Recherche appliquée

Des rats porteurs d'une mutation du gène DMD, à l'origine d'une dystrophie musculaire, reçoivent chaque jour pendant trois mois un composé par injection sous la peau ou par la bouche, et passent quatre fois un test d'agrippement et un électrocardiogramme. 80 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester ce composé déjà essayé chez des souris atteintes d'une forme légère de dystrophie. Le porteur décrit des rats "atteints de dystrophies sévères", aux "effets dévastateurs sur les muscles et le cœur", et les effets néfastes qu'il prévoit pour eux se résument à une griffe cassée pendant le test d'agrippement, un figement de quelques minutes et des réactions de la peau aux injections. Tous sont tués à l'issue, après une prise de sang sous anesthésie, pour des analyses histologiques et moléculaires.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont des myopathies génétiques rares qui touchent principalement les muscles et le cœur. La dystrophie de Duchenne est causée par des changements dans le gène DMD et touche surtout les hommes. Le gène DMD produit normalement une protéine appelée "dystrophine". Chez les patients, la quantité réduite de dystrophine induit une détérioration progressive des muscles, provoquant une faiblesse musculaire. La forme la plus sévère (absence complète de dystrophine) apparaît dès l'enfance et entraîne un déclin progressif de la mobilité et du fonctionnement cardiaque, fatale de façon prématurée. Jusqu'à présent, aucun traitement n'a été trouvé pour prévenir la maladie chez les personnes porteuses d'anomalies génétiques. L'objectif de notre étude est d'arrêter la progression de la maladie en utilisant de nouvelles substances qui empêchent la perte musculaire et améliorent la connexion entre les muscleset les nerfs qui déclenchent leur contraction. Il est attendu que ces substances contribueront à une amélioration de la contraction synchronisée des muscles et du cœur.

Bénéfices attendus

Notre laboratoire évalue des thérapies novatrices que nous testons sur des modèles aussi pertinents que possible. Le composé innovant étudié ici, dont l'efficacité a été démontrée sur un modèle de dystrophie légère chez la souris, sera évalué dans nos modèles atteints de dystrophies sévères, similaires à celles identifiées chez les patients. Ces dystrophies ont des effets dévastateurs sur les muscles et le cœur. Le composé innovant cible plusieurs mécanismes originaux qui, combinés, devraient limiter la perte musculaire et améliorer la connexion entre les cellules. Cela favorisera la contraction harmonieuse des muscles utilisés pour marcher, respirer et faire circuler le sang. Dans l'ensemble, nous espérons que l'administration de ce traitement chez les patients permettra de réduire la fonte musculaire qui les handicape.

Procédures

Avant le début de la procédure, chaque animal sera soumis à deux tests légers : un test d'agrippement et un électrocardiogramme (ECG), chacun durant respectivement 20 et 10 minutes. Ensuite, le traitement sera administré chaque jour sous la peau par injection ou par la bouche. L'administration dure 15 secondes. Un mois, deux mois et trois mois après le début du traitement, les animaux seront à nouveau soumis à un test d'agrippement et à un ECG. À la fin du traitement, soit trois mois après son démarrage, les animaux seront anesthésiés une ou deux fois par une injection sous la peau (20 secondes). Une fois endormis, les animaux se verront prélevés leur sang au moyen d'un geste de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Un effet indésirable du test d’agrippement est la cassure d’une griffe trop longue lors du saisissement de la barre. Les rats DMD peuvent exprimer une réponse aiguë de stress supérieure à la normale. Ils se figent pendant quelques minutes. Également, de possibles réactions de la peau consécutives aux injections multiples sur un même site.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Tout ce qui pouvait être testé sur l'efficacité des composés sans utiliser d'animaux a été réalisé avant le début de ce projet. Nous avons confirmé l'absence de toxicité des substances et de tous leurs métabolites chez les souris et les rats. Sur la base de ces résultats solides, notre objectif dans ce projet est de répondre à la question qui ne peut être abordée que chez l'animal vivant, avec tous ses organes en interaction constante : est-ce que l'action des substances innovantes testées permettra de ralentir efficacement la progression de la maladie musculaire ? Le cas échéant, par quels mécanismes moléculaires à l'intérieur des cellules ?

Réduction

Notre laboratoire a rassemblé une grande quantité de données à partir des modèles de rats utilisés dans ce projet. Nous avons perfectionné la correction des données avant de les analyser statistiquement. En se basant sur le calcul de la puissance statistique, il est recommandé d'utiliser seulement 8 rats par groupe. Ce nombre a été confirmé par d'autres projets similaires déjà terminés, pour lesquels des conclusions biologiques ont été obtenues. Pour nos analyses, nous employons des méthodes statistiques adaptées selon que nous comparons 2 ou 3 groupes d'animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des pièces avec contrôle continu de la température et de l'humidité de l'air ambiant. Le cycle d'éclairage des pièces respecte une alternance jour/nuit fondée sur les besoins naturels des animaux. Nous avons choisi de les élever dans les plus grandes cages disponibles sur le marché, leur permettant de marcher et de se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est adapté à l'évaluation de leur capacité locomotrice. Dans les cages, les rats ont un accès libre à la nourriture et à l'eau fournies à volonté. Les rats sont des animaux sociaux. Aussi, nous les hébergeons avec des congénères dans la même cage. Leur environnement est par ailleurs enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons en bois à ronger, des balles, des tunnels et des carrés de coton compacté. Pour éviter toute réponse de stress, les animaux sont habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, de la manière la plus douce possible. Le suivi des animaux est assuré par un personnel compétent capable de reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur chez les animaux. Nous avons établi une grille d'évaluation de la douleur, avec des points limites définis et affichés dans les pièces d'hébergement. Les rats sont constamment évalués en observant chaque individu, même les week-ends et les jours fériés. En cas d'anomalie, des mesures correctives sont prises. En cas d'absence de bénéfice suite au traitement prescrit, nous pratiquons une euthanasie compassionnelle. Elle permet d'éviter toute souffrance à l'animal.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère évolutivement proche de l'humain, ce qui en fait un modèle apprécié pour la recherche. Grâce aux récents outils de modification du génome, le rat est devenu un choix privilégié pour l'étude des troubles musculosquelettiques. Nos modèles de rats reproduisent fidèlement les myopathies humaines et sont appréciés en recherche médicale. Pour ce projet, les animaux utilisés seront âgés de 3 à 9 mois. À cet âge, l’impact de la maladie sur les muscles est détectable par des analyses de sang, de force, cardiaques et respiratoires. En utilisant des animaux de cet âge, il sera possible de conclure sur l’efficacité d’un traitement à un stade précoce de la malade.

Une injection d'huile minérale dans le ventre déclenche chez les souris de ce projet un lupus qui se développe ensuite sur huit à vingt-quatre semaines. 1 940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent jusqu'à dix injections intrapéritonéales en quinze jours et un prélèvement sanguin sous anesthésie, l'objectif étant de savoir si la suppression d'une cellule immunitaire rare, le basophile, freine la maladie. Le porteur écrit que ni douleur chronique ni souffrance permanente ne sont attendues et qu'aucun médicament contre la douleur n'est donc "nécessaire", tout en décrivant une maladie inflammatoire chronique entretenue pendant six mois.

Objectifs

Le projet a pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares (les basophiles) dans l'amplification des facteurs responsables d’une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (LES). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans ce but, des souris génétiquement modifiées au niveau des cellules d’intérêt seront utilisées pour évaluer l’importance de ces cellules et de leurs protéines dans le développement et le maintien de la maladie. Le projet a également pour objectif d’étudier l’efficacité thérapeutique de la suppression de ces cellules dans un modèle murin de la maladie afin de pouvoir développer l’approche chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du LES et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cellules d'intérêt comme cible thérapeutique dans le lupus permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les basophiles et/ou les mécanismes décrits. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de Lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.

Procédures

Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : des injections dans le ventre (« intrapéritonéales »), des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) et certains seront soumis au prélèvement d’un petit volume de sang (0.1 mL) une seule fois sous anesthésie générale. Chacun des gestes réalisés durent moins de 30 secondes. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale une seule fois dans le but d'induire la maladie étudiée. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale cinq fois sur une période de 8 ou 24 semaines: une fois dans le but de d'induire la maladie étudiée et 4 fois dans le but d'éliminer les cellules étudiées sur une période de 10 jours. Ces dernières souris auront un prélèvement sanguin sous anesthésie générale une seule fois avant d'éliminer les cellules d'intérêt la première fois. Cela nous permettra de comparer les paramètres sanguins de la maladie avant et après élimination des cellules. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale de huit à dix fois sur une période de 15 jours dans le but d'étudier l'effet de l'élimination des cellules d'intérêt dans un modèle de vaccination.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables induits sur les animaux sont de deux catégories. La première catégorie concerne le stress et les douleurs brèves induites par la contention manuelle des animaux, les injections intrapéritonéales multiples et les prélèvements sanguins (une seule fois) sous anesthésie générale. La deuxième catégorie concerne l’induction d’une maladie inflammatoire chronique (le lupus) par l’injection d’une huile minérale (pristane) dans le péritoine (le ventre) des souris. Cette huile peut induire, chez un faible pourcentage de souris, une difficulté respiratoire sur 2-3 jours, 2 à 3 semaines après l’injection. Après ce stade, la gêne disparaît. Les souris seront suivies de très près pendant cette phase pour s’assurer qu’aucune ne développe une forme respiratoire grave. La maladie induite (lupus) se développe alors sur une période de 8 à 24 semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'en analyser différents organes. La mort sera confirmée par vérification de l'arrêt cardio-respiratoire.

Remplacement

Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des systèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.

Réduction

L’étude de cellules humaines ex vivo (en dehors de l'organisme) et l’analyse des échantillons de patients a permis de réduire les hypothèses de travail et ainsi de limiter le recours aux modèles animaux. Les souris contrôles des procédures seront également utilisés pour réaliser des cultures cellulaires et des expériences in vitro après leur mise à mort. Les échantillons des souris chez lesquelles la maladie a été induite serviront de contrôles positifs pour des expériences ultérieures. Le but est de valider nos approches thérapeutiques afin de pouvoir les développer pour la pathologie humaine. Le nombre d’animaux qui seront utilisés est réduit au minimum mais est suffisant pour pouvoir obtenir des conclusions scientifiques solides.

Raffinement

Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les procédures du présent projet. Aucun médicament contre la douleur n'est donc nécessaire. Tous les animaux seront observés quotidiennement par le personnel compétent de l'animalerie. Afin de réduire au minimum le stress et la douleur qui pourraient être ressentis par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions : Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents infectieux. L’enrichissement de l’environnement des souris dans les cages (cotons pour construire des nids, maisonnettes en plastiques pour se cacher…) permet d’optimiser le bien-être des animaux. Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures). Les animaux devant être prélevés d'un peu de sang pour des analyses le seront après une brève anesthésie générale. Différentes actions seront mises en place allant de l’ajout de nourriture dans la cage à l’euthanasie anticipée de la souris. Les procédures dureront 24 semaines maximum pour notre modèle induit (souris âgées de 32 à 36 semaines au maximum en fin de procédure). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour analyse des paramètres de la pathologie. Aucun animal ne sera réutilisé dans des expériences ultérieures. L’état général des animaux chez qui la pathologie est induite sera suivi sur une grille de score permettant de s’assurer que l’état des animaux n’est pas altéré. En cas d’altération trop marquée, les animaux concernés seraient euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris) est le seul modèle de mammifères disposant des animaux modifiés génétiquement pertinents pour les objectifs scientifiques de notre projet ayant trait au lupus. Toutes les souris entreront en procédure à l’âge adulte (minimum 8 semaines d’âges) et seront analysées au maximum à 36 semaines d’âge.

Nées avec une mutation qui bloque la dégradation du céramide, les souris de ce projet ont une espérance de vie de 100 jours et développent dès trois semaines un retard de croissance, un gonflement du foie et de la rate et une faiblesse musculaire qui leur rend l'accès à la nourriture difficile. 1 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des vecteurs viraux censés apporter une copie fonctionnelle du gène ASAH1. Chaque mois, elles subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie au sinus rétro-orbital ou à la mandibule, une mesure de conduction nerveuse de vingt minutes et une heure trente d'observation de leur activité, avant un prélèvement terminal de muscles et une perfusion de fixateur par le flux sanguin. Les souris qui héritent de la mutation partent toutes en expérimentation puis sont tuées, celles qui n'en héritent pas sont mises à la reproduction pour entretenir l'élevage ou tuées faute d'usage.

Objectifs

La maladie de Farber et l’amyotrophie spinale associée à une forme d’épilepsie progressive myoclonique (SMA-PME) sont deux maladies génétiques rares causés par des mutations dans le gène ASAH1. Ce gène produit une enzyme appelée céramidase acide, qui décompose une substance appelée céramide dans les cellules. Lorsque ce gène est défectueux, l'enzyme ne fonctionne pas correctement, entraînant une accumulation toxique de céramide dans les cellules. Ces maladies affectent principalement le système nerveux et d'autres tissus du corps. Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif pour ces maladies. Notre projet vise à développer une thérapie génique pour traiter le déficit en céramidase acide. Pour cela, nous utilisons de virus modifiés appelées AAV comme transporteurs pour introduire une version correcte du gène ASAH1 dans les cellules des patients. Nous avons testé cette thérapie chez des souris modèles représentant la maladie de Farber. Deux méthodes d'injection ont été explorées : l'injection dans tout le corps et l'injection directement dans le cerveau. Les deux méthodes ont montré une amélioration de la survie des souris et une correction des symptômes de la maladie. Cependant, l'utilisation de ce vecteur à des fortes doses peut provoquer des altérations dans certains tissus après injection dans tout le corps. Par conséquence, l'objectif actuel de notre projet est de tester de nouveaux virus AAV qui ciblent plus efficacement les cellules malades. Cela nous permettrait de réduire la dose nécessaire pour obtenir un effet thérapeutique après injection dans tous les corps, minimisant ainsi les risques d'inflammation. Enfin, pour l’injection directe dans le cerveau il est important de confirmer si une telle méthode d’administration pourrait représenter une stratégie efficace pour traiter les formes du déficit en céramidase acide qui affectent principalement le système nerveux central et, secondairement, les autres organes.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier de nouveaux candidats médicaments et d’investiguer sur des défauts tissulaires dû à la maladie pour à terme apporter une solution thérapeutique adaptée aux patients qui aujourd’hui n’existe pas. D’abord nous allons investiguer sur la présence ou non d’une atteinte au niveau de la barrière hémato-encéphalique. Si cette hypothèse se révèle correcte, nous en tiendrons compte pour ajuster la conception des thérapies, y compris le choix du vecteur et la dose, afin de favoriser une distribution optimale du traitement. Par la suite, nous espérons choisir un vecteur AAV qui cible mieux les cellules affectées par la maladie. Cela nous permettrait d'utiliser une dose plus faible pour obtenir une correction complète, réduisant ainsi les coûts de production du produit et les effets secondaires liés aux doses élevées, comme observé lors des études précédentes. Enfin, nous aurons une vue plus claire sur l'efficacité de l'injection directe dans le cerveau comme méthode d’administration pour traiter les formes de déficit en céramidase acide qui affectent principalement le système nerveux central et, secondairement, les autres organes.

Procédures

Le prélèvement d’un petit bout de queue (2/5 mm) sera effectué sur des souris à la naissance ou à 15 jours de vie (5sec). L’administration des vecteurs AAV sera réalisé par voie intraveineux (15sec si volume ≤100 µL/20g; jusqu’à 1min si volume ≤ 250µL/20g) et par voie intra-cérébro-ventriculaire (ICV) (15sec). Afin d’évaluer l’efficacité du traitement lors des études, des tests fonctionnels pourront être réalisés chez des animaux vigiles : évaluation de leur activité tous les mois pendant 1h30 et analyse de leur force musculaire toutes les semaines pendant 10min. La force spécifique d’un muscle sera étudié chez d’autres animaux anesthésiés pendant 1h15 par animal une seule fois lors de l’étude. L’analyse de la transmission électrique entre les nerfs et les muscles sera réalisée chez des animaux anesthésiés pendant 20min tous les mois lors de l’étude. Chaque mois afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique, tous les animaux seront anesthésiés pendant moins de 5min pour réaliser un prélèvement de sanguin. En fin d’étude, des prélèvements de muscles (5min) ainsi que l’injection d’un fixateur par perfusion via le flux sanguin (5min) seront réalisés sous anesthésie générale et sans réveil pour l’animal.

Impact sur les animaux

La mutation dans le gène Asah1 chez la souris entraîne une accumulation toxique de céramide dans plusieurs organes de l’animale en accord avec les manifestations cliniques aussi décrites chez l’homme. Les animaux ont une espérance de vie de 100 jours, avec des symptômes apparaissant dès 3 semaines de vie : retard de croissance, gonflement du foie et de la rate, et faiblesse musculaire généralisée, rendant les déplacements et l'accès à la nourriture difficiles. Le test d'échappement peut causer une légère nuisance avec un pincement de la queue, provoquant rarement un léger saignement. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent occasionner une douleur légère liée à la piqûre.

Devenir

Certaines souris issues des croisements mais ne présentant pas de pathologie seront utilisées pour les accouplements nécessaires au maintien et à l'amplification de l'élevage. Les animaux issus des croisements mais ne présentant pas de pathologie et non nécessaires au maintien et à l'amplification de l'élevage seront euthanasiées. Toutes les souris présentant le phénotype pathologique seront incluses dans les procédures expérimentales et seront euthanasiées à la fin de la procédure expérimentale ou en cours de procédure si leur état de santé le nécessite.

Remplacement

Le modèle murin utilisé dans ce projet est le premier modèle pertinent publié dans la littérature qui récapitule les symptômes retrouvés chez les patients affectés par la maladie de Farber. Des modèles in vitro 2D existent, mais ils ne permettent pas d’étudier certains défauts majeurs de la pathologie, tels que l'infiltration de cellules immunitaires dans les organes cibles de la maladie. Les modèles in vitro 3D (ou organoïdes) ne possèdent pas à ce jour toutes les structures anatomiques spécifiques de chaque organe. De plus, on ne peut pas reproduire exactement la biodistribution du vecteur après administration dans le corps entier, ce qui limiterait les informations collectées pendant les études pour la transposabilité des résultats vers des études précliniques. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour cette étude.

Réduction

Le nombre minimal d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été déterminé à l’aide de calculs statistiques. Cela permet d’observer les différences entre les animaux sains et malades concernant la barrière hémato-encéphalique, d’étudier le potentiel thérapeutique de chaque vecteur testé et de maintenir les lignées tout au long du projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies avec du coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. Concernant les souris porteuses de la mutation pour le gène Asah1, des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 2 fois par semaine, en plus de l’observation quotidienne des animaux. De plus, un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès à la nourriture des souris malades. Afin de réduire la souffrance et le stress de ces animaux, des points limites ont été établis pour chaque procédure et manipulation. En cours du suivi du traitement, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie mandibulaire ou rétro-orbitale, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et le prélèvement sera au maximum du 10% de volume sanguin total de la souris. La méthode de prélèvement sanguin sera adaptée et réalisée au sinus rétro-orbital dans le cas où un processus de cicatrisation serait en cours (présence de croute, hématome, rougeur ou gonflement). L’œil sur lequel le prélèvement est effectué sera noté sur la fiche de suivi de l’animal afin de privilégier l’autre côté pour un prélèvement le mois suivant. Raffinement pour analyses fonctionnelles et prélèvement des muscles : afin de réaliser une mesure de force musculaire, l’animal recevra une injection d’analgésique en sous-cutanée, ce qui permettra de soulager les douleurs intenses éventuelles, et sera anesthésié par voie intrapéritonéale. L’animal sera également disposé sur un support chauffant tout au long de l’anesthésie.

Choix des espèces

Pour évaluer des stratégies thérapeutiques contre le déficit en céramidase acide, le modèle murin porteur d’une mutation dans le gène Asah1 a été choisi car il reproduit très fidèlement les symptômes de la maladie observées chez l’homme. Pour générer les animaux nécessaires à l’étude, les souris seront mises en reproduction entre l’âge de 8 semaines et 6 mois. Afin d’investiguer un défaut de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, les animaux contrôles et malades seront injectés à l’âge de 7 semaines et euthanasiés 8 jours après le traitement. À ce stade, la pathologie est suffisamment avancée pour déterminer si une altération existe et pour étudier les conséquences à court terme sur la capacité du vecteur à atteindre les régions touchées par la maladie. Lors de l’étude visant à identifier la combinaison vecteur-dose la plus efficace après injection via la veine de la queue, les souris seront traitées à l’âge de 7 semaines. Pour évaluer si l’injection directement dans le cerveau de vecteurs sélectionnés peut prévenir l’état inflammatoire dans le système nerveux central ainsi qu’au niveau des tissus périphériques pour les formes les plus sévères et précoces de la maladie, les animaux seront traités le jour de leur naissance.

Classer des reproducteurs restés en pisciculture selon la résistance de leurs collatéraux à la chaleur : 3 600 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont maintenues trois mois dans une eau chauffée entre 19 et 20 °C, puis soumises à deux pics à 24 °C pendant 24 heures à une semaine d'intervalle. Le porteur attend de la léthargie et une faible prise alimentaire, indique que la mortalité n'est pas le résultat principal recherché sans l'exclure, et prévoit une mise à mort quand un poisson ne réagit plus aux stimuli. Les retombées annoncées mêlent la santé des poissons d'élevage et la réduction des pertes de production, les truites testées ne pouvant de toute façon pas retourner dans leur ferme d'origine pour raisons sanitaires.

Objectifs

La truite arc-en-ciel est un animal poïkilotherme (sang froid) dont la température corporelle varie avec la température de l’eau. Dans un élevage de truites, la température de l’eau est une variable très importante et la truite y est particulièrement sensible, en particulier lorsque celle-ci dépasse les 18°C. En effet, des conditions thermiques défavorables limitent la croissance des animaux, provoquant des pertes économiques dans les élevages et les rendant de fait plus sensibles aux pathogènes. Les pertes en élevages liées aux vagues de chaleurs, bien que difficiles à estimer pourraient d’élever entre 3 et 5% de la production annuelle de 2022. Le projet s’inscrit dans une démarche d’amélioration de la résilience des truites aux aléas climatiques, et en particulier à la hausse des températures des rivières françaises. La sélection génétique est un levier intéressant permettant, sur la base de l’évaluation des caractéristiques individuelles de résistance à la température d’une population d’animaux, de mettre en place des plans de croisement visant à augmenter progressivement la robustesse des animaux des générations suivantes. Une précédente étude a d’ailleurs démontré que la résistance à des concentrations faibles en oxygène dans l’eau ou à des températures élevées pouvaient présenter une variabilité génétique exploitable pour l’amélioration des cheptels. Le projet consistera à évaluer la résistance, la résilience et la croissance de cohortes de truites arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) dans des conditions contrôlées d’hyperthermie chronique, plus représentative de conditions estivales survenant dans les rivières.

Bénéfices attendus

Les retombées attendues sont une amélioration de la santé et du bien-être des poissons en élevage lors d’épisodes hyperthermiques, ainsi qu’une diminution de l’utilisation des médicaments qui seraient nécessaires suite à affaiblissement des animaux du fait des températures. A terme, la sélection d’animaux s’adaptant mieux à des conditions hyperthermiques permettra de réduire les mortalités et la souffrance animale liée à ces conditions estivales et également de réduire les pertes de production et financières qui en découlent.

Procédures

Les animaux seront maintenus à une température de 20°C pendant une durée de 3 mois. A la fin de cette période, ils seront soumis à 2 pics de température à 1 semaine d’intervalle pendant lequel la température sera augmentée à 24°C pendant une durée de 24h.

Impact sur les animaux

Le projet consiste maintenir des poissons dans une eau de rivière chauffée entre 19 et 20°C pendant 3 mois et à observer leur croissance. Des signes de léthargie et une faible prise alimentaire peuvent survenir aux cours de ces tests. La mortalité n’est pas le principal résultat attendu, d’autant que les températures cibles correspondent aux pics de températures estivales, mais elle n’est pas exclue pour autant.

Devenir

Il n’est pas prévu de réutilisation des animaux à l’issue des procédures. Par ailleurs, pour des raisons sanitaires, les animaux ne pourront pas retourner dans leur ferme l’origine. L’ensemble des animaux devra donc être mis à mort à l’issue des essais.

Remplacement

Il n'existe pas d'alternative in vitro pour ce projet. L'évaluation de la résistance d'individus à des modifications de milieu doit se faire sur des animaux vigiles capables de mettre en œuvre des systèmes de défense complexes (immunité).

Réduction

Le nombre de poissons utilisé est réduit au minimum requis par les méthodes d'évaluation génétique. En effet, les individus testés dans le projet servent à évaluer et classer leurs collatéraux restés en pisciculture. De ce fait, le meilleur compromis doit être trouvé entre un nombre faible de poissons testés et une classification précise de leurs collatéraux en ferme.

Raffinement

Une surveillance accrue des poissons est réalisée lors des essais. Des couvercles sur les bassins permettent aux poissons d'avoir une zone d'ombre et de se cacher. Au cours des tests, Les opérateurs pourront décider d’une mise à mort compassionnelle des poissons lorsque nécessaire (i.e. si le poisson ne réagit plus aux stimuli).

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est l’espèce piscicole la plus produite en France et les entreprises partenaires du projet produisent 95% des alevins de truites élevées en France. La truite est par ailleurs très sensible aux variations des paramètres altérant la qualité de leur milieu, et notamment aux températures d’eau supérieures à 18°C. Les animaux testés sont des juvéniles de poids moyen pouvant aller de 50 à 100g, leur petite taille permet de les étudier dans de bonnes conditions expérimentales.

Une tumeur hypophysaire est implantée par chirurgie stéréotaxique dans le crâne de chaque rat, avec une canule d'injection laissée en place pendant les soixante jours du protocole. 60 rats Wistar Furth vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils développent des symptômes d'hypertension intracrânienne quand la tumeur devient volumineuse, ressentent une gêne de type démangeaison à cause de la canule, et sont tués au soixantième jour pour peser les tumeurs et chercher des métastases par autopsie cérébrale. Le porteur qualifie cette chirurgie de "peu douloureuse" et les injections intratumorales de "non douloureux", en faisant valoir que les mêmes gestes se pratiquent chez l'être humain sous simple anesthésie locale.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier l’effet des analogues de la somatostatine sur le contrôle des tumeurs hypophysaires sécrétant l’hormone de croissance en fonction de la voie d’administration du traitement (voie orale versus traitement local intratumoral) afin de s’affranchir de l’obstacle que représente la barrière hémato-encéphalique

Bénéfices attendus

Si notre hypothèse de travail selon laquelle les analogues de la somatostatine donnés comme traitement des tumeurs hypophysaires sont relativement peu efficaces à cause de leur incapacité à pénétrer dans l'hypophyse à cause de la barrière hémato-encéphalique, les résultats de notre projet pourraient ouvrir la voie au développement d'une technique chirurgicale visant à délivrer la médicament directement dans la tumeur résiduelle et à améliorer les taux de guérison de ces patients. de guérison des adénomes somatotropes.

Procédures

Les animaux seront initialement soumis à une procédure chirurgicale (stéréotaxie) peu douloureuse (sous anesthésie générale gazeuse). A titre de comparaison, ces chirurgies stéréotaxiques sont réalisées sous anesthésie locale pure chez l'homme en pratique clinique courante en France. Les autres procédures comporteront des prises de sang bi-mensuelles (sous anesthésie générale gazeuse) ainsi que des injections bi-hebdomadaires sur la canule d'injection prévue à cet effet (non douloureux, mais anesthésie générale gazeuse de < 1 minute envisageable en cas d'angoisse de l'animal). Au total, chaque animal ne subira qu'une seule procédure chirurgicale initiale pour implanter la tumeur (20 minutes de chirurgie sous anesthésie générale), puis 3 prises de sang à 15 jours d'intervalle (10 minutes sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont principalement en lien avec les symptômes d'hypertension intracrâniennen lorsque les tumeurs deviennent trop volumineuses. Aussi, les animaux peuvent ressentir une gêne à type de démangeaison en raison de la canule intratumoral qui restera en place pendant toute la durée de l'expérimentation. Enfin, les injections hebdomadaires peuvent être source d'anxiété chez les animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, après 60 jours, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tumeurs hypophysaires obtenue pour les peser et les analyser sur le plan moléculaire. Aussi, une autopsie cérébrale sera réalisée à la recherche de métastases à distance.

Remplacement

L’utilisation de modèle animaux pour l’étude du développement tumoral dans son microenvironnement habituel est indispensable. L’effet de la somatostatine administré par voie systémique sur ces tumeurs est connu mais son effet après administration directement dans la tumeur n’est pas connu. Bien que les propriétés de la barrière hémato-encéphalique soient largement connues, il est indispensable de confirmer notre hypothèse dans un modèle préclinique avant d’envisager toute nouvelle procédure chez l’homme. Actuellement il n’existe pas de modèle préclinique non-animal fiable de cette barrière hémato-encéphalique.

Réduction

L'évaluation de l'effet des médicaments selon la voie d'administration nécessite de comparer le médicament à la fois à un placebo mais aussi à sa voie d'administration systémique habituelle (sous-cutanée) ce qui nécessite au moins 3 groupes. Idéalement, il serait utile de tester la voie d'administration en placebo la molécule et la voie d'administration, soit 4 groupes d'animaux. Néanmoins, on peut s'affranchir d'un groupe d'animaux si tous les animaux recoivent une injection locale et une injection sous-cutanée (de placebo ou de médicament), permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux en n'utilisant pas de 4ème groupe. D'un point de vue statistique, le nombre d'animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance statistique à partir des différences de survie moyenne observées entre les groupes d'animaux dans notre précédente étude de survie des animaux de notre modèle expérimental en fonction de leur exposition à un médicament anti-tumoral. Le nombre d'animaux nécessaire est estimé statistiquement à 19 par groupes. Le geste technique d'insertion d'une canule d'injection intra-sellaire étant nouveau, 3 rats supplémentaires semblent nécessaires à l'optimisation de la technique opératoire. Le nombre total d'animaux nécessaire s'élève donc à 60 animaux (19 par groupe + 3 de mise au point).

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ils seront maintenus par deux minimum dans chaque cage avec de l’enrichissement du milieu par copaux de bois et tunnel en carton. Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaitre les points limites. Les animaux ne subiront qu’une seule chirurgie au cours de leur vie et celle-ci sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Toute procédure pouvant engendrer une douleur (prise de sang, injection) sera également effectuée sous anesthésie générale gazeuse. Tous les animaux seront opérés et surveillés par les membres de l’équipe qui a mis au point le modèle expérimental de tumeur hypophysaire orthotopique, sont habitués à ces procédures et à la reconnaissance précoce des points limites des animaux. Les points limites surveillés par l'équipe sont les suivants : hérissement du poil, isolement, aggressivité, ralentissement, inconfort. En cas d'apparition d'un de ces signes clinique, une fiche individuelle sera réalisée de manière quotidienne et ous les animaux qui présentent un score supérieur ou égal à 6/10 seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le choix d'un modèle animal de rat repose l'absence d'autre modèle expérimental préclinique de tumeur hypophysaire orthotopique. En effet, des modèles d'adénomes hypoophysaires obtenues par modifications génétiques chez la souris ne permettent ni d'étudier ces maladies dans un contexte immunologique physiologique, ni d'étudier des pathologies hypophysaires sécrétantes, ces modèles se limitant à des adénomes non-sécrétant. De plus, les adénomes hypophysaires chez l'homme sont sporadiques dans plus de 95% des cas et les modèles génétiques ne correspondent donc qu'à de rares situations cliniques chez l'homme. Le choix de cette souche spécifique de rats (Wistar Furth) est en lien avec la seule lignée cellulaire immortalisée de cellules hypophysaires somatotropes (GC) qui provient de cette souche de rat. Plusieurs tentatives de reproduction de norte modèle dans des souches plus courantes (Wistar Wi et Han) ont été réalisées, sans succès. Les procédures expérimentales débuteront entre 8 et 12 semaines après leur naissance, âge qui correspond à la maturité sexuelle des animaux afin d’obtenir un environnement ostreogénique favorable au développement des tumeurs.

Irradiées pendant dix minutes pour vider leur moelle osseuse, puis injectées de cellules leucémiques dans la veine de la queue, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La maladie s'installe comme prévu et provoque au bout de quelques semaines amaigrissement, paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, prostration, déshydratation, hypothermie ou embolie pulmonaire. S'y ajoutent quatre prélèvements sanguins à la mâchoire, une ponction dans le fémur en cas de non-détection des cellules, sept jours de gavage ou cinq jours d'injections abdominales, et un prélèvement de sang au cœur sous anesthésie. Le projet vise à comprendre pourquoi la greffe de moelle échoue chez plus de 40 % des patients atteints de leucémie aiguë myéloïde, retombée que le porteur situe dans la conception d'immunothérapies futures.

Objectifs

Les leucémies aigües myéloïdes (LAM) sont des maladies affectant la moelle osseuse puis d’autres organes par la suite comme la rate ou le foie. Afin de freiner cela il existe le traitement par chimiothérapie qui peut permettre une rémission complète mais souvent va progresser vers une LAM récidivante réfractaire à de nouvelles tentatives de chimiothérapie. En plus de la chimiothérapie il est possible d’effectuer des greffes de moelle osseuse, provenant d’un donneur compatible. Ce traitement induit une réponse de la partie de l’organisme greffée (ici de la moelle osseuse) contre la leucémie (Greffon contre la leucémie, GVL) afin d’éliminer les cellules leucémiques résiduelles. Cependant, la greffe ne permet pas toujours de guérir le patient (i) lorsqu’il n’y a pas une réponse suffisamment forte de l’organisme contre la leucémie ou (ii) lorsqu’il y a une réaction de la partie greffée contre l’hôte. Le projet vise donc à comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse GVL dans les LAM. Pour cela un modèle a été mis en place, en injectant des cellules sanguines (ou blastes) leucémiques provenant de souris malades, suivi de lymphocyte T (globule blanc qui jouent un rôle dans la réponse immunitaire) reconnaissant les blastes (cellules immatures de la moelle osseuse qui peuvent se différencier). Nous avons pu valider la réponse bénéfique GVL dans deux modèles précliniques, de par l’amélioration de la survie des souris recevant cette double transplantation. Les deux modèles étant un modèle de souris ayant été irradié afin de « faire de la place » dans la moelle osseuse et permettre aux cellules leucémiques de s’y développer. Et un modèle avec des souris recevant des cellules leucémiques de patients. Après l’étude de nombreux gènes chez la souris, nous avons pu identifier des gènes qui modulent la réponse GVL dans les LAM. Nous souhaitons à présent les valider et les définir et en parallèle nous allons tester de nouvelles molécules qui pourraient améliorer l’efficacité de la réponse GVL.

Bénéfices attendus

L’effet thérapeutique de la greffe de moelle osseuse est compromis dans plus de 40% des cas de patients atteints de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec une réponse immunitaire s’appelant : greffon contre la leucémie (GVL) insuffisante. Une meilleure compréhension des différents mécanismes est donc indispensable pour concevoir des immunothérapies (traitements) rationnelles et efficaces pour un traitement à long termes des LAM. Notre projet se propose d’identifier et de caractériser les potentiels acteurs de l’effet GVL afin d’optimiser la réponse immunitaire contre les cellules leucémiques.

Procédures

Les animaux vigiles (c’est-à-dire non endormi) seront tout d’abord préconditionnés par irradiation (durée: 10 min maximum) pour éliminer les cellules de la moelle osseuse afin de pouvoir injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse de quelques secondes dans la veine de la queue. Des prélèvements de sang au niveau de la mâchoire de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) seront réalisés pour évaluer l’évolution de croissance tumorale et récolter du matériel biologique pour des analyses ultérieures. En cas de non-détection des cellules leucémiques dans le sang, nous ferons une ponction de cellules dans l’os du fémur d’environ 5 minutes ; les animaux étant placés sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux vigiles recevront un traitement journalier de durée variable selon le type de thérapie par voie orale en gavage (pendant 7 jours consécutifs; durée du gavage: 30 secondes) ou bien par une injection dans la cavité abdominale en intra-péritonéal (pendant 5 jours consécutifs; durée de l'injection: 15 secondes). Dans le cas de combinaisons thérapeutiques, il peut y avoir deux administrations par jour, par exemple gavage + injection intrapéritonéale. A la fin du traitement, 3 jours après, les souris seront anesthésiées et un prélèvement de sang au niveau du cœur (durée 3 min) sera effectué.

Impact sur les animaux

Lorsqu’ils sont traités avec les différentes molécules, lors de la greffe ou lors du suivi de prise de greffe (gavage, intra-péritonéal, intra-veineux), les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables (stress et/ou perte de poids). Une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne peut également survenir. De plus, la greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie ou encore d’embolie pulmonaire . Pour les injections intraveineuses, les anesthésies ou les prélèvements sous-mandibulaires les effets indésirables sont surtout l’introduction d’une aiguille. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité ou une embolie pulmonaire. Très rarement, il peut y avoir également apparition de masses tumorales solides, d’origines leucémiques, dans diverses localisations (organes, tête).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse et observer la réponse contre la leucémie des lymphocytes T (catégorie de leucocytes (globule blanc) qui jouent un rôle dans la réponse immunitaire.

Remplacement

Pour identifier les acteurs qui permettent une réponse contre la leucémie , des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèles in vitro permettant de récapituler de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme entier. Bien que certains modèles in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de compréhension, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement des cellules cancéreuses qui peut modifier leur comportement. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles animaux, ici chez la souris.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établit grâce aux études antérieures du laboratoire et notamment à l’utilisation de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites et d’établir d’une liste de différents points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux et le suivi clinique réalisé tous les jours, 4 semaines après la greffe des cellules leucémiques permettent de recenser les différents points limites.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller infiltrer des organes à distance. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.

Tester le candidat médicament d'un client, seul ou associé au sémaglutide : 30 souris mâles rendues obèses par quatorze semaines de régime gras chez le fournisseur vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de sang et d'organes. Chacune reçoit trente-cinq administrations dans le ventre, décrites comme source de douleurs aiguës, subit dix-huit pesées, deux sessions de mesure des dépenses énergétiques de soixante-douze heures et une mise à jeun de quatre heures. Elles sont hébergées seules pendant toute l'étude, le porteur reconnaissant que cet isolement constitue une nuisance pour un animal social. L'étude se limite aux mâles parce qu'inclure des femelles obligerait à doubler les effectifs, une seconde étude chez la souris femelle n'étant prévue qu'en cas d'efficacité constatée chez le mâle.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse, en administration seule ou combinée avec un autre composé anti-obésité déjà autorisé sur le marché (sémaglutide). Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament (Composé X) sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (18 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule, du composé X ou du composé de référence par voie intrapéritonéale (35 administration; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (2 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Prélèvements sanguins (1 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 5) Mesures de dépenses énergétiques (2 sessions de mesures de 72h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement de sang et d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins pratiqués à D-3, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieur et une crème à base de lidocaïne sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée (Buprénorphine).

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 18 semaines (25 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de pré-conditionnement au régime enrichi en graisse chez le fournisseur.