Recherche appliquée

Une à six heures de chirurgie pour implanter des électrodes dans le cerveau, puis des séances d'enregistrement la tête fixée, montant progressivement jusqu'à deux ou trois heures. 720 souris vont être utilisées ainsi dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie terminale pour prélever le cerveau et vérifier la position des électrodes. Elles subissent aussi une biopsie de la queue, un gavage quotidien démarré neuf jours avant le premier enregistrement et un hébergement individuel. Ces souris portent une trisomie qui modélise le syndrome de Down, et le porteur écrit que le phénotype n'est pas considéré comme dommageable, tout en décrivant l'isolement et la perte de liberté de mouvement comme des inconforts modérés.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'examiner le fonctionnement des circuits corticaux sur des souris modèles du syndrome de Down afin de mieux comprendre les mécanismes responsables des déficits cognitifs et comportementaux associés à cette pathologie et si possible comment les corriger. En effet cette maladie, liée au développement anormal du système nerveux à cause de facteurs génétiques (trisomie), se caractérise par des troubles du comportement, de l'humeur, des relations sociales, et des déficits cognitifs extrêmement invalidants. Les souris modèles du syndrome de Down présentent des déficits génétiques dans des gènes impliqués dans le développement du cerveau et le retard mental. Notre hypothèse principale, que nous testerons par des enregistrements électrophysiologiques et comportementaux, est que certains éléments des circuits neuronaux du cortex sont défaillants sur ces modèles, entrainant une activité cérébrale anormale qui perturbe l'encodage et la computation neuronale. Nous évaluerons également l'action sur le fonctionnement des circuits corticaux de 2 drogues (candidats médicaments) récemment proposées comme ayant un intérêt clinique potentiel contre le syndrome de Down. Ces drogues, qui affectent les mécanismes intracellulaires au sein des neurones, permettraient potentiellement de restaurer des interactions neuronales normales dans ces pathologies, contre lesquelles aucun traitement pharmacologique efficace n'est à ce jour disponible.

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies, notamment neurodéveloppementales telles que retard mental et syndrome de Down, ce qui représente un intérêt sociétal considérable.

Procédures

Les animaux seront soumis à 7 types d'intervention, sur une durée totale de 2 à 4 semaines : biopsie de la queue pour phénotypage, procédure instantanée (fraction de seconde), traitement pharmacologique par gavage (1 ingestion par jour, démarrage 9j avant le premier enregistrement); procédures chirurgicales (implantation, sous anesthésie, d'électrodes ou d'une barre miniature pour enregistrement chez l'animal vigile), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine; procédure d'enregistrement sur l'animal vigile libre, d'une durée de 7j, ou en mode tête-fixée, par sessions quotidiennes de quelques minutes au départ (période d'acclimatation d'1 à 2 semaines) puis progressivement jusqu'à 2 ou 3h (période d'apprentissage et d'entrainement, sur 1 à 2 semaines); procédure d'enregistrement sur l'animal anesthésié, d'une durée de 3 à 6h; et enfin anesthésie terminale pour prélèvement du cerveau, procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.

Impact sur les animaux

La biopsie de la queue pour phénotypage génère une douleur légère et de courte durée. Le traitement pharmacologique par gavage (1 ingestion par jour, démarrage 9j avant le premier enregistrement) représente un stress physique et psychologique léger, mais n'est associé à aucune douleur. Les procédures chirurgicales (implantation d'électrodes ou d'une barre miniature sur l'os cranien), d'une durée de 1 à 6h, sont effectuées sous anesthésie générale et donc sans douleur ni inconfort. L'acte chirurgical n'est associé à aucune perte de fonction. La récupération post-chirurgicale est accompagnée de traitement analgésique (démarré dès avant l'acte chirurgical), ce qui limite la douleur à un niveau modéré. La procédure d'enregistrement sur l'animal vigile libre ou en mode tête-fixée n'est associée à aucune douleur particulière. En plus de l'hébergement individuel (isolement), compensé par un enrichissement de l'environnement et des interactions quotidiennes avec l'expérimentateur, l'inconfort lié à la fixation de la tête (perte de liberté de mouvement) est modéré car mitigé par les interactions avec l'expérimentateur (handling, enrichissement comportemental lié à la tâche) et par une habituation très progressive (sessions quotidiennes de quelques minutes au départ). Les procédures d'enregistrement sur l'animal anesthésié et de prélèvement du cerveau sont effectuées sous anesthésie générale sans réveil, complétée par un traitement antalgique, et donc sans aucune perception de la part de l'animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort. Ceci est indispensable pour caractériser l'état histologique du cerveau et pour s'assurer de la localisation des électrodes (identifiée par un marqueur florescent, le DiI) après les enregistrements in vivo.

Remplacement

L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur le cerveau issu de l'animal vivant. Il est en effet à ce stade de nos connaissances impossible de modéliser de façon réaliste le fonctionnement cognitif in vitro ou in silico. Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car elle présente le meilleur équilibre entre les bénéfices (accessibilité expérimentale et pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation dont actes chirurgicaux, perfusion transcardiaque ou mise à mort en cas d'atteinte de point limite).

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Une difficulté notable dans le calcul a priori du nombre d'animaux nécessaire est que les variables étudiées sont nouvelles, et leurs paramètres statistiques (moyenne et variance) par conséquent inconnus. D'après la littérature du domaine, un scénario plausible pour les variables que nous caractérisons est d'être en mesure de détecter une différence de 25% entre 2 échantillons de petite taille issus de distributions suivant une loi Normale dont l'écart type est d'environ 20% de la moyenne. Il faut ainsi un échantillon de 10 animaux pour détecter avec une certitude de 95% (risque α de type I) et une puissance de 0.8 (risque β de type II) une différence de 25% entre 2 moyennes dont les distributions suivent une loi Normale (µ, σ=0.2µ). Le nombre d'animaux retenu dans notre protocole, nécessaire pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences réalisée avec un taux de succès de 50%, est donc de 20 par lot expérimental. Toutefois, les animaux sont préparés par petites séries de 4 ou 5 et les résultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procédure s'arrêtant dès que le nombre de 10 expériences réussies par groupe est atteint.

Raffinement

Les dommages en termes de souffrance animale sont minimisés par les conditions d'élevage (cages collectives et enrichies de carré de coton jusqu'à la chirurgie et autant que possible après), le suivi des règles de l'art pour les interventions chirurgicales (aseptie, anesthésie et antalgie), le suivi régulier (quotidien dans les periodes péri-opératoires) des animaux par le chercheur responsable et par le personnel animalier (définition de points limites de bien être général qui déclenchent soins particuliers, voire euthanasie, selon leur gravité : cf fiche de suivi en annexe). Les animaux utilisés sont des souris d'une lignée transgénique modèle du syndrome de Down. Ce modèle a pour but de reproduire les altérations développementales des circuits neuronaux qui sous-tendent la pathologie chez l'homme. Toutefois, aucune étude à notre connaissance ne montre que les troubles associés au développement des circuits neuronaux dans le modèle que nous utilisons soient douloureux pour l'animal, et le phénotype n'est pas considéré comme dommageable.

Choix des espèces

Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. Elle est également une espèce de choix pour modéliser les pathologies cérébrales concernées par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinance par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (8-12 semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats (meilleure récupération post-chirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire.

Les souris utilisées appartiennent à des lignées dont la rétine dégénère rapidement, l'une perdant sa réponse électrophysiologique dès quatre mois. 540 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une injection sous la rétine, qui peut provoquer un décollement rétinien, une opacification de la cornée ou des saignements dans l'œil, puis passe des séances d'électrorétinographie et de tomographie sous anesthésie à six âges différents, une partie subissant en plus un test de réflexe optomoteur de trois fois vingt minutes à cinq âges et un test clair-obscur. La mise à mort sert à prélever les rétines pour des marquages histologiques et des analyses transcriptomiques, l'ensemble visant à documenter une thérapie génique avant un éventuel essai clinique.

Objectifs

Plus de 200 gènes sont actuellement associés à la cécité congénitale. Bien que la thérapie génique ait été proposée pour un grand nombre de ces gènes, cette approche présente des limites. Nous avons la preuve que l'introduction d'une copie saine d'un gène spécifique impliqué dans le développement des photorécepteurs (cellules de détection de la lumière dans l'œil) peut retarder la perte de vision. Pour explorer plus avant cet effet thérapeutique, nous utiliserons deux modèles murins différents de cécité congénitale causée par des mutations dans différents gènes. Notre objectif est d'établir l'effet thérapeutique et d'élucider les mécanismes à l'origine de cet effet.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, peu de thérapies sont proposées aux patients atteints de rétinopathies. La plupart permettent uniquement de ralentir la dégénérescence. Certaines, plus efficaces, sont uniquement proposées en fonction de votre mutation. Nous réalisons ce projet afin de développer une thérapie génique efficace pour de rétinopathies. Nous espérons par ce projet démontrer l’efficacité de notre traitement sur plusieurs modèles animaux, qui serviront de preuves de concept, ou d’études précliniques, nécessaires à réaliser en amont d’essais chez les patients. Le but est de poursuivre vers un essai clinique.

Procédures

Toutes les souris recevront une injection sous rétinienneous. Par la suite, les animaux seront soumise a ERG (mesure non invasive de la réponse électrique de la rétine à un stimulus lumineux) et un OCT (visualisation non invasive de la rétine en coupe chez la souris) sur les deux yeux (environ 20/30 minutes) à 6 âges diffeérents. Une autre partie des souris passeront un test de reflexe optomoteur (3 x 20 minutes espacés d’1 heure minimum) à 5 âges diffeérents. Ce test permet de quantifier les reflexes oculaires de la souris et se fait donc sur animal vigil. Elles pourront également réaliser un test comportemental appelé clair/obscur (5 minutes), ou la souris est filmée en train d’explorer une boite soit noire soit éclairée.

Impact sur les animaux

Les anesthésies répétées peuvent être dommageables pour les souris, mais elles sont espacées de 14 jours minimum. L’injection sous rétinienne peuvent provoquer un décollement rétinien qui se résorbe en 48h. Une opacification de la cornée peut être observée malgré l’ajout systématique de gel ophtalmique. Si une cataracte apparait néanmoins, elle se résorbe normalement d’elle-même rapidement. Si les animaux présentent des saignements anormaux dans l’œil lors de l’injection ou avant leur réveil.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, afin de récupérer les rétines et réaliser des marquages immunologiques sur les coupes histologiques, ou analyser les effets de notre traitement au niveau transcriptomique et protéique.

Remplacement

Le projet visant la validation d’une stratégie thérapeutique pour le traitement de maladies rétiniennes, une validation de ces approches in vivo est un prérequis des agences réglementaires avant la mise en place d’essais cliniques. Il est également fondamental de travailler sur des modèles animaux présentant des pathologies comparables à celles développées chez l’Homme. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie également par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones dont les interactions sont cruciales pour générer un signal visuel correct. Dans ce contexte il est essentiel de travailler in vivo car les processus de mort cellulaire, de neuroprotection, ou de réparation sont totalement dépendants de l’environnement cellulaire. Pour ces différentes raisons, des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

L'étude préclinique s'étendra sur une période de deux ans et a pour but d'évaluer l'efficacité d'une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie ophtalmique. Cette thérapie sera expérimentée sur deux lignées de modèles animaux. L'objectif est de confirmer l'efficacité du traitement sur un vaste panel de patients et de comprendre son mode d'action. La première phase de l'étude consistera à identifier la dose optimale à administrer à chaque modèle animal. Par la suite, une comparaison de l'efficacité du traitement sera effectuée. Seuls les animaux ayant reçu la dose la plus efficace seront soumis aux étapes ultérieures. L'objectif de cette étude est d'obtenir entre 7 et 10 yeux par traitement, afin de garantir des résultats statistiquement pertinents. Ce chiffre a été établi sur la base de données scientifiques. Seuls les animaux ayant été correctement injectés dans au moins un œil seront pris en compte dans l'analyse. Il est également possible que le nombre de modèles animaux soit réduit en fonction des résultats obtenus. Si, après un certain temps, le traitement s'avère inefficace, l'étude sera interrompue.

Raffinement

Durant l’injection sous-rétinienne, une anesthésie locale sera effectuée en plus de l’anesthésie générale. Une goutte de gel oculaire hydratant sera déposée sur l’œil des animaux pour préserver la cornée. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’au réveil. Afin de prévenir une éventuelle douleur, les animaux recevront un anti-inflammatoire suite à l’opération. Ils seront observés quotidiennement pour surveiller l’apparition éventuelle d’infection oculaire. Une grille de score adaptée est utilisée pour apprécier l’état des animaux, ce système comprend des points limites précoces qui permettent de détecter les premiers symptômes de douleur ou d’inconforme et d'intervenir rapidement.

Choix des espèces

La thérapie génique que nous souhaitons développer nécessite d’être validée in vivo avant d’être testée chez l’homme. Afin d’être le plus proche des pathologies humaines que nous souhaitons traiter, et ainsi évaluer les bénéfices/risques de notre approche thérapeutique, nous prévoyons d’utiliser des souris comme modèle d’étude. L’existence de lignées de souris atteintes naturellement ou non de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. Nos modèles sont bien établis en recherche ophtalmologique. Chaque modèle est différent, et les temps choisis pour les injections correspondent aux contraintes imposées par la dégénérescence rétinienne. Comme nous connaissons les modèles animaux que nous allons utiliser, nous pouvons définir le temps auquel il est plus pertinent d’injecter nos AAV, ainsi que les temps auxquels il faudra réaliser les expériences. Les rétines des souris utilisées dégénèrent très rapidement. Nous injectons donc à 14 jours aprés naissance et regarderont 21 jours plus tard les effets de l'injection. Les souris d'une autre lignée présentent une faible réponse électrophysiologique (ERG) dès l'âge de 4 mois, c'est pourquoi nous réaliserons les injections 30 jours après la naissance et examinerons l'efficacité de ces injections 30 jours plus tard. Nous observerons ensuite les effets de notre traitement entre 3 semaines et 1 an après injection.

Exposés six mois durant à des microplastiques issus de pneus et de plastiques dits biodégradables, 1 920 médakas marins subissent jusqu'à cinq anesthésies pour être mesurés et pesés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre eux passe cinq jours isolée en bac individuel pour une série de tests comportementaux, dont un de quarante-deux minutes. Le porteur reconnaît ignorer si des effets sublétaux ou létaux apparaîtront au cours de l'exposition, et retient la mélanisation, les infections et la nage altérée comme points limites. Tous sont tués pour analyse moléculaire et histologique de leurs organes, et les tests comportementaux, qualifiés de non invasifs, ne sont jamais nommés.

Objectifs

La production et l'utilisation de matières plastiques ont considérablement augmenté depuis 1950. Les plastiques sont très divers par leur composition chimique en polymère(s) et en additifs. Dans certains cas l'usage d'objets en plastique conduit à l'émission dans l'environnement de plastique sous forme de petites particules appelées microplastiques (MP) pour des tailles de 1 à 5000 μm et de nanoplastiques pour des tailles inférieures. C'est le cas par exemple des pneus, de certaines peintures ou de produits phytosanitaires. Au-delà de ces cas, la mauvaise gestion des déchets plastiques fait que de nombreux plastiques finissent dans l'environnement où ils se fragmentent sous l'effet de contraintes physico-chimiques jusqu'à former des MP ou des nanoplastiques. Outre la diversité de composition et de taille déjà évoquées, les MP varient dans leur forme qui dépend de leur origine (e.g. fil, fragment, pellet). Les plastiques biodégradables sont apparus comme une alternative potentielle aux plastiques conventionnels avec, par définition, la propriété de se dégrader dans l'environnement et donc de limiter leur impact. Cependant leur toxicité chronique n'a jamais été étudiée, de même que leur potentiel à se fragmenter dans les organismes en raison de leur biodégradabilité justement. L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité chronique chez un poisson de MP issus de différents pneus (variant par leur composition) et de plastiques biodégradables en composteur industriel ou en milieu marin). Des MP de PS (polystyrène) serviront de référence pour des plastiques conventionnels.

Bénéfices attendus

Les recherches présentées dans cette demande s'attacheront à identifier les effets des MP sur les populations de poisson. Cela devrait à terme fournir des données scientifiques nouvelles sur les risques des MP pour les écosystèmes aquatiques et ainsi permettre de mieux réglementer leur rejet et informer le public sur les risques environnementaux associés à ce type de déchets.

Procédures

Durant le projet, les individus seront chacun soumis à un maximum de cinq anesthésies pour biométrie (mesures taille et poids). L’ensemble de l’intervention ne dure pas plus de 5 min par poisson (transfert en quelques secondes dans le bac d’anesthésie, biométrie ~1 min) puis transfert en bac de réveil où le poisson est laissé pendant quelques min pour récupérer. Un sous échantillon d'individus est également soumis à des tests comportementaux non-invasifs, à raison d’un test quotidien sauf en jour 1 où un test en groupe puis un test en individuel s’enchaînent (pour une durée totale de 14 min de test) avec une période de repos total de 24 h pendant laquelle le poisson est nourri et placé dans un bac individuel en contact visuel proche avec ses congénères. Ci-dessous est présenté le détail des durées des différents tests : - Test 1 (en groupe) (jour 1): 5 minutes - Test 1 (individuel) (jour 1) : 9 minutes - Test 2 (individuel) (jour 2) : 7 minutes - Test 3 (individuel) (jour 3) : 42 minutes - Test 4 (individuel) (jour 4, 5) : divisé en 3 “sessions”, chacune d’une durée de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Des études précédentes ont montré l’absence de toxicité lors d’expositions aiguës ou chroniques aux MP (microplastiques) de différentes natures ou de mélange de plusieurs polymères chez le medaka marin et d'autres espèces bien que certains défauts subléthaux soient notés tels qu’une diminution de la croissance (moindre gain de poids en comparaison aux contrôles) et une baisse de la fécondité (baisse du nombre d’œufs produits pas femelle). Cependant des expositions aux MP de pneus de différentes compositions, ou de MP biodégradables en composteur industriel ou en milieu marin n'ayant jamais été réalisées, l'apparition d'effets subléthaux voire léthaux au cours des 6 mois d'exposition est donc pour l’heure inconnue. Il est cependant possible d’observer des effets subléthaux précocément durant la période d’exposition et de rapidement mettre en oeuvre l'arbre de décision des points limites à respecter.

Devenir

En cours ou en fin de projet, les animaux seront prélevés après euthanasie pour l’analyse moléculaire et histologique des organes.

Remplacement

Le Remplacement n'est pas possible dans le cas présent car nous étudions des fonctions intégratives à l’échelle individuelle des effets des microplastiques sur les téléostéens.

Réduction

Les effectifs ont été estimés à partir d’une analyse de puissance statistique afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisé dans le projet tout en conservant un effectif suffisant pour avoir des résultats fiables. L’analyse des résultats se fera grâce à des tests d’analyse de variance à 2 facteurs sur les différentes variables mesurées en incluant sexe et traitement comme facteurs fixes. Ils seront suivis de tests statistiques de comparaison multiple pour identifier les différences spécifiques entre les concentrations d’un même traitement.

Raffinement

Les individus, élevés en groupe dans des structures adaptées à l’espèce, sont observés trois fois par jour lors du nourrissage, ainsi l’atteinte d’un des points limites fixés (mélanisation, infection, nage altérée) sera identifié de manière précoce. Pendant les expériences menées pour l’étude des aptitudes comportementales, les individus sont gardés en bacs individuels pendant 5 jours afin de pouvoir conserver leur identité. Le stress qui pourrait être provoqué par l’isolement est réduit par la mise en place d’un contact visuel de proximité entre les poissons. Enfin, lors des mesures de taille et poids, les poissons sont maintenus en groupe jusqu’à l’anesthésie et manipulés seulement sous anesthésie.

Choix des espèces

Le médaka marin est un modèle animal qui permettra d’aborder les effets physiologiques des microplastiques de différents types sur les poissons osseux en milieu marin. L'espèce est caractérisée par une reproduction non-saisonnière en laboratoire, une bonne fécondité et par des cycles de vie courts qui permettent d’aborder aisément les questions des effets à long-terme impliquant des expositions à l’ensemble des stades de vie. Le démarrage de l'exposition dépend de la taille des MP (microplastiques) utilisés. Les animaux seront exposés à partir de 2 mois d'âge (MP de pneu) ou 1 mois d'âge (pour les autres MP) et se poursuivra durant l’ensemble de leur cycle de vie afin d’étudier la toxicité des différents MP sur les différents stades aux sensibilités différentes (croissance juvénile, maturation sexuelle). Ils seront manipulés au stade juvénile (1, 2 mois) et adulte (jusqu'à 6 mois) pour des mesures de croissance, d'évaluation de la reproduction et de comportement (maturité du système nerveux optimale) respectivement.

1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 900 d'entre elles reçoivent pendant douze semaines un régime gras destiné à provoquer un diabète de type 2, les 108 autres étant diabétiques par modification génétique, puis chacune subit sous anesthésie l'ouverture d'une plaie dans la peau du dos, avec un dispositif de recueil implanté autour et un suivi de quinze à vingt jours. Le porteur signale que le régime gras rend souvent les souris agressives envers leurs congénères et que la plaie devient douloureuse quand l'animal doit s'étirer. Sur le remplacement, il décrit des tests sur cellules ayant servi à présélectionner les traitements, sans indiquer ce qui empêche d'aller plus loin sans animaux.

Objectifs

De nos jours, la cicatrisation des patients diabétiques et des sujets agés demeure un enjeu social et économique crucial. De précédents travaux ont démontré un retard dans la vitesse de cicatrisation chez différents modèles murins diabétiques, causé par un état inflammatoire persistant. Aucune stratégie thérapeutique n’a encore permis d’apporter de véritables solutions efficaces, dans l’amélioration de la vitesse de cicatrisation chez le patient diabétique de type 2. La compréhension de la dérégulation des mécanismes cellulaires et moléculaires du processus cicatriciel chez le diabétique représente donc un enjeu essentiel pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le dispositif placé sur le dos de l'animal permet de récolter in situ la totalité de l’exsudat présent sur la plaie. Cette méthode de prélèvement préserve l’intégrité morphologique et fonctionnelle de différentes populations cellulaires et de différents médiateurs contenus dans l’exsudat, permettant de suivre l’évolution de la phase inflammatoire et de sa résolution. Notre dispositif nous donne ainsi une vraie « image de la plaie » et de son environnement. Ce dispositif permet l’administration de solutions à travers un septum directement sur la plaie et plus particulièrement de nouveaux principes actifs pouvant agir sur la vitesse de cicatrisation. Ainsi, les avancées récentes sur la compréhension de la dérégulation de la cicatrisation chez les patients diabétiques, notamment sur l’implication des macrophages, et notre savoir-faire sur ces cellules, ouvrent de nouvelles perspectives quant aux stratégies expérimentales à développer. L’exploitation de nos résultats de recherche et l’utilisation de notre dispositif expérimental innovant rendent possibles : i) le test de nouvelles molécules par application topique et; ii) la caractérisation des populations cellulaires présentes aux différentes étapes de ce processus (phase inflammatoire, phase de résolution, phase de réparation) sur un même animal, et iii) l’étude de nouveaux mécanismes d’actions favorisant la cicatrisation chez le patient diabétique en déterminant des cibles thérapeutiques(animaux génétiquement modifiés, administration de cellules pro-resolutives ).

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime gras afin d’induire un diabète de type 2 pendant 12 semaines (900 souris). Les animaux diabétiques soumis au régime gras (900) ou génétiquement diabétiques (108) subiront ensuite une procédure chirurgicale sous anesthésie permettant de créer une lésion cutanée dorsale et un dispositif non invasif sera implanté sur le pourtour de la plaie (1008 souris). La durée de l’anesthésie et de l’intervention est de 10min par animal. Les animaux seront suivis pendant 15-20 jours (observations de leur état général et suivi de la fermeture de la plaie par photographie). Les traitements cicatrisants seront administrés soit par injection intrapéritonéale (durée de quelques secondes), soit dans l’eau de boisson ad libitum ou par gavage (durée de quelques secondes), ou directement sur la plaie (durée de quelques secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux soumis à un régime gras afin d’induire un diabète de type 2 présentent très souvent un comportement agressif vis-à-vis de leurs congénères. La formation de la plaie peut induire de la douleur et l’animal peut modifier son comportement en réduisant ces mouvements. Le traitement par voie topique commencera 3 jours post-lésion. Il sera appliqué une fois par jour jusqu’à la cicatrisation complète. Ce mode d’administration sera privilégié car le dispositif facilite le traitement topique et ne génère aucune souffrance à l’animal. Pour le traitement par gavage ou dans l’eau de boisson peuvent altérer la prise hydrique.

Devenir

A l’issue du régime hyperlipidique et du suivi de la plaie, les animaux seront sacrifiés afin de prélever les tissus cicatriciels à différents temps post-lésion.

Remplacement

Nous testerons plusieurs types de traitements par voie topique et par voie orale qui sont susceptibles de pouvoir améliorer la cicatrisation chez les patients diabétiques. Ces traitements, auront été présélectionnées via des résultats préliminaires réalisés en amont de ces études. Ces études sont basées sur des tests in vitro qui permettent d’appréhender les effets potentiels des traitements sur les processus cicatriciels (contraction, migration et prolifération cellulaires, différenciation…). Les cellules pro-résolutives auront également été sélectionnées en amont grâce à des tests in vitro au laboratoire (cellules myéloides et mesenchymateuses).

Réduction

Les résultats actuels ont permis de valider, en fonction des différents et nombreux paramètres à évaluer, qu’un nombre de 9 souris par lot est nécessaire afin d’acquérir des données suffisantes et permettre d’effectuer des tests statistiques fiables. L’expérience et les données déjà acquises sur des souris contrôles nous permettrons de comparer la fiabilité de nos données et d’éviter l’utilisation inutile d’animaux (éviter le double emploi).

Raffinement

Au cours du régime gras, les animaux seront pesés 1x/semaine. Au cours du processus de cicatrisation, une surveillance journalière sera effectuée afin de suivre le poids par une pesée mais aussi le comportement des animaux. La perte de poids (20% maximum), le changement de posture (recroquevillée, tremblement...), la modification d’activité (isolement, difficulté respiratoire) et l’aspect des poils sont des signes de douleurs qui seront des critères d’arrêt de l’étude. Bien que le dispositif n’entrave pas le mouvement des animaux, la plaie peut être douloureuse lorsque l’animal doit s’étirer. Suite à la création de la lésion cutanée pratiquée sous anesthésie sur le dos des animaux, des biberons avec embouts longs, ainsi que des croquettes humidifiées permettront de faciliter l’hydratation et la prise de nourriture de ces souris. Ces aménagements permettront de limiter les déplacements et les redressements des animaux pour se nourrir. L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux.

Choix des espèces

Les souris représentent le modèle préclinique idéal. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés. Cette approche permettra d'étudier des mécanismes moléculairesafin de définir des cibles thérapeutiques. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. De plus, le modèle de souris diabétique mime la physiopathilogie du diabète observée chez l'homme avec une inflammation chronique à bas bruit altérant les mécanismes de cicatrisations. Le diabète de type 2 est essentiellement observé à l’âge adulte. Des souris présentant un état diabétique spontané et une obésité caractéristique du diabète de type 2, comme rencontré chez l’homme, seront utilisées entre 7 et 12 semaines. Le modèle du diabète de type 2 sera induit chez des souris mâles âgées de 6-7 semaines (stade adulte) par un régime riche en graisses (régime diabétogène) pendant 12 semaines minimum. L’âge influençant la cicatrisation, les expérimentations pourront être effectuées sur des animaux âgées entre 12-20 mois.

Immunodéprimées pour que des cellules tumorales humaines prennent sans être rejetées, 272 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules exprimant la mésothéline sous anesthésie, puis des séances d'imagerie par bioluminescence également sous anesthésie, et 24 d'entre elles un prélèvement sanguin. Le porteur écrit qu'elles développeront une pathologie humaine potentiellement grave et que l'anesthésie, les pesées et les mesures de masse tumorale peuvent être source d'angoisse. Toutes sont tuées pour que leurs organes soient examinés en imagerie ex vivo, l'objet étant de mettre au point un agent d'imagerie servant à présélectionner les patients éligibles à une thérapie ciblée.

Objectifs

Combiner l’imagerie des tumeurs et un traitement ciblé constitue une avancée prometteuse dans le domaine de la médecine personnalisée, c'est-à-dire adaptée à chaque patient. Cette combinaison d’approches se base sur l'utilisation d’une même cible tumorale pour, à la fois, guider la pré-sélection des patients susceptibles de mieux répondre au traitement ciblé et suivre l’effet du traitement et l'évolution de la maladie. La mésothéline est une protéine présente en grande quantité dans divers cancers agressifs tels que ceux des ovaires, du pancréas, du sein triple négatif et des poumons, pour lesquels les options thérapeutiques sont limitées. En raison de sa forte expression dans les tumeurs et de son rôle dans le développement tumoral, la mésothéline est une cible intéressante. Les anticorps à un seul domaine sont des molécules attrayantes en raison de leur petite taille, de leur courte demi-vie sérique, de leur spécificité et de leur modularité. Ils sont utilisés pour développer de nouveaux traitements et des agents d’imagerie non invasive. Des anticorps à un seul domaine ciblant la mésothéline ont été utilisés pour développer des agents d'imagerie non invasive afin de faciliter le diagnostic des patients atteints de cancer sur-exprimant la mésotheline. Après une caractérisation in vitro approfondie sur des différents modèles cellulaires, la capacité des molécules candidates à cibler spécifiquement les tumeurs sera évaluée in vivo sur des modèles murins porteurs de greffes de cellules tumorales humaines exprimant la mésothéline. Ces avancées pourraient ouvrir de nouvelles perspectives dans le diagnostic et le traitement des cancers associés à la surexpression de la mésothéline.

Bénéfices attendus

Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car dans une perspective de thérapie ciblée des cancers exprimant la mésothéline, le développement d’agents d’imagerie spécifiques de la mésothéline comme test compagnon pour prédire l'éligibilité des patients, suivre la réponse au traitement, surveiller l’évolution de la maladie l’évolution ou pour guider en temps réel l’exérèse des tumeurs au cours d'une intervention chirurgicale est d'une importance croissante.

Procédures

L’ensemble des animaux recevra l’administration de candidats diagnostiques et subira une transplantation de cellules tumorales sous anesthésie (durée= 6 à 10 minutes/souris). Le ciblage tumoral par les composés sera effectué par imagerie optique par bioluminescence, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris). Enfin, 24 animaux sur les 272 prévus dans ce projet subiront également un prélèvement sanguin (durée = moins d’1 minute) à l’aide de matériel dédié aux rongeurs.

Impact sur les animaux

Les animaux seront transplantés avec des cellules tumorales et développeront donc une pathologie humaine potentiellement grave. L’ensemble des animaux recevront des molécules candidates pour de l’imagerie optique de tumeurs. L'anesthésie des souris nécessaire à l’imagerie et à la transplantation, les pesées et les mesures de masse tumorale peuvent être source d'angoisse.

Devenir

L'ensemble des animaux de cette étude sera mis à mort à la fin des étapes expérimentales pour des raisons de caractérisations ex vivo par imagerie sur les organes.

Remplacement

Le projet in vivo est dans la continuité d’études réalisées in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez des patients. Nous avons besoin d’un modèle pertinent permettant de reproduire au mieux, non seulement la complexité du développement tumoral d’un point de vue phénoménologique, mais également la biodistribution des molécules candidates.

Réduction

Les études in vivo ne seront réalisées que sur les molécules candidates qui auront démontré une efficacité maximale in vitro. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir démontrer que l’effet de nos molécules est significatif par rapport aux groupes contrôles. De plus, lorsque ce sera possible, nous mutualiserons les groupes contrôles. La comparaison de différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

Les procédures d’implantation des cellules tumorales et d’imagerie par fluorescence seront réalisées sous anesthésie volatile. Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de coton et de dômes en carton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type d’études chez l’homme sans données précliniques solides. Nous avons retenu le modèle murin car l’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de tumeurs humaines chez un individu hôte d’une espèce différente. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature et dans nos propres études, pour ce type de modèle d’injection de cellules tumorales humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.

Tester des candidats médicaments fournis par des clients, dont le porteur écrit ne connaître ni la nature ni les effets secondaires possibles : 2 160 rats sont utilisés pour cela dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leurs tissus. On leur provoque une prostatite ou une hypertrophie de la prostate, avec des chirurgies pour injecter des composés directement dans la prostate, poser des pompes osmotiques ou des cathéters vésicaux externalisés, après quoi ils passent jusqu'à 48 heures en cage individuelle. S'ajoutent jusqu'à 24 heures en cage à métabolisme, trois heures trente en cage de restriction pour la cystométrie et une heure de contention pour un test de douleur. Le porteur écrit qu'aucun test statistique n'a servi à calculer les effectifs, retenus à douze animaux par groupe sur la base de son expérience et de la littérature.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur des modèles mimant différentes pathologies de la prostate (prostatite, hypertrophie bénigne de la prostate). La population vieillissant, de nombreuses pathologies de la prostate chez l’homme engendrent des problèmes urinaires ayant un impact important sur le bien-être et la qualité de vie (problème de sociabilisation, sujet tabou…). Il est donc nécessaire de réaliser des études expérimentales pour cette thématique de recherche.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et/ou avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de pathologies de la prostate (prostatite et hypertrophie bénigne de la prostate).

Procédures

Les animaux seront traités avec des candidats médicaments ou des agents inducteurs de pathologie par des voies d’administration classiques. Ces gestes, réalisés par du personnel qualifié et ayant de l’expérience, seront rapides (environ 1 min) pour limiter la manipulation des animaux et la gêne occasionnée. Les animaux auront des chirurgies pour l’administration de composés directement dans la prostate ou via l’implantation de pompes osmotiques ou d’implants (chirurgie rapide, environ 15 min). Les animaux pourront avoir une chirurgie un peu plus longue (environ 30 min) avec l’implantation de cathéters externalisés (cathéter vésical et d’administration). Les animaux pourront avoir des prises de glycémie donc un léger prélèvement sanguin à la queue (1 goutte) étant très rapide (1 min) 2 fois par semine. Des prélèvements sanguins plus importants pourront être réalisés au cours des traitements selon les protocoles expérimentaux (geste rapide 1-2 min) sur animal vigile (1 fois par semaine maximum). Les animaux pourront être mis dans des cages à métabolisme pendant 24H maximum ou être mis dans des cages de restriction pour évaluer le profil mictionnel via la cystométrie (pendant 3H30). Après l’implantation de cathéters externalisés, les animaux seront mis dans des cages individuelles pendant 48H maximum. Les animaux subiront un test comportemental de douleur où ils seront dans des « cages » de restriction pendant 1 heure environ (30-45 min acclimatation pour que l’animal se calme et test de douleur pendant 15 min). Ce test comportemental sera réalisé avant l’induction de la pathologie et à différents temps après l’induction de la pathologie.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, ces modèles miment des pathologies prostatiques humaines, les animaux pourront ressentir les mêmes symptômes tels que des troubles urinaires, une douleur pelvienne. De plus, une chirurgie peut toujours entraîner une gêne post-opératoire lors de la cicatrisation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet car des tissus seront collectés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique réellement efficace pour le traitement des pathologies prostatiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience sur ces modèles et les publications scientifiques publiées, un nombre minimum de 12 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre deux groupes et des tests pour évaluer la différence entre plusieurs groupes (tests paramétriques ou non-paramétriques selon la normalité des groupes). Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) notamment pour le suivi mictionnel via l’utilisation de cages à métabolisme. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, morceau de bois…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée afin d’éviter toute hypothermie. Un antalgique sera administré pour diminuer la douleur des chirurgies. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Nous essayons d’utiliser des méthodes non invasives (test de comportement, cages métaboliques) et d’acclimater les animaux avant l’expérimentation aux différentes installations afin de limiter au maximum le stress des animaux. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Les différents modèles sont bien décrits chez le rat dans la littérature et permettent de mimer les 2 pathologies prostatiques non cancéreuses les plus diagnostiquées et impliquant des troubles urinaires et/ou douleurs engendrant une diminution non négligeable de la qualité de vie des patients. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 6 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.