Recherche appliquée

Quarante-deux jours d'administration quotidienne par gavage ou par injection, et une colite entretenue par un produit chimique ajouté à l'eau de boisson sur des cycles de cinq jours espacés de neuf : 1 200 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Le produit altère le côlon, provoque des diarrhées et une perte de poids d'environ 10 % malgré une alimentation normale. La molécule testée a déjà passé un essai de phase 2 chez des patients atteints de rectocolite hémorragique et se trouve en phase 3, et il s'agit ici de tester son association avec d'autres composés en vue d'une autorisation de mise sur le marché. Le porteur retient des souris de neuf semaines, âge qu'il décrit comme optimal pour une colite ni trop importante ni trop mineure.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (rectocolite hémorragique et maladie de Crohn) touchent plus de 0,3% de la population mondiale et sont de plus en plus fréquentes avec l'industrialisation des pays. Les traitements existants ne sont parfois pas efficaces ou non-suffisamment efficaces avec une très grande variabilité au sein des malades. Ainsi, la proposition de nouvelles thérapies est nécessaire. Notre molécule a montré une efficacité anti-inflammatoire dans le modèle murin de colite et chez le patient atteint de rectocolite hémorragique lors d'un essai clinique de phase 2 et est actuellement évaluée dans un essai de phase 3. Dans l’objectif d’une autorisation de mise sur le marché de cette molécule en tant que médicament, nous voulons étudier la possibilité de l’associer avec d’autres composés déjà sur le marché ou en développement, pour améliorer la réponse des patients au traitements.

Bénéfices attendus

La démonstration de l’intérêt d’une association de notre molécule avec d’autres thérapies existantes, permettra d’offrir de nouvelles possibilités aux malades qui ne répondent pas aux traitements actuels des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.

Procédures

Les animaux seront exposés à l'ingestion d'un produit chimique ajouté à l'eau de boisson sur des périodes de 5 jours entrecoupées de 9 jours. Ils recevront un traitement par voie orale ou par injection (intrapéritonéale ou intraveineuse) de façon quotidienne sur une durée de 42 jours maximum. Cette procédure est non douloureuse et réalisée avec une contrainte faible en environ 10 secondes. Une prise de sang sera réalisée à la fin du protocole afin d'analyser différents paramètres biologiques. Cette procédure est réalisée sous anesthésie et est réalisée en maximum 30 secondes. Ces gestes seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus chez les animaux résultent de l’administration d’un composé chimique qui mime une inflammation du colon chez l’homme. Ce produit chimique induit une altération du colon provoquant une inflammation suivie par une perte de poids de l’ordre de 10% chez les souris, malgré une alimentation et une hydratation normale, et des diarrhées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude pour pouvoir réaliser des prélèvements de tissus et évaluer l’efficacité du traitement.

Remplacement

Nous voulons étudier le traitement d’une inflammation du colon et pour cela seule l’utilisation d’un modèle murin est adaptée car il permet d’étudier les effets sur un organisme vivant dans son intégralité étant donné que ce traitement a vocation d’être ensuite utilisé chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en permettant l’obtention de résultats solides garantis par des analyses statistiques. Le nombre de souris pour chaque groupe est fixé à partir des résultats précédemment obtenus dans un modèle d’inflammation murine du colon et les données recueillies dans la littérature.

Raffinement

La surveillance des animaux se fera régulièrement avec une évaluation du stress et de la douleur grâce à l'utilisation d'une grille de score, permettant d'évaluer l'atteinte des points limites. L'administration répétée des composés par voie orale ou injection sera réalisée par du personnel entrainé à un geste précis et rapide, ceci afin de limiter le stress de l'animal. L'hébergement des souris sera enrichi par l'ajout dans les cages de cabane en carton et de cotons, favorisant par exemple la construction de nids. Un fond musical est également assuré dans les locaux afin de diminuer le stress des animaux. Lors des périodes de récupération des animaux, de la pâtée alimentaire sera également distribuée dans les cages pour favoriser leur hydratation.

Choix des espèces

Le modèle murin d’inflammation du colon est très documenté et permet de reproduire les symptômes et les mécanismes immunitaires de la rectocolite hémorragique chez l'homme. C’est un modèle très utilisé car sa mise en place est rapide et non invasive (ajout d’un composé chimique dans l’eau de boisson) tout en offrant une bonne reproductibilité des résultats, évitant ainsi la répétition des études et limitant l’utilisation d’animaux. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 9 semaines car c’est l’âge optimal pour une induction de la colite qui ne soit ni trop importante ni trop mineure pour observer des effets des composés thérapeutiques.

Toutes tuées pour analyser l'infiltration inflammatoire de leur muscle cardiaque, 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 45 reçoivent des cellules tumorales implantées dans le pancréas au cours d'une intervention de vingt minutes, 45 autres des cellules de tumeur pulmonaire sous la peau du flanc, et 60 portent quinze jours une mini-pompe osmotique sous-cutanée qui diffuse l'hormone testée. Le porteur reconnaît que la croissance tumorale gêne les déplacements dans les derniers stades et réduit la prise alimentaire. Il justifie le recours à la souris par sa reproduction rapide et son nombre de naissances, et fixe les effectifs sur une bibliographie qui, écrit-il, suggère dix à quinze souris par procédure.

Objectifs

L'obestatine est une petite hormone produite principalement dans le tube digestif et distribuée dans divers organes et tissus. Cette hormone a des effets très bénéfiques sur le muscle squelettique, dont elle favorise la régénération. Cependant, le rôle de cette hormone dans le tissu musculaire cardiaque pathologique demeure peu clair de nos jours. Par conséquent, l'objectif principal de la présente étude est d'explorer la capacité de l'hormone en tant que traitement possible de la pathologie cardiaque associée à la perte musculaire consécutive au cancer. L'atrophie et la fonte musculaire sont des complications extrêmement graves du cancer et constituent la principale cause de décès chez de nombreux patients. L'atrophie et le dysfonctionnement du muscle cardiaque sont communs à pratiquement tous les types de tumeurs, réduisant la qualité de vie des patients. Au cours des dernières décennies, la réponse immunitaire s'est imposée comme une composante majeure de la pathologie cardiovasculaire et du muscle cardiaque. Pour cette raison, il nous semble intéressant de réaliser cette étude dans laquelle nous établirons : - Le profil des cellules inflammatoires qui atteignent le cœur en présence de différentes tumeurs. - Le rôle de l'hormone sur ces populations inflammatoires atteignant le cœur.

Bénéfices attendus

- Identification de nouvelles voies thérapeutiques ou de traitements liés aux cellules inflammatoires infiltrant le cœur. - Établissement de la petite hormone obestatine comme agent thérapeutique anti-inflammatoire potentiel.

Procédures

Au cours du développement de ce projet, les souris seront soumises à 4 interventions différentes : 1.- Echographie du cœur: Cette intervention sera réalisée sur toutes les souris du projet. L'acquisition a une durée de 10 minutes. Toutes les souris seront soumises à cette ntervention. 2.- Anesthésie : une anesthésie sera pratiquée pendant les échographies, pendant l'implantation des cellules tumorales et lors de la pose de mini-pompes osmotiques. La durée de l'anesthésie pendant l'échographie sera de 10 minutes. La durée de l'anesthésie pendant l'implantation des cellules tumorales sera de 20 minutes (pancréas) et 5 min (sous-cutanée). La durée de l'anesthésie pendant la pose de mini-pompes osmotiques sera de 10 minutes. Toutes les souris seront soumises à cette intervention. 3.- Induction de tumeur pancréatique: Des cellules tumorales pancréatiques seront implantées dans le pancréas sain de souris. Le développement de la tumeur dure trois semaines. A effectuer sur 45 souris. Intervention d'une durée de 20 minutes 4.- Induction tumorale sous-cutanée: Des cellules tumorales du pulmon seront implantées sur le flanc de la souris. Le développement de la tumeur dure quatre semaines. A effectuer sur 45 souris. Intervention d'une durée de 5 minutes 5.- Pose de mini-pompes osmotiques sous cutanées et infusion continue de l’hormone: les mini-pompes resteront implantées pendant 15 jours. A effectuer sur 60 souris. Intervention d'une durée de 10 minutes

Impact sur les animaux

- L'utilisation de l'anesthésie pour procéder à l'immobilisation de l'animal peut entraîner une baisse de la température de l'animal. - L'implantation de cellules tumorales dans le pancréas expose les animaux à un risque de blessure et peut provoquer une douleur modérée au niveau de l'incision. Les souris peuvent avoir une mobilité réduite. L'implantation de cellules tumorales sous-cutanées implique une petite piqûre, sans irritation observable. Les animaux peuvent simplement présenter des symptômes de stress. - Le développement de la tumeur dans les deux modèles peut entraîner une gêne pour les animaux, en particulier en ce qui concerne la mobilité dans les derniers stades du développement de la tumeur. Dans les deux modèles, les souris peuvent présenter une réduction de l'ingestion. - La mise en place de mini-pompes expose les animaux à un risque de blessure et stress.

Devenir

A l'issue de chacune des procédure les animaux seront mis à mort afin que l'infiltration inflammatoire du muscle cardiaque puisse être analysée.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux pour l'étude des pathologies est standardisée et largement utilisée. Cette étude serait irréalisable chez l'homme, et bien qu'il existe des modèles animaux peut-être plus proches de l'homme, des éléments tels que leur acceptation par la communauté scientifique, leur coût/bénéfice, et leur disponibilité (stabulation, protocoles expérimentaux, nombre d'animaux, etc.), explique l’utilisation de modèles murins, adaptés à ce type d'étude. Les modèles in vivo sont une étape essentielle dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des complications cardiaques. Il n'existe actuellement aucun modèle cellulaire ni aucune approche computationnelle permettant de visualiser le problème de l'acquexia.

Réduction

La bibliographie examinée suggère l'utilisation d'un nombre compris entre 10 et 15 souris pour les procedures signalées ci-avant. Ce nombre est décrit comme le plus approprié pour obtenir des données fiables et une analyse statistique robuste. On essaiera d'obtenir le maximum d'informations à partir d'un seul animal afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés

Raffinement

Les animaux seront logés dans des cages avec un maximum de 5 animaux par cage. L'air, l'humidité et la température doivent être contrôlés dans l'animalerie. Les animaux doivent avoir accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Afin de réduire les comportements nuisibles ou anormaux, les animaux doivent bénéficier de techniques d'enrichissement appropriées. Toutes ces techniques d'enrichissement permettent aux animaux de développer des capacités d'adaptation telles que la recherche de nourriture, la manipulation et les activités d'exploration. La surveillance des animaux s'effectue selon une grille de score de points limites.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. Grâce à ces modèles de souris, nous pouvons obtenir très rapidement des résultats pour la recherche, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce dont la reproduction serait beaucoup plus longue et dont le nombre de naissances serait beaucoup plus faible. Les animaux adultes ont été choisis pour le projet car ils ont une réponse inflammatoire suffisamment élevée pour être surveillée.

Dépourvues de poils par sélection, les souris SKH-1 laissent voir et mesurer les tumeurs de la peau sans rien raser. 80 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois fois par semaine pendant deux, quatre ou six mois, elles sont exposées aux UVB, en continu aux radiofréquences 5G à 26 GHz, ou aux deux, jusqu'à ce qu'apparaissent vers la seizième semaine de multiples tumeurs cutanées sur le dos, que le porteur décrit comme pouvant gêner leurs déplacements et les empêcher d'atteindre la nourriture dans la mangeoire. Toutes sont tuées pour prélever les tumeurs et la peau du dos.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'effet d'une exposition à la fois aux ondes radiofréquences (RF) émises par les systèmes de communications sans fil et au rayonnement solaire ultraviolet (UV) sur le développement des tumeurs cutanées chez la souris. Au cours de sa vie, l'homme est quotidiennement exposé à ces 2 types de rayonnement, possiblement cancérogène ou cancérogène connu, ce qui peut avoir des effets néfastes sur sa santé. De ce fait, l'exposition combinée et consécutive à ces deux agents physiques omniprésents dans notre environnement pourrait jouer un rôle important dans l'apparition de cancers cutanés. Avec l’arrivée de la nouvelle technologie 5G et ses fréquences plus élevées comme 26 GHz, il est crucial de savoir comment cela pourrait affecter la santé humaine, en particulier la peau. Bien qu’il soit connu que l'exposition au soleil, en particulier aux rayons UVB, endommage l'ADN et produit des substances nocives telles que des radicaux libres, nous n'avons pas encore suffisamment d'informations sur l'impact des ondes de téléphones portables à 26 GHz. Notre idée est donc que l'exposition quotidienne à ces deux facteurs pourrait potentialiser l'apparition des cancers cutanés chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de déterminer l'impact des RF sur les cancers cutanés UVB induits. Grâce à ce projet, nous espérons obtenir une réponse claire sur les RF : i) elles n'ont pas d'effet ii) elles jouent un rôle protumoral ou au contraire iii) un rôle antitumoral. Les données obtenues permettront d’améliorer la prévention concernant la survenue des cancers cutanés et diminuer leur mortalité si les RF amplifient l’effet délétère des UV. Les cancers cutanés sont visibles, affligeants, induisant un stress psychologique important. Limiter l’apparition des cancers cutanés et leurs effets secondaires, améliorera la qualité de vie des personnes touchées et diminuera le coût en terme de santé publique.

Procédures

Les animaux sont exposés aux rayons UVB 3 fois par semaine pendant moins d'une minute et/ou aux radiofréquences (RF) en continu et cela pendant 2, 4 ou 6 mois. A l'apparition des premières tumeurs, le volume tumoral est mesuré 1 à 2 fois/semaine au pied à coulisse sur souris vigile et cela jusqu'à la fin de la phase expérimentale.

Impact sur les animaux

L'exposition répétée aux UVB provoque de multiples petites tumeurs cutanées sur le dos des souris qui vont apparaitre aux alentours de 16 semaines d'irradiation. Ces tumeurs peuvent devenir gênantes pour se déplacer ou se redresser pour attraper la nourriture dans la mangeoire. Il est également possible que la co-exposition aux RF accentue le niveau de nuisance, si comme nous le supposons les RF potentialisent les effets des UVB.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et la peau du dos pour les différentes analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires in vitro ainsi que des modèles d'épidermes pigmentés humains reconstruits in vitro pour répondre à ces questions. Cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que la formation d’une tumeur, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. De nombreux articles ont mis en évidence l'importance du microenvironnement dans le processus de carcinogènése cutanée et malheureusement, il est à ce jour, très difficile de reproduire ce microenvironnement tumoral in vitro. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à la réalisation de ce projet a été scrupuleusement réduit au minimum en tenant compte de nos 10 ans d’expériences en matière de cancérogénèse UVB induite. En effet, les souris ne sont pas consanguines et par conséquent, nous avons toujours 2 ou 3 souris qui ne répondent pas aux irradiations ou peuvent avoir des réponses complétement atypiques par rapport au reste du groupe (croissance tumorale trop rapide ou trop lente), ce qui a été bien constaté au cours de nos précedentes expérimentations. Pour ces raisons, nous avons déterminé via des tests statistiques qu'un lot de 20 souris par condition était nécessaire pour avoir des données statistiquements exploitables à la fin de l'étude. Nous utiliserons également des lots témoins communs afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les animaux qui ne répondent pas favorablement seront néanmoins utilisés pour des prélèvements de peau et serviront de contrôle pour des analyses ultérieures.

Raffinement

Des études pilotes ont été réalisées pour raffiner l’ensemble de nos procédures expérimentales sur les animaux de manière à réduire au minimum les temps d’exposition, les temps de contention et d’isolement afin de prévenir toute douleur ou inconfort chez nos animaux. De plus, nous réalisons une surveillance quotidienne de nos animaux et nous avons mis en place des mesures conservatoires (ajout de croquettes dans les cages, biberons à longue pipette) et des points limites qui nous permettent d'agir rapidement en cas d'inconfort ou de douleur observés chez nos animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle car c'est un animal de petite taille, facile à héberger et à manipuler. C'est un modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain. Les souris SKH-1 sont bien connues pour l'étude de la cancérogénèse UVB-induite. Elles sont immunocompétentes et totalement dépourvues de poils ce qui rend la mesure et l'observation des tumeurs cutanées bien plus facile que sur d'autres modèles de souris. Les souris seront inclues dans le protocole expérimental à l'âge de 6 à 8 semaines. Ages auxquels elles sont considérées comme de jeunes adultes ayant atteint un poids de 20-25g, une maturité hormonale et un état métabolique stable.

720 rats en croissance vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun passe la période expérimentale seul en cage, dont deux fois 24 heures en cage métabolique et deux fois trois jours en cage de calorimétrie, avec deux radiographies sous isoflurane, deux prises de sang de 500 microlitres à la queue et un transport en voiture jusqu'à une plateforme distante. Ils sont nourris de régimes volontairement déficients en acides aminés indispensables, pour chercher dans leurs urines et leur sang des marqueurs de cette carence. Le porteur affirme que mesurer la croissance et le comportement alimentaire "empêche" tout remplacement par des modèles cellulaires, et présente le rat comme un modèle de l'enfant dénutri.

Objectifs

La qualité de l’apport alimentaire en protéines des régimes alimentaires dépend de leur capacité à satisfaire les besoins en acides aminés (AA) indispensables (AAI) tout au long des cycles de vie. C’est une question majeure de sécurité nutritionnelle, principalement dans les pays en voie de développement, où l’apport protéique total est modéré, voire bas. Plus généralement, la connaissance de la qualité de l’apport alimentaire en protéine est primordiale pour comparer les différentes sources de protéines, notamment dans le cadre des discussions sur le rééquilibrage des sources alimentaires végétales et animales, et la recherche de sources alternatives de protéines. La composition en AAI est variable selon les sources protéiques. En effet, les protéines d'origines animales ont un profil homogène et équilibré en AAI, alors que les protéines de céréales et les protéines de légumineuses (comme le gluten) sont déficientes en certains AAI. Les profils de référence de besoin en AAI, utilisés pour l’évaluation de la qualité protéique, initialement déterminés à partir de données de bilan azoté, ont été révisés à la hausse (Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO)/Organisation mondiale de la santé (OMS),2007) sur la base de nouvelles méthodes, rendant plus sélectifs les critères de qualité des protéines. Cependant, ces valeurs révisées restent discutées. Ainsi, lors de son rapport sur le besoin en protéines et AA en nutrition humaine, le comité (FAO/OMS) a conclu qu’aucune méthode actuelle d’estimation du besoin en AAI n’est entièrement fiable et qu'iI est donc primordial de proposer de nouvelles approches complémentaires pour préciser les valeurs des besoins et d’évaluer le statut nutritionnel protéique des différentes populations. Pour cela, la FAO a recommandé le recours à l’usage d’outils tels que la métabolomique (ensemble des métabolites), qui a notamment été appliquée avec succès pour estimer le besoin en d’autres micronutriments. L’objectif de ce projet est d’identifier les variations des profils du métabolome urinaire et plasmatique comme biomarqueurs spécifiques de la déficience en AAI et à évaluer l’efficacité de la supplémentation pour valider les biomarqueurs identifiés. Ce projet fait suite à deux projets précédents pour lesquels nous avons identifié et validé des biomarqueurs urinaires pour trois des neuf AAI. Ce projet se déroulera sur 2 sites, dont une plateforme pour évaluer leur dépense énergétique et la composition corporelle.

Bénéfices attendus

L’identification et la validation de biomarqueurs du statut en AAI permettra, à terme, de mieux définir les besoins en acides aminés indispensables. Cela servira à affiner les politiques nutritionnelles et à mieux évaluer la qualité des sources protéiques. De plus, cette étude nous renseignera sur les effets d’une supplémentation en ces acides aminés indispensables après une phase de déficience. Ces effets n’étant que peu rapportés dans la littérature, ces informations seront très utiles, notamment pour l’étude de la sous-nutrition chez l’enfant avec retard de croissance.

Procédures

Durant la période expérimentale , les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire. Les animaux seront placés deux fois pendant la période expérimentale en cages métaboliques pendant 24h pour collecter les féces et les urines, et deux fois en cage de calorimétrie pendant 3 jours pour la mesure de dépense énergétique. La densité minérale osseuse et la longueur du tibia seront analysés par radiographie deux fois au cours de l'expérience après anesthésie gazeuse (anesthésie à l'isoflurane 2% pendant 10-15min). Deux prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine de la queue de 500μl chacun .A la fin de l'expérimentation, les animaux seront mis à mort et une injection de valine 13C sera réalisée 30 minutes avant l’euthanasie (150μmol/100g poids corporel), dans le but de mesurer la synthèse protéique.

Impact sur les animaux

Durant la période expérimentale, les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire et de leur dépense énergétique (cages de calorimétrie indirecte), ainsi que la collecte des urines et fécès (cages métaboliques), ce qui peut engendre un stress modéré dû à l’isolement des animaux. Les animaux seront transportés à la plateforme 3 jours avant d'effectuer les mesures, afin d’évaluer leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte et leur composition corporelle. La plateforme se situe à plusieurs km de l’unité de rechercheset le transport des animaux sera réalisée en voiture ce qui peut engendrer un stress modéré. Aussi, les prélèvements sanguins lors de la procédure 2 sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré. Une injection sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. L’anesthésie gazeuse permettra de réduire la douleur engendrée par l’injection.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser des analyses sur différents tissus cibles.

Remplacement

La nécessité de mesurer les conséquences de l'ingestion d’un régime à faible teneur en AAI sur le comportement alimentaire et les paramètres de la croissance (gain de poids et composition corporelle) empêche le remplacement de l'expérimentation animale par des modèles cellulaires ou moléculaires. Les résultats de ce projet permettront de mettre en place une étude clinique chez l’enfant dénutri. Ainsi, les objectifs de ce projet ne peuvent être atteints sans avoir recours à l’animal, le rat étant un modèle pour l'humain, en particulier pour la nutrition.

Réduction

A partir des données issues d’une étude précédente, nous avons déterminé qu’un effectif de 10 rats par groupe est le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garder une puissance statistique satisfaisante. Cette étude inclue 6 lots, correspondant à chaque AAI à étudier. L’expérimentation comprendra 80 animaux pour chaque AAI étudié.

Raffinement

Le projet impose l'hébergement des rats en cages individuelles (répondant aux normes en vigueur) pour la mesure précise de la consommation alimentaire. Les rats demeurent dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils continuent à échanger par vocalises, et ils les voient et les sentent, ce qui modère l’impact de l’isolement. De plus, les cages seront enrichies au moyen de différents objets (tunnel, d’une tasse renversée, …) . De plus, un enrichissement social est prévu : les animaux seront placés en cages collective tous les jours pendant 2 h (durant les mesures de poids corporel et de gaspillage alimentaire). Les prises de sang sont réalisées par un expérimentateur expérimenté pour cet acte technique. Des aiguilles spécifiques permettant un écoulement plus efficace du sang en sortie d’aiguille sont utilisées, ce qui permet de limiter la durée et le stress engendré par les prises de sang. Les animaux seront transportés à la plateforme en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : Les animaux seront regroupés en fonction des régimes en cages collectives de transport avec de l’eau en gelée et de la nourriture à disposition. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Comme l’humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus, l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’homme, le porc ou le rat pour étudier la qualité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Nous utiliserons ainsi des rats en croissance comme modèle de l'enfant en croissance.

3000 rongeurs, 1800 rats et 1200 souris, vont être utilisés, tous tués sous anesthésie sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur cautérise l'urètre sous anesthésie générale pour provoquer une incontinence, on leur implante des cathéters dans la vessie, la veine jugulaire ou l'estomac, puis on comprime leur abdomen par pressions croissantes jusqu'à ce qu'une goutte d'urine sorte, quatre fois de suite. Les molécules testées viennent de clients dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires possibles. Il qualifie ce test de compression de "non invasive", n'indique pas le nombre de jours de traitement et reconnaît qu'aucun calcul statistique ne fonde l'effectif de dix animaux par groupe.

Objectifs

L’incontinence urinaire d’effort est un des problèmes majeurs du vieillissement. Cette pathologie est souvent sous-évaluée car tabou mais a un impact important dans la qualité de vie des patients. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de candidats médicaments sur le mécanisme de fermeture de l’urètre et sur l’incontinence urinaire d’effort induite par cautérisation de l’urètre.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints d’incontinence urinaire.

Procédures

Les animaux vont subir des traitements de produits à tester. Chaque geste classique (type gavage, administration intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire…) étant réalisé par du personnel qualifié, ces derniers devraient durer environ 30 sec à 1 min par animal. Le nombre de jours de traitement étant dépendant de chaque protocole expérimental, nous ne pouvons pas indiquer le nombre d’intervention pour ces gestes. Les animaux vont subir une chirurgie (lésion de l’urètre) sous anesthésie générale qui devrait durer 30 min maximum. Pour les tests de Leak Point Pressure (LPP) ou test de point de fuite, des cathéters pourront être placés dans différents organes (vessies, veine jugulaire, intragastrique par exemple…). Ces chirurgies dureront environ 20 min et l’animal ne la subira qu’une fois. Le test de LPP se fait sous anesthésie générale (anesthésie sans réveil). Ce test consiste à appliquer des pressions croissantes sur l’abdomen de l’animal (principalement au niveau de la vessie) et d’arrêter ces pressions dès qu’une goutte d’urine apparaît. Chaque session de ce test dure environ 30 sec. Et un animal aura plusieurs sessions (environ 4) avec 10-15 min de repos entre chaque.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Cependant, certains clients nous informent de potentiels effets secondaires pouvant apparaître avec leurs molécules. Des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, des lésions et une légère douleur (douleur de l’aiguille). Le modèle physiologique de ce protocole mimant une incontinence urinaire, les animaux subiront les effets secondaires de cette pathologie (pertes fréquentes et incontrôlées d’urines).

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort car anesthésies avec un anesthésiant irréversible (sans réveil).

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’incontinence urinaire. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Pour évaluer l’effets de candidats médicaments, la méthode du LPP (link point pressure ou pression du point de fuite) est une méthode non invasive qui consiste à appliquer des pressions croissantes au niveau de la vessie de l’animal et d’observer une fuite urinaire. Cette méthode se réalise sur des animaux anesthésiés (anesthésie sans réveil), ne provoquant pas de douleur aux animaux. Cette méthode sera réalisée par du personnel qualifié et validé pour cette technique, ce qui permettra d’obtenir des résultats significatifs avec un nombre minimum d’animaux. Aucun test statistique n’est réalisé pour définir le nombre d’animaux par groupe, mais avec notre recul et notre expérience, nous savons que n=10 animaux par groupe est le minimum nécessaire pour avoir des résultats significatifs. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre deux ou plusieurs groupes. Nous pensons réaliser 3 études par an chez le rat et 2 études par an chez la souris.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, nestlet…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de signes cliniques avant l’atteinte de points limites à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Des antalgiques seront utilisés pour les chirurgies afin de limiter la douleur. Les protocoles utilisés seront conformes aux recommandations des comités d'éthique et viseront à assurer le bien-être des animaux, en se référant aux "cinq libertés fondamentales" établies par l'Organisation mondiale de la santé animale. Cela implique : 1. que les animaux ont accès à une alimentation et à de l'eau en quantité et en qualité suffisantes 2. que nous prenons des mesures pour minimiser la douleur, les blessures et les maladies chez les animaux. 3. que nous veillons à ce que les conditions de logement et d'environnement des animaux soient adaptées 4. que nous permettons aux animaux d'exprimer leurs comportements naturels et essentiels à leur bien-être 5. que nous prenons des mesures pour minimiser la peur et la détresse chez les animaux grâce à un entrainement pour les rendre à l'aise avec les gestes techniques, les supports de contention ou les appareils utilisés pendant l'expérience.

Choix des espèces

Notre expertise chez le rongeur et en particulier chez le rat dans les études urologiques ainsi que les informations de la littérature sont les raisons qui nous ont fait choisir le rat en priorité. Toutefois, ces procédures peuvent très bien être extrapolées chez le souris, selon la demande de nos clients (expérimentations déjà réalisées dans notre laboratoire). Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.