Recherche appliquée

2 480 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous la peau, une injection radioactive dans la veine de la queue, jusqu'à six anesthésies chacune et des séances d'imagerie de quarante-cinq minutes, puis vivent seules en cage à partir de l'injection radioactive. Le porteur reconnaît que cet hébergement individuel provoque un sentiment d'isolement et une absence de liberté d'expression, et attend aussi des lésions au point d'injection, de la fatigue et des troubles digestifs. L'objectif immédiat reste de compter la radioactivité organe par organe sur les cadavres, la phase I chez l'être humain étant renvoyée à la fin de l'étude, et le porteur conclut que l'expérimentation animale est "requise" parce que les données précliniques sont "imposées par les autorités".

Objectifs

Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un élément radioactif à une molécule, ou vecteur, capable de se lier de manière spécifique à une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que le vecteur puisse diriger et concentrer l’élément radioactif dans les cellules cancéreuses. En fonction de l’élément radioactif choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur par imagerie nucléaire ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Ces rayonnements détruisent l’ADN des cellules cancéreuses, ce qui mène à la destruction de la tumeur. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Plusieurs types de vecteurs capables de se lier spécifiquement à la protéine N ont été développés. A la différence de nombreuses autres protéines exprimées par les cellules cancéreuses, la protéine N est capable de transporter les vecteurs qui s’y lient jusqu’à son noyau cellulaire qui contient l’ADN. En rapprochant l’élément radioactif de l’ADN, il est possible de potentialiser l’effet de la thérapie, tout en diminuant sa toxicité pour les cellules saines. Nous avons sélectionné deux vecteurs se liant à la protéine N de manière différente afin de maximiser les chances d’identifier un système efficace. Comme il existe plusieurs types d’élément radioactif avec des propriétés très différentes, il est nécessaire de comparer l’efficacité de plusieurs combinaisons vecteur-élément radioactif afin d’identifier le couple le plus efficace. Alors que certains de ces éléments radioactifs émettent des rayonnements ionisants capables de détruire les cellules cancéreuses, d’autres peuvent être utilisés pour détecter les tumeurs par imagerie, ce qui permettra dans un premier temps de vérifier que les vecteurs s’accumulent bien dans la tumeur chez la souris. Dans un second temps, l’imagerie permettra de sélectionner les patients dont les tumeurs expriment la protéine N et qui seront donc éligibles à la thérapie. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels par radiothérapie interne vectorisée sont presque systématiquement accompagnés d’effets secondaires graves dus aux dommages provoqués aux cellules non-cancéreuses. En dirigeant les éléments radioactifs de manière spécifique au noyau des cellules cancéreuses, la stratégie de ce projet a pour but d’augmenter l’efficacité de ces thérapies tout en diminuant leur toxicité. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l’Homme à la fin de l’étude

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - 1 Injection en sous-cutané au moment de la greffe de cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum). - 1 injection de produit en intraveineuse dans la veine de la queue lors des expérimentations d'imagerie ou de traitement (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum). - Anesthésie à l'isoflurane réalisée lors de la greffe des cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum), lors de l’injection intraveineuse des produits (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ou au moment de la mise à mort (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ainsi que pendant l’acquisition des images (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). Il y aura au total 6 anesthésies au maximum pour chaque animal. - Imagerie à l’aide d’un scanner dans les procédures d’imagerie (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). - Mesures du poids et de la taille des tumeurs dans les procédures d’imageries et d’évaluation de l’efficacité des traitements (réalisée dans l'établissement 2, 1 min maximum).

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : - douleurs générées lors de la greffe des cellules tumorales, lors de l’injection des agents d’imagerie ou de thérapie. - lésions locales au site d’injection dû à la rétention du composé radiomarqué. - gêne ou douleur provoquée par la croissance des tumeurs - fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines ou troubles digestifs dans les jours suivant l'injection du traitement radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. - stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. - sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie et de biodistribution.

Devenir

Les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris incluse dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficacité thérapeutique.

Remplacement

Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. La procédure d’imagerie permet d’observer la localisation du vecteur au cours du temps sans avoir mettre l’animal à mort (suivi longitudinal), ce qui permet de maximiser les informations recueillies en minimisant le nombre d’animaux mis à mort. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées.

Raffinement

Méthodes utilisées pour réduire la douleur : Raffinement des conditions d'hébergement : - Dans les procédures 1 et 2, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection du vecteur radiomarqué et de permettre un contact visuel des animaux. Chaque boite sera également enrichie d'un igloo et d'une roue en polycarbonate. - Dans toutes les procédures, des croquettes mouillées seront rajoutées dans les cages des souris souffrant de fatigue ou de faiblesse. Dans les procédures 3 et 4, des croquettes mouillées seront ajoutées systématiquement la première semaine suivant l’injection des vecteurs radiomarqués. - De la litière de cellulose sera utilisée pour limiter l’apparition de plaie chez les souris porteuses de tumeurs. - Le transport des animaux de l’EU1 à l’EU2 sera réalisée à l’aide de cages opaques à couvercle filtrant. Anesthésie : les animaux seront anesthésiés lors de la greffe des tumeurs (5 min maximum), lors de l'injection intraveineuse des composés (5 min maximum), lors des acquisitions d'image (45 min maximum) et lors de leur mise à mort (5 min maximum). Analgésie: en cas d'apparition de douleur, des analgésiques seront administrés aux animaux. Des points limites spécifiques à ce projet ont été mis en place pour limiter la souffrance des animaux au minimum. Ces points limites seront appliqués de manière stricte.

Choix des espèces

Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux humains est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de tumeurs humaines car celles-ci se caractérisent par l'absence d’un organe (le thymus), ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge, et ils sont plus résistants aux radiations.

Identifiées par une boucle d'oreille et une biopsie de la queue au sevrage, 1 345 souris passent des tests de mémoire à trois, six, douze et dix-huit mois, dont un test en piscine réparti sur cinq jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque mois, elles sont placées dans une autre cage le temps de recueillir trois crottes. 592 d'entre elles font en plus une à deux heures de route vers deux autres établissements pour des imageries cérébrales sous anesthésie, après plusieurs heures de mise à jeun, et toutes sont tuées pour prélever cerveau et intestin. Le porteur signale que les femelles de cette lignée transgénique peuvent mourir subitement à quinze mois sans signe annonciateur, et espère que le projet conduira à terme à la production d'un complément alimentaire pour les personnes âgées.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la démence la plus commune parmi les démences de la personne âgée où elle représente un peu plus de deux tiers des cas. L’âge est le principal facteur de risque de la maladie d’Alzheimer. En France, le nombre de personnes âgées de 65 ans ou plus et atteintes de la maladie d’Alzheimer serait compris entre 560 000 et 730 000 suivant les études. Même si la recherche reste très active pour cette maladie, aucun traitement n’est actuellement capable de modifier efficacement l’évolution de la maladie et la cause demeure toujours inconnue pour la forme la plus représentée dans la population. Des travaux récents soulignent le rôle du microbiote intestinal dans la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. La recherche de molécules capables de modifier le microbiote intestinal tout en prévenant d’autres altérations du système nerveux central observées chez le patient devient aujourd’hui une priorité pour de futurs traitements. Plusieurs études soulignent le rôle modulateur de certains polyphénols sur le microbiote intestinal pour avoir un écosystème bactérien bénéfique sur la santé humaine. Toutefois, l’interaction entre les polyphénols et ce microbiote est complexe et des recherches approfondies sont nécessaires pour valider cette cible périphérique dans la maladie d’Alzheimer. L'objectif de notre projet est d'étudier l'effet de plusieurs polyphénols sur l'évolution des troubles cognitifs dans un modèle de la maladie d'Alzheimer chez la souris. Trois établissements utilisateurs seront impliqués dans ce projet.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet conduira, à plus long terme, à la production d’un complément alimentaire visant à mieux vivre chez les personnes âgées.

Procédures

Dans l’établissement utilisateur EU1, les souris sont identifiées en posant une boucle d'oreille numérotée et les caractéristiques génétiques nécessaires à l'étude sont connues en réalisant une biopsie de la queue au sevrage. Les souris (1048) seront soumises à des tests du comportement pour évaluer les troubles cognitifs et moteurs liés au vieillissement physiologique et pathologique (Alzheimer) : au total 3 tests réalisés à 3, 6, 12 et 18 mois. Les tests de mémoire à court terme sont au nombre de 2, ils se feront respectivement 7 jours et 3 jours avant le début du test de mémoire à long terme. Chaque test de mémoire à court terme dure moins de 20 minutes. Le test de mémoire à long terme demande 4 jours d'apprentissage avec 4 essais par jour de 60 secondes espacés d'une heure. Le 5ème jour, la souris passe une seule fois le test sur 60 secondes. Durant tout le projet, les fèces seront recueillies 1 fois par mois. Les souris seront placées 5 min dans une nouvelle cage le temps du recueil de 3 crottes spontanées et retourneront dans leur cage d’origine. Dans un autre établissement utilisateur (EU2 à 1 heure de l’EU1), des souris (296) suivront deux imageries cérébrales pour évaluer le flux sanguin (30 min), l'inflammation et le métabolisme (60 min) qui nécessite la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie. Dans un autre établissement utilisateur (EU3 à 2 heures de l’EU1), d'autres souris (296) suivront une imagerie par résonance magnétique (30 min) après administration orale de glucose. Dans les deux EUs une anesthésie gazeuse, régulée sera réalisée sur tapis chauffant thermorégulé durant l'examen.

Impact sur les animaux

Inconfort transitoire lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse, associé à une douleur légère et transitoire liée à la pose de la boucle d’oreille et la biopsie. Tests comportementaux : stress léger et transitoire pour les tests de mémoire à court terme minimisé par l’habituation ; stress modéré et transitoire et sensation de froid légère et transitoire lors du test de mémoire à long terme avec des essais espacés d’une heure pour laisser le temps à la souris de se réchauffer. Concernant les protocoles d’imagerie dans l’EU2 nécessitant la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie, il est possible d’avoir les effets suivants sur 5 min maximum : Inconfort/douleur au niveau du site d’injection des agents de contraste ; Inconfort au niveau du site d’apposition de la sonde d’image ultrasonore ; Stress lié à la contention (imagerie) ; Stress lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse. L’imagerie au sein de l’EU3 est une technique non invasive. Cependant durant l’examen, un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé entre l’animal et le lit, peut subvenir, du fait de la variabilité inter-animaux, de la sensibilité aux anesthésiques. Cette nuisance entraînera l’arrêt de l’expérimentation. L’administration orale de glucose avant l’imagerie peut induire un stress et une souffrance et des blessures physiques si l’animal bouge mais cela est très rare car la canule utilisée sera en matière souple avec un bout arrondi et le geste sera exercé par une personne qualifiée. Aucune autre nuisance n’est connue sur ce modèle murin transgénique mise à part la mort subite à 15 mois chez les femelles sans signe annonciateur.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la demande d’autorisation de projet seront mis à mort avec la répartition suivante dans chaque établissement utilisateur : - EU1, 456 seront mises à mort pour le prélèvement du cerveau et de l’intestin en vue de réaliser des analyses biochimiques et de biologie moléculaire et d’étudier l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Les couples reproducteurs de plus de 6 mois et souris surnuméraires (297 au total)) seront mises à mort après inclusion dans des études hors champ. - 296 souris seront envoyées vers chaque établissement utilisateur EU2 et EU3 qui disposent de systèmes d'imagerie cérébrale indispensables à l'étude. Ces souris (592) seront mises à mort après les imageries pour des analyses biochimiques et de biologie moléculaire post-mortem.

Remplacement

Des études préliminaires in vitro ont déjà été réalisées pour étudier l’efficacité des polyphénols à une dose non toxique pour différentes cellules du cerveau permettant ainsi de définir les doses ciblées dans cette demande de projet. Ici, il est important de prouver les effets bénéfiques de ces polyphénols sur le vieillissement physiologique et pathologique Alzheimer mais aussi de s’assurer qu’elles n’ont pas d’impact délétère sur les fonctions physiologiques de l’organisme. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour juger de l’effet d’une nouvelle molécule à visée thérapeutique in vivo dans le cadre du vieillissement qu’il soit physiologique ou pathologique.

Réduction

Deux collaborations nationales sont envisagées dans ce projet et dans les deux cas il s’agit d’étudier les effets bénéfiques de polyphénols. Le fait de regrouper ces études sur la même demande de projet permet une réduction du nombre de souris. Par ailleurs, plusieurs paramètres sont mesurés chez une même souris, permettant ainsi de réduire encore le nombre de souris. Une souris permettra en final de générer des données aussi bien au niveau périphérique avec l’analyse du microbiote intestinal mais aussi au niveau cérébral. Enfin, le projet se déroulera par étapes. Si les résultats bénéfiques dans les étapes antérieures restent très faibles voire absents, des lots d’animaux ne seront pas inclus dans la suite du projet. Ainsi le nombre d’animaux indiqué est un nombre maximum. Pour estimer le nombre d’animaux par lot de souris, nous avons utilisé un calcul qui tient compte de la variabilité des réponses du vivant ; le nombre d'animaux par lot permettra d'obtenir des résultats robustes sur le plan statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en animalerie exempt de tout organisme pathogène spécifique et opportunistes (couples reproducteurs) ou tout organisme pathogène spécifique en respectant l’Arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles. Une période d’acclimatation de 10 jours minimum sera respectée avant l’introduction des souris dans une procédure. Pour diminuer les stress lors de la prise de l’animal pour les tests comportementaux, les animaux seront manipulés par préhension durant les 2 semaines qui précèdent les tests à raison d’une fois par jour. Pour le test comportemental en piscine, il est prévu de maintenir les souris dans ses mains en coupe posées sur une serviette (utile pour éponger l’eau) avant de les remettre dans leurs cages qui seront placées sur un tapis chauffant pour réchauffer les souris entre chaque essai. Dans les EU2 et EU3, les animaux seront hébergés en zone SPF en maintenant les interactions sociales des groupes de souris dans les sous-lots suivis dans l’EU1 avec une période d’acclimatation de 10 jours, température de 20-24°C, avec un enrichissement du milieu changé régulièrement (jouet en plastique : tunnel, igloo, maison). Pour diminuer les stress liés aux sorties des cages et aux contentions, les animaux seront régulièrement manipulés par le personnel en charge de l’étude. Le transport des animaux sera assuré vers les établissements utilisateurs collaborateurs par une société agréée pour le transport de rongeurs. Les cages seront réceptionnées par l’EU1 avant la date de transport pour permettre aux zootechniciens(nes) de prendre le temps de préparer les cages en incluant l’enrichissement, les gels hydriques en bonne quantité et l’alimentation nécessaire. Les anesthésies avec exsanguination seront réalisées sur tapis chauffant à température régulée. Toutes les anesthésies et analgésies prévues respecteront les résumés caractéristiques des médicaments utilisés (posologie). Pour les imageries dans les EU 2 et 3, du gel ophtalmique sera appliqué afin de compenser la sècheresse oculaire. Dans les 3 EUs, il est prévu une fois par semaine, une pesée des animaux avec l’utilisation d’une grille de scores et la mise en place de points limites gradés et d’actions en réponse à l’atteinte des points limites.

Choix des espèces

Dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, il existe différents modèles murins génétiquement modifiés. Le modèle choisi est largement utilisé dans la littérature et surtout présente une cinétique progressive des lésions comme chez l’homme contrairement à d’autres modèles murins plus agressifs. Pour ce modèle, il est donc aisé de faire des comparaisons avec les autres études déjà publiées. Les souris seront incluses dès l’âge de 3 mois, âge pour lequel aucun stigmate Alzheimer n’est détectable donc très intéressant pour définir les données basales avant tout traitement. Des lots de souris seront utilisés jusqu’à l’âge de 12 mois où la perte de mémoire est quantifiable ainsi que les caractéristiques biologiques de la maladie. D’autres lots seront suivis jusqu’à l’âge de 18 mois où la perte neuronale pourra être quantifiée ainsi que les autres paramètres déjà quantifiés à 12 mois pour voir leur évolution.

Trente semaines de gavages quotidiens et d'injections dans l'abdomen deux fois par semaine, huit prélèvements sanguins par animal : 12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties sur cinq établissements. S'y ajoutent la pose chirurgicale d'implants d'œstrogène, une injection de cellules tumorales humaines, une ligature vasculaire et une biopsie de la queue au sixième jour de vie. Le porteur indique que le gavage comporte un risque de perforation de l'œsophage et de passage du liquide dans les poumons, et que les tumeurs devenues volumineuses provoquent des douleurs et des difficultés à s'alimenter. Les souris des procédures d'expérimentation sont tuées pour exploration anatomique, celles de l'élevage restent en vie pour l'accouplement, à l'exception des mâles immunodéficients.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

Réintégrées au troupeau de truies expérimentales à la fin des procédures, 16 truies vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent sous anesthésie l'implantation d'une capsule de mesure de la température interne et la pose d'un cathéter dans l'oreille, puis trois prises de sang par jour pendant quatre jours et trois mesures de température rectale quotidiennes, autour de la mise bas. Un capteur vaginal est également posé, que le porteur retirera en cas d'inflammation ou d'écoulements. L'objectif déclaré est d'affiner le diagnostic d'un syndrome de dysgalactie présenté d'abord comme la source de "pertes économiques importantes" en maternité et comme le premier motif d'antibiothérapie chez la truie.

Objectifs

Le déroulement de la mise bas et la phase post-partum chez la truie est sujet à des perturbations responsables de pertes économiques importantes en raison de la relation étroite entre la santé des porcelets nouveaux nés et de leur mère. En maternité, la prévalence du syndrome de dysgalactie post-partum (SDPP) peut atteindre 20-30% des truies mettant bas et est le principal motif de traitement par antibiothérapie chez les truies. Le SDPP se caractérise par une diminution de la production de lait des truies et/ou une incapacité à allaiter correctement leurs porcelets. La physio pathologie du SDPP est complexe avec des composantes multiples (hormonales, métaboliques, inflammatoires, infectieuses, etc..) qui interagissent probablement entre elles. Même si les facteurs de risques ne sont encore pas tous connus, le SDPP peut être causé par des erreurs de gestion des animaux ou des bâtiments combinées à la présence d’agents pathogènes dans la porcherie. Par exemple, une mauvaise gestion du plan d’alimentation en gestation rendant les truies trop grasses peut augmenter l’occurrence de SDPP. Après la mise bas, les truies sont généralement plus sensibles aux agents infectieux. Leur système immunitaire est affaibli par le stress, et les voies de mise bas ouvertes ainsi que les morsures sur les trayons et sur la peau des mamelles favorisent aussi le SDPP. Le SDPP se manifeste souvent par une hyperthermie transitoire et les truies malades peuvent présenter des mamelles rouges et dures, des écoulements vaginaux purulents, des troubles digestifs (constipation) et manifester des comportements particuliers (manque d’appétit, se couche sur leur mamelle, refus d’allaitement, etc.). Une utilisation raisonnée d’antibiotiques pour soigner cette pathologie passe par un bon diagnostic qui repose à la fois sur les signes cliniques mentionnés plus haut et sur la mesure de la température interne afin de détecter une montée en température indicatrice de fièvre. A l’heure actuelle, il reste des questionnements sur le seuil de température à partir duquel la décision de traiter la truie doit être prise mais également sur période de mesure (jour, et heure de la journée) la plus appropriée pour détecter si possible précocement le début du SDPP. L’objectif de l’étude est de faire une analyse comparative des méthodes actuellement disponibles pour monitorer la température interne des truies autour de la mise-bas et pendant la première semaine de lactation.

Bénéfices attendus

La mesure en continu de la température et des constantes physiologiques des truies pendant la période peripartum doit permettre d’affiner le diagnostic du SDPP. En particulier, le projet va permettre de déterminer le timing le plus informatif de la journée et de la période peripartum pour mesurer la température interne des animaux. Les connaissances acquises dans ce projet sont de nature à contribuer à mieux comprendre la physio-pathologie du SDPP pour, à terme, raffiner les pratiques promouvant une utilisation raisonnée des antibiotiques chez la truie.

Procédures

Implantation de la capsule de mesure de la température interne et du cathéter veineux auriculaire pour permettre des prises de sang et des mesures de la température interne en évitant de stresser l’animal. Ce geste s'effectuera sous anesthésie. Les sédatifs sont injectés par voie intramusculaire et les truies sont placées en décubitus ventral pendant une durée totale de 15 minutes (durée de l'intervention chirurgicale). - Prélèvements de sang à l’aide du cathéter auriculaire (3 fois par jour pendant 4 jours à raison de 2,5 mL par prélèvement) pour le suivi des constantes physiologiques (marqueurs de l’inflammation). Chaque prélèvement durera moins d'une minute. - Mesure de la température rectale (3 fois par jour pendant 4 jours). la prise de température rectale durera moins de 30 secondes

Impact sur les animaux

- Implantation de la capsule de mesure de la température interne et du cathéter veineux auriculaire : Le protocole de monitoring des animaux en place dans l'établissement d’expérimentation permettra d'appréhender le risque lié à la sédation. La sécurisation du cathéter auriculaire par une bande adhésive autour de l'oreille peut entraîner une gêne pour l’animal. - Prélèvements de sang à l’aide du cathéter auriculaire : Les prélèvements de sang étant réalisés par du personnel compétent dans le cadre de procédures où les points limites sont définis et où des observations quotidiennes sont faîtes sur les animaux, nous ne nous attendons pas à des nuisances particulières liées aux différents prélèvements. Toutefois, nous ne pouvons pas totalement exclure la possibilité d'avoir des infections locales liées à la présence et à l'utilisation du cathéter veineux auriculaire. Le cas échéant, l'infection sera très rapidement mise en évidence par la mesure en continu de la température interne et l'animal recevra un traitement adapté. - Prise de température rectale : cette mesure étant réalisée sur des animaux non contraint par du personnel formé nous ne nous attendons pas à des nuisances particulières liées à ce geste.

Devenir

L'ensemble des animaux réintègre le troupeau de truies expérimentales à la fin des procédures.

Remplacement

Le porc est l'espèce cible de ce projet qui vise à raffiner les méthodes pour diagnostiquer le SDPP chez la truie. Il n'est pas possible d'étudier les variations de la température interne et des constantes physiologiques sans utiliser des truies de génotype conventionnel (Large White x Landrace) pour objectiver les actions à mettre en place ensuite en élevage, et au bénéfice de leur santé et leur bien-être. L'utilisation d'animaux vivants est nécessaire pour rendre compte de processus biologiques extrêmement dynamiques et sujets à une large variabilité entre individus. Le remplacement n’est pas possible car l’utilisation d’animaux est inhérente au type d’étude.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum statistique en fonction des mesures effectuées, sachant que l'objectif du projet est d’évaluer par des mesures en continu ou des mesures ponctuelles l’évolution de la température de chaque truie et de la relier au déroulement de la période peripartum et à des marqueurs d’inflammation mesurés dans le sang. Compte-tenu de la variation inter-individuelle des mesures, il s'agit d'obtenir un suivi complet sur au moins 10 truies. A partir des résultats de l’étude ayant mise au point l’implantation du cathéter auriculaire, un total de 12 truies est un nombre optimal pour prendre en compte les échecs de fonctionnement du cathéter. Les prélèvements de sang au cathéter jugulaire sont réduits au volume nécessaire pour les dosages métaboliques (2,5 mL/prélèvement) pour une cinétique journalière avec 3 points de prélèvements. Ainsi, un volume total de 30 mL de sang sera prélevé pendant l’ensemble de l’essai (soit environ 0,2% du volume sanguin total à l'issue de l'expérimentation, en considérant qu'il y a 65 mL de sang /kg de poids vif). L’étude sera précédée par une phase de pré-test réalisée sur un maximum de 4 animaux.

Raffinement

Toutes les mesures seront réalisées par du personnel formé et expérimenté. Toute intervention potentiellement douloureuse ou stressante sera contrôlée, et les animaux suivis dans les minutes ou heures qui suivent. En cas de souci de santé, le vétérinaire en charge du suivi de l’élevage expérimental sera consulté et les animaux traités en conséquence. Dans le cadre de prélèvements répétés de sang, le recours à un cathéter veineux auriculaire permet de réduire significativement le niveau de stress induit par un prélèvement de sang obtenu à l'aide d'un lasso nasal sur un animal en contention. Enfin, les capteurs de température ont pour objet d'obtenir un grand nombre de données (toutes les 2 à 5 min) en continu pendant l’ensemble de la période de mesure sans avoir à manipuler l'animal. La surface des loges (64 m² pour un groupe de 16 truies en gestation et 9 m² pour chaque truie en lactation) permet à l'animal d'avoir une activité minimale et elles offrent la possibilité d'interactions avec les congénères. Dans chaque loge, des jouets (toile de jute) et d'autres dispositifs d'enrichissement (chaine) seront placés dans les loges et régulièrement renouvelés afin de limiter l'ennui. L’anesthésie est pratiquée 15 min avant l’intervention d’une durée de 10-15 min. Le protocole de monitoring des animaux en place dans l'établissement d’expérimentation (suivi de la saturation de l'hémoglobine en oxygène par oxymétrie de pouls et du rythme cardiaque) permet d'appréhender le risque lié à l'anesthésie. L’analgésie est assurée pendant les 3 jours après les interventions chirurgicales. Pour les points limites en lien avec le mode de logement / conduite des animaux, l’apparition de problème digestifs (constipation), de troubles locomoteurs (arthrites ou blessure) ou respiratoires nécessitera un traitement adapté. Les animaux ne seront pas exclus du dispositif expérimental si le traitement permet une guérison rapide de l’animal. Pour les points limites spécifiques (implantation du cathéter veineux auriculaire, du capteur de température et la pose du capteur vaginal), le risque d'inflammation de la zone chirurgicale sera évalué quotidiennement et le cas échéant qui sera prise en charge. Pour la pose du capteur vaginal, une inflammation ou d'une infection détectée par une augmentation de la température interne au-delà de 38,9°C et/ ou par la présence d’écoulements vaginaux sera traitée de la manière suivante : le capteur sera retiré et l’inflammation sera traitée.

Choix des espèces

- Le porc ne peut pas être remplacé par une espèce modèle compte tenu de la spécificité de ses réponses physiologiques pendant la période peripartum de la femelle reproductive - Le porc est l'espèce cible du projet qui vise à trouver une méthode alternative pour étudier les évolutions des constantes physiologiques dans une période de sa vie productive (début de lactation) où la truie est particulièrement sensible au développement du SDPP qui est la cause principale de l’utilisation d’antibiotiques chez la truie reproductrice. Nous avons choisi de travailler sur la truie reproductrice gravide car ce stade est spécifiquement touché par le SDPP. Nous travaillerons sur des truies en 3ème ou 4ème portées ce qui correspond à la parité moyenne des truies en élevage commercial. Pour le pré-essai, nous utiliserons des truies de réformes non gravides.