Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Modulation des niveaux de BIN1 et DNM2 dans le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
La queue plongée dans un bain-marie jusqu'à vingt secondes, les pattes posées sur une plaque chauffée jusqu'à trente secondes, la queue tirée par l'expérimentateur pour mesurer la force d'agrippement, la course sur tapis roulant puis sur cylindre rotatif : 720 souris passeront cette série de tests à six mois puis à un an. 1 246 souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth vont être utilisées au total, 1 104 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour analyse histologique. 584 reçoivent une injection de virus adéno-associés entre le premier et le vingt et unième jour après la naissance, et des femelles sont isolées une semaine pour que leurs ultrasons soient enregistrés. Le porteur écrit que ces lignées ne présentent aucun signe de douleur ni incapacité locomotrice, alors qu'il déclare lui-même 1 104 souris en gravité sévère.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles souris. La maladie se manifeste au début de l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par des repliements complexes des gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses et une vitesse de conduction nerveuse réduite. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression de deux gènes impliqués dans une voie de signalisation associée à la CMT pour tenter d'atténuer les symptômes associés aux anomalies de la myéline. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique ainsi que par l'injection de virus adéno-associés couramment utilisés dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre quelle(s) voie(s) de signalisation sont impliquée(s) dans le dévelopement de la CMT. Une meilleure connaissance des processus moléculaires permettra de mieux comprendre la maladie et potentiellement de proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.
Procédures
Pour réguler l'expression des gènes impliqués dans la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, une partie de nos animaux (584 sur 1246) sera injectée (durée d'injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés entre le 1er et le 21ème jour après la naissance A soix mois et à un an, 720 souris (dont 360 injectés avec des virus adéno-associés) seront soumises à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire, la coordination motrice, la sensibilité, ainsi que la conduction nerveuse. Pour évaluer la force musculaire, les souris sont placées sur la grille d'un dynamomètre et la force d'agripement sera mesurée. Pour évaluer la coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant et sur un cylindre rotatif. Pour évaluer la sensibilité, les queues des souris seront mises dans un bain-marie et la latence d'enlèvement de la queue sera mesurée avec une durée limite du test de 20 secondes. Les animaux seront également placés sur une plaque chauffée et la latence de réaction sera notée avant de sortir l'animal avec un temps limite de 30 secondes.Pour évaluer la conduction nerveuse, la mesure de l'activité électrique musculaire des animaux se fera sous anesthésie générale. Amendement. Nous isolerons les femelles pendant 1 semaine puis nous les mettrons en contact avec des femelles wt plus jeunes pendant 10 minutes durant laquelles nous mesurerons les ultra-sons émis par les animaux isolés.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons trois lignées de souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Au vu des phénotypes observés chez les animaux modèles âgés (et donc montrant un pourcentage plus important des repliements de la myéline), nous n’anticipons pas que nos modulations d'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée n'engendre de phénotypes plus grave qu’une diminution de la coordination motrice. Nous effectuerons néanmoins une étude des phénotypes dommageable sur ces animaux. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force musculaire, l’expérimentateur tire progressivement la queue de l’animal agrippé sur la grille du dynamomètre afin d’obtenir la force développée par la souris. Pour la coordination motrice, le fait de se déplacer sur un cylindre rotatif surelevé engenre du stress physique chez l'animal. Pour les tests de sensibilité, la chaleur ressentie par l'animal engendre un stress physique. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale. La chirurgie pour l’injection de virus adéno-associés au niveau du nerf sciatique sera réalisée sous une anesthésie générale, une antalgie en sous-cutané et en local sera réalisée avant et après la procédure. Amendement. Pour les tests de vocalisation, l'isolement des animaux pendant 1 semaine provoquera un stress de classe modérée mais l'isolement est le seul moyen de stimuler la vocalisation des femelles avant de faire le test.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin des procédures pour prélèvements d'organes pour des études histologique.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquée dans le développement de cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptomes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 8 souris par groupe pour l'étude de phénotypes dommageables et 15 souris par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats. Une première étude pilote sera réalisée à 6 mois avec un nombre réduit d'animaux. Nous effectuerons ensuite une étude de phénotypes dommageables et une étude histologique (8 animaux par groupe) à six mois. Nous réaliserons finalement une étude comportementale à 6 mois et 1 an tout en effectuant une étude histologique à 1 an (15 animaux par groupe).
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 5 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. La pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). En cas de douleur, et particulièrement après les injections intrathécales et intracérébroventriculaires, un analgésique pourra être administré et l’étude pourra être prématurément stoppée. La douleur sera évaluée à l'aide d'un score. L'étude sera stopée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure des nerfs est trop différente. D'une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation sur le bénéfice de la structure des fibres nerveuses, de la coordination motrice, de la sensibilité et de la vitesse de conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, nous injecterons des virus adéno-associés chez des animaux âgés entre 1 et 21 jours selon la voie d'administration choisie pour cibler les cellules de Schwann avant l'apparition des symptomes. Les défauts de myélinisation s'aggravent avec l'âge des animaux modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Nous voulons donc réaliser une première étude histologique à 6 mois, âge auquel 10% des fibres présentent des défauts de myéline chez les animaux modèles de la CMT. Nous réaliserons ensuite une étude comportementale suivie d'une étude histologique à 12 mois, âge auquel les animaux modèles de la CMT présentent des déficits de coordination motrice et de vitesse de conduction nerveuse.
Cibles cellulaires thérapeutiques dans une maladie du système immunitaire : le lupus
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Attrapées et immobilisées à la main pour recevoir jusqu'à cinq injections dans le ventre en quinze jours, certaines souris subissent en plus un prélèvement de sang sous anesthésie générale dont la cicatrisation prend vingt-quatre heures. 1 380 souris, dont une lignée génétiquement modifiée qui développe une pathologie lupique, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 900. Le porteur écrit que ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus, et qualifie lui-même de "dommageable" le génotype qu'il utilise. Toutes sont tuées en fin de procédure pour analyse des organes, ceux des souris témoins servant en plus à des cultures cellulaires.
Objectifs
Le projet a pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares (les basophiles et les éosinophiles) dans le contrôle des facteurs immunitaires responsables d’une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (LES). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans ce but, des souris génétiquement modifiées au niveau des cellules d’intérêt seront utilisées pour évaluer l’importance de ces cellules et de leurs médiateurs (des molécules qu'elles libèrent) dans le développement et le maintien de la maladie. Le projet a également pour objectif d’étudier l’efficacité thérapeutique de l'élimination de ces cellules ou de leur injection dans un modèle murin de la maladie afin de pouvoir développer l’approche chez l’humain.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du LES et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cellules d'intérêt comme cible thérapeutique dans le lupus permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les basophiles et/ou les éosinophiles et/ou les mécanismes décrits. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.
Procédures
Un génotype (gène absent dans une lignée de souris) dit dommageable (souris LynKO) est utilisé dans le présent projet. Ces souris développent une pathologie lupique légère mais cependant quantifiable. Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : 1- des injections dans le ventre (« intrapéritonéales ») qui induiront une douleur brève de piqûre. Ces injections sont aussi efficaces que des intraveineuses pour disperser le composé injecté dans tous le corps mais moins contraignantes pour les souris. 2- des contentions (souris attrapées et immobilisées dans une main) : cet acte induit un stress bref pour les souris, mais sont indispensables pour réaliser les injections. 3- certaines souris seront soumises à un prélèvement d’un petit volume de sang (0.1 mL) une seule fois sous anesthésie générale. Ce geste peut induire un léger inconfort pour la souris le temps que la cicatrisation de la veine soit complète (24 heures). Ce prélèvement permettra de comparer les paramètres sanguins de la maladie avant le traitement et à la fin de la procédure. Chacun des gestes réalisés durent moins de 30 secondes. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale cinq fois au maximum sur une période de 15 jours. Ces interventions seront réalisées dans l’attention et la bienveillance au bien-être animal autant que faire se peut.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables induits sur les animaux seront un stress bref et des douleurs brèves. La contention des animaux induira un stress bref passager chez les animaux. Les injections induiront une légère douleur de piqûre brève. Les prélèvements sanguins (une seule fois) peuvent induire un léger inconfort pour la souris le temps que la cicatrisation de la veine soit complète (24 heures).
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés en fin de procédure afin d'en analyser les organes d'intérêts.
Remplacement
Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des systèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.
Réduction
L’étude de cellules humaines ex vivo (en dehors de l'organisme) et l’analyse des échantillons de patients a permis de réduire les hypothèses de travail et ainsi de limiter le recours aux modèles animaux. Les souris contrôles des approches in vivo (dans l’organisme vivant) verront leurs organes utilisés pour des cultures cellulaires et des expériences in vitro et les organes des souris malades traitées ou non serviront de contrôles positifs ou négatifs pour des expériences ultérieures. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé en fonction des besoins du projet afin de pouvoir conclure scientifiquement. Le nombre d’individus à analyser par groupe d’animaux sera gardé au minimum autant que faire se peut.
Raffinement
Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'ils soient contaminés par des agents infectieux, avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et avec un contrôle de la température, du cycle jour/nuit et de l’humidité. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales pour atténuer tout stress, ne sont jamais isolés et sont toujours hébergés avec des accessoires d’enrichissements (cotons pour nidifier, jouets type maisonnette pour pouvoir se cacher). Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans le présent projet. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. La contention des animaux reste nécessaire aux injections par voie intrapéritonéale (dans le ventre) prévues ce qui engendrera un stress bref chez les animaux. Ces pratiques seront réalisées dans l’attention et la bienveillance au bien-être animal autant que faire se peut. Les souris seront observées quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être.
Choix des espèces
Les études d’une approche thérapeutique innovante sur un modèle de pathologie humaine doivent être réalisées sur des modèles animaux afin de justifier le passage aux tests chez l’Homme. Notre projet s’inscrit dans cet objectif et toutes les mesures permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés ainsi que les éventuelles souffrances subies par ces animaux seront entreprises. L’espèce Mus musculus domesticus est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 8 semaines (stade adulte). Tous les animaux seront utilisés avant 41 semaines d’âge pour éviter tout risque de souffrance des individus.
Traitement du syndrome gastro-intestinal radio-induit par thérapie cellulaire chez le porc miniature (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Tous mis à mort trente jours après l'irradiation, pour prélever leur intestin et en examiner la réparation, 22 porcs miniatures vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Sevrés depuis peu et pesant cinq à sept kilos, ils subissent une irradiation abdominale sous anesthésie, un prélèvement chirurgical de graisse, huit prises de sang et un transport entre deux établissements. Les symptômes attendus vont des crampes abdominales et des vomissements aux diarrhées hémorragiques et à la fièvre, le porteur indiquant que l'apparition des diarrhées signale des dommages sévères. Il situe le projet dans un contexte d'accident nucléaire ou d'"acte de malveillance" et invoque un "besoin crucial" de traitement d'urgence.
Objectifs
Ce projet se déroule sur 2 établissements. Il a pour objectif de proposer un nouveau traitement par thérapie cellulaire utilisant un produit issu de la graisse en cas de syndrome gastrointestinal (consécutif à une rupture de la barrière intestinale) induit par l’irradiation à la fois pour le militaire ou la population victime lors d’une urgence radiologique, d’un accident nucléaire ou d’un acte de malveillance. Ce traitement est basé sur l’injection d’un produit de thérapie cellulaire la «fraction vasculaire stromale (SVF)» obtenue par digestion de la graisse issue de lipoaspiration. Ce produit est une source riche en cellules de renouvellement, et facile et très rapide d’accès. Actuellement la prise en charge du syndrome gastrointestinal (SGI) ne reste que symptomatique. La rapidité d’apparition des premiers symptômes dépend de la vitesse de renouvellement des cellules constituant les tissus lésés mais aussi de la radiosensibilité des cellules souches. Chez l’homme, les doses supérieures à 6 Gy (Gray, unité de la dose délivrée) sur un large volume d'organes touchés induisent principalement une destruction de la moelle osseuse et des lésions gastro-intestinales, entraînant diarrhée, déshydratation, septicémie, hémorragie intestinale engageant le pronostic vital dans les 10 à 15 jours après l'exposition. Il existe un besoin crucial de mesures thérapeutiques efficaces et rapides pour la gestion du SGI. Il a été démontré que l’injection de la SVF avait un bénéfice thérapeutique objectivé sur plusieurs paramètres (reprise de poids, restauration de la barrière intestinale) et amélioration de la survie chez Ia souris. Ce projet est en synergie avec les nouvelles stratégies en termes de santé, à savoir l’utilisation de produit de thérapie cellulaire à des fins de régénération tissulaire. La SVF d’obtention rapide et ne nécessitant pas de temps de culture cellulaire préalable à son injection est actuellement en essai clinique et est compatible pour le traitement d’urgence dans les 24 heures après l’irradiation. L’objectif de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de la SVF sur le cochon pour un passage en clinique.
Bénéfices attendus
La preuve de concept a été établie que l’injection de cette thérapie cellulaire chez la souris atteinte de syndrome gastrointestinal améliorait la survie des souris de 80%. Actuellement de nombreux essais cliniques utilisant la SVF sont en cours (osteoartrite, diabète de type 2, maladie de Crohn...). Face à l’enjeu géopolitique (contexte d’accident nucléaire ou acte de malveillance) l’objectif de ce projet est de progresser vers la clinique pour le traitement en urgence du SGI.
Procédures
Sous anesthésie générale, seront réalisés : ->dans l'établissement utilisateur EU 1 : - une prise de sang à J-4 avant irradiation puis à J1, 3, 7, 10, 15, 21, et 30 soit 8 prélèvements (temps de prélèvement entre 5 et 10 min). - une chirurgie de prélèvement de graisse (temps de procédure 20min) suivi de l'injection de SVF (cellules issues de la graisse, 10 min. - des injections d'antibiotiques sont réalisées tous les 3 à 5 jours, au besoin, de préférence lors d'une intervention sous anesthésie générale, ou sur animal vigile. -> dans l'établissement utilisateur EU 2 : - une irradiation, une seule fois pour une durée de 10 min sous anesthésie générale. - un unique examen endoscopique de 30 min, au cours de cette même anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les cellules de la moelle osseuse sont détruites chez l'Homme pour des doses d'irradiation comprises entre 2 et 6 Gy et conduisant à un défaut d'immunité, défaut de production de plaquettes et de globules rouges. Le syndrome gastro-intestinal survient pour des doses supérieures à 6 Gy (corps entier). Les symptômes majoritaires sont des crampes abdominales et des diarrhées ainsi que des nausées et des vomissements. Des céphalées peuvent également apparaître. L’apparition des nausées, de la fatigue, des crampes abdominales, des vomissements est attendue entre 1 et 3 jours après l'irradiation. L’apparition des diarrhées indique des dommages sévères et peuvent engager le pronostic vital. De 1 à 6 semaines après l’exposition, peuvent survenir d’abondantes diarrhées hémorragiques, de la fièvre, des infections ou septicémies.
Devenir
Tous les porcs sont mis à mort à la fin du protocole à J30 post-irradiation pour des prélèvements tissulaires post-mortem d’intestin pour un examen de la réparation intestinale.
Remplacement
Le passage à la clinique nécessite des animaux autres que le modèle rongeur. Il a été montré que la physiopathologie du syndrome gastro-intestinal sur le porc est similaire à celle observée chez l’homme. La production de cellules issues des tissus graisseux (pour la production du traitement cellulaire) en quantité suffisante est un paramètre limitant, le choix s’est porté sur le miniporc qui est un porc de taille réduite permettant l’injection de cellules en concentration compatible avec leur préparation au sein d’un laboratoire de recherche. Le passage de cette étude en clinique nécessite d’utiliser des modèles in vivo. Le remplacement par des modèles in vitro n’est donc pas possible.
Réduction
Pour atteindre la pertinence statistique, les groupes des miniporcs irradiés et traités par la thérapie cellulaire sont classiquement constitués de 6 à 7 individus pour pallier les variabilités inter-individus des animaux et également de la thérapie cellulaire injectée et pour éviter ainsi d’avoir à renouveler plusieurs fois l’expérimentation. Le nombre d’animaux choisi pour ce protocole est nécessaire et suffisant pour exploiter d’un point de vue statistique les résultats obtenus. Les cochons seront leur propre donneur de graisse, étant donné que les injections de SVF ne peuvent se faire qu’en autologue dû à la présence de cellules immunitaires, ce qui limite le nombre de cochon. Des mesures de la numération formule sanguine seront effectuées à J-4 avant l’irradiation afin d’avoir des valeurs sanguines des cochons avant tout traitement.
Raffinement
Les cages d’hébergement seront enrichies en objets (balles en plastique au sol et au mur). Les paramètres d'ambiance dnas les hébergements sont contrôlés. Les animaux seront anesthésiés pour les interventions (irradiation, prélèvements sanguins) et mis à mort selon la réglementation en vigueur. Des points limites sont définis et seront appliqués pour mettre fin dans les délais les plus brefs à toute anomalie, toute douleur, toute souffrance, toute angoisse ou tout dommage durable qui pourraient être évités tout au long des procédures expérimentales. Les animaux seront acclimatés pendant 2 semaines (habituation à la présence et au contact de l’Homme lors du change des boxes, distribution de caresses et de morceaux de pomme), puis transférés dans des cages de transport avec tapis mou, par un transporteur autorisé sous anesthésie générale en voiture climatisée pour la procédure d’irradiation. Les porcs sont surveillés pendant toute la durée du transport (maximum 45 min). Puis ils retournent dans leur hébergement dans les mêmes conditions de transport (temps transport/irradiation estimé à 3 heures). Une surveillance quotidienne pendant toute la durée de l’expérimentation sera effectuée par les techniciens animaliers et basée sur la prise alimentaire, la présence des troubles digestifs (diarrhée), de la posture et du comportement (animal prostré) : - Pesée des animaux toutes les semaines pendant la durée de l’expérimentation - Les signes de douleur/stress sont définis comme une réduction de la consommation alimentaire et/ou la présence de troubles digestifs et déshydratation, modification des signes locomoteurs (prostration, ne pas remuer la queue, manque de curiosité, changement dans le schéma de vocalisation normal au toucher). Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et mis à mort. Lors des procédures sous anesthésies, les animaux sont suivis par monitoring cardiaque et respiratoire. Afin de palier à tout risque d’infection lié aux prises de sang et moelle osseuse les cochons reçoivent un antibiotique par voie intramusculaire à chaque intervention sur l'animal. De plus afin de palier au risque de vomissements lié à l’irradiation abdominale un médicament anti-vomissement sera donné avant l’irradiation.
Choix des espèces
Le passage à l’étape clinique nécessite des animaux de grande taille. Les signes cliniques du syndrome gastrointestinale sur le porc de taille réduite (de type miniporc) seront ceux observés chez l’homme. De plus le choix s’est porté sur le miniporc qui est un porc de taille réduite permettant l’administration de cellules en concentration compatible avec la capacité de leur production. Les animaux seront pris après sevrage (soit 2 mois post naissance). Etant donné que le nombre de cellules à greffer est fonction du poids de l’animal, il faut donc des animaux le plus jeune possible avec un poids proche de 5-7 kg environ pour pouvoir greffer environ 10 millions de cellules (quantité compatible avec la production à partir du prélèvement de graisse).
Création et maintien d’une lignée transgénique de poisson zèbre pour étudier une nouvelle mutation génétique impliquée dans une pathologie osseuse
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Amputés d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie, baignés deux nuits dans un colorant sans nourriture, anesthésiés chaque semaine pendant trois semaines pour des séances d'imagerie, 1 832 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Tous seront tués à la fin du projet. Les poissons porteurs de la mutation étudiée développeront des malformations du crâne et de la colonne, que le porteur annonce sans en faire un critère d'exclusion, l'objectif étant de vérifier qu'une mutation repérée chez des enfants de petite taille cause bien la maladie. Il présente pourtant le poisson comme permettant des approches "largement non-invasives", tout en indiquant que le prélèvement de nageoire à trois jours entraîne aujourd'hui une importante létalité.
Objectifs
En étudiant 400 enfants de petite taille, il a été identifié une nouvelle mutation génétique responsable d'une maladie caractérisée par une petite taille et des malformations du squelette de la tête. Si le rôle de ce gène dans le développement squelettique a déjà été décrit, il n'a jamais été associé à une maladie humaine. Le développement d'un modèle animal est indispensable à la fois pour confirmer la pathogénicité de cette mutation et pour déterminer les mécanismes responsable de cette maladie. Par conséquent l’objectif de ce projet consiste à l’établissement et à la caractérisation d’un modèle de poisson-zèbre exprimant cette mutation afin d’étudier l’impact de la mutation sur le développement du squelette de la tête.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux définir le rôle d'une protéine au cours du développement squelettique. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies entrainant des défaut de la croissance osseuse . La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des pathologies osseuses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Un prélèvement d'un bout de nageoire, sera réalisé sous anesthésie (1 minute) sera effectué sur certains poissons. Certains poissons seront baignés 2 fois dans un colorant pendant une nuit à chaque fois hors flux sans nourrissage Certains poissons seront imagés 1fois/semaine pendant 3 semaines (3 minutes environs). Certains poissons subiront une injection intrapéritonéale sous anesthesie (5 minutes maximum).
Impact sur les animaux
Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d'intérêt, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. D'autre part, les poissons au cours des différentes procédures subiront des stress relatifs 1/ aux anesthésies répétées lors de l’acquisition d’images hebdomadaires, 2/ aux colorations in vivo, 3/ aux isolements nécessaires pour les acquisitions d’images et pour le génotypage des poissons, 4/au prélèvement d’un fragment de 1mm de la nageoire caudale sous anesthésie générale et 5/ à une injection intrapéritonéale sous anesthésie générale.
Devenir
L'ensemble des poissons de ce projet seront mis à mort à la fin de ce projet car l’ensemble des analyses auront été réalisées soit au court des procédures soit seront réalysees en post mortem.
Remplacement
Le développement du squelette est un mécanisme complexe impliquant différent types cellulaires interconnectés. Son développement est une suite d’évènements influencé par de multiples paramètres physiologiques et environnementaux. De ce fait, il est pour le moment impossible de modéliser parfaitement son développement in vitro, et le recours à l’expérimentation in vivo reste incontournable. Néanmoins l'utilisation du poisson comme espèce modèle permet cependant des approches largement non-invasives sans nécessité d’intervention chirurgicale.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour chaque manipulation est basé sur notre expérience au laboratoire. Ce nombre a été pour chaque protocole déterminé afin d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour l’obtention de résultats significatifs en prenant compte de la variabilité de la croissance des poissons observé au cours de précédents projets du laboratoire. Selon l'expérience, les tests d'ANOVA, de Mann Whitney et de Student seront réalisés. Au cours de la procédure 3 afin d’une part d’augmenter la puissance statistique et d’autre part de réduire le nombre d’animaux utilisé, les acquisitions d’image seront réalisées sur le même animal à différents temps. Nous mettons en place actuellement le prélèvement de la nageoire des poissons pour génotypage à 3 jours post fécondation au sein de l'animalerie. A l'heure actuelle ce geste entraine une importante léthalité et nécessite une amélioration. Néanmoins au cours de ces 5 prochaines années, la mise en place de cette technique permettra de réduire le nombre d'animaux par procédure.
Raffinement
Les poissons seront élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/ nuit de 14/10h et nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante et à maintenir un enrichissement social. Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d’interet, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. Dans le cas d’un défaut mandibulaire trop important, l’analyse des poissons se limitera à l’analyse des premières étapes du développement crâniofacial jusqu’à 5 jours post fecondation). Dans le cas d’un défaut mandibulaire modéré à faible, Les bacs à surveiller seront indiqués, le comportement des animaux face à la nourriture sera analysé quotidiennement lors du nourrissage par les animaliers. D’autre part l’apparition de symptômes morphologiques ou comportementaux sera suivie et les poissons seront scorés quotidiennement tout au long de leur croissance. Seuls les poissons nécessaires à la création, au maintien des lignées et à l’analyse du squelette post mortem aux stades adultes seront génotypés à 3mois post fécondation sous anesthésie générale en présence d’un analgésique. A la suite du génotypage, les poissons sont mis sous analgésiques pendant 48h. L’acquisition d'image nécessaire au cours des procédures d'imagerie in vivo sera réalisée avec un microscope permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie. Le milieu aqueux utilisé pour maintenir les poissons dans la bonne position pendant l’acquisition permet de garder la peau humide, alimente les branchies en eau et oxygène, et limite l’impact sur la peau et les écailles évitant ainsi les suffocations.
Choix des espèces
Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette dela tête. Le squelette de la tête présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués au cours de son développement. De plus, l'existence de poissons exprimant des protéines fluorescences dans les cellules participant à la formation osseuse permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. L’analyse du squelette se fera du stade larvaire (7jours post fécondation (jpf) ; formation du squelette pharyngé) jusqu’au stade adulte. Le poisson zèbre ayant une croissance continue tout au long de sa vie il est important d’observer l’evolution du phénotype squelettique à des stades tardifs ( 1 semaines, 2 semaines, 3 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois).
Etude de la pharmacocinétique et de la biodistribution de différentes nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétiques (SPIONs) chez le rat sain
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
33 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacun subissant soit huit prélèvements sanguins sous anesthésie après une injection intraveineuse, soit deux séances d'IRM d'une heure. Tous seront tués en fin de procédure pour prélever leurs organes. Le porteur justifie le choix du rat plutôt que de la souris par la possibilité de prélever davantage de sang sur un même individu, ce qui divise par huit le nombre d'animaux utilisés. Le bénéfice annoncé se limite à mieux comprendre comment influencer le comportement de nanoparticules d'oxyde de fer dans le sang, un usage en médecine humaine étant renvoyé au long terme.
Objectifs
Les nanoparticules à base de fer sont en plein développement et possèdent de nombreuses propriétés pour des applications en médecine : en effet, 1/ elles pourraient aider au diagnostic par imagerie IRM (imagerie par résonance magnétique) car le fer est visible en IRM mais aussi 2/ elles pourraient servir pour traiter des pathologies: i) sous un champ magnétique le fer peut dégager de la chaleur et détruire les cellules à proximité, ii) le fer peut également aider à augmenter les effets de radiothérapie (traitement par rayons) et enfin, iii) les nanoparticules peuvent jouer le rôle de transporteur de médicaments. Un élément indispensable avant de développer des nanoparticules est de contrôler leur comportement dans l’organisme afin de les amener sur leur lieu d’action. Le principal problème de la plupart des nanoparticules est qu’elles sont vite éliminées de la circulation sans avoir le temps de rejoindre leur cible et qu’elles s’accumulent dans le foie qui est l’organe qui permet leur élimination. Dans de précédents travaux nous avons identifié que certaines protéines présentes dans la circulation sanguine pouvaient influencer le comportement biologique de nanoparticules d’oxyde de fer aussi appelées Spions (Superparamagnetic iron oxide nanoparticles). Dans ce projet, nous souhaitons maintenant greffer ces protéines sur les Spions et évaluer leur comportement biologique : temps de circulation sanguine et élimination.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre comment influencer le comportement biologique de nanoparticules d’oxyde de fer pour à terme permettre leur utilisation en médecine humaine.
Procédures
Procédure 1 : Une injection intraveineuse (1minute) puis 8 prélèvements sanguins (2 minutes chacun) sous anesthésie. Procédure 2 : deux sessions d’imagerie par IRM (1h maximum chacune) seront réalisées ainsi qu’une injection intraveineuse (1 minute) sous anesthésie.
Impact sur les animaux
L’injection intraveineuse et les prélèvements sanguins répétés sous anesthésie pourraient présenter un léger inconfort et des lésions locales si le geste est mal maîtrisé. Un stress associé à la mise sous anesthésie peut également intervenir. Les composés administrés ne devraient avoir aucun effet.
Devenir
Des analyses complémentaires sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de l’étude. La totalité des animaux seront euthanasiés en fin de procédure
Remplacement
L’étude du devenir d’une molécule dans l’organisme rend la règle de remplacement difficilement applicable puisqu’il est nécessaire de l’étudier dans son contexte global avec une interaction entre les différents organes préservée.
Réduction
Une sélection de 6 Spions, préalablement testés in vitro pour l’étude de leur pharmacocinétique puis par la suite des 3 meilleurs Spions pour l’étude de biodistribution permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires en éliminant ceux avec les moins bonnes propriétés physiologiques. L’effectif de chaque groupe expérimental a été réduit à son minimum dans chaque procédure afin d’obtenir des résultats scientifiquement pertinents sur la base des études menées précédemment. L’utilisation du rat permet également de réduire les effectifs car il est possible de réaliser des prélèvements sanguins répétés compatibles avec nos analyses biologiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes sociaux de 2 ou 3 avec accès illimité à l’eau et la nourriture. L’enrichissement des cages sera composé de 2 pad de sizzle-dri (frisottis de carton). Un temps d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respecté avant le début de la procédure. La réalisation d’une imagerie IRM dans cette étude, qui est une méthode non invasive, permet de réduire la douleur et l’inconfort à son niveau minimum. La totalité des procédures est réalisée sous anesthésie et sur plaque/lit chauffant afin de réduire l’inconfort de l’animal. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance et également à la bonne réalisation des gestes techniques.
Choix des espèces
Pour les besoins de l’étude, nous devons prélever de façon répétée des volumes de sang pour nos analyses qui demanderaient l’utilisation de nombreuses souris. Dans un but de réduction du nombre d’animaux nous utiliserons le rat qui permet de diminuer le nombre d’animaux par 8 mais également l’imagerie par IRM. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (250g) afin qu’ils aient atteints leur maturité physiologique
Evaluation de l’effet de différents traitements contre l’état de mal épileptique chez le jeune rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 100 rats juvéniles, âgés de 21 à 45 jours, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à la fin pour prélèvement d'organes. Des convulsivants leur provoquent un état de mal épileptique pouvant durer jusqu'à quatre heures, 360 d'entre eux subissant en plus une chirurgie d'implantation d'électrodes crâniennes d'une heure, et jusqu'à vingt-deux gavages ou injections quotidiennes selon les groupes. L'isolement de deux à vingt-quatre heures pendant l'enregistrement des crises figure lui aussi parmi les nuisances déclarées, et les rats dont l'état de mal dépasse deux heures après administration des produits sont tués par surdose d'anesthésique. Sur le remplacement, le porteur affirme que les méthodes in vitro ne reproduisent pas les propriétés des crises dans un "cerveau entier" et que la modélisation informatique manque encore de données.
Objectifs
Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de traitements (pharmacologiques et probiotiques) sur 1) la terminaison de l’état de mal épileptique (status epilepticus) dans un premier modèle, et 2) la prévention de ce status epilepticus dans un deuxième modèle, chez des rats jeunes. Le status epilepticus est défini par une crise prolongée (plus de 5 min). Bien que la plupart des patients répondent bien aux benzodiazépines (médicament donné en première intention), certains patients sont réfractaires (35%) et nécessitent d’autres traitements. Nous proposons ici d’étudier les effets de différents traitements et différentes voies d’administration (orale, intrapéritonéale et intraveineuse) dans 2 modèles de status epilepticus, en commençant par une analyse comportementale, puis, après confirmation des doses effectives, par analyse électroencéphalographique (EEG).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier de nouveaux traitements anti-épileptiques pharmacologiques et/ou probiotiques efficaces dans la terminaison et/ou la prévention de l’état de mal épileptique. Le but est de proposer ces traitements chez l’enfant, soit pour prévenir de l’état de mal épileptique, présent dans de nombreux syndromes épileptiques, dont le syndrome de Dravet ; soit pour terminer un état de mal épileptique afin d’éviter la survenue d’altérations neurologiques. L’état de mal épileptique prolongé (réfractaire aux traitements actuels) touche 1 tiers de patients épileptiques et peut avoir des conséquences délétères pour le cerveau, voire entrainer la mort des patients.
Procédures
- Injection sous-cutanée : animal vigile, 1 fois pour tous les 1100 animaux, et au moins 2 fois pour les 360 animaux qui subiront une chirurgie. - Injection intrapéritonéale : animal vigile, 1 fois ou 2 fois pour 378 animaux respectifs ; et 6 fois (1 fois/jour) ou 22 fois (1 fois/jour) pour 86 animaux respectifs. - Injection intraveineuse : animal vigile, 1 fois pour 378 animaux. - Gavage oral : animaux vigiles, 6 fois (1 fois/jour) ou 22 fois (1 fois/jour) pour 86 animaux respectifs. - Chirurgie d’implantation d’électrodes EEG : anesthésie générale (une fois par animal) et analgésie (en tout 3 ou 4 injections sous-cutanée), 360 animaux, durée de la chirurgie maximum 1h. Ces procédures seront effectuées par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l’animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : 1) Une survenue d’un état de mal épileptique (d’une durée maximale de 4h) 2) un stress et une douleur dus à l’administration des convulsivants (PTZ et pilocarpine) 3) un stress et une douleur dus à l’administration aigue ou chronique des traitements proposés 4) un stress du à la chirurgie pour l’implantation d’électrodes (procédures 2 et 4) 5) un stress dû à l’isolement (de 2h à 24h) pendant les périodes d’enregistrement des crises Les traitements seront effectués par une personne expérimentée pour limiter le stress des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car: (1) Les modifications cérébrales induites par les crises ne peuvent être étudiées expérimentalement chez l’humain. (2) Les méthodes expérimentales in vitro ne reproduisent pas l’ensemble des propriétés des crises d'épilepsie survenant dans un cerveau entier (et ceux malgré le développement de méthodes alternatives). (3) La modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore insuffisantes pour produire des données applicables chez l’humain.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences, en testant d’abord les traitements par analyse comportementale avant d’effectuer des analyses EEG. De plus, les groupes contrôles et traités seront regroupés afin de minimiser l’utilisation des animaux. Enfin, pour les traitements préventifs : le traitement court de 5 jours sera réalisé en premier avant d’envisager un traitement plus long (21 jours) si nécessaire. Le calcul du nombre des animaux est fait selon une approche statistique, il nous faut au minimum 10 animaux par groupe. Pour les animaux qui seront implantés par des électrodes, un maximum de 12 animaux/groupe sera envisagé afin d’atteindre un minimum de 10 en cas de perte d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées enrichies avec des tunnels en plastiques (ou des huttes en carton après implantation d’électrodes, afin d’éviter que les animaux se soient coincés au niveau de leur connecteur). La température est controlée. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 7h/19h. Une surveillance attentive et quotidienne des animaux est réalisée. Avant chirurgie, une dose d’analgésique est administrée (environ 45 min avant). Pendant la chirurgie, un gel est instillé au niveau de chaque oeil pour éviter le dessèchement de la cornée. Un spray d’anesthésique local est appliqué au niveau de la peau incisée pour limiter la douleur. De plus, l’animal est maintenu à une température de 37°C à l’aide d’un tapis chauffant avec rétrocontrôle. Puis, à la fin de la chirurgie, une deuxième dose d’analgésique est administrée dans les 4h (soit 6h après la première) pour réduire la douleur postopératoire, puis un antalgique dans l’eau de boisson est donné pendant 48h. Une distribution d'aliment hydraté pourra être effectuée pour faciliter l'alimentation. Lors de l’induction de l’état de mal épileptique, les animaux sont suivis par vidéo ou vidéo-EEG. Si cet état de mal dure plus de 2h après administration des produits, les animaux seront mis à mort par surdose d’anesthésique. Les administrations (intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou par gavage oral) seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté.
Choix des espèces
L’espèce que nous avons choisi (rat Sprague Dawley) est le modèle le plus décrit dans la littérature comme reproduisant au mieux l'épilepsie induit par les proconvulsivants utilisés dans cette étude. Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. De plus, la lignée Sprague Dawley choisie montre un taux de survie élevé suite à l’induction des crises proposées. Pour toutes les procédures, nous testerons des animaux juvéniles (entre P21 et P45) afin d’évaluer des traitements compatibles chez l’enfant.
Evaluation de candidats médicaments dans des modèles de greffes tumorales issues de patients (PDX, Patient Derived Xenograft).
- Recherche appliquée
- Cancers
Les souris utilisées ici sont immunodéficientes, choisies pour ne pas rejeter les fragments de tumeurs prélevés sur des patients, certaines portant en plus un système immunitaire humain reconstitué. 13 340 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de tissus. Elles subissent une chirurgie de greffe de cinq à vingt minutes, jusqu'à deux mois de traitements par des molécules dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires, et jusqu'à dix prélèvements sanguins. Le nombre d'animaux par groupe, treize, ne repose sur aucun test statistique : le porteur le fixe à partir de son expérience et de la littérature.
Objectifs
Ce projet a déjà obtenu une autorisation de projet qui doit être renouvelée au bout des 5 ans échus. Les cancers sont en progression constante de nos jours et touchent plusieurs organes. Aux stades avancés, ils sont réfractaires à toute thérapie malgré le développement des thérapies ciblées. De nouvelles options thérapeutiques doivent donc être impérativement développées. Depuis plusieurs années, nous avons mis en place une importante plateforme de xénogreffes tumorales issues de patients (PDX Patient-derived xenograft) pour les cancers urologiques dans un premier temps du fait de notre thématique de recherche (mais d’autres domaines pourraient être testés) et de proposer ces modèles pour une évaluation fiable de candidats médicaments. L’objectif du projet est d’évaluer l’effets de candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes de tumeurs issues de patients chez la souris immunodéficiente et/ou humanisée.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de cancer.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse ou par voie fixe pour subir une chirurgie pour l’implantation de la tumeur. Ces chirurgies sont courtes et durent environ 5-20 min selon la voie choisie. Des antalgiques seront administrés aux animaux en sous-cutané pour limiter la douleur. Les animaux recevront également des traitements avec des candidats médicaments à tester (traitements pendant 2 mois maximum). Les voies et fréquences sont dépendantes de chaque protocole expérimental. Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront très rapides (environ 1 min) pour diminuer au maximum la contention des animaux et un stress possible. Les animaux pourront avoir des prélèvements sanguins sur animal vigile ou anesthésié (geste qui dure environ 1 min et 5-10 prélèvements maximum). La mesure des tumeurs se fera par palpation de la tumeur et évaluation de sa taille. Ce geste est très rapide (1 minute maximum) et ne provoque pas un grand stress à l’animal.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies et chirurgie sur les animaux peuvent provoquer du stress, une douleur, des lésions. De plus, nous greffons une tumeur cancéreuse aux animaux qui croit plus ou moins doucement selon les modèles pouvant entraîner une perte de poids des animaux, une gène…
Devenir
Les animaux seront euthanasiés car des prélèvements de tissus seront réalisés
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de certains cancers. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peut mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Les modèles expérimentaux en oncologie préclinique sont: - les lignées cellulaires in vitro et in vivo ; - les tumeurs induites chimiquement ; - les souris transgéniques ; - les xénogreffes tumorales issues de patient (PDX). Ce dernier modèle est reconnu comme le plus pertinent car il reflète l’hétérogénéité tumorale et est décrit dans la littérature. Cette approche est encore peu répandue pour la sphère urologique et la communauté scientifique manque de modèles de PDX pour évaluer les candidats médicaments. De plus, l’approche immunothérapeutique prend une grande ampleur en oncologie, ainsi il est important de développer des modèles de double humanisation (PDX implantés sur des souris humanisées) pour tester ces nouvelles immunothérapies (non réalisé à ce jour dans notre laboratoire mais en forte perspective pour les prochains mois). Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer une valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). La mesure de la croissance tumorale se fera via une méthode non invasive de palpation ou à l’aide d’un caliper pour des volumes plus importants. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. De plus, le fait de pouvoir congeler/décongeler des tumeurs issues de la biobanque et de pouvoir l’incrémenter avec des nouvelles tumeurs évite d’avoir toujours les tumeurs à amplifier dans les animaux pour les conserver, diminuant à terme le nombre d’animaux. Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale et principalement dans ces modèles, les publications scientifiques, 13 animaux seront utilisés par groupe expérimental car c’est le minimum requis pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence entre plusieurs groupes (tests paramétriques ou non-paramétriques selon la normalité des groupes).
Raffinement
En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée et administration d’antalgiques avant et après toute chirurgie. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type igloo, morceau de bois, carré de coton…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes pouvant aller jusqu’à un point limite (définition de points limites adaptés). Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Du fait de la perte de poids des animaux possible en fonction de certaines tumeurs, une alimentation humide type Diet gel sera ajoutée dans la cage de ces animaux si nécessaire. Si un animal présentait un symptôme pouvant amener à un point limite, il serait hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin, soigné et pris en charge en fonction de son état (isolement en dernier recours mais possible selon l’agressivité de ses congénères). Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.
Choix des espèces
Le modèle expérimental décrit dans ce projet est très bien décrit dans la littérature et nécessite l’utilisation d’animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d’un tissu étranger. L’espèce de référence pour les études en oncologie préclinique est la souris du fait de sa facilité d’utilisation et des nombreux modèles de souris immunodéprimées et humanisées produits. Nous utiliserons des souris jeunes (4-6 semaines à la livraison) pour faciliter la prise de greffe pour les primo-implantations et les tests d’efficacité de candidats médicaments. Pour les études d’immunothérapie, nous utiliserons des souris d’environ 14 semaines, lorsque le système immunitaire humain est bien reconstitué.
Evaluation de composés d’intérêt dans des modèles orthotopiques de cancer de la vessie
- Recherche appliquée
- Cancers
Anesthésiées pour recevoir des cellules cancéreuses directement dans la vessie, pesées jusqu'à une fois par jour, traitées jusqu'à trois fois par semaine, puis endormies à l'isoflurane trois fois par semaine pour un suivi de la tumeur en bioluminescence, 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent en plus une greffe sous la peau pour reproduire une situation métastatique, d'autres subissent des prélèvements de sang ou l'amputation de l'extrémité de la queue, la fréquence de ces gestes dépendant des demandes des clients. Le porteur indique que la croissance tumorale peut rendre les souris incapables d'uriner et de s'alimenter, et que les anesthésies répétées constituent en elles-mêmes une nuisance. Toutes sont tuées à la fin des études pour prélever leurs organes, le modèle ne permettant pas de les réutiliser.
Objectifs
Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements pour les cancers de la vessie, dont les besoins sont non satisfaits, chez la souris dans des modèles orthotopiques (injection de cellules cancéreuses au site correspondant à celui de la tumeur d’origine). Pour ces modèles, des lignées cellulaires cancéreuses de la vessie soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées directement dans la vessie par administration intravésicale. En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Les études consistent à administrer le ou les composé(s) à potentiel thérapeutique à des souris porteuses de tumeur, puis à mesurer la croissance tumorale, les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines et/ou tissulaires du composé d’intérêt. Les mesure de concentrations du composé permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et enfin de prédire les doses des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’homme. Le suivi de croissance tumorale permettra d’évaluer l’efficacité du ou des composé(s). Celui-ci sera réalisé par imagerie non-invasive de bioluminescence sur animal anesthésié. Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront être réalisés pour des analyses ex vivo complémentaires : histologiques, par cytométrie en flux… L’ajout de tumeur ectopique (injection des cellules par voie sous-cutanée) en plus d’une tumeur orthotopique (injection par voie intravésicale) pourra être utilisé pour tester l’efficacité de molécules anticancéreuses dans un contexte de tumeurs métastatiques ; aussi appelé modèle abscopal. L’effet abscopal est la régression de la lésion métastatique (ex : s.c.) après un traitement local de la tumeur primaire (i.e. vésicale). Le suivi de la croissance de la tumeur ectopique s’effectuera par mesure non-invasive par caliper.
Bénéfices attendus
Dans les pays développés, le cancer de la vessie est au 4ème rang par sa fréquence chez l’homme et 9ème chez la femme. En France, chaque année, plus de 11 000 nouveaux cas de cancer de la vessie sont diagnostiqués et les statistiques font état de 4 500 décès annuels. Le traitement du cancer de la vessie repose aujourd’hui principalement sur la chirurgie (exérèse partielle), une ablation totale de la vessie pouvant être pratiquée en cas de cancer infiltrant. La survie nette à 10 ans des patients atteints d’un cancer de la vessie est de l’ordre de 40%. Le taux de récurrence à 5 ans est entre 31 et 78%, ce qui souligne l’inefficacité des traitements actuels et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l’Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.
Procédures
Les gestes techniques concernant tous les animaux : • Inoculation des cellules cancéreuses dans la vessie (1 fois ; 15 min à 30min) sur l’animal anesthésié par injection intrapéritonéale d’un analgésique injectable • Pesées (maximum 1 fois par jour sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile • Administration intrapéritonéale (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile • Suivi de la croissance tumorale par bioluminescence (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 15 min à 1h) sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (3-4% pour l’induction et de 1-3% pour l’entretien) Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang (30 sec) : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera adaptée en fonction du volume prélevé en accord avec la consigne en vigueur. Les sites seront la veine submandibulaire sur animal anesthésié à l’isoflurane (3-4%) ou veine caudale, ou amputation unique de la queue (coupe < 2 mm sur l’extrémité non inervée de la queue) sur animal vigile. • Injection sous-cutanée de cellules cancéreuses (1 fois ; 1 min) sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (3-4% pour la l’induction et de 1-3% pour l’entretien) • Mesure de la croissance tumorale au pied à coulisse (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 1 min) sur animal vigile • Administrations des composés à potentiel thérapeutique : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera en accord avec la consigne interne en vigueur. Les voies envisagées sur animal vigile seront les voies (30 sec) : per os, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse via la veine caudale ou intramusculaire. Les voies possibles sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (pour induction 3-4%, pour maintien 1-3%) seront intradermique (1 min), intraveineuse via le sinus rétro-orbital (30 sec) ou intravésicale (15 min à 1h).
Impact sur les animaux
Ces modèles peuvent engendrer une dégradation de l’état de santé de l’animal pouvant se traduire par une perte de poids, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli) et/ou une altération des fonctions normales (impossibilité d’uriner et de s’alimenter). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de la croissance tumorale. Les effets indésirables possibles seront systématiquement demandés au client avant tout traitement pour les anticiper. Les animaux seront également soumis à des mesures de tumeur par bioluminesence post-administration des cellules tumorales/potentiels médicaments par voie intravésicale ce qui nécessite des anesthésies répétées. Ces anesthésies répétées peuvent constituer une nuisance notamment au travers de la contention de l’animal pour le placer dans la chambre à anesthésie ou pour l’administration de ketamine/xylazine.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des études afin notamment de prélever des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …). Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux.
Remplacement
Principalement 2 approches sont utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basée sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.
Réduction
Dans le modèle orthotopique, la croissance tumorale sera suivie au cours du temps par imagerie de bioluminescence. Dans le modèle sous-cutané, la croissance sera mesurée par caliper. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié (pour l’imagerie de bioluminescence), là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base principalement sur les données de la littérature complétés d'analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux à l'aide de logiciels spécifiques, généralement basés sur des tests type test de Student bilatéral, afin que les nombres utilisés soient réduits au minimum nécessaire. Il est prévu environ 50 études (10 études par an) et 150 molécules testées au regard du nombre d’animaux utilisés. Chaque étude comportera en moyenne 5 groupes avec 10 animaux par groupe et 3 molécules à tester par étude.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaire de la directive n°2010/63/UE. Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinels. Les animaux seront groupés dans des cages contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations liées à l’étude sur l’animal sera réduit au strict nécessaire ( ex : pesées, bioluminescence).Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles orthotopiques de cancer de la vessie chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car : 1/ sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2/ la disponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Le stade adulte est utilisé :les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer.
Evaluation de la charge bactérienne pulmonaire et splénique chez la souris neutropénique infectée par 3 souches différentes de Klebsiella pneumoniae.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Pour compléter une étude déjà menée, 30 souris vont être rendues neutropéniques par deux injections dans le ventre, infectées par Klebsiella pneumoniae, puis tuées deux heures plus tard afin de mesurer la charge bactérienne de leurs poumons et de leur rate. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré. L'infection passe par le nez, sous anesthésie brève, et le porteur la décrit comme un léger inconfort de quinze secondes. Il affirme que de nouvelles options thérapeutiques sont "indispensables" et que ces témoins supplémentaires sont "nécessaires" pour appuyer sa démarche auprès des acteurs publics de la santé.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la charge bactérienne pulmonaire et splénique après 2h d’infection pulmonaire par des souches bactériennes résistantes chez la souris neutropénique. Ce projet est une étude complémentaire. En effet, dans ce modèle, différents traitements ont été testés et ont donnés des résultats très encourageants dans le traitement de ces infections. Cependant, des témoins supplémentaires sont nécessaires pour appuyer cette démarche auprès des acteurs publics de la santé.
Bénéfices attendus
Les pneumonies bactériennes dues à des espèces multi résistantes constituent un challenge pour les professionnels de santé. En effet, ces pathogènes bactériens deviennent de plus en plus difficiles à traiter en raison de leur capacité à produire des mécanismes de résistance. Ces bactéries résistantes sont de plus en plus communes dans les systèmes de santé nord-américains et européens et de nouvelles options thérapeutiques sont indispensables pour traiter ces infections. Ce projet s’inscrit dans la complémentarité d’une autre étude menée où un traitement antibactérien a montré une réelle efficacité contre ces infections et pourrait représenter une nouvelle ligne thérapeutique pour lutter contre ces infections. Le bénéfice de ce présent projet serait donc d’appuyer cette théorie en ajoutant comme données complémentaires la charge bactérienne pulmonaire et splénique réelle avant l’initiation des traitements (c’est-à-dire 2h après l’infection).
Procédures
Les souris recevront deux injections intrapéritonéales (de 5 secondes) à J-4 et J-1 avant infection. L’infection se fera par voie intranasale par l’injection de 50µL (2 secondes) à l’aide d’une pipette et sous une courte anesthésie volatile.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue est l’injection intrapéritonéale pour l’immunodépression des souris. Ce geste entraine une légère douleur au moment de la piqure mais dure moins de 5 secondes et l’animal retrouve sa mobilité. Ce protocole est bien défini et n’entraine aucune autre nuisance. L’administration intranasale de la suspension bactérienne sera réalisée par du personnel compétent et expérimenté. Cette intervention entraine un léger inconfort de courte durée (temps d’infection 15 secondes).
Devenir
Tous les animaux (30) seront mis à mort 2h post infection afin de dénombrer la charge bactérienne présente dans les poumons et dans la rate.
Remplacement
A ce jour, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique. En effet, Dernièrement, des études ont démontré une activité intéressante de cet antibiotique couplé à une molécule contre ces multi résistantes. La mesure de l’efficacité de cette combinaison ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est de 10 souris par groupe ce qui permettra d’effectuer une analyse statistique fiable (estimation de la diminution de la charge bactérienne dans les poumons par une analyse statistique.
Raffinement
D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée et risquerait même de faire flamber l’infection. L’infection sera réalisée sous anesthésie. Un programme d’enrichissement de l’environnement sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal. Les animaux seront hébergés à 10 par cage. S’agissant d’une étude très courte (2h) aucun sepsis n’est attendu, et les souris seront surveillées tout au long de cette expérience.
Choix des espèces
Les souris CD1 représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la charge bactérienne. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée dans l’étude précédente ayant montré des résultats encourageants. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédentes études).
Efficacité thérapeutique de nanoparticules dans un modèle murin de cancer du sein HER2+. ( EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Le poids, le comportement et l'apparence des souris porteuses de tumeurs sont contrôlés chaque jour pour décider du moment de leur mise à mort. 4 011 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un groupe de 2 100 subit une injection puis un unique prélèvement sanguin sous anesthésie terminale, un autre de 1 001 reçoit une incision du flanc, une greffe de cellules cancéreuses dans la glande mammaire, huit injections du produit testé puis, deux fois par semaine pendant quatre mois au plus, une injection de luciférine suivie d'un examen d'imagerie sous anesthésie. L'objet du projet est de comparer des nanoparticules ciblant HER2 selon leur taille et leur composition, et les souris chez qui la tumeur n'a pas pris sont tuées elles aussi, parce qu'elles ont reçu des cellules tumorales.
Objectifs
Le cancer du sein est le premier cancer chez la femme en France, dont 10 à 20% sont HER2 positifs (protéine exprimée à la surface des cellules positives). Cependant, des résistances aux traitements proposés actuellement se développent, et la toxicité systémique (toxicité qui affecte l’ensemble de l’organisme) des traitements existants reste problématique. Il reste donc indispensable de chercher de nouveaux traitements contre le cancer du sein. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules associées à des nanoparticules ciblant HER2, réduisant les effets secondaires dans le traitement du cancer du sein. Nous espérons ainsi ouvrir de nouvelles pistes pour résoudre cette problématique de santé publique. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanoparticules dans l’arsenal thérapeutique actuel du cancer du sein. La comparaison des différentes nanoparticules ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanoparticules sur le ciblage de la tumeur, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanoparticules pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer du sein humain grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.
Procédures
- Un groupe de 700 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis 2 prélèvements sanguin à deux jours d’intervalle, sous anesthésie (durée : environ 30 secondes). Les souris subiront cette séquence d’une semaine sur 4 semaines (4 injections et 8 prélèvements au total). - Un groupe de 2100 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie terminale (sans réveil) (durée : 30 secondes). - Un groupe de 210 souris subira 2 injections de cellules cancéreuses (10 secondes chacunes) sur animal anesthésié, puis une injection du médicament (7 à 15 jours après) sur animal vigile d’une durée de 10 secondes ; puis sera observée à 7 temps différents par imagerie sous anesthésie (durée : 30 secondes) réparties sur 3 jours. - Un groupe de 1001 souris subira 1 incision sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes) suivie d’une injection de cellules cancéreuses dans la glande mamaire sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes), puis 10 à 20 jours plus tard, huit injections du médicament (10 secondes) sur animal vigile, et deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude (4 mois maximum), une injection de la luciférine (nécessaire à l’imagerie) sur animal vigile (durée 10 secondes) suivie de l’examen en imagerie (durée 1 min) sous anesthésie. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs. Les animaux concernés par l’étude de la dose maximale tolérée et de toxicité et de pharmacocinétiques seront réceptionnés, hébergés, injectés et sacrifiés dans l'EU1. Dans le cadre de l’étude de biodistribution ; la réception, hébergement, la greffe et la pousse tumorale se fera dans l'EU1, puis les animaux seront transférés dans l'EU2 pour l’injection des formulations et le suivis jusqu’à euthanasie. L’ensemble des animaux de l'étude d’efficacité thérapeutique sera réalisée dans l'EU2 (réception, hebergement, greffe/pousse tumorale, injection des formulations).
Impact sur les animaux
Il n’y a pas de nuisances attendues sur les souris saines autre que la toxicité éventuelle de la molécule à haute dose (perte de poids, perte de poils). Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Les nuisances attendues pour l’incision du flanc sont des douleurs au niveau de la zone incisée. Les nuisances attendues pour les souris porteuses de tumeurs sont la nuisance due à la tumeur : perte de poids, nécrose, etc. Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Après injection intraveineuse, des irritations au point d’injections peuvent apparaître et seront surveillés.
Devenir
Les souris sont prélevées post-mortem pour des analyses ultérieures, elles seront donc toutes mises à mort. Les souris dont la pousse tumorale n'a pas prise seront mises à mort car elles ont étés injectées avec des cellules tumorales.
Remplacement
Nous avons préalablement réalisé des études in vitro afin de remplacer en partie l’expérimentation in vivo autant que possible, mais à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. En effet, cette étude préclinique, visant à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanoparticules pour le traitement du cancer du sein nécessite obligatoirement l’utilisation d’animaux entiers pour déterminer la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique et leur efficacité.
Réduction
Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible grâce au suivi par imagerie non invasive et non irradiante (croissance tumorale et biodistribution des formulations dans les modèles de souris porteuses du cancer du sein). Une étude préliminaire, avec un nombre restreint de groupes conditionnera la suite du projet, le nombre d’animaux annoncé est donc un nombre maximum.
Raffinement
Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Un analgésique sera localement appliqué sur les sites d’ouverture de la souris. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs sera mesurée tous les 3 jours. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la structure du bien-être animale. Pour le transport des animaux, ces derniers seront installés dans des boites spécifiques assurant leur confort et leur sécurité (isolation thermique, filtre sanitaire, chaufferette) pour un temps de transport estimé entre 5 à 10 minutes. Une période d’acclimatation de 12 à 24h minimum sera observée suite à leur transferts.
Choix des espèces
La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La plupart des antécédents génomiques de la souris sont similaire à ceux de l’homme (env. 95%), ce qui rend les souris particulièrement utiles pour la recherche sur les maladies humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6-8 semaines, âge adulte de manière à avoir un poids corporel plutôt stable d’environ 20g.
Evaluation cognitive de souris modèles de myopathie de Duchenne dans un contexte social en cage d’élevage
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Une biopsie de l'extrémité de la queue puis l'implantation sous la peau d'une puce RFID sous anesthésie précèdent trois à huit semaines passées en colonie de douze à seize individus, où l'accès à la boisson change de place et d'horaire selon des règles que chaque souris doit apprendre. 1 596 souris porteuses de mutations modélisant la myopathie de Duchenne vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur présente ce dispositif comme évitant tout stress lié à l'isolement, à la restriction alimentaire ou à la manipulation, tout en indiquant que certaines souris peuvent se retrouver privées d'eau par la pression sociale du groupe ou parce que la règle à apprendre dépasse leurs capacités, et qu'une souris qui ne s'abreuve toujours pas au bout de douze heures est retirée et tuée. Les cerveaux sont prélevés après les tests, 80 femelles et mâles surnuméraires étant gardés en vie pour former de nouveaux couples.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est causée par des mutations qui conduisent à une dégénérescence musculaire, mais également à des troubles cognitifs, comportementaux et neuropsychiatriques. Les patients atteints de DMD présentent en particulier des déficits d’apprentissage, de mémoire et de la flexibilité comportementale. La présence et la sévérité de ces troubles dépend de la position des mutations dans le gène responsable de la maladie et les études chez la souris impliquent donc la comparaison de plusieurs modèles porteurs de différentes mutations. Ces souris lorsqu’elles sont testées de manière isolée montrent fréquemment des réponses de stress et de longues périodes d’immobilité, alors que leur activité dans un environnement familier est comparable à des souris témoins. Ce projet a pour but d’évaluer le comportement et les capacités cognitives des souris modèles de DMD avec une approche plus éthologique, en plaçant des groupes sociaux dans une grande cage d’élevage dans laquelle les animaux peuvent apprendre différentes tâches pendant plusieurs semaines, à différents moments du cycle jour/nuit, et sans intervention d’un expérimentateur car les tâches sont programmées et la quantification des comportements est automatisée. Le projet permettra d’identifier des déficits comportementaux pouvant servir à évaluer l’efficacité de traitements, qui pourront être analysés rapidement sur des groupes importants d’animaux. Ce projet est donc important pour le diagnostic et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des troubles affectant le cerveau dans la DMD.
Bénéfices attendus
Les troubles comportementaux et cognitifs associée à la myopathie de Duchenne sont encore peu étudiés mais ne peuvent plus être aujourd’hui considérés comme secondaires, car vu l’évolution des thérapies et prises en charge dans cette maladie, la durée de vie des patients s’accroit considérablement et les troubles affectant le système nerveux prennent progressivement une place de plus en plus importante dans la vie des patients. De plus, certaines mutations ont un impact très handicapant (déficience intellectuelle, troubles neuropsychiatriques) chez environ un tiers des patients. Il est donc important d’apporter des réponses à ces questions au cours d’études sur des modèles animaux de la maladie, porteurs de différentes mutations. Les résultats de ce projet permettront de préciser les relations entre mutations et sévérité des déficits, et d’identifier des déficits comportementaux utiles pour de futures études précliniques évaluant l’effet de traitements pour compenser ces troubles. L’évaluation automatique des comportements et des capacités cognitives dans notre dispositif a aussi un intérêt majeur au niveau éthique, car il permet de tester les souris dans leur lieu d’hébergement familier, enrichi par le contexte social et par une activité naturelle de recherche de boisson dans des zones différentes de la cage, en évitant tout stress lié à l’isolement, à la restriction en aliment, à l’anxiété induite par un environnement nouveau, ou à la manipulation par l’expérimentateur. Ce dispositif permet aussi l’obtention rapide de résultats sur des cohortes conséquentes de souris dans des conditions expérimentales stables, à la fois pendant les périodes diurnes et nocturnes. Les protocoles développés dans ce projet permettent d’étudier des fonctions cognitives de haut niveau affectées dans de nombreuses autres pathologies neurodéveloppementales et neurodégénératives, et pourront donc s’appliquer à de nombreuses études et modèles dans notre institut.
Procédures
Une biopsie de l'extrêmité de la queue (1mm) est faite le à l’âge de 7-10 semaine pour identifier le génotype des souris. Une anesthésie gazeuse de courte durée (
Impact sur les animaux
Une légère douleur pourrait être ressentie au moment de la biopsie de la queue pour génotypage. Certaines souris pourraient avoir des difficultés d’accès à la boisson du fait de la pression sociale susceptible de s’instaurer dans un grand groupe, ou dans certains protocoles impliquant une compétition sociale ou quand la règle à apprendre pour accéder à la boisson s’avère trop compliquée pour certaines souris modèles présentant un sévère déficit cognitif.
Devenir
Suite à leur production la majorité des souris (1516) passent expérimentation, 80 souris sont gardées pour former de nouveaux couples. À la suite des tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem de leur cerveau. Une partie des femelles et mâles surnuméraires sera gardée en vie et utilisée pour former de nouveaux accouplements (n=80), les autres seront utilisées pour des prélèvements d’organes hors champ, ou euthanasiés.
Remplacement
Les recherches précliniques pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont initialement menées sur des souris. Notre projet a pour but d’effectuer des tests comportementaux qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants. Les souris sont utilisées à un âge où la maladie est à un stade précoce, sans symptômes moteurs et ne donnant pas lieu à des souffrances.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration statistique convaincante des objectifs. Sur la base des publications utilisant des méthodes similaires d’analyse du comportement, la réussite des expériences nécessite 12-15 souris par groupe. Nous utilisons des tests statistiques adaptés aux petits échantillons. De plus, notre approche avec enregistrement de données 24/24h permettra d’obtenir de nombreuses données comportementales, tout en limitant la variabilité, et donc le nombre d’animaux, par la répétition des mesures qui sont ensuite moyennées au sein de chaque expérience. Les études seront initialement conduites sur les lignées dont les mutations conduisent chez l’Homme aux déficits cognitifs plus sévère, tandis qu’une autre lignée, dont la mutation a peu d’impact chez l’Homme sur la cognition, ne sera étudiée qu’à titre comparatif seulement avec les protocoles qui auront révélé des déficits dans les autres lignées. L’ensemble de ces mesures permet de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés dans l’ensemble du projet.
Raffinement
Une semaine avant l’étude, une courte anesthésie (
Choix des espèces
Les explorations précliniques dans le cadre de cette maladie sont menées sur des souris. D’autres modèles animaux de cette maladie existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différentes lignées porteuses de mutations représentatives des mutations retrouvées chez les patients et induisant des variations dans la sévérité des symptômes. Les souris jeunes adultes seront étudiées (minimum 8 semaines). Ceci est nécessaire pour comparer aux résultats obtenus dans des projets précédents au même âge. De plus, c'est à cet âge que des traitements sont habituellement testés chez ces souris. Les troubles comportementaux et cognitifs sont présents à cet âge ; tester des souris plus vieilles (>6 mois) pourrait biaiser nos conclusions car leurs performances seraient influencées par un handicap moteur avancé.
Etude du rôle de cadhérines dans le système système digestif et ses pathologies
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Une piqûre ou une incision de la veine caudale chaque semaine pendant huit semaines, un gavage, une injection, douze heures sans nourriture, deux mois de régime gras et une biopsie de queue à six jours. 537 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 220 d'entre elles et modéré pour 317, toutes tuées pour prélèvement. Le porteur indique établir des organoïdes intestinaux à partir de ces mêmes souris pour traiter ex vivo une partie des questions, tout en concluant qu'aucun modèle de remplacement n'existe à ce jour. Les champs du résumé désignent l'objet de l'étude comme "un gène" sans jamais le nommer, et ne disent pas ce que les souris développeront réellement.
Objectifs
Il s’agira de comprendre précisément le rôle d’un gène dans le métabolisme digestif et de déterminer les conséquences de son absence pour des maladies affectant l’intestin (cancer du côlon, maladies inflammatoires chroniques de l’intestin comme la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique). Ces deux objectifs nécessitent l’utilisation de modèles murins à même de récapituler la complexité de l’intestin et d’intégrer l’interrelation fonctionnelle des organes du système digestif en contexte physiopathologique.
Bénéfices attendus
Le projet apportera d'importants bénéfices en termes de compréhension de la biologie, de développement de traitements et d'étude des maladies humaines. En effet, il permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques qui garantissent le fonctionnement du système digestif et sont dérégulés lors de maladies (ex. cancer colorectal, maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, diabète, obésité). A terme, les nouvelles connaissances générées par le projet contribueront à améliorer la santé humaine en fournissant des pistes innovantes pour la prévention, le diagnostic et la prise en charge thérapeutique des maladies du système digestif.
Procédures
- Prélèvements sanguing : piqûre veine caudale sur animaux vigiles une fois par semaine pendant 8 semaines ou par incision veine caudale sur animaux vigiles une seule fois ou trois fois avec 20 jours d’intervalle. - Injection : 1 injection unique sur animaux vigiles. - Gavage : une seule fois sur animaux vigiles avec une canule de gavage. - Diète : pas de croquettes pendant 12 h, réalisé une seule fois. - Régime riche en graisse (20 %) : réalisé pendant 2 mois, une seule fois. - Biopsie de queue : une seule fois sur animaux vigiles âgés d’environ 6 jours.
Impact sur les animaux
Les procédures sont susceptibles d’entrainer un stress, des modifications du poids (gain/perte) et la douleur chez les animaux soumis aux expérimentations, mais elles ont été réfléchies afin de réduire au maximum ces effets indésirables. Les animaux seront surveillés très régulièrement durant les procédures pour détecter le plus précocement possible la douleur chez les animaux et y remédier. En cas d’apparition de signes de souffrance au cours des protocoles (ex. perte de poids importante, pelage dégradé, prostration), les animaux seront mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.
Remplacement
Des observations faites chez les malades, ainsi que des expériences effectuées avec des cellules cultivées in vitro, suggèrent fortement que la disparition d’un gène étudié par l’équipe perturbe le fonctionnement du système digestif et conduit à des pathologies intestinales. Pour confirmer ces hypothèses et comprendre le rôle de ce gène, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal : la perturbation du métabolisme digestif, l’apparition de lésions tumorales ou d’un syndrome inflammatoire intestinal ne peuvent survenir que dans un organisme entier, pourvu de l’interconnexion fonctionnelle des différentes acteurs (ex. organes, système immunitaire, microbiote), et sur le long terme. Il n’existe pas de modèle alternatif de remplacement disponible à ce jour pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque procédure a été défini sur la base de la littérature scientifique et de façon à permettre des analyses statistiques (calculs de puissance statistique). Pour ne pas utiliser des groupes d’animaux supplémentaires, les prélèvements seront stockés et pourront être utilisés par la suite s’il est nécessaire d’examiner des paramètres complémentaires. En outre, des organoïdes intestinaux seront établis à partir des animaux pour étudier lorsque cela est possible certaines questions scientifiques ex vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions sanitaires contrôlées et permettant un bien-être optimal (ex. groupes sociaux, carrés de coton pour la fabrication des nids, bâtonnets à ronger). Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. En outre, des points limites ont été prédéfinis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux seront surveillés très régulièrement durant les procédures pour détecter le plus précocement possible la douleur (ex. perte de poids, pelage dégradé, prostration, mimiques faciales) et y remédier. En cas d’apparition de signes de souffrance, les protocoles seront soit allégés (dose ou durée) si cela est possible, soit immédiatement arrêtés.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus) qui permet de générer des modèles d’étude des maladies humaines pertinents et bien caractérisés. Les lignées de souris transgéniques nécessaires à la réalisation du projet ont été décrites dans la littérature scientifique comme n’ayant aucune altération grave de leur bien-être et de leur santé. En particulier, elles ne développent pas spontanément des tumeurs ou une inflammation intestinale. Certaines de ces lignées de souris produisent des selles d’aspect graisseux et développent un surpoids en vieillissant, mais leur espérance de vie, ainsi que leur comportement, sont similaires à ceux des souris normales. Les expériences seront réalisées avec des souris adultes au moins âgées de 8 semaines.