Recherche appliquée

Pour arrêter la formulation définitive d'un anticancéreux avant sa production à grande échelle, 125 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis trois injections intraveineuses hebdomadaires du composé testé, avec pesée et mesure de la tumeur trois fois par semaine pendant cent jours. Le porteur indique avoir déjà évalué cette molécule, seule et encapsulée, dans le même modèle tumoral, avec de "très bonnes réponses anti-tumorales". Il refait l'expérience pour ajuster l'enveloppe du produit aux contraintes industrielles, en affirmant devoir mesurer son effet sur un "organisme entier".

Objectifs

Le système immunitaire joue un rôle essentiel dans le développement des cancers. Récemment, de nouvelles immunothérapies permettant la modulation du système immunitaire ont permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Dans ce sens, une molécule contenue dans les bactéries a été mise en évidence pour son efficacité à stimuler le système immunitaire. La détoxification de ce composé et son encapsulation ont permis d’améliorer sa pharmacocinétique et réduire sa toxicité pour permettre son injection intraveineuse. Ce projet vise à déterminer la meilleure formulation pour encapsuler notre molécule dans un modèle de cancer colorectal implanté en sous-cutané chez la souris immunocompétente. Les cancers colorectaux font partie des types de cancers les plus répandus. C’est le 3e cancer le plus fréquent chez l’homme après ceux de la prostate et du poumon, et c’est le 2e cancer le plus fréquent chez la femme après celui du sein. Nous avons déjà évalué dans ce même modèle tumoral notre molécule seule ou encapsulée. Dans les deux cas nous avons obtenu une très bonne tolérance et des très bonnes réponses anti-tumorales. Afin d'évaluer notre molécule dans des essais cliniques et pour répondre aux contraintes de la production à grande échelle, nous devons optimiser notre formule pour l'encapsuler. Ce projet a pour objectif de déterminer la formulation définitive de notre produit

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir la composition finale de notre formulation avant son évaluation en clinique. Cette approche thérapeutique permettra au mieux de guérir les patients atteints de cancers colorectaux, sinon de ralentir la progression tumorale. Ces résultats sont nécessaires afin de procéder à l’évaluation ultérieure de ces molécules dans le cadre d’études cliniques précoces chez l’Homme, prévues en 2026.

Procédures

Pour chaque souris : - 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales sous vapeur d’isoflurane (3,5 %) - durée < 1minute. - à chaque administration du traitement (1 fois/semaine, 3 fois) : 1 contention + 1 injection intraveineuse (animal vigile) du composé testé - durée < 5 minutes - à chaque pesées et mesures des volumes tumoraux (3 fois/semaine) : 1 contention < 1min.

Impact sur les animaux

- douleur lors d’injection de cellules tumorales en sous-cutané (durée de quelques minutes, une fois), - gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral atteint le point limite. Il n’y a pas de métastase attendue avec les modèles tumoraux utilisés. - stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux cutanés (durée de quelques minutes) - douleur lors d’injection dans la veine caudale (durée de quelques minutes, trois fois)

Devenir

Les animaux seront mis à mort 100 jours post-greffe après si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai afin d’observer et quantifier la réponse anti-tumorale sur le long terme.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, l’efficacité de notre molécule et de notre formulation ont déjà été validées sur des modèles in vitro par toutes les techniques pertinentes pour l'étude de nos produits. Nous devons passer maintenant à l'in vivo pour évaluer son effet sur un organisme entier. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anti-cancéreux dépend fortement du microenvironnement. Par ailleurs plusieurs paramètres impactants sur l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour toutes ces raisons nous devons effectuer les études d’efficacité sur la souris.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'un outil statistique et la procédure sera réalisée sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contenant une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. L’état général des souris sera aussi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement en surveillant leur état général. Des points limites détectés via une grille de score (détaillée dans le paragraphe dédié) permettront, en fonction des observations, la mise en place des mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux.

Choix des espèces

Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs et permettent de constituer des groupes d’effectifs compatibles avec des résultats statistiquement significatifs. Les souris immunocompétentes sont particulièrement utilisées pour l’étude de l’efficacité antitumorale dans le cas de la stimulation du système immunitaire comme immunothérapie antitumorale. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Greffées de cellules leucémiques prélevées chez des enfants, par voie intraveineuse ou directement dans le fémur sous anesthésie générale, 3 842 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à douze prises de sang, trois ponctions de moelle osseuse, une irradiation sub-létale de sept minutes et un gavage quotidien pendant quatre semaines. Les souris développent une leucémie qui provoque perte de poids et affaiblissement général, et toutes sont tuées, pour analyse post-mortem ou parce qu'elles sont transgéniques. Le projet se donne pour objectif d'identifier des approches alternatives à l'utilisation d'animaux non-humains pour l'étude des leucémies pédiatriques, tout en prévoyant 3 842 souris sur sa durée.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques de l’enfant et de l’adolescent sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Le traitement standard comprend une polychimiothérapie, parfois associée à une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour les patients de haut risque ou en rechute. La greffe de cellules souches hématopoiétiques (CSH) est un traitement lourd, source de séquelles à long terme. Des progrès sont donc nécessaires pour réduire le taux de rechute, améliorer la survie et limiter les séquelles. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies l’enfant à mauvais pronostic. Pour tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, il est essentiel de pouvoir travailler sur les cellules tumorales les plus proches possibles de celles présentes chez les patients afin de prendre en compte la complexité génétique des tumeurs. La xénogreffe dérivée du patient développée après transplantation de la tumeur primaire humaine directement dans divers modèles murins immunodéprimés a été utilisée largement pour modéliser différents types de cancer. En effet, ces tumeurs conservent les caractéristiques histologiques des tumeurs parentales, reflètent mieux l'hétérogénéité de l'échantillon du patient et constituent une plate-forme pour évaluer les médicaments anticancéreux (molécules pharmacologiques et immunothérapies, dans des conditions physiologiques. Le projet a également pour objectif d'identifier des approches alternatives à l’utilisation de modèles animaux pour l’étude des leucémies pédiatriques. Pour cela, nous utiliserons des modèles de cellules pluripotentes induites humaines cultivées in vitro pour caractériser les propriétés tumorales des cellules exprimant les oncogènes des leucémies issues des cellules souches en comparant les cellules obtenues in vitro et in vivo à celles provenant des patients. A terme, l'utilisation de cellues souches pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux pour réaliser certaines approches exclusivement in vitro. Nous utilisons des outils statistiques permettant de définir le nombre minimal d'animaux à utiliser pour obtenir des conclusions significatives pour chaque approche.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'améliorer les modèles utilisés afin d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette : -D'amplifier des cellules leucémiques de patients afin de réaliser leur analyse moléculaire et définir l'efficacité de réponse à plusieurs molécules pharmacologiques qui seront identifiées par les analyses moléculaires. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -De définir si des cellules souches pluripotentes induites pourraient, à l'avenir, être utilisées à la place des cellules humaines primaires et dans les approches in vitro pour réduire l'utilisation de souris. -De caractériser l'efficacité anti-tumorale d'approches précliniques, incluant certaines immunothérapies . -D'améliorer les modèles développés dans le but de réduire le nombre de souris utilisées et de définir les prérequis pour le replacement de certains modèles murins in vivo par des approches in vitro.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection intra-veineuse sous anesthésie locale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-veineuse de molécules sous anesthésie locale: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-fémorale sous anesthésie générale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal) et chaque injection prend 3 à 5 minutes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être journalier sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang sous anesthésie locale: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle sous anesthésie générale : jusqu'à 3 prélèvements par souris avec une fréquence d'au moins 15 jours. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes. Irradiations sub-léthale, une seule fois, durée 7 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général. Les interventions répétées de type injection ou prélèvements de sang peuvent éventuellement occasionner rarement des hématomes ou des lésions locales. Les injections intrafémorales ou les prélèvements de moelle dans le fémur peuvent rarement occasionner des douleurs persitantes et des boîteries. Les irradiations sub-léthales n'ont aucun effet indésirables au-delà des manipulations légères pour les pratiquer.

Devenir

Tous les animaux du projet sont transgéniques et seront donc euthanasiés. De plus, beaucoup développeront des maladies de type leucémie et seront euthanasiés pour analyses post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération/maturation terminale des lignées hématopoïétiques à partir de cellules souches n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches pluripotentes induites), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.

Réduction

De nouvelles lignées de souris immunodéficientes sont développées régulièrement par d'autres laboratoires et certaines sont rapportées comme ayant un taux de greffe des cellules hématopoïétiques humaines supérieur et donc permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces approches. Nous comparerons l'efficacité de ces modèles à celui du modèle de référence pour la prise de greffe de nos échantillons leucémiques afin de sélectionner le modèle qui permettra de réduire le nombre de souris utilisées pour les greffes primaires. Des méthodes statistiques seront utilisées pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaire et suffisant et pour analyser les résultats. Au cours des années passées, nous avons identifié un modèle plus réceptif aux greffes de cellules hématopoïétiques primaires ou issues de cellules souches pluripotentes induites. Nous utilisons donc maintenant régulièrement cette souche qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Nous poursuivrons la comparaison avec de nouvelles souches de souris immunodéficientes qui deviendraient disponibles au cours du projet. Dans le cas où elles montreraient une efficacité, nous serons donc amenés à utiliser de nouvelles lignées et à diminuer le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Afin de réduire l’invasivité des prélèvements, nous introduisons des rapporteurs luminescents dans les cellules humaines utilisées pour les approches précliniques afin de pouvoir suivre la prise de greffe et l’efficacité des traitements par des approches d’imagerie corps entier sans prélèvements (ex: sang ou moelle) permettant une meilleure quantification de l'efficacité globale du traitement.

Choix des espèces

Les souris représentent une espèce relativement facile à élever qui permet l’obtention de résultats rapides du fait de leur temps de génération réduit. Elles possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l’homme. Pour cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, car ces souris permettent une prise de greffe efficace de cellules humaines, avec un risque de rmaladie du greffon contre l'hôte réduit et peuvent être utilisées pour les approches précliniques. Par le passé, nous avons contribué à des approches précliniques pour un composé qui ont conduit à des phases cliniques. Ces modèles sont également utiles pour le test d'immunothérapies. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, des article récents montrent l’importance d'utiliser des souris receveuses nouveau-nés. Ainsi, nous pourrons transplanter les cellules soit dans des receveurs nouveau-nés ou adultes pour comprendre l'importance de l'âge de l'organisme lors du dévéloppement des leucémies retrouvées chez l'enfant.

Déjà utilisés dans d'autres expériences et présents sur le site depuis au moins un an, trois macaques à longue queue vont subir une injection directe dans le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'IRM et l'injection intracérébrale se déroulent en une seule séance d'environ six heures sous anesthésie générale, après intubation, et le réveil peut s'accompagner de désorientation, de perte d'équilibre, de perte de réflexes et d'hypothermie. Convulsions, tremblements, chutes, ulcères cornéens et œdème aux points d'entrée du cadre stéréotaxique figurent parmi les suites possibles. Le porteur affirme qu'il n'existe aucune alternative non animale pour vérifier qu'une injection intracérébrale est bien tolérée, et destine ce modèle validé à des études réglementaires de toxicologie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de valider le modèle d’administration intracérébrale chez le primate non-humain. Ce modèle sera validé grâce à l’injection d’un produit de référence associé à un agent de contraste et via une évaluation histopathologique complète afin d’évaluer l’impact et qualité de la procédure d’administration intracérébrale nécessaire pour la conduite d’étude de toxicologie générale. Une fois validé, ce modèle sera utilisé sera utilisé dans des études précliniques d'évaluation de la sécurité de candidats médicaments destinés à être administrées par voie intracérébrale chez l'homme.

Bénéfices attendus

La validation du modèle d’administration intracérébrale chez le primate non-humain permettra la réalisation d’études de toxicologie règlementaire qui sont nécessaires pour démontrer la sécurité des produits pharmaceutiques en développement, avant leur mise sur le marché ou les premiers essais cliniques (notamment pour le développement de thérapie innovante telle que la thérapie génique administrée par voie intracérébrale chez l’homme). De plus la validation pourra contribuer à la mise sur le marché de nouvelles thérapies sûres pour les patients atteints de pathologie du système nerveux central (exemples: maladies de Parkinson et Alzheimer).

Procédures

L’imagerie IRM et l’injection intracérébrale (1 occasion, d’une durée d’envion 6 heures) seront réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale). Une évaluation neurocomportementale sera réalisée en post-administration/prélèvement (durée d’environ quelques minutes) afin de déceler toute potentielle atteinte neurologique en lien avec la procédure. Des prélèvements sanguins seront réalisés à raison de 3 temps (prétest, durant la phase d’observation et à la mise à mort). Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux vigile et seront de courte durée (quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les procédures d’administration intracérébrale sont pratiquées sur animaux anesthésiés qui seront mis à jeun la veille de la procédure. Des événements anesthésiques peuvent survenir (ex : hypothermie, hypotension…). Lors du réveil anesthésique, une désorientation/perte d’équilibre, perte de certains réflexes neurologiques (palpébral…) ains qu’une hypothermie et baisse d’activité (en raison de la durée de la chirurgie, envion 6 heures) peuvent être observées temporairement. Des signes locaux (oedème) au niveau des points d'entrée des cadres ou des ulcères cornéens pourraient être observés et être associés à de la douleur. Des symptômes neurologiques (risque de pertes d'équilibres ou chutes, tremblement, convulsions,…) peuvent être observé à la suite de la procédure d’administration intracérébrale. Pour les prélèvements sanguins (PS) qui seront réalisés sur animaux vigiles, ceux-ci pourraient être associés à des sensations désagréables de ponction mais seulement pendant une courte durée et des hématomes post-prélèvement. Les signes cliniques suivant pourraient être observés en cas de réaction exagérée au produit pharmaceutique de référence : • Troubles de la coordination des mouvements • Diminution de l’appétit • Somnolence • Vomissement • Diarrhée. Ces signes cliniques devraient être seulement transitoires et seront surveillés par un vétérinaire.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et une évaluation histopathologique et une analyse de biodistribution seront réalisées au niveau du tissu cérébral à la fin de la procédure afin d’évaluer l’impact de la procédure d’administration intracérébrale. Ceci afin de valider le modèle, dans le contexte des études réglementaires de toxicologie.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas d’alternative non animale permettant d’évaluer la sécurité et la toxicité, notamment systémique et neurocomportementale des futurs candidats médicaments dans le cadre du développement de thérapies innovantes, telle que la thérapie génique. Il n’existe pas non plus d’alternative non animale pour valider que la technique d’administration intracérébrale aboutit à une exposition de l’animal au produit pharmaceutique de référence et que celle-ci est bien tolérée (analyse histopathologique).

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique (biodistribution du produit réference). De plus, dans les études réglementaires de toxicologie 3 animaux par groupe sont généralement utilisés. Au total, 3 animaux seront utilisés dans ce projet. Des animaux non-naïfs seront utilisés dans le cadre de ce projet afin de réduire l’utilisation d’animaux.

Raffinement

Le produit de référence associé à l’agent de contraste sera injecté à une seule occasion (volume maitrisé de 100 µL par hémisphère, débit maximal 3 µL/min) et à une dose bien tolérée sans effet toxique attendu. Les animaux non-naïfs sont présents sur le site depuis au moins 1 an, et sont acclimatés aux conditions de vie dans le laboratoire. Les animaux auront au moins 5 jours d’acclimatation dans la salle d’étude avant le J1. Un entrainement pour les pesées corporelles et des interactions positives seront mis en place. Pour limiter le stress des animaux, les animaux seront manipulés régulièrement par les personnes en charge des procédures expérimentales (contention, suivi du poids). Des récompenses alimentaires seront distribuées après les actes contraignants. Une protection mécanique préventive des yeux et des soins locaux seront mise en place pré- et post-opératoire afin de réduire le risque d’ulcéres cornéens. L’injection intracérébrale sera réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique. Une analgésie/anti-inflammatoire et antibiothérapie préventive sera mise en place avant (entre 30min et 1h avant l’anesthesie) et après administration (jusqu’à 6h et 7 jours après administration pour l’antibiothérapie et l’analgésie/anti-inflammatoire, respectivement) du produit de contraste et élément d’essai afin d’anticiper toute douleur ou détresse. Des mesures de prévention de l’hypothermie seront appliquées pendant l’anesthésie et au réveil. Une évaluation neurocomportementale sera réalisée duant le pretest et à deux occasions après adminisration (+4h et +24h post-procédure). La mise à mort sera considérée pour les points limites suivants : convulsions ne rétrocédant pas spontanément ou à l'administration d'anti-convulsivants ou convulsions répétées dans la même journée, incapacité prolongée de l'animal à se déplacer ou pertes d'équilibres durables impactant la qualité de vie de l'animal, perte d'appétit ne rétrocédant pas aux mesures de soutien, perte de poids supérieur à 15% et infection des plaies chirurgicales ne rétrocédant pas aux soins. Des soins locaux quotidiens seront appliqués à la suite de l’administration, jusqu’à 7 jours post-administration. Les animaux sont gardés isolés 2h pour limiter le risque de chutes. En cas d’hypothermie, une prise en charge par lampe chauffante (et/ou coussin chauffant) sera mise en place. Les primates seront socialisés.

Choix des espèces

Les études réglementaires de toxicologie doivent se faire chez une espèce pertinente pour l’évaluation de la sécurité des futurs candidats médicaments. La pertinence du primate non humain (PNH) pour la conduite des études de sécurité préclinique est basée sur une homologie phylogénétique, anatomique et transcriptomique importante avec l’Homme. De nombreuses nouvelles stratégies thérapeutiques du système nerveux central (SNC) sont basées sur des produits biologiques ou de thérapie génique qui nécessitent une homologie phylogénétique ou transcriptomique importante avec l’Homme afin d’évaluer les propriétés pharmacodynamiques du produit mais également les potentiels effets toxiques. Par conséquent, l’utilisation d’autres modèles non-rongeur (tel que porc et chien) est inapproprié dans ces études. L’utilisation du primate non humain pour la validation du modèle d’administration intracérébrale est donc justifiée puisque les études précliniques non rongeurs sur ces nouvelles thérapies seront réalisées chez le macaque. La validation du modèle d’administration intracérébrale ne nécessite pas de pré-requis d’âge et se fera sur jeunes adultes/adultes comme pour les études de toxicologie réglementaire. Des animaux d’environ 3 ans seront utilisés pour ce projet.

Les brebis gestantes et les agneaux qui présentent des signes de souffrance ou d'infection après une manipulation peuvent être mis à mort par injection. 212 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Au 125e jour d'une gestation de 145 jours, chaque brebis est opérée environ quatre heures sous anesthésie générale et son fœtus reçoit des cathéters vasculaires, puis une anesthésie loco-régionale permet des prises de sang sur le fœtus, huit par journée de manipulation, la même brebis étant utilisée pour plusieurs expériences dès le quatrième jour. L'équipe mesure l'effet d'une anesthésie de césarienne, d'une péridurale ou d'une sédation du fœtus sur son cœur, sa tension et son sang. Le porteur déclare 20 adoptions, tout en écrivant qu'à la fin des procédures expérimentales, les animaux non-humains utilisés sont mis à mort.

Objectifs

La majorité des patientes en salle de naissance bénéficie d’une analgésie devant les douleurs entraînées par les contractions utérines lors du travail. Leur mise en place peut provoquer une instabilité de la fréquence cardiaque et de la tension artérielle maternelle transitoire lors de l’injection des médicaments, et entraîner des anomalies du rythme cardiaque fœtal. L’impact d'une césarienne ou d'une anesthésie générale ou d'une péridurale maternelle sur l’hémodynamique fœtale et le retentissement sur le système nerveux autonome reste peu connu, et sa compréhension est nécessaire afin de diminuer la morbi-mortalité fœtale.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à observer une modification des paramètres fœtaux sanguins et cardiaques plus importante en cas d’analgésie type césarienne par rapport aux autres analgésies. L’impact serait en pratique clinique d’adapter l’analgésie maternelle pour diminuer le risque d’hypoxie foetale et ses complications (lésions cérébrales anoxo-ischémiques). Cette étude permettra également de déterminer l’effet sur le coeur et la tension artérielle des sédations foetales lors d’une réanimation à cordon intact afin d’optimiser la prise en charge des nouveaux-nés vulnérables.

Procédures

Chaque brebis sera soumise à une chirurgie sous anesthésie générale d'une durée d'environ 4 heures, une seconde anesthésie cette fois loco régionale sera réalisée sans objectif d' incision mais uniquement pour les prélèvements sanguins chez le foetus, ces prélèvements serviront pour la vérification des gaz du sang (valeur de pH, quantité d’oxygène et de dioxyde de carbone dans le sang etc), et l’évaluation du retentissement de l’anesthésie effectué. Les quantités prélevées seront de 0,3 ml à raison de 8 prélèvements par journée de manipulation. Chez la brebis ces prélèvements serviront à évaluer le retentissement son état sanguin en comparaison à l'état sanguin de son foetus.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu serait la douleur modérée pendant et suite à la chirurgie de la brebis gestante, dont la prise en charge de la douleur est optimisée pendant les manipulations et par un protocole anti douleur après les manipulations durant 3 jours par Buprénorphine.

Devenir

Après une évaluation de l’état général des brebis à l’issue de la chirurgie par l’expérimentateur (sensibilisé au bien-être animal) et les zootechniciens, les animaux ne seront pas euthanasiés en vue de l’expérimentation chronique. Ils seront hébergés dans une animalerie conventionnelle et agréée. après manipulation et si nécessaire, une euthanasie peut être effectué par une injection médicamenteuse des brebis et des agneaux (en cas de signe de souffrance ou d’infection) A la fin de ces procédures expérimentales, les animaux sont euthanasiés.

Remplacement

L’étude du fœtus humain n’est possible qu’en cas d’expérimentation non invasive et après validation des hypothèses au préalable chez l’animal. En effet d’un point de vue éthique, il n’est pas justifié de réaliser une expérimentation qui comporte un risque de perte fœtale (la réalisation de prélèvements sanguins ou la mesure de façon invasive de la pression artérielle moyenne sur le fœtus par abord cordonal est techniquement possible mais avec un risque de perte fœtale de 3 à 10%). Aucun modèle non animal ne pourrait permettre de réaliser ce projet.

Réduction

Plusieurs procédures expérimentales sont incluses dans ce projet. Les fœtus d’agneau seront leur propre témoin ce qui limitera le nombre d’animaux nécessaires pour le protocole. L’étude consistera à comparer l’état de base des paramètres de fréquence cardiaque et pression artérielle des foetus, de leur signal cérébral et des paramètres sanguins à la réponse obtenue lors d’une analgésie et sédation maternelle et fœtale. La réponse des fœtus d’agneau étant habituellement très reproductible d’un animal à l’autre, un effectif faible (environ 8 à 12 animaux par groupe expérimental) est suffisant.

Raffinement

Chaque brebis arrive 10 jours au moins avant la date de la chirurgie afin de s'acclimater à son nouvel environnement. Les brebis sont livrées au minimum par 2 afin de réduire le stress du transport. Les brebis sont hébergées à plusieurs en permanence dans les box et aucune brebis ne sera seule hébergée afin de réduire le stress lié à la solitude. La manipulation sera effectuée sous anesthésie générale avec un protocole spécifique d'anesthésie, d'anti douleur et d'antibiotique préventif. Les expérimentations seront débutées 4 jours après la chirurgie et une même brebis sera utilisée pour plusieurs expérimentations afin d’optimiser au maximum l’utilisation de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle animal doit avoir des caractéristiques morphologiques et physiologiques proches du modèle humain. C’est le cas de la brebis, qui est un mammifère avec une gestation de singleton ou de jumeaux, dépendante du placenta et de la circulation foeto-placentaire. Le poids et la circulation du fœtus d’agneau sont proches de ceux du fœtus humain. Sa taille est suffisante pour permettre la pose de cathéters vasculaire, en limitant le risque de perte fœtale liée à la chirurgie. Des études sur plusieurs jours sont possibles chez le fœtus d’agneau instrumenté ce qui permet de limiter le nombre d’animaux par projet. Ce modèle est reconnu par la communauté scientifique comme le modèle animal le plus proche pour étudier la physiologie fœtale, ce qui justifie la pertinence de notre choix. Notre protocole de recherche est sur le foetus. Il est donc nécessaire d’utiliser des brebis gestantes. Notre expéri-mentation aura lieu lors du dernier tiers de la gestation (intervention à 125 jours pour un terme de 145 jours). Cet âge gestationnel est nécessaire pour que le fœtus soit suffisamment gros pour la chirurgie, pour la pose de cathé-ters vasculaires (2500 à 3000 g) et pour limiter les risques de perte fœtale per opératoire.

Pour tester des vecteurs de thérapie génique contre une maladie mitochondriale qui tue la plupart des enfants atteints avant deux ans, 3 892 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des tissus. Les nouveau-nés sont anesthésiés par contact avec de la glace humide pendant trente à soixante secondes, puis injectés dans la veine temporale. Chaque souris peut subir jusqu'à treize échocardiographies sous anesthésie, treize open field et treize grip tests, et un quart d'entre elles, celles chez qui le gène est éteint, développe une cardiomyopathie fatale accompagnée de perte de poids, de difficultés de mouvement et d'une posture anormale. Les trois quarts restants naissent sans la mutation et sont tués comme les autres, l'effectif de 3 892 n'étant justifié que par référence à des travaux antérieurs.

Objectifs

Les mutations du gène d’intérêt provoquent une maladie rare affectant le cerveau, le coeur et le foie. Ce type de maladie se manifeste dans les premiers mois de la vie et la majorité des enfants meurent vers l'âge de deux ans. À ce jour, il n'existe aucun traitement pour cette maladie. Le gène d’intérêt code pour une protéine essentielle pour la production d'énergie dans nos cellules. L’objectif général de ce projet est de développer un traitement pour la maladie causée par des mutations du gène d’intérêt par thérapie génique chez les souris. En particulier, nous allons développer des vecteurs thérapeutiques pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. L’expression de la version normale du gène d'intérêt peut réparer les dommages causés par la mutation du gène d'intérêt. En injectant ces vecteurs thérapeutiques dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés.

Bénéfices attendus

À ce jour, les maladies causées par des mutations du gènes d’intérêt ne disposent toujours pas de traitement curatif permettant de les guérir ou de contrôler leur évolution. Le projet permettra de développer et d'évaluer l'efficacité thérapeutique de notre approche chez la souris. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques.

Procédures

-Injection par voie intraveineuse dans la veine caudale (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris ) - échocardiographie (20 min par souris; 13 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 13 fois maximum par souris) -open field test (10 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -grip test (5 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -Injection par voie intraveineuse dans la veine temporale (30 secondes par souris; 1 fois maximum par souris) - anesthésie par hypothermie (en contact avec de la glace humide) (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris) -biopsie par genotypage (1 min par souris; 1 fois par souris)

Impact sur les animaux

Les souris où l’expression du gène d’intérêt est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée) développeront une cardiomyopathie fatale. En plus de la maladie cardiaque, ces souris peuvent présenter une perte de poids, des difficultés de mouvement et adopter une posture anormale. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant la contention dans un tube en plastique spécial et l’injection, le stress pendant les tests comportementaux, l’échocardiographie et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire et indispensable dans notre étude car nous devons tester l'efficacité des vecteurs thérapeutiques dans la prévention de la maladie. De plus, en testant l'efficacité thérapeutique chez les souris, qui développent normalement la maladie, nous avons la possibilité de voir si la maladie est prévenue ou si elle est retardée. En outre, l'utilisation de modèles de souris est nécessaire parce que les vecteurs thérapeutiques peuvent exprimer la version normale du gène d’intérêt de différentes manières dans les tissus et les cellules en culture..

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies neurologique et sur des méthodes et analyses statistiques. Pour réduire le nombre total de souris, nous testerons d'abord l'efficacité de 4 vecteurs thérapeutiques sur une partie des souris. Seul le meilleur vecteur sera utilisé après dans les études suivantes. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.

Raffinement

Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante et l'aiguille pour l'injection sera la plus fine possible. Concernant l'injection chez les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress : l'éloignement temporaire de la mère et la préservation de la litière de la cage maternelle. En outre les injections des nouveau-nés seront effectuées sous anesthésie par hypothermie induite par la stimulation du petit sur de la glace humide pendant 30-60 secondes. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiés tout en réduisant les vibrations et le bruit. En plus l'échographie et les tests comportementaux ne sont effectués que 7 jours après l'arrivée des souris pour permettre leur acclimatation.

Choix des espèces

Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement plus proches des humains. De plus, afin de tester l'efficacité du traitement pour le développement de la thérapie génique, l'utilisation de mammifères est indispensable et les souris représentent un bon modèle. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Pour l'injection, nous utiliserons des nouveau-nés et souris juvéniles. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris juvéniles et adultes

Porteurs par construction d'une dégénérescence de la rétine et d'une déficience majeure du système immunitaire, 1 680 rats vont être élevés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur immunodéficience s'accompagne d'une alopécie qui fait s'accumuler des poils sous la paupière, source d'irritation oculaire, et d'une malocclusion dentaire qui peut conduire à la malnutrition. Chaque rat subit une biopsie de queue ou d'oreille dans les dix jours suivant la naissance, et certains une coupe des dents. Une partie sera transférée à trois mois vers un autre établissement pour y recevoir des greffes de cellules humaines, une autre sera gardée pour la reproduction, les rats au mauvais génotype, ceux dont la fertilité baisse, ceux qui atteignent un an et ceux dont la malocclusion devient trop importante étant tués.

Objectifs

La transplantation de cellules comme traitement des maladies dégénératives de la rétine est une des plus prometteuses parmi les thérapies visant à restaurer la vue et l’utilisation de cellules souches humaines, est une des approches les plus prometteuses; L’évaluation de son bénéfice thérapeutique et l’absence d’effet néfaste nécessite sa mise en œuvre et l’évaluation de ses conséquences positives comme négative à l’aide d’un modèle animal présentant des caractéristiques proches de la maladie humaine. Cependant, la transplantation de cellules humaines chez l’animal, donc dans une autre espèce, est par nature source de rejet sévère de la greffe (barrière d’espèce) par le système immunitaire compromettant notre capacité à évaluer son efficacité. Notre projet consiste à réaliser un élevage d’animaux modèles porteur d’une mutation génétique responsable d’une dégénérescence rétinienne et d’une autre mutation, responsable d’une déficience majeure du système immunitaire. cette déficience du système immunitaire empeche le rejet de greffet et permettra par la suite de mettre en place de nouveaux traitements basés sur la greffe de cellules.

Bénéfices attendus

Les travaux de thérapie cellulaire humaine de ces dernières années utilisant des dérivés de cellules souches humaines ont permis d’établir sa faisabilité en termes de survie et d’intégration dans le tissus hôte à court terme. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un suivi dans le temps trop court en raison d’une faible survie des cellules greffées en raison de la barrière d’espèce. L’immunodéficience (système immunitaire défaillant) des animaux qui seront élevés dans ce projet, permettront de réaliser des greffes en limitant significativement le rejet des cellules transplantées. Une survie à plus long terme laisse présager la mise en évidence d’un véritable bénéfice fonctionnel de la transplantation. L’élevage de ces animaux permettra également de s’affranchir des traitements pharmacologiques immunosuppresseurs (traitement visant à réduire voir bloquer la réponse immunitaire) à l’efficacité variable sur le moyen et long terme.

Procédures

Un prélèvement d'un petit bout de queue ou d’oreille (biopsie) pour analyse génétique est réalisé une seule fois dans les 10j jours suivant la naissance. Les animaux qui seront utilisés dans ce projet sont immunodéficients et peuvent présenter un phénotype dommageable due à une malocclusion dentaire (défaut de pousse des dents) pouvant dans certains cas nécessiter une intervention invasive rapide de quelques secondes (coupes des dents) voir une euthanasie en cas de malocclusion trop sévère.

Impact sur les animaux

Les animaux qui seront utilisés dans ce projet peuvent présenter un phénotype dommageable caractérisé par une malocclusion dentaire (défaut de pousse des dents) pouvant poser des problèmes de malnutrition. Dans certains cas cette malocclusion nécessite une intervention invasive (coupes des dents) qui peut provoquer un certain stress. Par ailleurs, les animaux subiront un prélèvement au niveau de la queue (biopsie) pour identifier certaines caractéristiques génétiques. Le prélèvement est rapide et n’est réalisé qu’une seule fois mais peut être une source de douleur ou d’inconfort au moment du geste. Les animaux présentent une défaillance du système immunitaire (immunodéficient) impliquant un risque accru de maladie. Par ailleurs, l’alopécie caractéristique des animaux présentant une déficience du système immunitaire peut conduire à l’accumulation de poils dans le cul de sac conjonctival (sous la paupière) responsable d’irritation et donc d’une certaine gêne.

Devenir

Une partie des animaux seront transférés (à l’âge de 3 mois) dans un autre établissement utilisateur dans le cadre d’une utilisation continue et rattaché à d’autres projets faisant l’objet d’autorisations distinctes. D’autres permettront de maintenir la colonie (élevage ; reproduction). Les animaux ne présentant par les caractéristiques génétiques nécessaire pour le projet, ceux présentant une baisse de fertilité, ou ayant atteint l’âge d’1 an ou enfin ceux présentant un point limite seront euthanasiés.

Remplacement

Le projet consiste à élever des animaux qui permettront la réalisation d’autres projets (utilisation continue) bénéficiant d’une autorisation et dont l’objectif est de développer une thérapie cellulaire pour des maladies dégénératives de la rétine conduisant à la cécité. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Le projet nécessitera 1680 animaux. Il s’agit du nombre strictement nécessaire pour permettre le maintien de la colonie et produire le nombre d’animaux requis pour les autres projets expérimentaux disposant d’une autorisation de projet (dans le cadre d'une utilisation continue). Le nombre d’animaux a été calculé afin d’obtenir des résultats robustes d’un point de vue statistique. Le nombre total tient compte du fait que certains animaux ne pourront pas être inclus dans l’étude en raison de malocclusions (défaut de pousse des dents) ou d’un profil génétique incompatible avec les projets expérimentaux associés.

Raffinement

L’alopécie précoce des animaux de phénotype « Nude » peut se traduire par une petite accumulation de poils sous la paupière, source d’irritation oculaire et potentielle source d’infection locale si elle n’est pas traitée. Les procédures prévoient une surveillance accrue de ces animaux et un nettoyage des yeux au sérum physiologique en cas de besoin. Les animaux sont par ailleurs hébergés par 2 dans des cages de stabulation standard avec enrichissement. Une alimentation et un enrichissement spécifique présentant un risque de malocclusion sera mis en place afin de limiter son développement. Pour protéger les animaux au maximum en raison de leur faible immunité, tout le matériel est stérilisé par autoclavage (cage, litière, enrichissement) ou irradié (croquettes). La manipulation des animaux s’effectue uniquement sous hotte et les animaux sont hébergés en portoir ventilé à pression positive. L’atteint d’un point limite, principalement une malocclusion trop importante conduira à l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

le projet prévoit l’élevage d’animaux génétiquement immunodéficients et présentant une dégénérescence rétinienne Ces rats sont porteurs d’une mutation ayant des conséquence identique à celles retrouvés chez de nombreux patients souffrant de dégénérescence rétinienne. Ces animaux présentent également une autre mutation qui compromet le système immunitaire des rats (immunodéficience) qui a pour conséquence le non rejet des cellules greffées. Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (barrière d'espèce). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme. Enfin, la dégénérescence rétinienne chez ces animaux est rapide permettant de réaliser la transplantation chez des animaux relativement jeunes (3 mois), àge auquel les animaux présentant les caractéristiques génétiques attendues seront transféré sur un autre projet. le transfert d’animaux jeunes (trois mois) permettra de limiter les atteintes liées aux vieillissement tout en permettant un suivie à moyen/long terme des cellules transplantées (prévu jusqu’à 6 mois post-transplantation). Les animaux en élevage et présentant les bonnes caractéristiques génétiques seront mis en accouplement à partir de l’âge de 10 semaines, âge auquel les animaux présentent une fertilité permettant leur reproduction.