaines environ. Des anomalies squelettiques sont également à noter ou des anomalies cutanées avec un pelage pouvant devenir épars. Enfin, des problèmes cardiaques importants sont souvent responsables de la mort prématurée de ces souris. Par ailleurs, nous nous attendons possiblement à la présence d’une inflammation légère au niveau des yeux sur les animaux traités avec la molécule pendant plus de 8 semaines.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses protéiques.
Remplacement
Notre projet s’inscrit dans la continuité d’une étude in vitro menée sur des cellules de patients. Cependant, ce modèle cellulaire ne permet pas d’explorer l’intégralité des mécanismes qui peuvent avoir lieu dans un organisme. Le passage au modèle in vivo est donc une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Il nous est nécessaire de disposer d'un organisme entier pour pouvoir mieux comprendre la pathologie de la progéria. Le seul mammifère modèle de la maladie qui nous permet de réaliser des essais pré-cliniques en vue d’une mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’Homme est la souris. Il existe aussi un modèle de porc, cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats interprétables. Dans ce sens la cohorte destinée à l’analyse de l’efficacité précoce comporte 6-8 animaux par groupe. L’estimation du nombre d’animaux par groupe nécessaire a été réalisée sur le critère principal suivant : comparaison du niveau moyen de progérine entre chaque groupe de traitement (comparaison de moyennes). La deuxième cohorte destinée à l’évaluation d’un possible espacement du traitement comporte 6 animaux par groupes et par temps d’analyse. Enfin la dernière cohorte destinée à l’observation plus tardive d’un phénotype clinique mesurable comporte 10 animaux par groupe. Pour l’ensemble des cohortes, le nombre d’animaux utilisés a ainsi été optimisé pour permettre d’observer un effet du traitement.
Raffinement
Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, l’apparence physique. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas d’inflammation des yeux, les animaux seront traités avec une crème ophtalmique 1 à 2 fois par jour pendant minimum 5 jours. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal blessé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés 2x/semaine et observés quotidiennement. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gel, facile à ingérer par les souris afin d’éviter toute malnutrition.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul modèle envisageable pour tester des approches thérapeutiques dans le cadre de cette pathologie, puisqu’il s’agit d’une maladie génétique qui a été modélisée sur la souris. Le modèle que nous utilisons récapitule à la fois la mutation génétique de la maladie, ainsi que la majorité des caractéristiques cliniques et de l’évolution de la pathologie observée chez l’Homme. Une seule autre espèce génétiquement modifiée existe, il s’agit d’un modèle de porc. Cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée. Les animaux seront traités à partir de l’âge de 5 semaines, avant que la pathologie ne se développe et jusqu'à maximum 15 semaines pour étudier l'efficacité tardive.
Effet de candidats-médicaments dans un modèle murin de la maladie de Parkinson, basé sur l’injection stéréotaxique de 6-hydroxydopamine (6-OHDA)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
900 souris vont être utilisées dans des procédures classées sévères, toutes tuées au plus tard cinq semaines après l'opération pour que leurs tissus soient collectés. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique de 45 minutes pour recevoir une injection de 6-hydroxydopamine dans la substance noire, lésion censée reproduire la neurodégénérescence de la maladie de Parkinson. Suivent jusqu'à deux administrations quotidiennes pendant cinq semaines, par gavage ou par injection sous la peau, dans le nez ou dans le ventre, et trois tests moteurs répétés. Le porteur justifie la classification sévère par la douleur postopératoire et le stress cumulés, et affirme que ce degré de complexité ne peut être atteint qu'avec un modèle animal, le projet s'inscrivant dans le développement préclinique de ses partenaires.
Objectifs
La maladie de Parkinson, qui touche 200 000 personnes en France, est la deuxième maladie neurodégénérative la plus courante, provoquant des problèmes de coordination motrice, de rigidité musculaire, de tremblements et de lenteur des mouvements. Le manque de médicaments efficaces contre cette maladie représente un défi majeur pour la santé. Notre modèle animal, basé sur l'injection de 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans la substance noire de souris de 3 mois, vise à reproduire la neurodégénérescence associée à la maladie de Parkinson, qui est liée à l'âge. Ce projet a pour objectif de déterminer le potentiel neuroprotecteur de divers candidats-médicaments dans ce modèle murin, s'inscrivant ainsi dans les projets de développement précliniques de nos partenaires.
Bénéfices attendus
Le projet s'intègre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour cette maladie incurable. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats médicaments pourra se poursuivre.
Procédures
Tous les animaux de ce projet subiront une opération spécifique : une chirurgie stéréotaxique, qui dure environ 45 minutes, sous anesthésie générale et avec des médicaments pour gérer la douleur. Leur état de santé sera surveillé pendant cinq jours après l'opération pour repérer tout effet indésirable ou signe de souffrance. Le traitement inclut des soins réguliers (au maximum deux fois par jour, durant 30 secondes au plus) administrés soit par gavage, soit par des injections sous la peau, dans le nez, ou dans le ventre. Les capacités motrices des animaux seront testées à travers trois tests différents, chacun durant une minute et espacés de 10 minutes, pour évaluer leur coordination. Ces tests ne prendront pas plus de cinq minutes par jour. Enfin, les animaux subiront une prise de sang au niveau du cœur sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie, qui peut causer des douleurs après l'opération. Les traitements quotidiens des souris (maximum deux fois par jour pendant cinq semaines) par gavage, ou par injections sous la peau, dans le nez ou dans le ventre, peuvent provoquer du stress, surtout au début. Les tests de motricité peuvent également être stressants car ils nécessitent de placer les souris dans des environnements nouveaux pour elles. Ces différents aspects (la douleur potentielle après l'opération, le stress causé par les traitements quotidiens et les tests de motricité) expliquent pourquoi la procédure est classée comme "sévère".
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des échantillons biologiques au plus tard 5 semaines après la chirurgie
Remplacement
Les processus pathophysiologiques de cette pathologie impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (neurones et cellules gliales) dans différentes structures cérébrales (striatum, substance noire). Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.
Réduction
Le nombre de souris (n par groupe) a été optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Ceci permet donc de réduire le nombre d'animaux nécessaire et d'optimiser l'utilisation de chaque souris. La motricité fine des souris sera évaluée, des études publiées dans la littérature scientifique suggèrent qu'un nombre de 12 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (puissance: 80%, seuil de significativité à 5%). Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe pour détecter d’éventuels effets significatifs de candidats médicaments dans modèle animal de la maladie de Parkinson.
Raffinement
Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (papiers pour nids, tunnel en carton), (ii) des approches d'analgésies avant, pendant et après l'opération, (iii) et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (température corporelle) pendant et après l'opération (pour assurer un rétablissement rapide). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (5 au maximum), en cages ventilées, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort. Si un point limite est atteint, durant l'étude, les souris seront euthanasiées en utilisant les méthodes d’euthanasie autorisées. La méthode utilisée est l’euthanasie par surdose d’isoflurane, suivie par une dislocation cervicale.
Choix des espèces
La souris possède un système cérébral complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude de la maladie de Parkinson. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiés aux études impliquant des souris. Nous utiliserons des animaux âgés de3 mois. Ce stade de développement chez la souris est approprié pour observer un processus de mort cellulaire.
Identification de nouveaux biomarqueurs pour détecter le dopage par autotransfusion dans un modèle de souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Des souris reçoivent du sang d'autres souris conservé au froid 14 jours, pour mettre au point des tests capables de détecter le dopage sportif par autotransfusion. 380 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ou menées sous anesthésie sans réveil pour une partie d'entre elles, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur sang. Le protocole comprend un prélèvement de sang dans le cœur sous anesthésie générale, une transfusion sans anesthésie et huit prises de sang en sept jours, et la transfusion peut provoquer des complications aux yeux ou une surcharge du volume sanguin avec insuffisance respiratoire. Le porteur écrit qu'une étude avec des volontaires humains est "nécessaire", que les études humaines sont "complexes et coûteuses", et que la souris permettra d'évaluer plusieurs paramètres à la fois.
Objectifs
La transfusion sanguine est un moyen interdit mais très simple et efficace d'améliorer les performances sportives. En effet, un simple don de sang, sa conservation au froid et sa réinfusion quelques semaines plus tard augmentent le volume des globules rouges et la capacité d'oxygénation. Cette transfusion est difficile à détecter car le sang du donneur et du receveur sont très souvent identiques et le volume transfusé est faible: des méthodes très sensibles sont donc nécessaires pour la détecter. Une étude de transfusion avec des volontaires humains est nécessaire pour explorer les différents paramètres chez le receveur après la transfusion. Les études humaines sont toutefois complexes et coûteuses. L'utilisation d'un modèle animal permettra d'évaluer plusieurs paramètres en même temps chez le receveur. À cet égard, le modèle de souris a déjà été utilisé pour de nombreuses études dans le contexte transfusionnel. Au cours des dernières années, de nombreuses études et diverses approches ont été testées pour identifier les marqueurs de la transfusion. Pour ce faire, il est possible de caractériser les globules rouges dans la circulation du receveur après la transfusion, à la recherche des altérations bien connues des globules rouges qui se produisent pendant le stockage au froid en banque de sang. En effet, au cours de cette période, une série de modifications qui altèrent les globules rouges ont été décrites; ce qui pourrait permettre de détecter de très faibles niveaux de globules rouges préalablement stockés dans la circulation du receveur.
Bénéfices attendus
Le dopage reste un défi majeur dans le sport. Dans ce contexte, l'identification de nouvelles méthodes de détection est une priorité de l'Agence Mondiale Antidopage pour améliorer l'efficacité de la lutte contre le dopage. Ceci est particulièrement évident dans le contexte des transfusions sanguines pour lesquelles il n'existe actuellement aucune méthode de détection directe. Ainsi, ce projet permettra de valider de nouvelles méthodes. En cas de résultats encourageants dans cette étude animale, ce projet constituera une excellente base pour des études ultérieures, notamment avec des sujets humains ayant récemment reçu une transfusion sanguine. Ces méthodes pourraient facilement être mis à la disposition des laboratoires antidopage en cas de résultats prometteurs.
Procédures
Analgésie pendant 20min, puis anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée une seule fois. Prélèvement intracardiaque d'une souris analgésiée sous anesthésie générale pendant 1 minute, effectuée une seule fois. Transfusion sanguine sur animal vigile pendant 5-10 secondes, effectuée une seule fois. Anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée une seule fois. Prélèvement de sang sous anesthésie générale pendant 1 minute, effectué 1 seule fois. Prélèvement de sang sur animal vigile pendant quelques secondes, effectué 8 fois sur 7 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables des procédures sur les animaux sont modérés. Stress induit par la contention, l'analgésie, la piqûre d'anesthésie, la mise en anesthésie, la transfusion et les prélèvements sanguins. L'anesthésie peut causer une hypothermie. La transfusion peut entraîner des complications oculaires et correspond à un apport aigu d’un volume circulant supplémentaire pouvant entraîner une surcharge volémique avec insuffisance respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever du sang qui sera analysé.
Remplacement
Veille bibliographique permanente pour éviter toute expérimentation inutile ou redondante. L’expérimentation animale est indispensable pour évaluer in vivo, dans un modèle préclinique, l’impact de la transfusion sur les paramètres sanguins et biochimiques et les propriétés des globules rouges du receveur. Les expérimentations sur animal vigile ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro, qui par ailleurs ne peuvent reproduire les conditions de dopage par réinfusion de sang.
Réduction
Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Les tests statistiques utilisés rigoureusement permettent l’analyse d’échantillons de petites tailles. Notre expertise des modèles de transfusion sanguine chez la souris ainsi qu’un test statistique nous informent que des groupes de 12 souris sont nécessaires pour générer des résultats robustes. Pour chaque souris transfusées le sang sera analysé par de multiples paramètres pour obtenir un maximum d'informations (numération formule sanguine, plusieurs marqueurs biochimiques, plusieurs propriétés du globule rouge). Certaines méthodes ont été optimisées afin d'être réalisées sur de très faibles volumes de sang prélevé, permettant un suivi longitudinal sur le même animal.
Raffinement
Les transfusions et prélèvements de petits volumes de sang (5µl) sur souris vigiles seront prélevées par du personnel expérimenté qui maîtrisent les gestes techniques. Hébergement adapté des animaux, enrichissement de l’environnement. Lorsque la procédure expérimentale le permet, l'analgésie et l'anesthésie est utilisée pour réduire l'inconfort de l'animal. Un protocole de surveillance du bien-être est défini a priori et appliqué pour chaque procédure, avec définition de points-limites basés sur un score composite d’items d'observations cliniques (apparence physique externe, changement de comportement des animaux, complications liées à la transfusion).
Choix des espèces
L'utilisation du modèle de banque de sang de souris déleucocyté et stocké pendant 14 jours reproduit les conditions de stockage d’une banque de sang chez l’homme et ceci est transposable aux dommages observés lors du stockage à froid pendant 42 jours d’une poche de sang humaine. Des souris jeunes adultes âgées de 6 à 8 semaines seront utilisées comme "receveuses" dans tous les modèles de transfusion permettant d’homogénéiser les groupes en terme de volume circulant et d’âge. Des souris adultes âgées de 10 à 12 semaines seront utilisées comme "donneuses" pour la réalisation des banques de sang maximisant le poids des souris et le volume à prélever.
Validation en modèle murin de l’effet thérapeutique d’un vaccin muqueux anti-SARS-CoV2 contre les symptômes du covid-long
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Les souris qui perdent 15 % de leur poids ou présentent des difficultés respiratoires après l'infection par le SARS-CoV-2 sont mises à mort sans délai, l'infection pouvant les tuer en huit jours. 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs poumons, de leur cerveau et de leur tête. Chacune reçoit une puce sous la peau du dos, subit huit prises de sang à raison d'une par semaine, trois ou quatre vaccinations par le nez sous anesthésie générale et une inoculation du virus par la même voie. Toute médication susceptible d'interférer avec la réponse immunitaire est exclue. Les résultats doivent alimenter une publication et une éventuelle demande d'essai clinique pour le candidat vaccin LVT-001, contre les symptômes du covid long.
Objectifs
Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.
Bénéfices attendus
Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.
Procédures
Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sous anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 3 et 4 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).
Impact sur les animaux
Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie intra-péritonéale pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pur le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire.
Choix des espèces
Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.
Evaluation de l’effet de l’environnement hormonal sur les performances d’un implant cochléaire chez la gerbille
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Les gerbilles qui perdent plus de 15 % de leur poids ou qui cumulent trois signes cliniques sont mises à mort. 54 gerbilles de Mongolie vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, le porteur indiquant qu'une fois traitées ou implantées elles ne pourront pas être réutilisées. Trente d'entre elles reçoivent un implant cochléaire sous anesthésie générale et quatre séances d'enregistrement auditif, vingt-quatre subissant deux prélèvements de sang derrière l'œil, geste dont il reconnaît qu'il peut laisser des lésions oculaires. L'enjeu déclaré est d'expliquer les baisses d'intelligibilité observées chez des patientes implantées pendant leurs règles, et de leur proposer des corticoïdes si l'hypothèse hormonale se confirme.
Objectifs
L’implantation cochléaire permet la réhabilitation des surdités sévères et profondes quand l’appareillage conventionnel est en échec. Elle est recommandée dans ces cas par la Haute autorité de Santé (HAS). Les implants cochléaires ont prouvé leur efficacité leur fiabilité tant chez l’adulte que chez l’enfant et sont utilisés maintenant en routine depuis plus de 30 ans dans le monde entier. Si les résultats sont assez constants, il a été rapporté dans toutes les équipes des fluctuations des performances associées à des fluctuations d’impédance électriques des électrodes de l’implant cochléaire. Le mécanisme de ces fluctuations d’impédance électrique, le plus souvent dans le sens de l’augmentation, est mal compris. En clinique nous avons pu observer, des cas de fluctuations menstruelles, caractérisées par une intelligibilité effondrée en période de menstruations. Il est donc fort possible que des récepteurs aux hormones sexuelles, des récepteurs aux corticostéroïdes soient impliqués dans ces fluctuations d’impédances électriques autour de l’implant cochléaire, associées à des fluctuations des performances auditives. Afin de répondre à cette question, l’objectif du projet est d'évaluer les variations des performances d'un implant cochléaire en fonction des fluctuations hormonales dans un modèle expérimental chez la gerbille.
Bénéfices attendus
Les retombées seront d’ordre physiopathologique, et clinique avec un impact immédiat sur la prise en charge des patients implantés cochléaires présentant des fluctuations auditives et d’impédance. Sur le plan clinique, si nos hypothèses se confirment nous pourrons proposer l’administration de corticoïdes à nos patientes gênées par ces fluctuations auditives récurrentes. Le modèle pourra servir ultérieurement pour les mêmes mesures dans d’autres conditions critiques.
Procédures
Injection sous cutanée : ~ 30s Prélèvements rétro-orbitaires (< 1 min): 2 prélèvements par animaux sous anesthésie générale espacés de 36h - 24 gerbilles. Implantation cochléaire sous anesthésie générale (15 min) : 30 gerbilles Enregistrements des paramètres auditifs : 4 enregistrements (non invasif) par gerbille (30 min) 30 gerbilles
Impact sur les animaux
Après les prélèvements veineux rétro-orbitaires les gerbilles peuvent présenter des lésions oculaires. Après implantation cochléaire les animaux peuvent avoir pendant un certain temps des altérations de l'équilibre.
Devenir
A l'issus de chaque procédure les animaux seront mis à mort. En effet ayant été traité et/ou implanté, ils ne pourront pas être réutilisés dans d'autre procédure
Remplacement
A ce stade aucune méthode alternative actuelle ne permet de remplacer les protocoles et procédures décrits ci-dessous. En effet, il est nécessaire de confirmer que les observations faites en clinique sont similaires chez l’animal in-vivo dans un contexte physiologique complexe.
Réduction
Nous travaillions avec un nombre d'animaux le plus faible possible mais de manière à ne pas compromettre la pertinence des résultats. Les prélèvements nécessaires aux dosages oestradiol sont relativement important ce qui explique que nous ne pouvons faire que 2 prélèvements par animal dans le temps imparti. Dans la 2ème étape, nous ferons les enregistrements et prélèvements (1 au pic en rétro-orbitaire et un à avant euthansie) sur le même animal à différents temps afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux utilisés permet de réaliser une étude statistique dans de bonne condition.
Raffinement
Afin d’assurer le bien-être et le confort des animaux, les gerbilles seront surveillées et manipulées tous les jours par l’expérimentateur et les personnes compétentes. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, sauf pendant la récupération de la chirurgie, et auront un environnement enrichi (des rouleaux en carton et des bandes de papier) avec accès libre à la nourriture et l’eau. Leur état physique et comportement seront évalués régulièrement de la réception à l'euthanasie en remplissant le tableau d'évaluation. Dans le cas où l’animal montre au moins un de ces signes cliniques, soit il pourra être soigné (administration des antalgiques contre la douleur, désinfection des blessures, etc.) sans compromettre les résultats et il sera gardé dans l'étude, soit il ne peut pas être soigné, alors sa manipulation sera arrêtée et nous procèderons à sa mise à mort. Dans le cas où l’animal présente trois ou plus des signes cliniques ou si il perd plus de 15% de son poids initial, nous procèderons à sa mise à mort.
Choix des espèces
Les gerbilles sont un modèle largement utilisé pour étudier le système auditif. La sensibilité des gerbilles aux faibles fréquences, importantes dans la perception de la parole, est similaire à celle de l'homme. De plus, l'audiogramme des gerbilles est similaire à celui de l'homme. Les gerbilles seront utilisées à l'âge adulte. Elles seront commandées âgées de 42-48 jours (6-7 semaines) qui correspond à l'âge adulte (ni en croissance ni en vieillissement). puis habituées à leur nouvel environnement pendant 2-3 jours avant de débuter les pesées quotidiennes afin de les familiariser. Les expérimentations (injection/chirurgie) ne commenceront donc au minimum qu'une semaine après réception.
Évaluation de nouveaux radiotraceurs ou candidats-médicaments pour l’ischémie périphérique.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Anesthésiées pour une chirurgie de quarante minutes qui interrompt la circulation dans l'artère fémorale d'une patte, 1 380 souris passent ensuite par cinq à six imageries laser doppler et cinq imageries isotopiques pouvant durer deux heures, étalées sur 21 jours. Une partie reçoit en plus des injections abdominales ou des gavages, jusqu'à deux fois par jour pendant trois semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur énumère les atteintes possibles : douleur, œdème douloureux du membre, infections, incapacité à se servir de la patte, irritations de l'œsophage liées au gavage. Celles qui vont au bout sont tuées pour prélever leurs tissus, et 88 souris qui n'auront pas perdu la vascularisation de leur patte pourront être réutilisées dans un autre projet.
Objectifs
La maladie artérielle périphérique (MAP) se définit comme un blocage partiel ou total d’une artère causé par une accumulation de lipides dans la paroi des vaisseaux artériels se situant en périphérie de l’aorte. Elle est généralement provoquée par un durcissement des artères (athérosclérose). La MAP représente un problème majeur de santé publique dans les pays développés. Malgré les progrès réalisés dans la prévention des facteurs de risque (tabac, diabète, obésité…) et dans les techniques interventionnelles et chirurgicales (pontage, stents…) pour améliorer la perfusion des membres inférieurs, une partie importante des patients atteints sont considérés comme « non répondeurs » pour la revascularisation et ont un pronostic particulièrement défavorable avec des taux élevés de mortalité et d’amputation des membres. En conséquence, l’identification de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter cette complication invalidante est d’un intérêt critique. Le but de ce projet est d’évaluer soit de nouveaux radiotraceurs qui permettraient un meilleur suivi ou détection des processus de réperfusion (recrutement des petits vaisceaux autour ou créations de nouveaux vaisseaux permettant la revascularisation du membre inférieur), soit d’évaluer l’efficacité de nouveaux candidats-médicaments sur un modèle murin d’ischémie de la patte par arrêt de la circulation dans l'artère fémorale de la patte.
Bénéfices attendus
Le diagnostic et le traitement précoces, ainsi qu’un suivi rigoureux, contribuent à améliorer la qualité de vie des patients en réduisant les symptômes associés et en augmentant l’efficacité des traitements. L’utilisation de nouveaux traceurs permet de détecter le site d’ischémie et facilite la prise en charge rapide des traitements, en augmentant les chances de bon pronostic des patients. Les traceurs développés grâce à la recherche en imagerie médicale offrent une précision supérieure dans la détection du site ischémique. Cela permet aux médecins de cibler plus précisément les zones affectées, réduisant ainsi les dommages aux tissus sains environnants.
Procédures
Les animaux auront : une chirurgie (1 fois, durée 40 minutes max, sous anesthésie générale), des imageries laser doppler (5 à 6 fois sur 21 jours, durée :5 min ; sous anesthésie général), des imageries isotopiques (5 fois sur 21 jours, durée maximum 2h ; sous anesthésie). Une partie des animaux auront également des injections de médicaments soit par injections abdominal soit par gavage (maximum 2 fois pas jours pendant 21 jours , durée en moyenne 1 à 2 minutes, sur animal vigile en contention) et certain auront des prélèvements sanguins au niveau de la queue (2 fois maximum, sous anesthésie, 2min).
Impact sur les animaux
Pendant les procédures décrites dans cette saisine, les animaux sont passibles d’expérimenter ce qui suit : • Douleur et inconfort : la chirurgie pourra provoquer une douleur due au manque d'oxygène et de nutriments dans les tissus affectés. Cela peut aussi entraîner une diminution de l'appétit chez l'animal, conduisant à une perte de poids et à une augmentation du stress. Les traitements réalisés sur les animaux vigiles peuvent entrainer un stress dû aux contentions répétées de l’animal ainsi que des irritations de l’œsophage et des problèmes de déglutition dans les cas des gavages. Les traitements répétés par injections peuvent entrainer des petites plaies cutanées. • Problèmes circulatoires et œdème : le manque de circulation peut entraîner une accumulation de liquide dans les tissus, provoquant un gonflement douloureux et une altération de la fonction des membres affectés. • Infections : en raison de la chirurgie, les tissus ischémiques sont plus sujets aux infections en raison de la réduction de l'apport sanguin et de la réponse immunitaire locale ; ça peut entrainer aussi une dégradation de la peau et du pelage dans le cas des infections cutanées. • Difficulté de locomotion : les animaux dont la patte n'est plus correctement vascularisé peuvent présenter une difficulté ou une incapacité à utiliser leur patte. Cela peut réduire leur capacité à se déplacer librement ou à chercher de la nourriture. • Les anesthésies gazeuses répétées peuvent entrainer des difficultés respiratoires lors de l’anesthésie, ainsi que des difficultés d’endormissement et de réveille au cours du temps.
Devenir
Tous les animaux qui iront au bout des procédures seront mis à mort de afin de récupérer les tissus d'intérêts et de pouvoir compléter l’études avec des expérimentations ex vivo et in vitro. Les animaux qui n'auront pas développé de perte de la vascularisation de la patte et qui seront sortis du projet en bonne santé pourront être réutilisé dans un autre projet.
Remplacement
Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent l’utilisation de modèle complexe. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative in vitro ou in sillico qui permet d'avoir une vision complète des grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’Homme. L’ensemble des candidats radiotraceur et des candidats médicament, qui seront testés dans ce projet, auront été préalablement évalués pas des études in vitro pour leur ciblage spécifique et leur efficacité.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé aux maximums tout en assurant des résultats statistiquement exploitables, nous avons calculé les effectifs à l’aide d'un logiciel de statistique G*Power. Pour l’évaluation de nouveaux traceur radioactif, le marquage spécifique dans la patte avec le blocage artériel sera comparé avec la patte en controlatérale (saine), chaque animal sera donc son propre contrôle. Pour la partie sur le développement de nouveaux candidat médicament, nous réaliseront sur 5 groupes distincts une série de 5 mesures répétées sur les mêmes animaux grâce aux imageries in vivo permettant de visualiser les traceur radioactif et permettant de faire des études longitudinales. Nous analyserons les données à l'aide de tests statistiques multiparamétriques.
Raffinement
Les chirurgies, les injections par voie veineuse et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal et un réveil rapide. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées, en plus de l’anesthésie générale, d’une analgésie locale et générale par injection sous cutanée de morphinique . Pendant une heure après la chirurgie, une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter toutes complications post- opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne sera permis qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Les périodes de traitements sur animaux vigiles seront précédées d’une semaine d’habituation à la contention pour diminuer le stress lors des expérimentations. Les gavages se feront avec sonde de nutrition vétérinaire adaptée aux souris. L’embout est arrondi pour ne pas endommager les parois de l’œsophage et de l’estomac et l’on attend que la souris avale le bout de la sonde (sans forcer) pour éviter les fausses routes. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour les prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieure à 20 % du poids initial, l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance inutile. Les conditions d’hébergement classiques ; animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et à l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12 h ; seront enrichies en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de bâtons ou boules en bois pour faire les dents, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypie.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. Le modèle d'ischémie des membres inférieurs chez la souris est bien documenté et a fait l'objet de plusieurs publications dans notre équipe. Notre modèle d’ischémie des membres inférieurs se fait chez le jeune adulte. Les animaux arriveront dans l’animalerie à 6 semaines (poids compris entre 25 et 35 g en fonction du sexe) et la chirurgie sera faite dans leur 8e semaine (poids compris entre 27 et 40 g). À la fin du protocole, les souris devraient peser entre 28 et 45 g.
Etude de nouvelles thérapeutiques innovantes dans le cadre des vascularites à anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rendues malades par des injections intraveineuses répétées sous anesthésie, les souris développent en dix jours une altération de leur fonction rénale. 1 360 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de l'étude pour évaluer l'évolution de la maladie. Il s'agit d'induire deux modèles de vascularite auto-immune, puis de tester des molécules censées remplacer des immunosuppresseurs que le porteur qualifie lui-même de lourds. Celui-ci affirme qu'aucun effet significatif sur le bien-être des animaux non-humains n'a été rapporté pour ces modèles, sans nommer les molécules testées ni le seuil de la grille de score au-delà duquel les souris sont tuées.
Objectifs
Les vascularites sont un groupe de maladies auto-immunes touchant les petits vaisseaux sanguins. Parmi elles, un sous-groupe se distingue par la présence d’auto-anticorps dirigés contre certaines cellules du système immunitaire. La prise en charge thérapeutique de ces vascularites est complexe. Elle repose sur l’instauration de traitements immunosuppresseurs « lourds » (phase d’induction), qui doivent être administrés le plus rapidement possible pour éviter les séquelles, mais il est essentiel d’être certain du diagnostic. En effet, les traitements actuellement disponibles entraînent de lourds effets indésirables, et un retard thérapeutique peut grandement impacter les chances de survie des patients. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux outils thérapeutiques pour enrichir l’arsenal thérapeutique disponible et permettre une meilleure prise en charge des patients, tout en diminuant les effets indésirables à long terme.
Bénéfices attendus
Les vascularites sont des pathologies complexes à traiter. Cette étude pourrait enrichir notre compréhension de la maladie et améliorer les options thérapeutiques en offrant un traitement moins invasif, pouvant être débuté plus rapidement pour réduire les séquelles. Un traitement plus spécifique pourrait également améliorer la qualité de vie des patients, diminuer le risque d’effets secondaires et, par conséquent, augmenter les chances de survie.
Procédures
Les souris seront prélevées pour des analyses sanguines une semaine avant le début de la procédure, puis deux fois au cours des deux semaines suivantes pendant l'induction de la pathologie. Afin de minimiser le stress lié à ces prélèvements, les souris seront sous anesthésie générale pendant le prélèvement sanguin. Les échantillons d'urine seront également collectés au même moment, en utilisant des souris vigiles et en les laissant uriner à leur convenance. L'induction de la pathologie sera réalisée selon deux modèles : Modèle 1 : L'induction se fera par une injection intrapéritonéale suivie d'injections intraveineuses sous anesthésie générale quotidiennes pendant trois jours. Modèle 2 : Ce modèle sera induit par une injection intraveineuse sous anesthésie générale, suivie, cinq jours plus tard, d'une autre injection intraveineuse sous anesthésie générale, puis d'une injection intrapéritonéale.
Impact sur les animaux
Les souris développeront progressivement une altération de la fonction rénale au cours des 10 jours d'induction de la maladie. Aucun effet significatif sur le bien-être ou le stress induit par ce modèle n'a été rapporté jusqu'à présent. Les injections intraveineuses répétées peuvent entraîner de la douleur ; ces injections seront donc réalisées sous anesthésie générale induite par isofluorane. Les souris seront ensuite soigneusement surveillées pendant leur réveil pour détecter toute réaction indésirable ou inconfort.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'étude afin d'évaluer l'évolution de la maladie et d'analyser l'impact des molécules testées sur cette dernière.
Remplacement
Les études réalisées dans des systèmes simplifiés ont démontré l’efficacité de ces molécules. Cependant, ces systèmes ne parviennent pas à reproduire la complexité des interactions cellulaires dans un organisme entier et ne permettent pas d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nos molécules dans un contexte aussi complexe que celui de la vascularite.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé en fonction du nombre minimum requis pour atteindre une puissance statistique suffisante. Ce calcul prend en compte l’hétérogénéité intrinsèque des modèles de maladies induites et la nécessité de répéter chaque cohorte au moins trois fois pour minimiser les biais expérimentaux. Pour éviter tout biais lié aux cages, les animaux seront aléatoirement répartis entre les différentes cages. De plus, des études pilotes seront réalisées pour les souris génétiquement modifiées afin d’évaluer leur pertinence dans les expérimentations et, le cas échéant, réduire leur nombre en cas de résultats négatifs.
Raffinement
Chaque cage sera équipée d'enrichissements, tels que des igloos en plastique, pour permettre aux souris de se cacher et d'améliorer leur bien-être. Les gestes techniques effectués sur les animaux seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté afin de minimiser la douleur et la souffrance. Par ailleurs, le bien-être des animaux sera régulièrement évalué par le personnel de l'animalerie à l'aide d'une grille de score spécifique. Cette grille permet d'évaluer la souffrance animale et, si un seuil critique est atteint, des soins particuliers seront fournis aux animaux. Si les niveaux de souffrance dépassent un seuil prédéfini, les animaux seront euthanasiés conformément à cette grille.
Choix des espèces
Les modèles de vascularites disponibles incluent les modèles chez les rats et les modèles murins. Nous avons choisi d'utiliser des modèles murins en raison de l'expertise de notre équipe et du personnel de l'animalerie dans ce type de modèle. De plus, l'un des deux modèles est déjà familier à notre équipe, ce qui facilite sa mise en place. Les souris seront utilisées après leur sevrage, entre 8 et 12 semaines après leur naissance, car les modèles d'induction de vascularite ont été validés pour ces animaux à cet âge.