Recherche appliquée

Pour tester une molécule pro-coagulante destinée à limiter les hémorragies cérébrales humaines, 36 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Une chirurgie d'une heure sous anesthésie générale leur provoque une hémorragie dans le cerveau, suivie d'IRM et de scanners à quatre, six et vingt-quatre heures, chaque examen exigeant une nouvelle anesthésie. Le porteur indique que les animaux se retrouveront désorientés, avec des déficits neurologiques moteurs et cognitifs. Il envisage de ne pas les réveiller après l'examen de six heures et conclut que, dans ce cas, "il n'y aurait pas de nuisance associée au réveil".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une atteinte neurologique soudaine, secondaire à une lésion vasculaire. On peut distinguer 2 types d’AVC : l’AVC ischémique ou infarctus cérébral (85% des cas), et l’AVC hémorragique (15% des cas). Les hémorragies cérébrales (HC) représentent 10 à 30 % des AVC, soit environ 25 000 nouveaux cas par an. Les HC sont à l’origine d’une très lourde morbi-mortalité, avec une mortalité précoce de plus de 40% à 30 jours dont la moitié des décès surviennent dans les 48 premières heures. Seuls 20% des patients seront autonomes à 6 mois. Le mauvais pronostic des hémorragies cérébrales est directement lié à la croissance de l’hématome ainsi qu’aux complications survenant à la phase aiguë (hypertension intracrânienne, hydrocéphalie aiguë et crises convulsives). L’objectif thérapeutique principal est de contrôler la croissance de l’hématome et ses complications neurologiques. Une grande proportion de patients atteint d’HC sont bien souvent sous traitement anticoagulant ce qui à pour conséquence d’augmenter considérablement la probabilité et la gravité de l'HC. L'une des principales raisons de ces mauvais résultats est que les patients sont tout simplement traités trop tard avec des agents d'inversion. Les thérapies actuelles nécessitent une prise d’information multifactorielle (identification de l'anticoagulant, calcul de la dose, poids du patient…), processus chronophage qui réduit les chances du patient. Ainsi, le projet propose d’évaluer une nouvelle molécule de première ligne ayant un mode d’action universel ne nécessitant pas d’identifier l’anticoagulant et dont la mise en œuvre est simple et rapide ce qui permettrait une prise en charge plus rapide du patient. Il est donc prévu d’utiliser cette molécule dans un modèle d’AVC hémorragique chez le porc en vue de passer ce nouveau traitement au plus vite en phase clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet à pour but de participer au développent d’une nouvelle molécule à visée clinique dans la prise en charge de l’hémorragie intracérébrale. Les travaux réalisés devraient permettre à l’industriel de valider le composé dans un modèle animal dont l'anatomie cérébro-vasculaire est proche de l’homme et ainsi augmenter le taux de succès des futures études cliniques.

Procédures

Les animaux auront une intervention chirurgicale induisant une hémorragie cérérale sous anesthésie générale d'une durée de 1 heure . Puis l'évolution de cette hémorragie sera suivi à l'aide d'outils d'imagerie médicale IRM (durée de 30 minurtes) et scanner (durée 15 minutes) à différents temps (+4h, +6h et +24h). Pour chaque examen d'imagerie l'animal est maintenu sous anesthésie générale . Ainsi il est prévu de réapliser les imagerie à +4h et +6h dans la continuité de la chirurige. L'animal ne sera donc pas révillé avant la fin des examens à +6h. Une seconde anesthésie sera alors nécessaire à +24h pour effectuer les examens d'imagerie sur une durée de 1 heure.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie d’induction de l’hémorragie intracérébrale ainsi que le suivi en imagerie post-AVC, les animaux se trouveront désorientés, avec des déficits neurologiques moteurs et cognitifs vecteur de stress. Pour cela une surveillance accrue des animaux sera réalisée sur les 24h post AVC. Il est également probable que le choix du temps d’évaluation soit inférieur à 24h, soit à +6h post AVC. Dans ces conditions, les animaux ne seraient pas réveillés de l’anesthésie générale et seraient mis à mort suite à l’examen d’imagerie médicale. Ainsi, il n’y aurait pas de nuisance associée au réveil.

Devenir

L'induction d'une hélorragie cérébrale provoquant des troubles neurologiques, il n'est pas prévu de maintenir en vie des animaux dont la qualité de vie soit trop impactée. Ainsi, il est prévu une mise à mort en fin de procédure.

Remplacement

Les études de développement de stratégies thérapeutiques nécessitent leur validation sur un modèle animal proche de l’homme avant un potentiel essai clinique. Cette étude se positionne dans la validation in vivo d’un nouveau traitement thérapeutique faisant suite à de nombreuses études in vitro. Il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux dans ce contexte

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au maximum afin de pouvoir conclure à un effet de la molécule testée et ce à l'aide d'une analyse de puissance statistique. Il est prévu d’utiliser des approches d’imagerie non invasives afin de faire un suivi de l’évolution de la pathologie à différentes phases post-opératoires et ainsi cibler la meilleure approche stratégique. Le nombre d’animaux nécessaire est néanmoins réduit et l’étude prévoit maximum 36 animaux, 6 pour la phase pilote et 30 pour l’étude principale. En fonction des résultats de la phase pilote, il sera également possible d’inclure les 6 animaux dans l’étude principale permettant de réduire d’autant les animaux de l’étude principale.

Raffinement

Au cours de cette étude, toutes les dispositions seront prises afin de réduire au maximum la souffrance et le stress et l’angoisse des animaux en accord avec les points limites identifiés pour ce projet. L’étude est menée par du personnel formé et expérimenté, sensible au bien-être et soins spécifiques des animaux. Une acclimatation à l’arrivée après transport du fournisseur est prévue (minimum 7 jours). Les animaux seront hébergés 2 par 2 pour favoriser les interactions sociales dans des boxes contrôlés en hygrométrie et température. Enrichissement et alimentation seront adaptés pour limiter les comportements anormaux (stéréotypies, prostration…) avec un suivi journalier des comportements individuels et alimentaires ainsi que des interactions sociales. Pour la chirurgie et le suivi en imagerie, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique. Les paramètres physiologiques (température, hydratation) seront contrôlés.

Choix des espèces

Les modèles d’hémorragies cérébrales ont été développés chez les rongeurs mais l’anatomie et la physiologie vasculaire du porc est plus proche de celle de l’Homme. En effet, les résultats d’une étude chez le porc apportent des informations plus probantes pour une utilisation ultérieure en clinique chez l’Homme, notamment pour les pathologies cérébrovasculaires. Pour ces raisons, nous avons choisi le porc comme modèle d’étude. De plus, le laboratoire a de l’expérience dans les manipulations chez le porc, les séquences d’imagerie sont connues et les installations sont ad hoc pour le bon déroulé des expériences. Les animaux seront utilisés à un stade jeune (autour de 4 mois, 35 à 40 kg). A ce stade, le cerveau a terminé son développement. Ce poids permet de concilier ses animaux à la manipulation et aux études d’imagerie.

Fournir à un établissement privé des brebis dont les ovaires ont été retirés, pour tester un dispositif intravaginal libérant un progestatif : 30 brebis sont ovariectomisées sous anesthésie générale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit ensuite cinq prises de sang, cinq collectes d'excréments et dix à douze trajets routiers de deux heures répartis sur deux ans, le porteur prévoyant de les réutiliser d'une étude à l'autre pour réduire l'effectif. Il écrit que les 30 brebis seront gardées en vie et que 10 seront replacées, quand le champ structuré du résumé ne déclare que ces 10 retours. Une brebis qui ne se nourrit plus pendant quatre jours ou qui perd du poids malgré le traitement est mise à mort, et le porteur note qu'une infection postopératoire peut entraîner abattement, fièvre et anorexie.

Objectifs

Le projet, qui se déroule dans 2 établissements utilisateurs, s’inscrit dans le plan de développement préclinique d’un produit pharmaceutique/zootechnique dans la sphère de la reproduction ovine. Ce produit est un dispositif intravaginal à libération longue d’un progestatif. L’objectif est de mettre à disposition des brebis ovariectomisées, pour des études de pharmacocinétiques visant à : 1) caractériser et sélectionner le meilleur prototype de dispositif intravaginal (le produit) en comparaison à un produit de référence (environ 3 à 4 études in-vivo préliminaires), 2) confirmer le profil et les propriétés pharmacocinétiques du dispositif sélectionné et/ou démontrer la bioéquivalence en comparaison avec un produit de référence (1 étude). La phase expérimentale de ces différentes études pharmacocinétiques (4 à 5 études sur 2 ans minimum) sera conduite dans un établissement tiers, situé à moins de 2 h du lieu d’hébergement des brebis. L’établissement dispose d’un comité d’éthique interne qui évaluera chaque étude utilisant les brebis ovariectomisées.

Bénéfices attendus

Le projet vise à développer un produit contenant un progestatif visant à synchroniser l’œstrus des brebis en saison sexuelle ou en contre saison. Actuellement il n’existe pas d’alternative dans la filière ovine à ce type de produit. L’utilisation de brebis ovariectomisées dans le cadre du développement préclinique d’un produit pharmaceutique/zootechnique dans la sphère de la reproduction ovine permet : - de s’affranchir des taux d’hormones endogènes liées au cycle de reproduction qui est saisonné. En effet pour suivre le profil pharmacocinétique des progestatifs utilisés dans les prototypes, il faut pouvoir les doser et donc ne pas être biaisé par les taux endogènes. – de pouvoir réutiliser les mêmes brebis sur l’ensemble des études pharmacocinétiques prévues car les études pourront être réalisées à n’importe quel moment de l’année, indépendamment de la saisonnalité des cycles de reproduction. - d’utiliser des designs d’étude en cross-over, en augmentant ainsi la puissance statistique et permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux à inclure par étude. – de pouvoir comparer les différentes études entre elles car les animaux seront réutilisés pour chacune d’elles (environs 4 à 5 études de pharmacocinétique en prévision).

Procédures

Toutes les brebis subiront dans l'E2 : une ovariectomie sous anesthésie générale (20 minutes); dans l'E1 : 5 prises de sang et 5 collectes de fécès (1 minute pour 1 prise de sang + 1 collecte de fécès), réparties sur 2 ans; et entre 10 et 12 trajets d’environ 2 heures à chaque fois, répartis sur 2 ans.

Impact sur les animaux

Au sein de l’E1, les nuisances attendues relèvent de pratiques d’élevage. Pour gérer de manière optimum le parasitisme, des coprologies de contrôles seront réalisées sur les animaux, pouvant occasionner une gêne transitoire lors du prélèvement de féces. Par ailleurs, dans le cadre des contrôles sanitaires pour les mouvements d’animaux entre l'E1 et l'établissement tiers, nous prévoyons des prises de sang, une après chaque test pharmacocinétique afin de garantir le statut sanitaire du cheptel en retour sur le site d’élevage. Les brebis peuvent éprouver un stress léger lors des contentions nécessaires pour les prises de sang. Une nuisance éventuelle serait l'apparition d'hématome suite aux prises de sang effectuées. Au sein de l’établissement E2, les nuisances attendues sont liées à la chirurgie ovariectomie. Le statut ovariectomisé n'entraine pas d'effet indésirable au cours de la vie de l'animal. Les animaux peuvent ressentir du stress lors des manipulations, de la phase pré opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible, ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthésie, une irritation de l’appareil respiratoire supérieur (liée à l’intubation) peut apparaître, mais c'est rare. Les animaux peuvent subir du stress lors des phases de transport entre les différents établissements.

Devenir

Les 30 animaux seront gardés en vie et retourneront dans l'E1 à l'issue du projet. 10 animaux seront replacés.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour déterminer les profils pharmacocinétiques in-vivo de différents actifs et/ou dispositifs sur l’espèce cible. L’utilisation de brebis ovariectomisées permet de s’affranchir des taux hormonaux endogènes et d’éviter les interférences avec le progestatif du dispositif. Le design en cross-over est accessible et permet de réduire le nombre d’animaux par étude car les animaux sont leur propre témoin et la puissance statistique est plus importante, permettant une meilleure comparabilité des différents prototypes, et des études entre elles. De plus, les brebis ovariectomisées vont être réutilisées à chaque étape du développement préclinique sur une période d’environs 2 ans minimum.

Réduction

Il a été évalué que 30 brebis ovariectomisées seraient nécessaires pour le développement de ce projet. En effet, dans chacune des premières études pilotes, qui vont permettre de choisir un prototype parmi 2 testés, 2 groupes de 12 brebis seront nécessaires (chaque groupe permet de comparer un prototype au produit de référence), soit un total de 24 brebis. Le développement de ce produit est basé sur le principe de bioéquivalence. Selon les bonnes pratiques il faut au moins 12 animaux évaluables par traitement pour que l’étude soit acceptable. Pour une étude pilote, ce nombre d’animaux pourrait être réduit à 10. Cependant, lorsque le risque de perte de sujets existe, on peut inclure des animaux supplémentaires pour maintenir une puissance statistique correcte. Ici, on ne peut négliger ce risque de perte d’animaux évaluables par traitement (perte du dispositif avant la fin de la période de pose). Une marge de 20% d’animaux supplémentaires est communément admise (10+2 soit 12 par groupe). Enfin, à cause de la forte variabilité interindividuelle des profils pharmacocinétiques de progestatifs, 12 animaux par groupe permettraient d’assurer une puissance statistique suffisante pour conclure dans les études pilotes. 3 animaux additionnels sont également prévus dans une étude PK pour couvrir toute problématique (échec d’administration, maladie…). Enfin, les brebis ovariectomisées seront réutilisées pour l’ensemble des études, donc en anticipant la perte possible d’animaux sur les 2 ans de développement, un nombre de 30 brebis ovariectomisées est nécessaire.

Raffinement

Au sein de l’E1, afin de prévenir tout stress, les animaux sont gardés en groupes sociaux stables, dans des conditions d’élevage optimales avec fourrages et concentrés de qualité, soit sur aire paillée avec enrichissement soit au pâturage. Les animaux seront supervisés par du personnel formé et habilité. Lors des déplacements entre les établissements, les animaux seront transportés selon les normes de bien-être en vigueur (densité, paillage…) dans un véhicule agrée conduit par du personnel habilité titulaire d’un captav. La durée de transport entre les sites est de 2 heures. Lors de leur arrivée dans l’E2, afin de prévenir tout stress, les animaux sont gardés en groupes sociaux stables, dans des conditions d’élevage optimales avec fourrages et concentrés de qualité et des locaux calmes. La douleur est traitée préventivement avant l’acte chirurgical dès l’anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu’à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l’état normal est estimé à 3-4 jours postopératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. Un animal anorexique, prostré, recevra l’administration de morphinique. Sans réponse physiologique satisfaisante, il sera procédé à l’euthanasie suivie du prélèvement du site lésionnel pour analyse. Tout animal qui ne se nourrit pas pendant 4 jours ou avec perte de poids par rapport au poids initial malgré le traitement sera mis à mort. Les animaux seront surveillés quodtidiennement sur les 6 paramètres suivants : 1/ s’alimente : oui-non 2/ Boit : oui-non 3/ se lève : oui-non 4/ reste figé : oui-non 5/ température en degré 6/ estimation de la douleur de 0 à 3 (0 aucune douleur et 3 douleur intense).

Choix des espèces

L’espèce ovine est l’espèce cible. La physiologie et la réponse hormonale des ruminants sont particulières à ces espèces. Le projet porte sur un dispositif de contrôle de la reproduction des femelles. Les animaux utilisés sont donc des brebis multipares (ayant mis bas au minimum une fois) et ayant terminé leur croissance et leur développement.

1 515 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à vingt échographies abdominales sous anesthésie de quinze minutes et dix prélèvements de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés avant la naissance ou sur des souriceaux de deux, cinq et quinze jours, pour déclencher un cancer du foie de l'enfant, d'autres animaux recevant une greffe de fragment tumoral au cours d'une chirurgie abdominale. Le porteur signale que l'usage d'animaux à des âges aussi précoces peut conduire la mère à les abandonner, voire à les manger. Toutes sont tuées à l'issue, pour une maladie qui touche vingt enfants par an en France et dont quatre sur cinq guérissent avec les traitements actuels.

Objectifs

L’hépatoblastome (HB) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. La survie globale à 5 ans actuellement est de 80 pour cent. Le traitement associe de la chimiothérapie à base de Cisplatine à une résection chirurgicale de la tumeur. Mais 20 pour cent des enfants traités vont développer une résistance au Cisplatine au cours de la chimiothérapie néoadjuvante ou au cours de la récidive de la maladie. Il existe actuellement peu d’alternatives thérapeutiques, avec des données insuffisantes sur les alternatives proposées. Il est donc crucial de pouvoir tester de nouvelles associations de traitement ou de nouveaux traitements. Les modèles pré-cliniques d’hépatoblastome qui existent aujourd’hui sont réalisés sur des souris nude, souris immunodéprimées, chez qui un fragment d’HB humain, ou des suspensions cellulaires issues de culture cellulaires d’HB sont implantés en sous cutané ou en situation orthotopique, c’est-à-dire directement dans le foie. Cependant le système immunitaire a un rôle primordial dans la réponse anti-tumorale. Il est donc très important de développer des modèles syngéniques d’hépatoblastomes chez la souris immunocompétente afin de pouvoir, une fois le modèle établi, étudier l’effet de nouveaux traitements et également étudier la réponse immunitaire impliquée dans la réponse anti-tumorale. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Notre équipe s’intéresse à deux grands types de tumeurs malignes du foie : les carcinomes hépatocellulaires (CHC) principalement développés chez l’adulte et les hépatoblastomes (HB) qui se développent chez l’enfant de moins de 5 ans. L’HB est une maladie rare mais c’est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. L'incidence est de 1 à 1,5 /1000000 d'enfant de moins de 15 ans, et cette incidence est en cours d'augmentation. Il touche 20 enfants par an en France. Dans le cas des HB, bien que la majorité des patients répondent aux traitements conventionnels, environ 20 pour cent sont réfractaires et décèdent. Les modèles de xénogreffes de lignées tumorales ou de greffes orthotopiques de tumeurs dérivées de pièces opératoires de patients représentent les modèles précliniques les plus pertinents actuellement pour étudier la réponse thérapeutique. Mais ces modèles sont développés chez des souris immunodéficientes et ne permettent pas d’étudier le rôle du système immunitaire. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, et notamment les mécanismes immunitaires, et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pouvant être bénéfiques aux patients réfractaires aux traitements habituels.

Procédures

Les animaux pourront être soumis, selon les cas, à l’un des gestes suivants : 1) une chirurgie abdominale ou lombaire pour injection dans le foie ou la rate (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (réalisé dans l'établissement utilisateur 1 (EU1), 2) injection percutanée (animal vigile, 1 fois maximum, 15sec) (EU1), ou 3) une chirurgie abdominale pour greffe d’un fragment tumoral dans le foie (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (EU1). L’ensemble des animaux seront amenés à avoir : des prélèvements de sang de faible volume (animal anesthésié, 10 fois maximum avec une intervalle d’une semaine minimum entre chaque, 1min) ; un suivi par échographie abdominale (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 min) (EU1) ; pour certains un transport dans un autre établissement afin d’effectuer une imagerie non invasive par IRM (animal anesthésié, 2 fois, 30 min) (réalisé dans l'établissement utilisateur 2 (EU2)). En fin de période de maintien les animaux seront anesthésiés, un dernier prélèvement sanguin (1 min) sera réalisé et ils seront immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues sont principalement celles engendrées par les procédures chirurgicales réalisées, qui peuvent engendrer une douleur au niveau de l’incision au réveil de l’animal et avoir une incidence sur l‘état général de santé de l‘animal (perte d‘appétit, baisse de l‘activité, infection de la cicatrice, détresse de l’animal dans les cas les plus grave), ainsi qu’entrainer une légère gêne dans la locomotion. Un risque anesthésique est également à prendre compte (détresse respiratoire, réveil intempestif). L’utilisation d’animaux à des âges précoces peut engendrer un abandon de la part de la mère, voir du cannibalisme dans le cas des nouveau-nés. Un stress de l’animal peut aussi être constaté lors des contentions, ainsi qu’un inconfort lors des injections. Le développement des tumeurs hépatiques est généralement asymptomatique et n’entraîne donc pas de nuisances en soit, car les animaux seront euthanasiés avant que les tumeurs entrainent une dégradation de l’état général des animaux. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance du fait du stress lié à la néophobie des rongeurs. Un risque anesthésique est également à prendre compte car l'IRM est effectuée sous anesthésie générale (détresse respiratoire, risque d'hypothermie, réveil intempestif).

Devenir

Le prélèvement des tissus d’intérêt étant nécessaire pour la réalisation de nos analyses, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin des procédures grâce à une méthode réglementaire, et dans le respect des bonnes pratiques.

Remplacement

Les modèles in vitro ne miment que partiellement la pathologie humaine car ils ne permettent pas de modéliser certains paramètres biologiques pouvant influencer le développement tumoral ou la réponse thérapeutique, tels que les interactions des cellules tumorales avec leur environnement ou encore l'hétérogénéité intra-tumorale. Il est donc essentiel de disposer de modèles in vivo reproduisant le plus fidèlement possible les caractéristiques de la pathologie humaine. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour mieux comprendre l'histoire naturelle de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Les effectifs ont été réduits au maximum et les groupes seront composés de 8 à 12 animaux. Cet effectif a été déterminé grâce à un calcul de puissance, afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en permettant d’obtenir des résultats suffisamment robustes, et les expériences pourront être réitérées jusqu’à 3 fois si nécessaire. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Afin de limiter au maximum les éventuelles variations entre les expériences, les paramètres d’hébergement et de soin des animaux seront contrôlés. Le suivi tumoral hépatique sera réalisé grâce à une méthode non invasive, l’imagerie par échographie et par IRM, ce qui diminue également le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d'animaux utilisés sur la totalité du projet s'élève à 1515.

Raffinement

Les paramètres d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Les cages seront enrichies avec du coton de nidification, des maisonettes en plastique ainsi que des batônnets à ronger. Les femelles gestantes seront regroupées à 2 par cages afin d’éviter leur isolement, et ne seront séparées qu’après avoir mis bas afin d’éviter la surpopulation au sein d’une même cage. Les animaux issus d’établissement fournisseur observeront une durée d’acclimatation de 7 jours minimum avant toute utilisation. Un change sera réalisé par le personnel de l’animalerie une fois par semaine (sauf indication contraire) et une surveillance quotidienne rigoureuse des animaux sera réalisée tout au long de leur vie. Des pesées seront également réalisées à intervalles réguliers et une grille de suivi est utilisée. Les procédures seront raffinées afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux (personnel formé et compétent, anesthésie et analgésie adéquate suite aux procédures chirurgicales puis surveillance rapprochée des animaux avec étiquetage spécifique des cages concernées), et des points limites précis seront établis. Si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, il sera immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire afin d’éviter toute souffrance animale. La Structure chargée du Bien-Etre Animal et/ou le vétérinaire pourront être sollicités pour conseil si besoin. Les transposrts des animaux entre l'EU1 et l'EU2 est assuré par un transporteur agréé, dans des boîtes de transport appropriées, ventilées, sécurisées et suffisament spacieuses. Un apport en nourriture et en eau gélifiée sera fourni durant le transport. Le temps de transport est de moins de 20 minutes entre les 2 EU.

Choix des espèces

La souris est un modèle expérimental de choix pour l'étude des pathologies humaines car c'est un petit mammifère qui se reproduit rapidement, est facile à manipuler, et dont nous avons une bonne connaissance du comportement et de la génétique. De plus, le génome de la souris est identique à plus de 95 pour cent à celui du génome humain, ce qui suggère une bonne homologie des mécanismes observés. On peut également facilement apprécier les modifications physiques et/ou comportementales traduisant une souffrance et/ou douleur, ce qui conduirait à l’euthanasie de l’animal. De nombreux outils moléculaires sont également disponibles chez ce modèle animal. La première procédure sera réalisée sur des femelles gestantes âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte et également à l’âge optimal permettant le bon déroulement de la gestation d’une part, et une bonne récupération de l’acte chirurgical d’autre part. Les vecteurs viraux seront injectés à différents âges (prénatal, 2, 5 et 15 jours de vie post natal), présentant un foie encore immature et en prolifération, afin de développer un hépatoblastome.

Les femelles de cette lignée transgénique peuvent mourir subitement à quinze mois sans signe annonciateur, seule nuisance du modèle que le porteur reconnaisse. 1 345 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Après une biopsie de la queue au sevrage, elles passent trois tests comportementaux à trois, six, douze et dix-huit mois, dont un test de mémoire en piscine étalé sur cinq jours, et une partie est transportée une à deux heures vers deux autres établissements pour des imageries cérébrales sous anesthésie. Le porteur détaille la répartition des mises à mort : 456 pour prélever le cerveau et l'intestin, 592 après les imageries, 297 couples reproducteurs ou animaux surnuméraires tués après avoir été inclus dans des études hors champ, le tout pour un futur complément alimentaire à base de polyphénols.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la démence la plus commune parmi les démences de la personne âgée où elle représente un peu plus de deux tiers des cas. L’âge est le principal facteur de risque de la maladie d’Alzheimer. En France, le nombre de personnes âgées de 65 ans ou plus et atteintes de la maladie d’Alzheimer serait compris entre 560 000 et 730 000 suivant les études. Même si la recherche reste très active pour cette maladie, aucun traitement n’est actuellement capable de modifier efficacement l’évolution de la maladie et la cause demeure toujours inconnue pour la forme la plus représentée dans la population. Des travaux récents soulignent le rôle du microbiote intestinal dans la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. La recherche de molécules capables de modifier le microbiote intestinal tout en prévenant d’autres altérations du système nerveux central observées chez le patient devient aujourd’hui une priorité pour de futurs traitements. Plusieurs études soulignent le rôle modulateur de certains polyphénols sur le microbiote intestinal pour avoir un écosystème bactérien bénéfique sur la santé humaine. Toutefois, l’interaction entre les polyphénols et ce microbiote est complexe et des recherches approfondies sont nécessaires pour valider cette cible périphérique dans la maladie d’Alzheimer. L'objectif de notre projet est d'étudier l'effet de plusieurs polyphénols sur l'évolution des troubles cognitifs dans un modèle de la maladie d'Alzheimer chez la souris. Trois établissements utilisateurs seront impliqués dans ce projet.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet conduira, à plus long terme, à la production d’un complément alimentaire visant à mieux vivre chez les personnes âgées.

Procédures

Dans l’établissement utilisateur EU1, les souris sont identifiées en posant une boucle d'oreille numérotée et les caractéristiques génétiques nécessaires à l'étude sont connues en réalisant une biopsie de la queue au sevrage. Les souris (1048) seront soumises à des tests du comportement pour évaluer les troubles cognitifs et moteurs liés au vieillissement physiologique et pathologique (Alzheimer) : au total 3 tests réalisés à 3, 6, 12 et 18 mois. Les tests de mémoire à court terme sont au nombre de 2, ils se feront respectivement 7 jours et 3 jours avant le début du test de mémoire à long terme. Chaque test de mémoire à court terme dure moins de 20 minutes. Le test de mémoire à long terme demande 4 jours d'apprentissage avec 4 essais par jour de 60 secondes espacés d'une heure. Le 5ème jour, la souris passe une seule fois le test sur 60 secondes. Durant tout le projet, les fèces seront recueillies 1 fois par mois. Les souris seront placées 5 min dans une nouvelle cage le temps du recueil de 3 crottes spontanées et retourneront dans leur cage d’origine. Dans un autre établissement utilisateur (EU2 à 1 heure de l’EU1), des souris (296) suivront deux imageries cérébrales pour évaluer le flux sanguin (30 min), l'inflammation et le métabolisme (60 min) qui nécessite la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie. Dans un autre établissement utilisateur (EU3 à 2 heures de l’EU1), d'autres souris (296) suivront une imagerie par résonance magnétique (30 min) après administration orale de glucose. Dans les deux EUs une anesthésie gazeuse, régulée sera réalisée sur tapis chauffant thermorégulé durant l'examen.

Impact sur les animaux

Inconfort transitoire lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse, associé à une douleur légère et transitoire liée à la pose de la boucle d’oreille et la biopsie. Tests comportementaux : stress léger et transitoire pour les tests de mémoire à court terme minimisé par l’habituation ; stress modéré et transitoire et sensation de froid légère et transitoire lors du test de mémoire à long terme avec des essais espacés d’une heure pour laisser le temps à la souris de se réchauffer. Concernant les protocoles d’imagerie dans l’EU2 nécessitant la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie, il est possible d’avoir les effets suivants sur 5 min maximum : Inconfort/douleur au niveau du site d’injection des agents de contraste ; Inconfort au niveau du site d’apposition de la sonde d’image ultrasonore ; Stress lié à la contention (imagerie) ; Stress lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse. L’imagerie au sein de l’EU3 est une technique non invasive. Cependant durant l’examen, un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé entre l’animal et le lit, peut subvenir, du fait de la variabilité inter-animaux, de la sensibilité aux anesthésiques. Cette nuisance entraînera l’arrêt de l’expérimentation. L’administration orale de glucose avant l’imagerie peut induire un stress et une souffrance et des blessures physiques si l’animal bouge mais cela est très rare car la canule utilisée sera en matière souple avec un bout arrondi et le geste sera exercé par une personne qualifiée. Aucune autre nuisance n’est connue sur ce modèle murin transgénique mise à part la mort subite à 15 mois chez les femelles sans signe annonciateur.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la demande d’autorisation de projet seront mis à mort avec la répartition suivante dans chaque établissement utilisateur : - EU1, 456 seront mises à mort pour le prélèvement du cerveau et de l’intestin en vue de réaliser des analyses biochimiques et de biologie moléculaire et d’étudier l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Les couples reproducteurs de plus de 6 mois et souris surnuméraires (297 au total)) seront mises à mort après inclusion dans des études hors champ. - 296 souris seront envoyées vers chaque établissement utilisateur EU2 et EU3 qui disposent de systèmes d'imagerie cérébrale indispensables à l'étude. Ces souris (592) seront mises à mort après les imageries pour des analyses biochimiques et de biologie moléculaire post-mortem.

Remplacement

Des études préliminaires in vitro ont déjà été réalisées pour étudier l’efficacité des polyphénols à une dose non toxique pour différentes cellules du cerveau permettant ainsi de définir les doses ciblées dans cette demande de projet. Ici, il est important de prouver les effets bénéfiques de ces polyphénols sur le vieillissement physiologique et pathologique Alzheimer mais aussi de s’assurer qu’elles n’ont pas d’impact délétère sur les fonctions physiologiques de l’organisme. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour juger de l’effet d’une nouvelle molécule à visée thérapeutique in vivo dans le cadre du vieillissement qu’il soit physiologique ou pathologique.

Réduction

Deux collaborations nationales sont envisagées dans ce projet et dans les deux cas il s’agit d’étudier les effets bénéfiques de polyphénols. Le fait de regrouper ces études sur la même demande de projet permet une réduction du nombre de souris. Par ailleurs, plusieurs paramètres sont mesurés chez une même souris, permettant ainsi de réduire encore le nombre de souris. Une souris permettra en final de générer des données aussi bien au niveau périphérique avec l’analyse du microbiote intestinal mais aussi au niveau cérébral. Enfin, le projet se déroulera par étapes. Si les résultats bénéfiques dans les étapes antérieures restent très faibles voire absents, des lots d’animaux ne seront pas inclus dans la suite du projet. Ainsi le nombre d’animaux indiqué est un nombre maximum. Pour estimer le nombre d’animaux par lot de souris, nous avons utilisé un calcul qui tient compte de la variabilité des réponses du vivant ; le nombre d'animaux par lot permettra d'obtenir des résultats robustes sur le plan statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en animalerie exempt de tout organisme pathogène spécifique et opportunistes (couples reproducteurs) ou tout organisme pathogène spécifique en respectant l’Arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles. Une période d’acclimatation de 10 jours minimum sera respectée avant l’introduction des souris dans une procédure. Pour diminuer les stress lors de la prise de l’animal pour les tests comportementaux, les animaux seront manipulés par préhension durant les 2 semaines qui précèdent les tests à raison d’une fois par jour. Pour le test comportemental en piscine, il est prévu de maintenir les souris dans ses mains en coupe posées sur une serviette (utile pour éponger l’eau) avant de les remettre dans leurs cages qui seront placées sur un tapis chauffant pour réchauffer les souris entre chaque essai. Dans les EU2 et EU3, les animaux seront hébergés en zone SPF en maintenant les interactions sociales des groupes de souris dans les sous-lots suivis dans l’EU1 avec une période d’acclimatation de 10 jours, température de 20-24°C, avec un enrichissement du milieu changé régulièrement (jouet en plastique : tunnel, igloo, maison). Pour diminuer les stress liés aux sorties des cages et aux contentions, les animaux seront régulièrement manipulés par le personnel en charge de l’étude. Le transport des animaux sera assuré vers les établissements utilisateurs collaborateurs par une société agréée pour le transport de rongeurs. Les cages seront réceptionnées par l’EU1 avant la date de transport pour permettre aux zootechniciens(nes) de prendre le temps de préparer les cages en incluant l’enrichissement, les gels hydriques en bonne quantité et l’alimentation nécessaire. Les anesthésies avec exsanguination seront réalisées sur tapis chauffant à température régulée. Toutes les anesthésies et analgésies prévues respecteront les résumés caractéristiques des médicaments utilisés (posologie). Pour les imageries dans les EU 2 et 3, du gel ophtalmique sera appliqué afin de compenser la sècheresse oculaire. Dans les 3 EUs, il est prévu une fois par semaine, une pesée des animaux avec l’utilisation d’une grille de scores et la mise en place de points limites gradés et d’actions en réponse à l’atteinte des points limites.

Choix des espèces

Dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, il existe différents modèles murins génétiquement modifiés. Le modèle choisi est largement utilisé dans la littérature et surtout présente une cinétique progressive des lésions comme chez l’homme contrairement à d’autres modèles murins plus agressifs. Pour ce modèle, il est donc aisé de faire des comparaisons avec les autres études déjà publiées. Les souris seront incluses dès l’âge de 3 mois, âge pour lequel aucun stigmate Alzheimer n’est détectable donc très intéressant pour définir les données basales avant tout traitement. Des lots de souris seront utilisés jusqu’à l’âge de 12 mois où la perte de mémoire est quantifiable ainsi que les caractéristiques biologiques de la maladie. D’autres lots seront suivis jusqu’à l’âge de 18 mois où la perte neuronale pourra être quantifiée ainsi que les autres paramètres déjà quantifiés à 12 mois pour voir leur évolution.

Après un transfert de cellules T qui déclenche chez elles une maladie auto-immune de la peau, 714 souris sont saignées sous anesthésie à J0, J7, J14, J21 puis J28, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La maladie provoque des érosions sur le museau, autour des yeux et des oreilles, sur le dos, la poitrine, l'abdomen, les quatre pattes et la queue, une perte de poils et un allongement des dents. Le porteur écrit que cette inflammation ne peut pas être atténuée, puisque la réduire modifierait le phénotype recherché. Toutes sont tuées à l'issue, pour mesurer dans leurs tissus le niveau d'inflammation et la réponse immunitaire.

Objectifs

Les maladies bulleuses auto-immunes sont un groupe de maladies inflammatoires chroniques de la peau rares avec des bulles et des érosions de la peau. Parmi ces maladies, le pemphigus vulgaire (PV) est caractérisé par la production d’auto-anticorps (auto-Ac) dirigés contre deux protéines desmosomales. Les traitements des formes modérées à sévères de PV sont efficaces, cependant, il y a environ 40 % de patients en rechute. Par conséquent, il existe un besoin médical non satisfait afin de prédire et de guérir les rechutes de PV. Les réponses Ac sont contrôlées par des globules particuliers appelés lymphocytes T. Nous avons observé chez les patients PV une diminution de ces cellules T après traitement corrélée à une baisse prolongée des auto-Ac.

Bénéfices attendus

Notre objectif est de tester le rôle causal et mécanistique des lymphocytes T dans la physiopathologie du PV à l’aide de modèles murins pré-cliniques de PV déficients pour la population de lymphocyte T afin de développer de nouvelles thérapies.

Procédures

Prélèvement sanguin à J0, J7, J14, J21 et J28 après transfert des cellules T afin d'évaluer la mise en place de la pathologie autoimmune de PV par mesure de la quantité d'auto-anticorps sérique. Les prélèvements de sang auront lieu sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie = 2 min). Nombre total d'interventions chez les animaux = 5.

Impact sur les animaux

Développement d'une pathologie équivalente au PV : erosion (Museau, Région périorbitaire, Région périoriculaire, Dos, Poitrine, Abdomen, Patte avant droite, Patte avant gauche, Patte arrière droite, Patte arrière gauche, Queue), alopécie (face, dos, cou et abdomen), allongement des dents avants

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin que nous prélevions et analysions dans les tissus le niveau d'inflammation et la réponse immunitaire dans le contexte du pemphigus

Remplacement

Les maladies inflammatoires chroniques cutanées sont des maladies multifactorielles complexes dans lesquelles plusieurs organes du corps jouent un rôle important (p.ex., les structures épithéliales, les organes lymphoïdes secondaires ou encore le système vasculaires etc). Ce projet est multidisciplinaire et vise à mieux comprendre le rôle des cellules du système immunitaire dans le contrôle d'un modèle murin mimant le PV. De ce fait nous devrons travailler avec des animaux vivants afin de pouvoir analyser le rôle des différents organes et différents types cellulaires suspectés d'être impliqués dans le développement de cette pathologie étudiée.

Réduction

Nous avons calculé que le nombre minimum pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement interprétables est de 7 souris/groupe et que les expériences seront reproduites 3 fois. Au total 10 lots experimentaux réalisés, ce qui correspond à 102 groupes experimentaux. Nous essayons d'effectuer le maximum d'analyse sur le même animal : analyse des tissus inflammés par histologie, analyse multiparamétrique en cytométrie en flux pour analyser la nature, le phenotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires

Raffinement

Les animaux seront attentivement observés après induction du PV. Le poids des animaux sera suivi et si les souris devaient perdre 20% de leur poids initial ou si nous observons des signes de douleurs apparentes, l'animal sera mis à mort. Les animaux seront placés dans des cages (5 souris par cage) avec enrichissement : igloo/maison, papier kraft pour nidification. L'objectif de ce projet est de tester de nouvelles approches thérapeutiques, donc l'inflammation induite ne pourra être réduite car elle impacterait le phénotype.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présentent de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.