Recherche appliquée

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sous anesthésie générale une chirurgie qui obstrue le flux urinaire d'un rein pour provoquer une maladie rénale chronique, puis un prélèvement de sang rétro-orbital le jour de sa mise à mort. Le porteur indique que la plaie peut s'infecter et que l'animal peut souffrir, se désorienter et perdre du poids. Les retombées annoncées, de nouvelles stratégies contre l'insuffisance rénale, sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat étant d'évaluer le rôle d'un récepteur de l'immunité innée. Sur le remplacement, il affirme que les cultures de tubules rénaux ne reproduisent ni la vascularisation ni le flux urinaire, et conclut qu'aucune approche in vitro ne peut se substituer à la souris.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques sont des maladies génétiques ou acquises. Le rein va subir de nombreuses modifications qui conduisent au développement de petits kystes, associés à une inflammation du rein et à son remplacement progressif par un tissu cicatriciel aboutissant à sa destruction. A terme, la maladie aboutit à l’insuffisance rénale terminale qui nécessite le recours à la dialyse et la transplantation rénale, deux procédures lourdes et coûteuses. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter aux patients d’évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. Plusieurs études ont montré le rôle délétère de l’immunité innée dans le développement des lésions rénales dans différents modèles murins de maladies rénales chroniques. L’étude proposée ici a pour objectif d’évaluer le rôle d’un récepteur de l’immunité innée dans l’apparition de lésions rénales dans un modèle murin chirurgical de maladie rénale chronique. Ce modèle utilise une chirurgie rapide sous anesthésie générale sur animaux adultes qui permet d’obstruer le flux urinaire d’un des 2 reins et ne compromet pas la fonction rénale du rein restant. L’invalidation génétique de ce récepteur de l’immunité innée sera évaluée à différents temps après la chirurgie : 1, 4 et 14 jours.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre d’élucider le rôle d’un récepteur de l’immunité innée sur le développement des lésions rénales en vue de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles de freiner la progression des maladies rénales chroniques.

Procédures

L’ensemble des animaux (120 souris) sera soumis à une chirurgie sous anesthésie générale. L’acte chirurgical en lui-même est d’environ 5 minutes. Le temps global de la procédure de chirurgie (préparation, anesthésie, chirurgie, suture et réveil) est de 2 heures. Enfin, l’ensemble des animaux sera soumis à un prélèvement de sang (30secondes) sous anesthésie générale le jour de la mise à mort. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir 2 injections pour l’anesthésie pré-opératoire et lors de la mise à mort ce qui peut induire un stress momentané lors de la contention et une douleur aigüe lors de l’injection. Le modèle chirurgical n’induit pas par lui-même de nuisance puisqu’un seul des 2 reins étant obstrué, l’autre rein maintient une fonction rénale normale. En revanche, suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir (désorientation, éventuelles douleurs, perte de poids) et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection (douleur aigüe). Le prélèvement sanguin rétro-orbital sous anesthésie générale peut induire une douleur aigüe.

Devenir

L’ensemble des 120 animaux sera mis à mort afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro ne permettent pas l’étude intégrée d’un rein ayant une vascularisation, un flux urinaire, des fibroblastes et des cellules immunitaires. Il n’est donc pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et lors de l’évaluation des points limites par la personne en charge du protocole afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Afin de réduire la douleur associée à la chirurgie, une anesthésie générale est réalisée. Un antalgique et un analgésique seront administrés en pré- et post-opératoire. Les souris présentant une infection de la plaie se verront appliquer une solution de désinfection ainsi qu’une pommade anti-septique jusqu’à disparition des symptômes. A l’issue de la procédure, les souris seront mises à mort sous anesthésie générale préalable. Tout animal en souffrance recevra un antalgique et/ou des compléments alimentaires. Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage.

Choix des espèces

La souris permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Les souris utilisées sont déficientes pour une protéine de l’immunité innée. Ces souris ont été décrites dans la littérature scientifique comme le modèle de référence pour étudier la voie de l’immunité innée dont le rôle est questionné dans cette étude. Les animaux subiront une chirurgie à l’âge adulte (8-12 semaines) après la fin de maturation des reins.

Choisis parce que leur œil a presque la taille d'un œil humain, 20 lapins New Zealand vont subir le retrait de leur cristallin et son remplacement par un sac capsulaire artificiel, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'intervention dure 25 à 30 minutes par œil sous sédation profonde, et le porteur annonce une gêne visuelle d'une quinzaine de jours puis une irritation de la cornée pendant sept à dix jours. Dix lapins sont prévus au départ, dix de plus si l'implantation échoue ou si l'œil rejette le dispositif. Trois mois après la greffe, tous sont tués pour que leurs cornées soient prélevées et analysées.

Objectifs

La perte du cristallin chez les patients à deux origines majeures : *La cataracte qui est une opacification partielle ou totale du cristallin qui menace la vue à long terme. Elle touche plus d’une personne sur cinq à partir de 65 ans et près de deux sur trois après 85 ans. L’opération de la cataracte consiste à inciser le cristallin, puis à y injecter une lentille intraoculaire IOL (Intraoculaire Lens) afin de restituer l’acuité visuelle du patient. Certaines complications de l’opération peuvent amener à une rupture du sac capsulaire entraînant un déplacement de l’IOL dans la cavité vitréenne. L’IOL sélectionné ne peut plus être utilisé et le chirurgien doit alors envisager une opération secondaire pour le remplacer. *L’aphaquie congénitale ou traumatique : La luxation ou l’absence totale de cristallin peut aussi intervenir : • Suite à des maladies du tissu élastique ou certaines pathologies oculaires, qui fragilisent le complexe cristallin-sac capsulaire-zonule • Suite à un traumatisme contusif violent • Suite à de la radiothérapie pour des traitements ophtalmiques oncologiques Notre équipe en collaboration avec un laboratoire spécialisé dans les implants oculaires a développé un sac capsulaire artificiel, remplaçant totalement le cristallin et permettant de : • Eviter les opérations secondaires de la cataracte suite à des complications • Apporter une alternative facilement implantable suite au cas de luxation ou d’absence naturelle totale de cristallin. Après de multiples tests d’implantations dans des yeux artificiels, une étude préclinique chez l’animal est indispensable avant le passage chez l’homme.

Bénéfices attendus

L’implantation de ce sac capsulaire artificiel appelé MIOS remplacera totalement le cristallin et permettra d’éviter les opérations secondaires de la cataracte suite à des complications des anciennes génération d’implants (IOL) et apportera une alternative facilement implantable suite au cas de luxation ou d’absence naturelle totale de cristallin de plus il peut permettre d’intégrer des inserts cosmétiques permettant de traiter les défauts d’IRIS (Aniridie). L’opération de la cataracte est l’intervention chirurgicale la plus fréquente au monde. Près de 4.700.000 personnes sont opérées en Europe chaque année (INSERM 2017) et 800.000 opérés en France en 2020

Procédures

Une intervention chirurgicale ophtalmologique qui consistera en l'exérèse du cristallin puis son remplacement par la pose d'un implant oculaire (sac capsulaire artificiel) cette intervention aura une durée de 25 à 30 minutes

Impact sur les animaux

Les lapins ressentiront une gêne dans l’acclimatation de la vue pendant environs 15 jours après l’opération. Ils ressentiront une irritation de la cornée au niveau du site opératoire pendant une période de 7 à 10 jours. Puis une reprise de la vue normale progréssive.

Devenir

Tout les animaux ayant subit la procédure 1 suivront la procédure deux et à l'issu de cette dernière procédure ils seront mise à mort pour évakuation histologique.

Remplacement

Pour répondre au principe de remplacement la mise au point de la technique de greffe du sac capsulaire artificiel a été réalisée sur des yeux artificiels malgré tout il est indispensable de passer sur un modèle animal pour suivre l’intégration et la fonctionnalité de l’implant au court du temps.

Réduction

Ce projet a pour but une application direct en médecine humaine de cette nouvelle forme d’implant. Il est donc important de prouver la bonne intégration et le bon fonctionnement de ce nouveau dispositif médical intraoculaire. Notre première approche qui a permis de réduire l'utilisation des animaux vis à vis de l'implantation à 10 lapins a été effectuée sur des yeux artificiels. La maitrise parfaite de l'implantation a permis d'exclure ce facteur de l'analyse de nos résultats futurs sur la parfaite intégration des implants. En nous basant sur des études antérieures ayant permis la mise en application de prothèses intraoculaires nous avons pu déterminer que 10 lapins maximum seraient suffisant. Dans un premier temps 10 lapins seront opérés d’un œil (retrait du cristallin et remplacement par un sac capsulaire artificiel). Au terme des 3 mois d’évaluation sans complication majeure et avec une parfaite récupération de la vue le projet sera arrêté et l’étude validée. Dans le cas de complications lors de l’implantation, de rejet de l’implant par défaut de d’intégration ou de problèmes de récupération de la vue, 10 nouveaux lapins seront opérés en concertation avec le SBEA de notre établissement afin d’apporter des mesures correctives. Le minimum d’animaux utilisés sera donc de 10 et le maximum 20.

Raffinement

L’ensemble des procédures seront effectuées sous sédation profonde monitorée, couplée à une anesthésie locale médiée par un collyre ophtalmique. Le temps opératoire sera très courts maximum 30 minutes par oeil et pratiqué par un chirurgien qualifié. Afin de garantir une parfaite transposition chez l’humain les soins post opératoires seront les mêmes qu’en médecine traditionnelle : -Injection sous conjonctivale d’anti-inflammatoire en fin d’intervention, ainsi qu'un collyre anti-rejet. -Pommade ophtalmique deux fois par jour jusqu’à cicatrisation totale soit 7 à 10 jours. Chaque jour, un examen ophtalmologique sera pratiqué ainsi que des photos seront réalisées afin de suivre la bonne intégration de l'implant. A 3 mois post-greffe les cornées seront prélevées pour analyses histologiques. La manipulation des lapins sera facilitée par des séances d’entrainement récompensée (Fruity bites) durant les deux semaines d’acclimatation pré-opératoire. Des Bunny Block, des briquettes de bois et de luzerne seront disposés dans la cage de façon alterné afin d'assurer l'enrichissement du milieu et de la musique douce sera diffusée quotidiennement. Les points limites seront déterminés en se basant sur le Rabbit Grimace Scale. Cette évaluation consiste à observer attentivement les joues, les yeux, les oreilles, le museau et les moustaches de l'animal en tenant compte d'une échelle d’évaluation des expressions faciales du lapin. Dans cette étude nous porterons une attention toute particulière aux yeux et au regarde.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le lapin new zealand. L’expérimentation proposée est relativement facile chez le lapin car la taille de l’œil est proche de celle de l’homme. Les lapins peuvent sous sédation être facilement examinés au biomicroscope pour la réalisation de photos post-opératoires et sont de très bons candidats pour cette mise au point. Stade adulte afin que l'oeil de l'animale ait atteint sa taille maximale. Soit 2kg à 2.5 kg

Pour voir si un anti-inflammatoire ajouté à l'immunothérapie retarde le cancer du foie, 104 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à des semaines différentes selon leur groupe. Deux jours après leur naissance, elles sont séparées de leur mère le temps d'une injection de streptozotocine, puis nourries au régime gras dès le sevrage jusqu'à développer une cirrhose puis un carcinome hépatocellulaire à partir de la seizième semaine. Suivent de quatre à quarante injections dans le ventre sur animal éveillé selon les groupes, trois anesthésies gazeuses, deux scanners du foie et deux allers-retours de cinq cents mètres entre l'animalerie et le service d'imagerie, le porteur qualifiant d'"indolore" cette évolution vers le cancer. La seule limite décrite pendant l'examen tient au monitoring respiratoire, l'animal en détresse étant retiré de l'appareil, soigné et surveillé jusqu'à son réveil.

Objectifs

Le cancer du foie est le 6° cancer le plus fréquent et la 3° cause de décès par cancer dans le monde. Il survient sur un foie avec une inflammation et en situation de cirrhose. Le traitement de référence est une immunothérapie mais elle ne fonctionne que chez un patient sur 3. Aussi, nous souhaitons voir si un traitement de l’inflammation, déjà efficace dans d’autres pathologies inflammatoires, combiné à l’immunothérapie, permettra de retarder ou éviter l’évolution vers le cancer dans un modèle de souris mâles développant tous les stades d’évolution depuis la cirrhose jusqu’au cancer du foie. Des imageries par scanner seront réalisées pour évaluer l’effet préventif, ou curatif, ou complémentaire de l’immunothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements utilisateurs, un établissement pour l'hébergement et un établissement spécialisé dans les imageries.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de comprendre et étudier les mécanismes bénéfiques d’un médicament régulant l’inflammation sur le cancer du foie avancé développé sur un foie gras et inflammé, et d’évaluer sa complémentarité avec l’efficacité antitumorale de l’immunothérapie.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU1 : - La maladie du foie gras sera provoquée chez les souris en leur injectant un antibiotique, appelé streptozotocine, juste après leur naissance, et cela prendra seulement 5 secondes par souris. Ensuite, après avoir été sevrées, elles recevront une alimentation riche en graisse. - Le traitement par le médicament régulant l’inflammation du foie se fera par injections dans le ventre 4 jours par semaine en suivant un plan spécifique pour chaque groupe de souris. Chaque injection prendra environ 3 secondes par animal. - Le traitement par immunothérapie se fera par des injections dans le ventre 1 jour par semaine avec des injections à partir de la semaine 18 pour les groupes d’étude concernés. Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU2 : - Une imagerie du foie sera réalisée en utilisant un scanner, pendant que les souris seront sous anesthésie générale. Cette procédure sera effectuée par du personnel qualifié et avec le matériel approprié pour les souris, incluant une plaque chauffante et un suivi des signes vitaux. Cela prendra entre 2 minutes par souris. L'agent de contraste pour l’imagerie sera administré qu’une seule fois pour toute la durée de l’étude.

Impact sur les animaux

- Injection à J+2 de vie + séparation du souriceau de la mère de quelques minutes classée légère. - Au sevrage, régime riche en graisse provoquant l’évolution de la maladie jusqu’au carcinome hépatocellulaire à partir de la semaine 16 classé légère. - 4, 16, 20, 40 injections intra-péritonéales sur souris vigiles selon les groupes d’étude classée modérée. - 3 anesthésies gazeuses par individus de 5 minutes chacune (1 pour réaliser une injection de produit de contraste en veine caudale + 2 pour réaliser les imageries) classée légère- 2 aller-retours entre l’animalerie centrale et animalerie d’imagerie, distante de 500 mètres classée légère.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude et les procédures.

Remplacement

A nos jours, il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’apparition et l’évolution de la stéato-hépatite métabolique vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Une étude chez l’animal est indispensable pour mettre en évidence l’effet de l’inhibition d'un récepteur de l'immunité associé ou non à l’immunothérapie sur l’ensemble des paramètres contribuant au développement de cancer du foie.

Réduction

Nos résultats préliminaires de la mise en place de ce modèle nous ont permis de calculer et de fixer le nombre de 104 souris mâles de façon optimale, en nous appuyant sur une méthode statistique adéquate. L'utilisation de l'imagerie permet donc de limiter le nombre d’animaux utilisés, car non invasive.

Raffinement

Dès leur réception, les souris parents auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement avant de réaliser les accouplements. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, enrichissement) à leur bien-être. Une observation quotidienne du bien-être animal avec une grille d’évaluation de l’état des animaux et une pesée tous les 3 jours seront réalisés pour tous les animaux tout au long du projet. Les injections chez les souriceaux mâles puis au long de l’étude seront réalisées par un zootechnicien expert sur animal vigile. Le régime riche en graisse administré à partir de la 4ème semaine de vie (dès le sevrage), conduit à l’évolution de la maladie jusqu’au cancer du foie de manière indolore. Après la phase de sevrage, les souris seront hébergées en petit groupe cage avec des divers types d’enrichissements, tels que : des cylindres de coton et/ou des nids de papier, afin de permettre aux souris de construire des nids confortables, ainsi que des Mini Dômes comme refuge. Des petits bouts de bois non toxiques seront fournies afin de permettre aux souris d'assouvir leur besoin de ronger. Des tunnels ou des abris afin de permettre aux souris de se cacher et d'explorer leur environnement. Les stades d’évolution de la maladie seront évalués de manière non invasive par scanners, sous anesthésie générale sans douleur, avec une seule injection du produit de contraste pour toute la durée du suivi sur plusieurs semaines. Durant l’examen, les animaux seront surveillés par un monitoring respiratoire. Si l’animal présente une détresse respiratoire, il sera immédiatement retiré de l’appareil, soigné et surveillé jusqu’au réveil.

Choix des espèces

Les principaux modèles des maladies chroniques du foie ont été validés internationalement sur des souris ou des rats. Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence du modèle invalidé génétiquement pour le récepteur d’intérêt permettant d’étudier le(s) rôle(s) spécifique(s) de l’inflammation dans la maladie du foie gras non alcoolique et du cancer du foie. Les souriceaux débuteront le protocole à J+2 de vie et seront issus de souris gestantes et le termineront à la semaine 20 ou 22 selon les groupes d’étude.

Constituer et entretenir une collection de tumeurs humaines greffées, mise à disposition d'autres chercheurs et des tests précliniques de médicaments : 9 830 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit sous anesthésie générale, après incision du dos, un fragment de tumeur ou une injection de cellules tumorales, la plaie refermée par deux ou trois agrafes, puis un marquage à l'oreille ou une puce sous la peau. Suivent des mesures de tumeur jusqu'à trois fois par semaine, parfois des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire ou une ponction intracardiaque terminale, et selon les modèles un traitement à la testostérone ou aux œstrogènes. Le porteur juge "indispensable" de développer ces modèles sur un "organisme complexe", et chiffre l'effectif en greffant chaque modèle sur six à dix-huit souris par passage, pour un taux de pousse annoncé à 25 % minimum.

Objectifs

L’augmentation des chances de succès de la mise sur le marché d’un médicament efficace, notamment en oncologie, passe par l’amélioration des systèmes permettant de tester le potentiel thérapeutique de ce médicament avant son application enclinique, et donc par la mise au point de modèles in vivo mieux caractérisés et plus proches des pathologies étudiées. Les modèles de Patient Derived tumor Xenografts (PDX) sont des outils précieux pour la recherche visant à étudier les effets de médicaments en amont des essais cliniques puisqu’ils conservent les caractéristiques moléculaires et histologiques des tumeurs primaires humaines dont ils sont issus. L’établissement de collections de PDX est donc aujourd’hui un enjeu majeur pour l’évaluation des thérapies anti-cancéreuses afin de reproduire au mieux la diversité des cancers humains, de développer des thérapies spécifiques et d’identifier les marqueurs biologiques prédictifs de la réponse à ces thérapies. Le but de ce projet est de développer une collection de modèles PDX fiables, représentant au plus près la maladie humaine, afin de mettre à disposition du plus grand nombre de chercheurs des outils performants permettant de comprendre et de lutter efficacement contre les différents types de cancers. Les modèles PDX seront générés à partir de l’exérèse de tumeurs prélevées chez des patients consentants, ou encore par transfert de modèles primo-implantés par nos collaborateurs. La réalisation d’analyses moléculaires fait partie intégrante du projet afin de caractériser le plus finement possible les modèles développés. Ce sont elles qui permettront de choisir le modèle étudié en préclinique (selon la présence d’une mutation particulière, l’expression d’un gène spécifique,…). La mise en service de modèles PDX couvrant la diversité tumorale permettra de relever les défis actuels rencontrés dans la lutte contre le cancer grâce à une identification rapide des évènements oncogéniques, leur ciblage thérapeutique et l’anticipation des mécanismes de résistance et de toxicité aux traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif le développement de modèles de PDX nécessaire pour déterminer l'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques développées ou en cours de développement dans un contexte préclinique, dans le but d’améliorer et d'identifier des thérapies efficaces pour le traitement des divers types de cancers. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Parmi un grand nombre de molécules à tester, incluant de nouvelles molécules ou des molécules développées ou en cours de développement, les études précliniques ont une première étape vers l’identification des traitements plus efficaces ou avec des effets secondaires moindres.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une greffe correspondant à l'implantation d'un fragment de tissus tumoral ou de cellules dissociées issues de tissus tumoral. Avant la greffe, les souris sont anesthésiées (anesthésie générale). La peau est incisée au niveau du dos de l'animal après désinfection préalable. La greffe est réalisée par l'implantation d'un fragment tumoral ou l’injection de cellules. Afin d'identifier avec précision le modèle implanté, les souris seront marquées au niveau des oreilles ou avec une puce insérée en sous cutané. L'incision est alors refermée par 2-3 agrafes préalablement aseptisées. La procédure a une durée globale de 30 minutes maximum par souris. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être et de leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Selon les caractéristiques des modèles, un traitement à la testostérone ou une supplémentation en oestrogènes pourront être réalisés. Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale. La durée de mesure de la tumeur et de pesée est inférieure à 1 minute par animal. Dans le cadre d'une meilleure connaissance des modèles des prélèvements de sangs pourront être effectués au niveau du sinus retro-orbital (sous anesthésie gazeuse) ou de la veine caudale, dans le respect des directives européennes. Des ponctions intracardiaques pourront être pratiquées lors de prélèvements terminaux, sous anesthésie générale. La durée de prélèvement est inférieure à 1 minute par animal.

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie et la chirurgie, une hypothermie, des douleurs post-opératoires et un risque d’infection peuvent être attendus. La xénogreffe de tumeurs peut également provoquer une perte de poids (modèles cachectiques). Un stress induit par les prélèvements sanguins est également une nuisance attendue. Ces nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont transitoires et peuvent donc être classés en modérés. Dans le cas où ces nuisances persisteraient, elles déclencheraient l’euthanasie de l’animal par atteinte d’un point limite.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur d'un fragment tumoral ou de cellules tumorales, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. La réutilisation ne peut pas être possible car les effets des procédures précédentes que les animaux ont subies (greffe de fragment tumoral, greffe de cellules tumorales, traitement hormonal) pourraient introduire une variabilité indésirable dans les résultats de toute étude ultérieure.

Remplacement

La production de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests pré-cliniques afin de valider leur absence de toxicité et leur efficacité sur la croissance tumorale, avant une application chez l’Homme. Il existe des méthodes alternatives à la réalisation de tests sur les animaux (in vitro, prédictions informatiques…), permettant de réduire la quantité de tests à effectuer en nombres de traitements et en détermination de doses. Cependant, elles n’offrent pas la possibilité de lier les effets des traitements avec une activité du métabolisme d’un organisme complexe pour l’étude de la distribution et de l’efficacité thérapeutique. Ce projet a pour objectif de développer les modèles PDX à partir de tumeurs de patients. Ces modèles sont les seuls représentant le plus fidèlement possible les diversités caractéristiques observée dans les cancers humains, et ce dans un organisme complexes. Ils permettent d’augmenter les chances de succès dans le développement de traitements efficaces et personnalisés pour des populations définies (médecine personnalisée), avant un transfert en étude clinique chez l’Homme.

Réduction

Le développement de PDX est standardisé et la parfaite connaissance de ce type de modèles permet de mettre en place une stratégie expérimentale utilisant un nombre d’animaux réduit au minimum. Nous estimons développer 40% des modèles primo-implantés (taux de chances qu’un modèle pousse chez la souris à partir d’un échantillon humain) et 100% des modèles transférés par les partenaires du projet, ces derniers ayant été greffés chez la souris au préalable, leur croissance chez la souris a déjà été un succès. Lors de la greffe d’une tumeur sur un animal, les chances qu’elle pousse est de minimum 25% (d’après les données internes et les données de la littérature). Pour maximiser les chances de réussites et espérer la croissance d’au moins une tumeur par passage, chaque modèle est greffé sur 6 animaux à chaque passage. Si, pour un modèle donné, nos analyses montrent que le taux de pousse est supérieur à 25%, le nombre d’animaux greffé à chaque passage pourra être réduit à 4 au lieu de 6. Afin de garantir la conservation des modèles dont le développement a été un succès, et pour analyser leurs caractéristiques biologiques et moléculaires, une banque biologique est créée, nécessitant de greffer chaque modèle sur 18 animaux à un passage donnée. Si le taux de pousse est supérieur à 25%, le nombre d’animaux greffé à ce passage pourra être réduit à 12 au lieu de 18. Afin de vérifier les possibilités de décongélations des modèles, 3 méthodes de décongélations sont testées, cela nécessite l’utilisation de 6 animaux par méthode de décongélation (3x6=18 animaux). Si la première méthode de décongélation testée est un succès, les deux autres méthodes ne seront pas testées permettant de réduire le nombre d’animaux à 6 au lieu de 18.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour monitorer leur bien-être général et leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Pour chaque animal, tout signe clinique observé susceptible de causer une douleur, une souffrance ou une angoisse, sera immédiatement enregistré. Lors de l’acte chirurgical, la greffe se fera sous anesthésie générale. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant pour éviter le risque d’hypothermie. De l’antiseptique sera appliqué sur la peau des animaux, les agrafes seront aseptisées et le matériel utilisé sera stérilisé pour éviter les risques d’infection. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. En cas d’une perte de poids supérieur à 15% du poids en début d'expérimentation, une supplémentation sous forme de gel alimentaire sera ajoutée dans la cage jusqu'à ce que la perte de poids soit inférieure à 10% du poids en début d'expérimentation. Si une sécheresse oculaire est observée lors des prélèvements, un protecteur oculaire sera administré à l’animal. L'ensemble de ces mesures permet d'anticiper et de réduire une éventuelle souffrance de l'animal.

Choix des espèces

L'objectif du projet est le développement de modèles nécessaires pour la réalisation de tests précliniques, dont le but final est la détermination de l’efficacité de nouvelles thérapies pour le traitement des cancers. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Il existe des méthodes alternatives à la réalisation de tests sur les animaux (in vitro, prédictions informatiques…), permettant de réduire la quantité de tests à effectuer en nombres de traitements et en détermination de doses. Cependant, elles n’offrent pas la possibilité de lier les effets des traitements avec une activité du métabolisme d’un organisme complexe pour l’étude de la distribution et de l’efficacité thérapeutique. Nous utilisons des souches murines immunodéprimés qui sont classiquement utilisées pour des greffes de tumeurs humaines et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques et qui ont été utilisées lors du pré-développement des modèles par les partenaire du projet. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux, en fin de période d'acclimatation, de plus de 18g, âgés entre 6 et 10 semaines pour augmenter nos chances de succès

Quinze semaines d'un régime gras rendent 288 souris obèses, diabétiques et porteuses d'un foie chargé de graisse, avant sept prélèvements de sang en deux heures le jour du test au glucose. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue. Le porteur ne décrit comme douleurs que celles des piqûres de la queue et des prélèvements à la veine sous-mandibulaire, qualifiées de légères, l'obésité, le diabète et la stéatose induits restant rangés au titre des perturbations métaboliques attendues. La mise à mort finale sert à récolter le sang et les organes pour identifier les protéines associées à la protéine p85 dans la voie de l'insuline.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie métabolique caractérisée par une concentration élevée de sucre (hyperglycémie) dans le sang. Le nombre de cas est en constante augmentation, en parallèle avec l’augmentation des cas d’obésité. Les patients diabétiques développent fréquemment des maladies chroniques du foie, notamment caractérisées par une accumulation de graisses dans le foie (stéatose). L'hyperglycémie, qui définit le diabète de type 2, est liée à l'action inadéquate de l'insuline. L'insuline est libérée par le pancréas suite à l'ingestion d'un repas. Elle agit avec d’autres protéines en cascade afin de faire entrer le sucre dans les cellules et maintenir sa concentration correcte dans le sang. Parmi les protéines de cette cascade, on retrouve notamment une protéine appelée p85. Afin de mieux comprendre les mécanismes liés au développement d'un diabète et d'accumulation de graisses dans le foie, nous souhaitons identifier les protéines qui participent au maintien de la concentration correcte de sucre dans le sang chez des souris mâles et femelles obèses. Pour cela, nous utiliserons des souris transgéniques afin d'identifier les protéines qui sont associées à la protéine p85. Ces souris seront nourries avec un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une stéatose chez l'animal. Les études cliniques et précliniques indiquent des différences majeures liées au sexe dans la voie de l'insuline, ainsi nous utiliserons des souris des 2 sexes. A la fin de l'expérience, différents organes seront prélevés afin de purifier la protéine d'intérêt et d'identifier les protéines auxquelles elle est associée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de la voie de l'insuline dans les pathologies du diabète de type 2 et du foie gras (stéatose hépatique). La purification spécifique des protéines d'intérêt de la voie de l'insuline permettra d'identifier et de comparer leurs interactions avec d'autres protéines chez des souris saines et des souris obèses. Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.

Procédures

Les animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou un régime obésogène riche en graisses pendant 15 semaines. Les animaux seront pesés toutes les semaines. Un prélèvement d’une seule goutte de sang à la queue sera réalisée 1 fois toutes les 2 semaines (petite piqûre de la veine caudale avec une lancette de 1 mm). Ce prélèvement ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. Les animaux recevront une fois une solution de glucose par gavage et une fois de l'insuline par injection intrapéritonéale. Le gavage et l'injection prennent chacun moins de 30 secondes et seront espacés au minimum d'une semaine. Le même jour, des prélèvements d’une seule goutte de sang seront réalisés à la queue toutes les 15 min minutes sur une durée de 2h pour étudier, soit 7 prélèvements prenant moins de 5 secondes chacun. Un prélèvement intermédiaire de sang, prenant environ 15 secondes, pourra aussi être réalisé (1 fois 100 μl), espacé au minimum d’une semaine avec les autres prélèvements. Juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire.

Impact sur les animaux

Les animaux nourris avec les régimes gras deviendront obèses et présenteront des perturbations métaboliques associées à l’obésité telles que le développement d’un diabète (concentration élevée de sucre dans le sang) et d'une stéatose (accumulation de graisses dans le foie). Les prélèvements sanguins (intermédiaire et final) à la veine submandibulaire et les injections de glucose (OGTT) et d’insuline (ITT) peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention et une légère douleur. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang (pour la mesure de la glycémie) peut entraîner une légère douleur.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation de l’animal entier car les pathologies étudiées sont complexes et ne peuvent pas être mimées avec fidélité en culture cellulaire. En effet, dans ces pathologies, plusieurs organes de l'organisme communiquent entre eux. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d'étudier une version modifiée d'une protéine d'intérêt.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant la piqûre permettant de prélever une goutte de sang. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Contenues et pesées deux fois par semaine, les souris sont examinées à la recherche de ganglions hypertrophiés, d'une posture voûtée ou d'une perte de poids, signes que le lymphome se développe et qu'il faut les tuer avant leur mort "naturelle". 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes et leurs tumeurs. L'objectif est de constituer un stock de tumeurs à partir duquel une même tumeur sera réimplantée dans plusieurs souris receveuses, pour alimenter de futures études précliniques sur le lymphome diffus à grandes cellules B. Le porteur annonce que certaines souris recevront une injection d'une minute pour ce transfert de cellules tumorales, sans dire combien, et ne mentionne aucune analgésie.

Objectifs

Le lymphome est le cancer du sang le plus répandu et le sixième cancer le plus répandu dans le monde. Le lymphome diffus à grandes cellules B est une forme agressive de lymphome, représentant 30 à 40 % des cas. Le traitement actuel du lymphome diffus à grandes cellules B consiste en une chimiothérapie ou une greffe de moelle osseuse ; cependant, environ 40 % des patients cessent de répondre au traitement (maladie récidivante) ou ne répondent pas au traitement (maladie réfractaire), généralement avec des conséquences fatales. Il est donc urgent de trouver des traitements plus efficaces pour ces lymphomes. Actuellement, il y a un manque de modèles expérimentaux qui ressemblent avec précision au lymphome diffus à grandes cellules B. L'objectif de ce projet est de générer des lymphomes à l'aide d'un nouveau modèle de souris permettant de suivre l'initiation et la progression du lymphome. Ce modèle nous permettra d'étudier les causes du développement du lymphome ; et grâce à l'expansion de ces tumeurs chez des souris receveuses, nous générerons suffisamment de matériel pour des applications précliniques, y compris de futures études in vitro et in vivo.

Bénéfices attendus

À court terme (1-3 ans), nous générerons des informations importantes sur les gènes et les voies qui contribuent à l’apparition et à la progression du lymphome, qui sont actuellement inconnus. À long terme (3-5 ans), ces modèles permettront de réaliser des études précliniques pour identifier de nouvelles façons de tester de nouvelles thérapies afin de faire progresser les traitements contre les cancers du sang.

Procédures

Les souris qui développeront des lymphomes seront surveillées. Nous manipulerons (contention) les animaux deux fois par semaine pour les peser et les observer à la recherche de signes de formation de tumeurs : perte de poids, réduction des mouvements, posture voûtée, fourrure ébouriffée, hypertrophie des ganglions lymphatiques, changements de comportement pour mettre à mort les souris avant leur mort « naturelle ». Les tissus seront collectés pour déterminer les causes de la formation de tumeurs et générer un référentiel de tumeurs. Certaines souris recevront une injection pendant 1 minute pour transférer des cellules tumorales.

Impact sur les animaux

Les symptômes associés au lymphome comprennent : perte ou prise de poids, respiration rapide, pelage ébouriffé, posture voûtée et/ou de mouvements lents. En outre, la manipulation des souris pendant la surveillance du développement du lymphome peut induire du stress. Et il peut y avoir une inflammation au site d’injection. Des injections entrainent également du stress et des douleurs légères de courte durée.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure nécessaire pour la récupération des organes et la récupération des tumeurs pour leur étude ultérieure.

Remplacement

Compte tenu de la complexité du processus impliqué dans la formation des lymphomes, résoudre ce problème uniquement par l’analyse in vitro n’est pas suffisant et l’utilisation de modèles animaux est essentielle. Par conséquent, pour l’instant, aucune méthode alternative ne permet de remplacer complètement le modèle murin dans notre étude. Cependant, les résultats obtenus à partir de nos expérimentations permettront de développer un protocole in vitro qui pourrait à terme remplacer partiellement les modèles animaux. De même, la même tumeur récoltée peut être utilisée pour implanter plusieurs souris receveuses, limitant ainsi la nécessité d’augmenter le nombre de souris donneuses.

Réduction

L'élevage sera géré en externe, et nous permettra de limiter le nombre de croisements au minimum afin d'obtenir le bon nombre de souris nécessaire à ce projet. Nous utiliserons des souris mâles et femelles puisque le lymphome affecte les deux sexes. Nous utiliserons des statistiques prédictives pour établir la constitution des groupes. De plus, les cellules tumorales excédentaires récoltées sur des souris mises à mort seront congelées pour créer une banque de tumeurs, afin de minimiser le nombre de souris nécessaires pour fournir du matériel pour de futures expériences.

Raffinement

Nous avons établi une grille d'évaluation avec des seuils précoces adaptés pour détecter les lymphomes suffisamment tôt afin de réduire au maximum la souffrance animale tout en conservant une rigueur scientifique. Cela comprend une surveillance accrue lors de l'observation de changements de poids, de mouvements, d'apparence physique et de comportement ; et arrêter l'expérience lorsque les symptômes du lymphome apparaissent. De plus, si les souris présentent des égratignures ou des blessures, nous utiliserons une solution d'iode pour désinfecter la zone.

Choix des espèces

Les souris sont les espèces les plus utilisées pour étudier la formation et le développement des lymphomes en raison de la flexibilité nécessaire pour effectuer des manipulations génétiques (souches avec des gènes désactivés) et de la possibilité de tester l'agressivité de la maladie par le transfert de cellules tumorales dans des souris réceptrices. Ils ont également un cycle de vie court et se reproduisent facilement. Pour les expériences de développement de lymphomes, les souris vieilliront jusqu'à 14 mois, puisque la latence de cette maladie, d'après nos études précédentes, se situe entre 8 et 14 mois. Pour les expériences impliquant le transfert de cellules de lymphome, des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines sont couramment utilisées comme souris receveuses.

Des injections quotidiennes d'immunoglobulines prélevées chez des patients, pendant sept à dix-sept jours, provoquent chez la souris une myopathie nécrosante avec perte de force musculaire. 154 souris, dont une partie immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les muscles gastrocnémiens. Elles subissent en plus deux à quatre microprélèvements sanguins sous anesthésie, jusqu'à cinq tests d'agrippement et une mesure de force in situ de dix minutes. Le porteur affirme que l'atteinte musculaire n'a pas de répercussion visible en termes de souffrance, tout en décrivant une échelle qui va de la queue traînante à la paralysie du train arrière et un protocole arrêté au score 2.

Objectifs

Au sein des myopathies inflammatoires, les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) sont définies histologiquement par la présence d'une importante nécrose des fibres musculaires sans infiltrat inflammatoire. La nature auto-immune des myopathies nécrosantes a été suggérée par leur association fréquente à la présence d'autoanticorps (aAc) ; dont l'aAc anti SRPP (anti-3-Hydroxy-3-MethylGlutaryl-Coenzyme A Réductase) avec une corrélation du titre avec la myolyse. Notre laboratoire a établi un modèle murin de MNAI par injection à des souris d'immunoglobulines G purifiées issues de patients porteurs cet d’aA anti-HMGCR. Ce transfert induit une myopathie clinique avec diminution de la force musculaire associée à un dépôt d’IgG et de molécules du sytéme du complément à la surface des fibres musculaires, démontrant le caractère directement pathogène des aAc et suggérant un rôle cytotoxique exclusif du complément. Nous avons déja démontré l'efficacité préventive d'un inhibiteur spécifique du complément. L'objectif général de notre programme est d'évaluer l'efficacité thérapeutique d'un nouvel inhibiteur spécifique du complément humain dans notre modèle murin de MNAI par transfert d'anticorps de malades et de la comparer à celle d'un autre inhibiteur commercialisé mais de spécificté différente et de la molécule antagoniste. Pour ne pas avoir de réponse xénogénique lors de la procédure évaluant le rôle curatif de cette molécule, nous aurons recours à des souris immunodéficientes. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires.

Bénéfices attendus

Lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal, nous avons pu démontré l'efficacité de molécules thérapeutiques dans (i) l'apparition et (ii) le traitement de la myopathie. Cela s'est traduit par respectivement (i) une absence d'atteinte histologique et de diminution de la force musculaire et (ii) par une réduction significative de l'atteinte histologique et une restauration de la force musculaire. Avec ce nouvel inhibiteur du fragment C2 du complément nous pouvons nous attendre à une restauration partielle ou complète de la fonction musculaire de l'animal ouvrant ainsi la porte à un essai clinique chez les patients atteints de MNAI.

Procédures

Les animaux seront soumis à des microprélèvements de sang (2 à 4 en fonctions des groupes d'animaux) de 75 microlitres, prélèvement sur souris anesthésiée, durée de l'acte 20 secondes. Les souris seront injectées quotidiennement avec du complément, par voie intra péritonéale (IP), durant 7 à 17 jours selon les groupes, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Injection des immunoglobulines G en IP, de 2 à 5 fois par souris selon les groupes, sur respectivement une période de 7 à 17 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Une mesure de la force musculaire par test d'agrippement (grip test) sera réalisée pour chacune des souris, durée moins de 10 secondes, jusqu'à 5 tests sur le temps de suivi des souris. Mesure de la force musculaire in situ-sur souris anesthésiée, 1 seule mesure par souris, en fin de procédure, durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal dans l'évaluation de molécules thérapeutiques a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercussion visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids.

Devenir

Le prélèvement des gastrocnémiens pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de moléculesinhibitrices du complément dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisée que chez l'animal.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autre protocoles expériementaux utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'auto-anticorps chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis de faire un calcul statistique excat des effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologique obervées lors de ces protocoles.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées : température, hygrométrie, cycle jour/nuit, change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de celllose et des fibres de coton. De plus, en raison de leur sensibilité aux infections, les animaux seront maintenues en portoir ventilé. Les prélèvements sanguins, la mesure de la force musculaire et la mise à mort des animaux seront réalisés sous anesthésie gazeuse grâce à un matériel dédié. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite dans l’ensemble des expériences. Cette échelle est définie de la façon suivante: Score 0 : condition physiologique (pas de signe clinique) ; Score 1 : faiblesse du train arrière, queue trainante ; Score 2 : diminution de l’activité locomotrice des pattes arrières, courbure du dos significative ; Score 3 : paralysie du train arrière. Elle permettra également d’évaluer la douleur des animaux et de mettre en place une procédure visant à la limiter. En effet, les animaux seront observés quotidiennement et l'apparition de signes cliniques, poils hirsutes, perte de poids visible (sans pesée) ou prostration, ou lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes seront atteints entraineront la mise en place de dispositions pour réduire la douleur. Un traitement préventif quotidien de la douleur sera mis en place lors de la première injection des anticorps pour les animaux de tous les lots. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. Un analgésique sera administré en sous cutané 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement par un des tests adaptés.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.

Perte de poids d'au moins 20 %, hypothermie, anorexie prolongée, automutilation : les rongeurs qui présentent ces signes plus de 24 heures sont sortis des expériences et tués. 4 850 souris et 2 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes et de sang. Ils reçoivent des psychostimulants jusqu'à trois fois par semaine pendant six semaines, développent hyperactivité et stéréotypies de léchage, de rognage et de reniflement, et passent jusqu'à dix-huit tests de locomotion d'une heure dix, plus sept passages en labyrinthe en T le même jour. L'objet réel est le criblage de molécules pour des formulations dissuasives, associant un stimulant prescrit et un composé censé en limiter l'abus, avant une éventuelle utilisation chez l'être humain.

Objectifs

Les psychostimulants prescrits sont aujourd’hui indiqués pour le traitement du trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH). Ces traitements vont réduire les symptômes liés à la maladie en augmentant l’attention et la vigilance et en réduisant l’hyperactivité. Ils sont généralement sans danger lorsqu’ils sont utilisés à des doses thérapeutiques via la voie d’administration autorisée. Cependant, ces stimulants présentent un potentiel addictif important et sont classés comme substance contrôlée par les organismes de réglementation. L’abus et le mésusage de psychostimulants est devenu un problème de santé majeur. Ces médicaments sont détournés de leur usage normal dans un but récréatif. En effet, le mésusage des médicaments prescrits sur ordonnance peut inclure : la prise d’une dose incorrecte, ou au mauvais moment, oublier de prendre une dose, arrêter le médicament trop tôt. L’abus est défini comme soit l’utilisation sans ordonnance, soit en plus grande quantité et/ou plus souvent, soit par une voie d’administration non autorisée telle que la voie intranasale ou intraveineuse.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans la prévention de l’utilisation abusive, de la dépendance et de l’addiction aux stimulants prescrits. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver et de développer potentiellement des formulations dissuasives par combinaison d’un stimulant et d’une molécule pour prévenir les abus, les mésusages et l’addiction associés à la prise de psychostimulants.

Procédures

Les animaux ne subiront pas de procédures chirurgicales. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés au cours et en fin de procédure (soit entre 1 et 3 prélèvements maximum par animal). Tous les animaux recevront une injection sous cutanée pour l’implantation de la puce d’identification RFID. Les animaux recevront les administrations des traitements soit par voie intrapéritonéale, orale ou intraveineuse. Pour la procédure 2, en cas d’administration par voie intrapéritonéale ou orale, les animaux recevront 3 injections par semaine pendant 6 semaines maximum. En cas d’administration par voie intraveineuse, la fréquence est adaptée et les animaux recevront 2 injections par semaine pendant 4 semaines maximum. Concernant les tests comportementaux, pour la procédure 1, les animaux seront soumis à 2 tests de locomotion sur 3 jours (pour une durée totale de 2 heures et 20 minutes). Pour la procédure 2, les animaux seront soumis à 18 tests maximum de locomotion sur une période de 6 semaines (3 tests/semaine) qui dure chacun 1 heure et 10 minutes. Pour la procédure 4, les animaux seront soumis à 7 tests au sein du labyrinthe en T qui auront lieu le même jour (soit 20 minutes de test maximum par animal le jour du test). Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour déterminer les scores des points limites.

Impact sur les animaux

Du fait de l’administration aigu ou chronique de psychostimulants, les animaux vont développer une hyperactivité et/ou des stéréotypies comportementales (mouvements anormaux et involontaires de type léchage, rognage, reniflement) lors des sessions expérimentales. Ces comportements sont transitoires et disparaissent au bout d’une ou deux heures pour l’hyperlocomotion ou au bout de plusieurs minutes pour la stéréotypie après l’administration du stimulant. Ces comportements seront surveillés lors de chaque expérimentation. L’administration aigue d'une molécule va induire des déficits cognitifs qui seront transitoires (24 heures). Une session d’acclimatation ou test d’essai seront réalisés afin de réduire le stress des animaux au nouvel environnement. Également, l’isolement et le changement de boisson intervenant dans certaines expérimentations peuvent induire du stress et de l’anxiété chez les animaux. Ces paramètres seront surveillés en observant le comportement de l’animal dans sa cage, en vérifiant la prise de nourriture et de boisson. De plus, le poids des animaux sera suivi entre 2 et 5 fois par semaine. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. Certains organes seront récupérés et des prélèvements sanguins seront réalisés.

Remplacement

Ce projet se focalise sur des modèles expérimentaux d’hyperactivité, de sensibilisation comportementale et de TDAH nécessitant l’utilisation d’animaux. En effet, ce sont des modèles qui étudient principalement le comportement de l’animal et il n’existe pas de modèle cellulaire ou autre pouvant reproduire nos procédures expérimentales. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Pour les expérimentations, il a été prévu un nombre suffisant d’animaux en accord avec la littérature existante ou nos expériences précédentes pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité de notre combinaison (stimulant/molécule). Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des molécules thérapeutiques qui auront montré une efficacité lors d’études précédentes afin de limiter l’utilisation des animaux.

Raffinement

Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (implantation des puces d’identification) durant toute la procédure expérimentale afin de maîtriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l’étude. Les animaux trouvés dans des conditions moribondes et les animaux montrant une douleur sévère et montrant des signes de détresse seront mis à mort. Les points limites sont définis selon les Directives de l’OCDE (document ENV/JM/MONO(2000)7) et incluent notamment : une perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids initial, une hypothermie, une absence prolongée de réponse volontaire à un stimulus externe comme le bruit, des problèmes ambulatoires empêchant l’animal d’accéder à la nourriture ou à l’eau/anorexie prolongée, difficulté à respirer, automutilation, blessure ou ulcération de la peau etc. Un tableau de suivi a été mis en place en adaptant les points limites au seuil le plus bas. Si les signes persistent au bout de 24h, l’animal sera sorti des procédures expérimentales et euthanasié. Afin de diminuer le stress des rongeurs, leur milieu sera enrichi avec du matériel de nidification afin que les animaux puissent se cacher et ronger. La sociabilisation avec l’expérimentateur sera plus importante pour les animaux isolés dans leur cage. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’habitation. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude. Un tunnel sera utilisé pour limiter la contention des souris par la queue. Afin d’optimiser l'expérience, les animaux seront randomisés selon le poids des animaux ou leur locomotion, l’administration de psychostimulant induisant une hyperlocomotion. L’objectif est de préserver le bien-être des animaux. La satisfaction de leurs besoins physiologiques et comportementaux permettra d’éviter tout biais sur les résultats des expérimentations.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés. Ces deux espèces sont appropriées pour les études comportementales. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études en addictologie en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Différentes souches pourront être utilisées en fonction des espèces. Afin de pouvoir étudier la période d’adolescence chez nos animaux, ils auront au moins 6 semaines au début de chaque procédure. En effet, l’adolescence se caractérise par un risque important de développer une addiction ou des troubles liées à l’utilisation de substances. Il est donc important d’étudier cette période chez les animaux et de la comparer aux animaux adultes. L’utilisation de l’espèce souris ou rat se fera en fonction de l’avancée scientifique du projet : continuité du modèle pour valider les résultats dans un contexte laboratoire indépendant ou au contraire changement d’espèce pour valider les résultats dans un modèle indépendant. Également, le choix de l’espèce dépendra de l’efficacité de la molécule dans une espèce donnée. En effet, si celle-ci s’avère efficace elle pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèce indépendante.

1 712 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune portant une tumeur greffée dont le volume est mesuré trois fois par semaine pendant soixante jours. Douze jours après la greffe, elles reçoivent une séance de radiothérapie d'environ quinze minutes, avec fatigue générale et irritation cutanée à la clé. Le porteur indique que la tumeur sous-cutanée peut provoquer une perte de poids, une plaie nécrosante, des douleurs et la mort, et que les souris non guéries seront tuées quand ces effets deviendront importants. Il écrit aussi que les anti-inflammatoires ne pourront pas être utilisés, la réponse immunitaire étudiée y étant trop sensible, et s'en remet à une grille de six items relevée trois fois par semaine.

Objectifs

Les traitements anti-cancéreux ont fait des progrès réguliers depuis des décennies. Pourtant, une grande partie des patients meurent encore de cette maladie. Depuis quelques années, une nouvelle sorte de traitement a montré une efficacité remarquable : l’immunothérapie. Ce traitement favorise une réponse anti-cancéreuse naturelle : la réponse immunitaire. Ces résultats ont conduit les chercheurs à ré-analyser d’anciens traitements, ce qui a permis de montrer que la radiothérapie, un traitement dont bénéficie plus de la moitié des patients, stimule aussi la réponse immunitaire. Malheureusement, on connait encore trop mal cet aspect de la radiothérapie pour pouvoir l’utiliser efficacement. Notre laboratoire a trouvé des conditions qui améliorent la réponse immunitaire induite par une radiothérapie. Nous avons identifié en partie les raisons de cette amélioration. Malheureusement, nous ne comprenons pas totalement les mécanismes mis en jeu. Ce projet vise à identifier et comprendre ces mécanismes, avec un double objectif. D’une part, la possibilité d’une application chez l’humain nécessite une excellente compréhension des effets d’un éventuel traitement. D’autre part, l’amélioration que nous obtenons n’est que partielle. La compréhension de ses mécanismes précis permettra d’améliorer encore l’efficacité de la radiothérapie en optimisant les conditions de traitement. Enfin, il est clair que notre objectif final est de développer un médicament utilisable chez l’humain. C’est pourquoi ce projet prévoit de mettre en place une stratégie thérapeutique faisant appel uniquement à des technologies utilisables chez les patients.

Bénéfices attendus

Les médecins fondent des espoirs importants sur l’utilisation d’une réponse anticancéreuse naturelle, la réponse immunitaire, pour soigner les patients. Ces espoirs sont le fruit de la découverte d’un type de médicaments nouveaux, montrant une grande efficacité : les immunothérapies. Les chercheurs essayent maintenant de trouver les conditions dans lesquelles cette réponse anticancéreuse naturelle peut être stimulée par des traitements classiques comme la chimiothérapie et la radiothérapie. Notre projet s’inscrit dans cette démarche, puisqu’il repose sur nos travaux qui ont identifié une méthode permettant d’améliorer la réponse immunitaire induite par la radiothérapie. Le premier bénéfice attendu est d’ordre fondamental : étudier comment on peut modifier la réponse immunitaire anticancéreuse par la radiothérapie permet de comprendre comme elle fonctionne. Or il s’agit d’un mécanisme extrêmement fin, mettant en jeu plusieurs types de cellules et de molécules. Le deuxième bénéfice attendu est orienté vers l’amélioration du traitement des patients. C’est en comprenant comment on a pu améliorer la radiothérapie qu’on pourra l’améliorer encore mieux. Enfin le troisième bénéfice est directement médical. Si nous parvenons à reproduire notre traitement en utilisant uniquement des technologies utilisables chez les patients, nous pourrons proposer aux cliniciens de traiter leurs patients avec ces technologies, dans des essais cliniques contôlés.

Procédures

Afin d’étudier la radiothérapie, nous utiliserons des modèles animaux dans lesquels ceux-ci seront d’abord greffés avec des cellules tumorales par injection (environ 2 minutes par animal) puis traités par radiothérapie 12 jours après. Nous utilisons un système d’irradiation préclinique spécialement conçu pour les petits animaux, dans lequel l’ensemble de la procédure prend environ 15 minutes. Nous pourrons alors suivre l’efficacité du traitement en mesurant le volume tumoral au cours du temps. Ces mesures seront réalisées 3 fois par semaine pendant une durée n’excédant pas 60 jours. Par ailleurs, dans certaines expériences, les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever les tumeurs 1 à 3 jours après radiothérapie, afin d’en étudier la composition, et notamment leur infiltration par des cellules du système immunitaire. D’autres tissus (sang, rate, ganglions lymphatiques drainants) pourront alors être prélevés en même temps.

Impact sur les animaux

La présence d’une tumeur peut induire chez l’animal qui la porte une série de conséquences indésirables. Dans le cas d’une tumeur sous-cutanée, les animaux peuvent subir une perte de poids, une plaie nécrosante, des douleurs, un stress, et finalement la mort. Pour une tumeur greffée dans un organe particulier, les conséquences peuvent comporter un dysfonctionnement de cet organe, induisant des pathologies dépendant de l’organe ciblé.. Enfin, la radiothérapie induit un certain nombre d’effets secondaires connus, comme une fatigue générale, ou une irritation de la peau au site d’irradiation. Les prélèvements et injections au sinus rétro-orbital provoquent un stress temporaire, et peuvent causer une irritation ou une infection oculaire.

Devenir

Dans les expériences de suivi de croissance tumorale, les animaux non-guéris devront être mis à mort lorsque la tumeur provoquera des effets délétères importants, définis à l’avance. L’ensemble des animaux sera mis à mort au bout de 60 jours. Dans certaines expériences, l’analyse de la réponse immunitaire nécessitera de déterminer les cellules immunitaires présentes dans la tumeur, et dans différents organes, ce qui ne pourra se faire qu’après avoir mis à mort les animaux.

Remplacement

Nous avons développé un système expérimental in vitro qui nous permet d’étudier le mécanisme moléculaire du contrôle de l’expression de l’interféron béta dans les cellules myéloïdes par la protéine TRIM33. Toutefois, la réponse immunitaire est un processus complexe, pluricellulaire et intégré, que l’on ne sait pas reproduire correctement in vitro. Son activation par la radiothérapie ne peut donc pas être étudiée in vitro.

Réduction

Afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux requis pour les expériences, nous avons utilisé un logiciel qui permet de calculer la taille minimale des groupes permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif pour les effets attendus dans les conditions expérimentales que nous utilisons. Les expériences seront analysées au fur et à mesure, et la mise en évidence d’un effet supérieur à l’effet attendu permettra de réduire la taille des lots.

Raffinement

Toutes les manipulations seront réalisées après anesthésie, afin de réduire le stress et/ou la souffrance liés à la manipulation. D’autre part, le fait de travailler sur des femelles nous permettra le cas échéant de regrouper les animaux afin de les maintenir dans des conditions de sociabilité satisfaisantes. Dans la mesure où nous travaillons sur la réponse immunitaire, qui est très sensible aux agents anti-inflammatoires, leur utilisation ne sera malheureusement pas possible. Nous avons défini une grille de score comportant 6 items qui seront analysés sur chaque animal trois fois par semaine, et un algorithme permettant de décider la poursuite ou non de l’expérience pour l’animal considéré.

Choix des espèces

Les questions que nous posons requièrent la possibilité d’étudier la réponse immunitaire dans un modèle préclinique de radiothérapie. Nous ne pouvons donc pas nous affranchir d’un modèle expérimental animal. Nous avons choisi la souris d’élevage, car elle donne la possibilité d’accéder à de nombreux outils expérimentaux qui permettront une plus grande efficacité dans les approches expérimentales, et donc une moindre utilisation des animaux. D’autre part, le développement d’un système immunitaire mature nécessitera d’attendre que les souris aient atteint l’âge adulte.