Recherche appliquée

Tuées trois par bassin à chacun des six temps de prélèvement, pour que le tissu cicatriciel soit analysé, 72 truites arc-en-ciel sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poisson reçoit un transpondeur dans le muscle du dos, puis une lésion cutanée pratiquée au trépan à biopsie. Six prises de sang suivent sur 56 jours, avec une anesthésie cumulée pouvant atteindre soixante-dix minutes et une sortie de l'eau cumulée de treize minutes trente. Le projet sert à caler un modèle de cicatrisation pour tester ensuite des additifs alimentaires, dans une filière d'élevage où les blessures cutanées sont fréquentes et traitées aux antibiotiques.

Objectifs

Les poissons interagissent directement avec leur environnement par leur peau, et la fonction d'homéostasie de la muqueuse cutanée dépasse de loin celle des organismes terrestres. La peau des poissons est constituée d'un grand nombre de cellules sécrétrices de mucus, de macrophages et de divers lymphocytes, permettant la fonction de barrière primordiale au maintien de l'homéostasie. En condition industrielle, des lésions cutanées, des abrasions et des ulcères apparaissent fréquemment chez les poissons d’élevage. Cela entraine des pertes de sang et la contamination des tissus sous-jacents par des particules étrangères et des agents pathogènes. Dans ces situations, les plaies cutanées doivent être traitées rapidement afin d'éviter des conséquences encore plus négatives pour les poissons. Cela entraine un accroissement de l’utilisation de traitements et notamment d’antibiotiques. Si le processus de cicatrisation est très bien décrit chez les mammifères, les travaux chez les poissons sont beaucoup plus récents. La principale différence est une inversion des phases d’inflammation et de ré-épithélialisation dans les premiers jours après une blessure chez les poissons. Des travaux ont également démontré qu’ il était possible d’améliorer le processus de cicatrisation par l’ utilisation d’additif alimentaire. Ces travaux sont importants pour améliorer les conditions d’élevage des poissons et participer au développement d’une filière plus durable limitant l’utilisation d’antibiotiques. Ce projet pilote propose de (1) mettre au point un model expérimental subclinique de suivi des processus de cicatrisation du filet après utilisation d’un trépan de biopsie (2) de déterminer la variabilité individuelle et inter-bassin de la mesure des différents paramètres dans nos conditions expérimentales. Cela permettra par la suite, si le modèle est validé, de mener des expériences utilisant ce modèle pour prévenir de la dégradation des lésions par l’utilisation d’additifs alimentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet exploratoire s’inscrit dans l’amélioration des conditions d’élevage des salmonidés. Il permettra, en premier lieu, de suivre et de caractériser toutes les phases de la cicatrisation chez la truite arc en ciel dans les conditions de nos installations. A l’issu de cette étude exploratoire, il sera possible de déterminer quels sont les paramètres à suivre les plus pertinents et d’optimiser le nombre d’animaux nécessaires pour utiliser ce modèle. Enfin, ce projet permettra à terme d’évaluer le bénéfice réel des additifs alimentaires sur l’amélioration de la cicatrisation cutanée chez la truite arc en ciel dans le cadre d’essais ultérieurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pou une durée de 56 jours. Au début de la procédure, les poissons (12) seront identifés par un transpondeur (durée introduction 3 secondes) placé dans le muscle du dos après anesthésie, et tous les poissons seront soumis à une lésion à l'aide d’un trépan à biopsie (durée 15 secondes). Aux jours 0, 3, 7, 14, 35 et 56 post-lésion des prises de sang seront réalisées. A chaque temps, un volume sanguin nécessaire et suffisant pour l'analyse des paramètres biochimiques sera prélevé sur chaque poisson anesthésié. Pour chaque prise de sang, le temps ne dépassera pas 1 minute. En fonction du poisson et de la cinétique d'échantillonnage, la durée totale de l'anesthésie durera entre 8 et 70 minutes, et la mise hors de l'eau totale entre 3 et 13 minutes 30 secondes sur trois mois (durée cumulée).

Impact sur les animaux

Changement du comportement alimentaire, saignement localisé au niveau du site de ponction du tissu. Réaction inflammatoire dans les premiers jours de la cicatrisation, guérison anormale de la lésion.

Devenir

Les animaux seront mis à mort au fur et à mesure de la procédure (soit 3 animaux par bassins , 6 temps de prélèvements) afin de réaliser les prélèvements de tissus cicatriciels. Plus d'animaux à la fin de la procédure.

Remplacement

La procédure expérimentale est nécessaire et ne peut pas être remplacée par une autre stratégie n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. Il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico capable de mimer l’intégralité des acteurs cellulaires et acellulaires participant à la complexité des processus de cicatrisation et à la modulation de cette réponse par la nutrition.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre minimum d'animaux à utiliser pour évaluer ce projet exploratoire. Le nombre d'animaux a utilisé permettra d'obtenir une densité adéquate pour favoriser une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux. Des analyses post mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer un maximum d'information possible par animal afin de valider le modèle exploré dans ce projet. Le nombre d'animaux et la conception expérimentale de ce projet ont été établis en suivant une approche statistique validée par un biostatisticien.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux sont définies afin que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux, l'enrichissement des bassins ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur. Aucun animal ne restera isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux. Avant toute manipulation (pesée ou prélèvement) au cours de cette étude, les truites arc en ciel sont anesthésiées. La capture et le stress dus à la sortie des bassins sont réduits au maximum par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs lors des pesées, des prises de sang et des mesures. Les conditions expérimentales sont également raffinées par un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’une mousse humide pour faire reposer l’animal sur un support de contention adapté, d'un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans une procédure interne qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. Un analgésique sera utilisé par voie intramusculaire afin de réduire la douleur après l’introduction du transpondeur et lors de la réalisation des lésions et de permettre une meilleure récupération et une réduction des effets secondaires comme les frottements de l'animal contre les murs. Utilisation de pansement hydrorésistant antiseptique et antifongique après la réalisation de la lésion pour éviter l'infection de la lésion. Un minimum de deux observations quotidiennes des animaux est réalisé afin de détecter prématurément des signes cliniques de dommages corporels et pour vérifier que les poissons s’alimentent correctement. Dès l’observation d’un signe clinique, les animaux sont suivis au moyen d’une grille de score de point limites.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la truite arc-en-ciel, en tant que modèle animal de salmonidé. La truite est un bon modèle pour les salmonidés car elle est taxonomiquement proche du saumon et les résultats pourront être transposés chez le saumon. La truite est également un animal plus résistant aux conditions d'élevage, aux maladies, avec un taux de croissance plus élevée permettant de rester dans le cadre du développement d’un modèle de cicatrisation subclinique. Au début de l’étude les truites pèseront 50 grammes. Elles seront élevées pendant 4 semaines, puis, à 100 g les poissons seront blessés et un suivi de cicatrisation sera réalisé pendant 56 jours. Le poids final à la fin de l’étude sera de 320g.

Un agent cancérigène dans l'eau de boisson pendant seize semaines, ou une injection de cellules cancéreuses dans la bouche suivie d'une tumeur buccale qui gêne l'alimentation. 1 500 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tumeurs et des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet déclaré est de comprendre comment un composant de la matrice extracellulaire bloque les cellules immunitaires autour des cancers de la tête et du cou. Les atteintes décrites se limitent à l'anxiété et à la douleur transitoire des injections buccales, sans que soit précisé ce que quatre mois d'ingestion d'un cancérigène font subir aux 419 souris du modèle chimique.

Objectifs

Les cancers de la tête et du cou (ORL) représentent la 6ème cause de cancer humain avec une espérance de vie à 5 ans de 50%. On distingue ceux liés à une infection virale préalable et ceux provoqués par une exposition aux agents cancérigènes (tabac/alcool). La défense immunitaire permet de lutter contre le développement du cancer. Comprendre l’impact de l’environnement immédiat de ces cancers sur la défaillance immunitaire est donc cruciale. La Matrice Extra Cellulaire (MEC) structurant les tissus cancéreux a une constitution et une organisation spécifique qui favorise la progression cancéreuse. Nous avons identifié qu’un composant de la MEC des cancers ORL impacte la position des cellules immunitaires et la sévérité du cancer humain et d’un cancer ORL murin. Lorsque ce même modèle de cancer ORL se développe chez des souris qui n’expriment ce composant structurant, le cancer est moins grave et les cellules immunitaires ne sont pas séquestrées dans l’environnement de la tumeur. Notre objectif est de comprendre la nature des relations de contact entre les cellules immunitaires et ce composant au cours du développement du cancer et de déterminer quand et comment ce composant modifie les performances immunitaires. Ceci permettra d’améliorer nos connaissances sur les relations de proximité au sein des cancers ORL et sera important pour la recherche préclinique en identifiant de nouveaux traitements pour stimuler la défense immunitaire. Sur cinq ans, nous développerons trois modèles de cancers mimant les cancers ORL humains chez la souris normale, sans ce composant structurant ou sans un type immunitaire pour dévoiler les relations entre la défense immunitaire et notre composant structurant au cours de la croissance tumorale: Le premier modèle consiste en l’administration pendant 16 semaines d’un dérivé de la nicotine dans la boisson des souris pour mimer le cancer lié au tabac. Les tumeurs collectées en fin de procédure permettront d’identifier les défaillances de la défense immunitaire à différents stades du cancer; Deux modèles de greffe tumorale buccale par injection de cellules cancéreuses indépendantes d’une infection virale ou dépendante d’une infection virale. Ils permettront de comparer les mécanismes de défense immunitaire dans les cancers dépendant ou non d’une infection virale et leur défaillance. Ces modèles courts seront utiles pour déterminer le rôle de cellules particulières de la défense immunitaire et pour l’évaluation de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’identifier les relations microscopiques entre la défense immunitaire et un composant structurant et les conséquences de ces interactions sur la nature, la fonction des cellules immunitaires, la croissance cancéreuse et la structure du tissu malade. A terme, ces travaux permettront d’identifier des pistes nouvelles de stimulation du système immunitaire dans les cancers ORL afin de stimuler la défense immunitaire. Les modèles murins de développement de cancer ORL que nous proposons de développer et caractériser représente un outil indispensable pour déterminer les relations complexes et temporelles en place au sein des tumeurs. Ces études chez la souris poseront les bases d'une étude translationnelle chez l'Homme. Les résultats de cette étude serviront aussi au developpement de modèles in vitro pertinents.

Procédures

1 Modèle chimique: Administration d'un agent cancérigène dans l'eau de boisson pendant 16 semaines n'ayant pas d'impact direct sur l’alimentation (16 semaines par souris, 419 souris maximum). 2 Modèles de greffe buccale: 1 injection de cellules cancéreuses dans la bouche et une injection dans l'abdomen pour l'anesthésie pour contrôler la douleur et l’anxiété due à l'injection des cellules cancéreuses dans la bouche (2 injections totales par souris, 780 souris maximum). Elimination d'une population de la défense immunitaire pour évaluer son rôle dans la croissance cancéreuse par injection dans l'abdomen d'une drogue: 8 injections dans l'abdomen par souris (modèle chimique) sur 80 souris maximum et 2 injections dans l'abdomen par souris (modèles de greffe tumorale) sur 160 souris maximum.

Impact sur les animaux

les injections de cellules cancéreuses dans la bouche peuvent générer de l'anxiété et une douleur transitoire correspondant à une nuisance modérée. Lla croissance des tumeurs buccales peut avoir un impact sur l'alimentation correspondant à une nuisance modérée

Devenir

TOUS mis à mort en fin d'expérimentation afin de réaliser des gestes post-mortem (prélèvementsde tumeurs et d'organes pour analyses biologiques)

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre les relations complexes des cellules immunitaires avec l'environnement immédiat du cancer. Ce type d'étude est difficilement envisageable chez l'Homme car les prélèvements de cancer accessibles pour la recherche sont de très petites tailles et la rareté de nos cellules nous oblige à travailler sur du matériel biologique suffisamment important. Par ailleurs, nous ne pouvons pas étudier l’effet de traitements innovants visant soit à éliminer ou bloquer l’infiltration des tumeurs par certaines cellules dans des modèles in vitro. Or ce type d'analyse est un pré-requis pour pouvoir valider de nouvelles cibles d'immunothérapie chez l'homme. Ces travaux permettront également de mieux comprendre les relations complexes responsables de la croissance cancéreuse, ce qui permettra dans le futur de développer des modèles alternatifs in vitro découlant de nos résultats par ingenierie du tissu.

Réduction

Nous avons déterminé les effectifs de nos groupes de manière à obtenir une forte validité statistique (avec puissance de 0.8) avec un minimum d’individus et notre projet a été conçu pour optimiser la quantité d’informations analysables. Le nombre total d'animaux requis est de 1500 pour l'ensemble et la durée totale du projet. Afin de réduire au mieux le nombre d’animaux, nous procéderons à une analyse séquentielle. Une première série d’expériences permettra de développer les modèles murins et de définir les conditions optimales d'expérimentation (n: 260 souris/an sur deux ans). Nous utiliserons ensuite trois modèles tumoraux optimisés dans des souris sans composant structurant et leur contrôle. Le schéma d'accouplement de ces souris a été optimisé pour obtenir 50% de souris avec et sans composant structurant par couplage et les males et les femelles seront utilisés pour réduire le nombre d'animaux inutiles (n: 150 souris par an pendant 4 ans). De plus, nous utiliserons également des souris males et femelles dans laquelle une population immunitaire est éliminée et leur contrôle dans les trois modèles tumoraux (n: 480 souris maximum). Nous réduirons ce nombre de 160 souris si nos résultats antérieurs démontrent que le modèle chimique et un modèle de greffe ont des caractéristiques similaires. Dans ce cas les expériences ne seront menées que sur deux des trois modèles tumoraux.

Raffinement

Afin d’améliorer les conditions d’hébergement réglementaires des animaux (porteurs ventilés, 5 animaux par cage, objets déplacés régulièrement pour stimuler la curiosité) dans le contexte de cette pathologie buccale, du gel nutritif est ajouté dans la cage afin de faciliter l’alimentation après les injections de cellules cancéreuses. Les injections de cellules cancéreuses sont réalisées sous anesthésie en présence d'un médicament anti-douleur afin de contrôler l'anxiété et la douleur liée à l'injection. Les signes de l'évolution du cancer, le suivi des animaux seront effectués conformément à une grille d’évaluation permettant de définir un niveau de douleur/souffrance à partir duquel les animaux concernés seront mis à mort. Plus particulièrement, il est à noter que les modèles cancéreux seront établis de façon à limiter la croissance tumorale a un volume de 20% en deça du point limite éthique afin d’éviter une souffrance liée à un problème nutritionnel et le suivi quotidien du comportement et une pesée bi-hebdomadaire des animaux permettra de détecter les signes précoces de souffrance. Enfin les souris dans lesquelles notre population immunitaire d'intérêt peut être éliminée par injection d'une drogue ont un phénotype attendu non dommageable mais le bien-être des souris (poids, posture et mobilité) sera documenté hebdomadairement dès le début de l'expérimentation afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Les modèles murins de tumeurs ORL que nous proposons de développer et d'utiliser permettront de caractériser un environnement complexe qui mime les tumeurs humaines. Ce type d’analyse détaillée est un pré-requis pour pouvoir identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et identifier de nouvelles approches d’immunothérapie chez l’homme. Les souris seront mises en expérimentation à un âge de 8 semaines, âge auquel le système immunitaire est mature.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un tatouage des phalanges et le prélèvement d'un morceau d'oreille, cinq jours de gavage quotidien, une restriction alimentaire, puis un test comportemental de trente minutes par jour pendant onze semaines consécutives. L'enjeu déclaré est de savoir si des souris porteuses d'une mutation du gène FUS présentent des troubles de la motivation et de l'impulsivité, et si remettre la protéine dans le noyau des neurones les atténue. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de recourir à un modèle animal reproduisant la complexité comportementale et structurelle du système nerveux central humain.

Objectifs

La démence fronto-temporale (DFT) est une maladie maladie neurodégénérative incurable caractérisée par l’atteinte de deux structures majeures dans le cerveau. Les symptômes des patients atteints de DFT sont multiples et peuvent inclure des troubles liés au jeu d’argent, à l'hyperphagie et à la consommation de drogue. Tous ces comportements peuvent résulter d'une altération de la motivation et/ou de l'impulsivité. Ce type d’altérations est peu étudiée. Nous avons dans notre laboratoire un modèle de souris qui mime cette maladie en reproduisant la mutation d’une protéine mutée chez les patients. Ce projet a deux buts. Le premier est de regarder si ces souris présentent des problèmes de motivation et/d’impulsivité. Le second but est de voir si le fait de relocaliser cette protéine dans le noyau des neurones est suffisant pour atténuer ces problèmes comportementaux.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, les troubles des comportements compulsifs dans la DFT sont très peu étudiés alors qu’ils peuvent être à l’origine de souffrances physiques (alcoolisation, hyperphagie) et/ou mentale importantes. Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre ces comportements. Par ailleurs, si le fait de remettre la protéine mutée à sa place s’avère efficace, cela pourrait orienter les prochaines recherches pharmacologiques ou pharmaceutiques vers une stratégie visant à relocaliser cette protéine à sa place normale chez les patients souffrant de maladie qui affectent le cerveau.

Procédures

Les animaux recevront un traitement (administration par gavage sur animal vigil afin de limiter les risques de fausse route) durant 5 jours, à raison de 1 fois par jour. La durée du gavage est d’environ 20 secondes. Nous réaliserons une tâche d’apprentissage qui nécessite que les souris soient motivées pour la réaliser. Pour atteindre ce niveau de motivation, la seule chose connue à ce jour est la mise en place d’une légère restriction alimentaire (qui vise à réduire le poids cible de l’animal est à 5%). Les souris passeront un test (non invasif) tous les jours pendant 11 semaines consécutive à raison de 30 minutes par jour.

Impact sur les animaux

6 types de nuisances sont attendues au cours de cette étude : 1- L’administration par gavage du traitement peut entrainer un stress lié à la contention transitoire et à l’administration du traitement ainsi que des fausses routes. 2- Le traitement en tant que tel pourrait avoir des effets secondaires mais de nombreuses études utilisent ce composé et aucune n’a fait remonter un effet secondaire notoire et délétère. 3- Le stress que pourrait causer la réalisation de la tache comportementale. 4- La restriction alimentaire nécessaire pour la réalisation de la tâche 5- Afin d’identifier les souris et de réaliser le génotypage, nous devons effectuer un tatouage (aux niveaux des doigts) et un prélèvement d’un morceau d’oreille (trou d’environ 1 mm de diamètre). Ceci entraine une douleur aiguë et transitoire.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures car nous avons besoin de prélever les tissus pour vérifier que notre protéine d’intérêt (FUS) soit à nouveau à sa place (dans le noyau des neurones) mais aussi pour étudier les impacts au niveau microscopique (moléculaire, cellulaire et biologique) de notre intervention.

Remplacement

Ce projet a pour but d’étudier si la DFT est associée à des troubles motivationnels et compulsifs et si l’on peut modifier l’apparition de ces troubles en annulant une mutation. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale mais aussi celle structurelle du système nerveux central, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les analyses histologiques et moléculaires sur les mêmes animaux que ceux chez qui auront réalisé une des procédures. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude pilote qui sera un point de décision entre la suite de la réalisation, un non, du projet.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Les expérimentateurs en charge sont formés à chaque procédure et nous avons une très bonne connaissance du modèle utilisé. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes (âgées de 2/3 mois au début des procédures) car les patients souffrant de DFT liée à FUS sont toujours des patients adultes.

Une partie de la vessie retirée puis remplacée par un implant du commerce, huit cochons miniatures subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils sont ensuite hébergés seuls pendant trois à six mois, le porteur reconnaissant que l'isolement d'une espèce grégaire peut créer stress et anxiété, avant une cystoscopie sous anesthésie puis la mise à mort pour analyse de la vessie, du foie et des reins. Il s'agit de vérifier qu'un implant de 4 à 8 cm de diamètre régénère du tissu vésical à une taille jugée transposable à la chirurgie humaine, deux essais précédents ayant porté sur des implants plus petits. Le texte du RNT décrit six animaux répartis en deux groupes, alors que huit sont déclarés au titre des atteintes attendues, sans que cet écart soit expliqué.

Objectifs

Le projet porte sur le développement d'un implant tissulaire pour la reconstruction de la vessie. La reconstruction de la vessie est nécessaire dans certaines malformations congénitales. La référence en matière de remplacement de la vessie est l’utilisation d’un segment d’intestin mais le contact entre les urines et l’intestin entraîne des complications telles qu'une production excessive de mucus, des calculs urinaires, des troubles métaboliques et, à long terme, même une tumeur maligne. C’est pourquoi les chirurgiens recherchent de nouvelles méthodes de reconstruction de la vessie. L’ingénierie tissulaire constitue une approche prometteuse pour fabriquer des substituts de novo à la vessie. Plusieurs stratégies peuvent être envisagées mais nous pensons que la médecine régénérative guidée avec laquelle on fournit un « squelette » implanté qui fournit une structure architecturale temporaire et orchestre l'attachement/la croissance cellulaire et la régénération du tissu in vivo est plus attractive avec des produits disponibles dans le commerce et prêts à l'emploi. Jusqu'à présent, ces implants ont été utilisés avec succès pour la réparation d'urètre chez le lapin et le chien et la sécurité des implants a été confirmée dans une étude préliminaire chez l’Homme sur la réparation des sténoses urétrales. Ces implants ont également démontré une régénération tissulaire dans un modèle d'augmentation vésicale de lapin (2,5 cm x 2,5 cm) et un modèle d’augmentation vésicale de porc (2 porcs, implant de 4,5 cm de diamètre). Par contre, la taille de l’implant était trop petite par rapport aux besoins cliniques chez l’Homme. Il est donc nécessaire de poursuivre nos recherches avec des implants de plus grandes tailles qui représentent mieux la réalité clinique. Ainsi, l'objectif de cette étude est de démontrer la capacité des implants de 4 et 8 cm de diamètre (taille d'implant cliniquement pertinente) de régénérer du tissu vésical dans un modèle d’augmentation vésicale de porc.

Bénéfices attendus

Une intégration réussie de l'implant suivie d'une régénération tissulaire au site d'implantation confirmerait le potentiel de l’implant régénératif à devenir une option thérapeutique pour les patients nécessitant une augmentation ou une reconstruction vésicale partielle de la vessie. Un implant du commerce et prêt à l'emploi permettrait d'éviter un deuxième site chirurgical en chirurgie reconstructive de la vessie et réduirait ainsi tous les risques liés au prélèvement de tissu intestinal actuellement utilisé pour la reconstruction de la vessie. Les avantages de l'implant peuvent être résumés par des risques moindres de complications postopératoires, des durées chirurgicales plus courtes et une récupération plus rapide.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de type cystectomie partielle (opération qui consiste à enlever seulement une partie de la vessie) avec réparation par implant régénératif. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés pour une durée de 3 mois (n = 2) ou 6 mois (n = 4) avant euthanasie. Avant l'euthanasie des animaux, ils seront soumis à une cystoscopie (réalisés sur animaux anesthésiés).

Impact sur les animaux

Le premier effet indésirable potentiel est en lien avec la chirurgie subie par les animaux. Parmi les effets indésirables possibles en lien à la chirurgie, il est possible que l’animal éprouve une douleur malgré le protocole d’analgésie, la plaie chirurgicale peut aussi saigner, s’infecter ou mal cicatriser. Le second effet indésirable potentiel est lié l’hébergement des animaux. En effet, suite à la chirurgie et pendant une durée de 3 à 6 mois, les animaux seront hébergés individuellement. Les porcs étant une espèce grégaire cela pourrait créer un stress et une anxiété chez les animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort suite à la procédure car des prélèvements post-mortem doivent être réalisés pour analyse histologique (vessie, foie, rein).

Remplacement

Les implants ont subi de nombreux tests in vitro pour démontrer leur sécurité, leur conformité chirurgicale et leurs interactions favorables avec les cellules. Les tests in vivo sur le site clinique pertinent sont la seule possibilité d'évaluer la régénération fonctionnelle des tissus. La régénération tissulaire est une interaction complexe entre l'implant et le tissu environnant du site d'implantation avec ses cellules vivantes et ses processus médiés par les intégrines. Par conséquent, il est important de tester un implant d’une taille cliniquement pertinente sur le site d’implantation clinique ciblé.

Réduction

Ce projet est une étude de faisabilité. L'étude est donc réalisée avec un nombre réduit d'animaux (n = 6 avec 2 tailles d'implants testés 4 (n = 2) et 8 cm (n = 4).

Raffinement

La chirurgie est réalisée par des chirurgiens spécialisées en collaboration avec des personnels scientifiques et techniques formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie sur modèle porcin. L'anesthésie et l’analgésie durant les interventions ont été conçues pour supprimer la douleur induite par une chirurgie et la manipulation des viscères. Après la chirurgie, les animaux bénéficieront d’un suivi assuré par les techniciens en expérimentation ainsi que par les différents intervenants. Toute intervention potentiellement douloureuse ou stressante sera contrôlée, et les animaux suivis dans les minutes ou heures qui suivent. En cas de souci de santé, le vétérinaire sera consulté et les animaux traités en conséquence.

Choix des espèces

Le miniporc est très proche de l’Homme en terme de physiologie et d’anatomie. La taille de sa vessie est appropriée pour réaliser une cystectomie avec une taille d’implant cliniquement pertinente. Le recours au mini-porc est donc pertinente pour pouvoir transposer les résultats à l’humain. Les animaux seront adultes. La croissance d’un animal jeune pourrait interférer avec la reconstruction de la vessie.

4 800 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées pour les prélèvements finaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est refroidie jusqu'à 32 °C par hypothermie provoquée, avec dix à quinze prises de température rectale espacées de quinze à trente minutes sur trois à cinq heures, une à trois administrations intraveineuses ou sous-cutanées et jusqu'à quatre prélèvements de sang, sans anesthésie ni analgésie. Cette hypothermie sert de signal pour mesurer si des molécules attelées à un médicament franchissent les barrières de l'organisme, sur une lignée dont le récepteur cible a été humanisé. Le porteur écrit travailler "faute d'alternatives de remplacement" et présente la souris comme "le seul système physiologique" intégrant les paramètres qu'il veut mesurer.

Objectifs

Les maladies neurologiques, musculaires et les maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. À l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, notre avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments, sur une lignée murine humanisée pour le récepteur cible de ce projet.

Bénéfices attendus

Choix d’une lignée murine humanisée pour notre récepteur d'intérêt : La transposition de nos recherches sur un modèle de souris humanisées, permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. Enfin, le fait de pouvoir humaniser notre cible chez la souris constitue un excellent outil stratégique et scientifique, se traduisant par une réduction importante du nombre d’animaux au sein des études, par un gain de temps considérable (et de coût), tout en réduisant par la suite de potentiels essais sur modèles animaux plus gros. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une avant l’euthanasie des animaux. La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). La mise en contention (avant toutes administrations (1 à maximum 3) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 1 à maximum 3. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50µl/semaine). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations (une ou trois maximum par individu), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 7jours). Un stress thermique pouvant quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mise à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique, ou suffisamment informel. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Dans notre cas, le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit alors de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. L’utilisation de faibles cohortes d'animaux permettra d’aller en ce sens, tout en allant exploiter un maximum de résultats et par l’obtention de données statistiques significatives.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes mixtes 4 individus (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 8 groupes par étude et 15 études par an, sur chacune des deux lignées de souris. Aussi, nous n’aurons besoin que de 960 animaux par an (4 *8*15*2), soit un total de 4800 souris sur 5 ans (960*5). Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte (50%mâles et 50% femelles (cages séparées). Le faible nombre d’individus (4, ici) sera suffisant pour obtenir une analyse statistique robuste. Les prélèvements de tissus en fin de procédure, nous permettrons d’optimiser cette dernière sur plusieurs types de post-expérimentations en apportant des données supplémentaires et ainsi, nous permettront d’éviter une utilisation abusive et inutile d’animaux (Réduction). De façon identique, la réalisation de prélèvements sanguins en cours de cinétique permet d'obtenir davantage de données pharmacocinétique, permettant ainsi de renforcer et d’optimiser l’étude et in-fine de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal. Nous porterons une attention particulière à la préparation en amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux (7 à 14 jours avant expérimentation). 48h à 72h avant les administrations, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce avec un cycle de lumière obscurité (12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Un maximum de 4 individus de même sexe par cage, maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires. De plus, travaillant sur animal sain, la simplicité des administrations uniques ou répétées sur animal vigile et le court laps de temps d’exposition des molécules, nous permettent d’éviter toute apparition potentielle de phénotypes dommageables chez les animaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs issus de deux fournisseurs différents.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques (groupes de 4 individus). À l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux, car il présente une cible humanisée (récepteurs) tout en gardant les avantages cités précédemment. Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, d'organes ou de liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons pour les deux lignées, des animaux dits « jeunes adultes », âgés en moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Non mis à mort à l'issue mais rendus disponibles pour une prochaine expérience après une période de repos, trois macaques à longue queue déjà utilisés dans un projet antérieur subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une sonde est introduite dans leurs narines jusqu'à l'œsophage pour administrer deux fois, à trois semaines d'écart, un candidat médicament contre le cancer du foie. Leur sang est ensuite prélevé sans anesthésie à la veine ou à l'artère fémorale, jusqu'à 10 % du volume circulant, avec un risque d'hématome et d'anémie transitoire. Le donneur d'ordres n'attend aucun effet indésirable puisqu'il a déjà testé la molécule sur des primates non humains à doses plus élevées, et le porteur décrit cette étape comme "indispensable" à la poursuite des essais réglementaires chez l'être humain.

Objectifs

Ce projet repose principalement sur la réalisation de prélèvements sanguins pour l’isolement de plasma et de cellules mononuclées du sang périphérique après administration d’un candidat médicament chez le primate non humain. Le candidat médicament servira dans le traitement des carcinomes hépatocellulaire, une forme de cancer primitif du foie. Les doses qui seront testées dans ce projet sont des doses que l'on sait non toxiques car déjà testées à des concentrations plus élévées sur le primate non humain par le doneur d'ordres. L’objectif sera double : tout d’abord l’étude pharmacocinétique de la molécule et l’étude de sa pharmacodynamie dans le sang du primate non humain.

Bénéfices attendus

L’étude de la pharmacocinétique d’une molécule à une concentration donnée permettra de prédire la dose administrable à l’homme. Réaliser ces tests sur un petit nombre d’animaux permet de déterminer les doses qui seront utilisées par la suite dans des études réglementaires plus conséquentes, mais permet également de réduire le nombre d’animaux et de raffiner leur utilisation en administrant une molécule dont on a déjà établi un profil, ce qui va permettre d’adapter le suivi.

Procédures

Les animaux de cette étude recevront un candidat médicament pour le traitement des carcinomes hépatocellulaire par voie orale à deux reprises espacées d’environ 3 semaines. Pour ce faire, la contention de l’animal se fera dans son hébergement à travers les barreaux dans le module d’isolement. Ce mode de contention permettra d’éviter de sortir l’animal complètement, réduisant son stress, et la durée de contention. Pour l’administration par voie orale, une sonde sera insérée dans l’œsophage de l'animal via les narines. Une seringue sera ensuite adaptée sur la sonde et la solution sera administrée à l’animal. L’administration durera quelques secondes. Les volumes administrés aux animaux seront en accord avec les procédures internes validées par le vétérinaire et avec les recommandations éthiques en vigueur. Tous les animaux de cette étude seront soumis à des prélèvements sanguins au niveau des veines et/ou artères fémorales et/ou céphaliques, sans anesthésie, d'une durée de quelques secondes (de 10 secondes à 30 secondes) en fonction du nombre de tubes à remplir. Les prélèvements de sang seront réalisés à hauteur du volume maximum prélevable en fonction du pourcentage du volume sanguin circulant, selon les recommandations éthiques et ne dépasseront pas 7mL/Kg soit 10% du volume sanguin circulant suivi d'une période de repos de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins peuvent provoquer du stress et/ou l’apparition d’hématome(s) au niveau de la zone de ponction. Lors de prélèvements fréquents ou en grande quantité, une anémie transitoire peut également apparaître. Une réaction systémique de type fièvre peut éventuellement apparaître les jours suivants les administrations. Un suivi de la température corporelle sera donc réalisé pendant plusieurs jours post-administration. Pour ce protocole, le donneur d’ordres n’attend aucun effet indésirable spécifique lié à son candidat médicament car celui-ci a déjà été testé sur le primate non humain à des doses plus élevées que celles qui seront utilisées dans ce protocole.

Devenir

A la fin de cette procédure, les animaux ne seront pas mis à mort et pourront être réutilisés après une période de repos selon les recommandations éthiques, selon l’avis du vétérinaire et de la structure du bien être animal.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet il n’est pas possible de remplacer l’utilisation de l’animal. En effet, déterminer le profil pharmacocinétique et pharmacodynamique de la molécule en fonction de la dose administrée permettra d’obtenir des informations sur le candidat médicament chez l’animal, indispensable au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. L’évaluation clinique des animaux effectuée avant et après administration de la molécule permettra d’observer et d’anticiper d’éventuels effets secondaires. Tous ces résultats permettront d’ajuster la dose optimale qui pourra être administrée chez l’homme, indispensable à la poursuite des essais réglementaires en clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus pour ce projet est de 3 (1 mâle et 2 femelles) non naïfs. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats interprétables et transposables à l’homme. En raison du faible nombre d’animaux, seules des analyses statistiques descriptives seront réalisées. Les animaux utilisés dans ce protocole sont non naïfs, donc issus d’un projet antérieur, de classe légère. Ils ont bénéficié d’un temps de repos adéquat et le vétérinaire ainsi que la structure du bien être animal ont autorisé leur réutilisation.

Raffinement

Afin d’optimiser le bien-être des animaux et de leur permettre d’exprimer leurs besoins comportementaux primaires, les animaux sont hébergés en groupes sociaux, avec des congénères qui ne seront pas inclus dans cette procédure, (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets sont mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises sont distribuées quotidiennement (après les manipulations et en fin de journée) dans la litière et dans des dispositifs à friandises (tube, jouets...). De la musique est diffusée dans les salles d’hébergements en continu pendant la journée à un volume raisonnable, afin d’avoir une homogénéité sonore de leur environnement et contribue à diminuer le stress lié aux activités du personnel ou autres animaux des autres salles de l’animalerie. La température et l’hygrométrie des hébergements sont suivies et contrôlées quotidiennement. Les animaux disposent d’eau de boisson à volonté, d’une quantité quotidienne d’aliment adaptée à leur poids et de fruits et/ou légumes frais pour compléter et diversifier leur régime alimentaire. Les animaux sont suivis quotidiennement par le personnel d’étude, formé et compétent. Deux observations sont faites quotidiennement avec prise en compte du stress et de la douleur potentiels. Enfin, un suivi pondéral des animaux est fait au minimum une fois par semaine pour suivre leur état de santé. Des points limites sont définis, adaptés aux besoins physiologiques des animaux. Un vétérinaire attitré est, au besoin, appelé afin d’évaluer l’état des animaux et de prescrire tous les soins nécessaires. Les animaux sont non naïfs, ils sont donc habitués à leur environnement et aux interactions avec les techniciens. Cependant, ils auront 28 jours d’acclimatation avant le démarrage de l’étude pendant lesquels ils auront des séances d’entrainement aux différents actes de l’étude avec un renforcement positif. Enfin, les animaux auront des temps de repos entre les prises de sang et les administrations du candidat médicament (environ 3 semaines). Les prélèvements de sang seront réalisés à hauteur du volume maximum prélevable en fonction du pourcentage du volume sanguin circulant, selon les recommandations éthiques.

Choix des espèces

Par leur origine phylogénétique, les primates non humains présentent une forte proximité avec les humains en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Le candidat médicament en développement étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent. Enfin, la séquence d'acides aminés cible et déterminante dans le mécanisme d'action du candidat médicament n'a pas de différence significative entre l'homme et le primate non humain. De jeunes adultes seront utilisés de préférence pour des raisons de maturité du système immunitaire.