Recherche appliquée

672 souris et 336 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules de glioblastome leur sont implantées dans le cerveau, puis une partie subit une seconde chirurgie pour réduire la tumeur, l'ensemble reproduisant la prise en charge des patients humains. Le porteur reconnaît que les traitements testés étant nouveaux, il ne connaît pas tous leurs effets, et attend des tumeurs cérébrales accompagnées ou non de pertes de poids. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité d'un glioblastome et qualifie ses effectifs de "strict minimum" "scientifiquement irréprochable".

Objectifs

Les traitements pour les patients souffrant de glioblastome (GB) incluent la chirurgie (pour un peu plus de 60% des cas) et la combinaison de radio- et chimiothérapie (principalement appliquée par l’utilisation d’un agent chimiotérapeutique). Lors d'une étude précédente nous avons mis en place un modèle murin qui récapitule la prise en charge du patient ce qui rend la validation de nouvelles approches thérapeutiques très pertinentes. Ainsi ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles murins pertinents de glioblastomes.

Bénéfices attendus

Les glioblastomes sont responsables de nombreux décès, à ce jour une résection de tumeurs avec un traitement adapté permet une survie des patients de 6.9 à 14.6 mois. L’objectif est donc de prolonger ces délais mais aussi et surtout améliorer le confort des patients. A ce jour les traitements pour les patients souffrants (GB) incluent la chirurgie (pour un peu plus de 60% des cas) et la combinaison de radio- et chimiothérapie (principalement appliquée par l’utilisation de l’agent alkylant temozolomide (TMZ). La validation d’un inhibiteur passant la barrière hématoencéphalique et potentialisant la combinaison radio- et chimiothérapie et ceux en diminuant les doses de TMZ ont pour objectif d’améliorer la survie mais aussi le confort de vie des patients..

Procédures

Dans la procédure 1 implantation tumorale nous réalisons une analgésie en sous-cutanée (2 secondes) 30 minutes avant l’anesthésie qui elle est en intrapéritonéale (2 secondes) puis nous procédons à l’implantation intracérébrale de cellules tumorales (10 minutes). La suture de la peau est réalisée à la fin de l’implantation avec du fil de suture (2 minutes). Dans la résection tumorale nous procédons à une analgésie en sous-cutanée (2 secondes) 30 minutes avant l’anesthésie qui elle est en intrapéritonéale (2 secondes) et à l’injection dans la veine caudale (2 secondes), puis nous réalisons la chirurgie afin de réduire la tumeur (15 minutes). La suture de la peau est réalisée à la fin de l’implantation avec du fil de suture (2 minutes).

Impact sur les animaux

Stress lié à l’anesthésie par agent chimique en inhalation et/ou injection lors des administrations / imageries. Stress lié à la contention pour l'implantation de cellules tumorales et lors des suivis clinique. Le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associé ou non à de la perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères.

Devenir

En fin de procédure les organes seront prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques

Remplacement

Il est impossible d’évaluer l’effet thérapeutique d'anticorps sur un modèle in vitro ou in silico. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire la complexité d'un glioblastome, et seul le modèle animal permet de conduire ce projet. La souris et le rat sont des animaux très adaptés à ce travail avec une littérature validant ce choix.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochable. Pour ces études les tests statistiques non paramétriques seront utilisés en cohérence avec le nombre de groupes analysés et d'animaux. Au total 672 souris et 336 rats au maximum seront nécessaires pour cette étude.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des souris et des rats, un suivi adapté des animaux sera instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Pour cela des soins pré-, per- et postopératoires adéquats seront réalisés. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale et des traitements analgésiques sont systématiquement utilisés pour prévenir toute douleur.

Choix des espèces

Les glioblastomes sont responsables de nombreux décès, à ce jour une résection de tumeurs avec un traitement adapté permet une survie des patients de 6.9 à 14.6 mois. L’objectif est donc de prolonger ces délais, mais aussi et surtout améliorer le confort des patients. Dans une première phase, nous avons mis au point un modèle animal qui retrace la même prise en charge que celle réalisée chez les patients. Dans une deuxième phase correspondant à cette étude nous allons tester de nouvelles molécules, afin d'améliorer la survie et le confort des animaux tout en combinant radiochimiothérapie. L’utilisation des modèles souris, déjà en place dans le laboratoire sera complétée par celle de rat, avec pour but des approches confirmatoires (modèles différents) mais aussi l’utilisation d’animaux modifiés. Nous utiliserons des souris et des rats de 8 à 10 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs semaines dans un modèle immunocompétent ou immunodéprimé, donc l’implantation sur des jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées au plus tard à 110 jours pour prélever la moelle épinière, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes subissent une biopsie de la queue vers six jours, et 260 d'entre elles portent une mutation qui provoque une paralysie progressive, avec des tests moteurs hebdomadaires que le porteur n'énumère pas. Quatre-vingts souris reçoivent en plus une stimulation magnétique de la moelle sous anesthésie générale pendant quatorze jours. Le porteur fixe le point limite à une paralysie modérée qu'il décrit comme ayant "peu d'impact sur la vie de l'animal", et prévoit croquettes mouillées et biberons à longue tétine pour que les souris n'aient pas à se redresser.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative touchant les neurones moteurs (appelés aussi motoneurones). Elle se déclare à l’âge adulte, il n’existe à ce jour aucun traitement curatif et l'issue de la maladie est fatale. De plus, les mécanismes conduisant à la dégénérescence des motoneurones restent mal connus à ce jour. En outre, une dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures a été observée, cette dégénérescence étant considérée comme une conséquence de celle des motoneurones. Cependant, des études récentes suggèrent que la dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures pourrait précéder, voire contribuer, à celle des neurones moteurs. Le premier objectif de ce projet sera donc d'étudier la dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures au cours de l'évolution de la maladie chez des souris transgéniques qui reproduisent la sclérose latérale amyotrophique. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité thérapeutique d’un traitement non-invasif dans le développement de la maladie. En effet, il a été démontré que la stimulation magnétique répétitive permet d'augmenter la survie des neurones et de réduire la démyélinisation après une lésion traumatique de la moelle épinière. Par conséquent, nous étudierons les effets de la stimulation magnétique répétitive sur la dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures. Pour cela, afin de pouvoir étudier spécifiquement les oligodendrocytes et les oligodendrocytes matures dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique, des souris permettant de suivre spécifiquement ces cellules seront croisées avec des souris développant la sclérose latérale amyotrophique au cours du temps ; ces deux lignées de souris étant présentes au sein de notre animalerie.

Bénéfices attendus

Ce projet s’intéresse aux mécanismes qui concourent à la dégénérescence des motoneurones et donc au développement de la sclérose latérale amyotrophique dans un modèle de souris qui reproduit la maladie décrite chez l’Homme. Il permettra donc le cas écheant de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de cette maladie. Cette étude nous permettra également d’avoir une meilleure connaissance sur les bénéfices d’une méthode non invasive (stimulation magnétique répétitive) dans ce contexte pathologique. Cela permettrait, sur un plus long terme, d’envisager de proposer ce traitement dans le cadre de la prise en charge des patients qui développent la sclérose latérale amyotrophique.

Procédures

L'ensemble des animaux, soit 360 souris, subiront une biopsie de queue vers 6 jours afin de réaliser le génotypage de ces animaux. Pour une première série d’expérimentations ; 100 souris controles (50 males et 50 femelles) seront utilisées afin de réaliser des expériences d’histologie. De la même facon, 100 souris exprimant les symptomes de la sclérose latérale amyotrophique (50 males et 50 femelles) seront utilisées afin de réaliser des expériences d’histologie. Pour une seconde série d’expérimentations 160 souris exprimant les symptomes de la sclérose latérale amyotrophique (80 males et 80 femelles) seront utilisées afin de réaliser des expériences de comportements et d’histologie. Les tests de comportements seront réalisés à partir de l’âge P50 et seront effectués toutes les semaines. La moitié de ces souris, soit 80 souris, bénéficiera d’un traiment par stimulation magnétique qui durera 14 jours. Ce traitement se fera sous anesthésie générale pendant 10 minutes (10hz pendant 10 secondes suivies de 20 secondes sans stimulation avec une intensité de 0.4T). Les animaux seront stimulés soit de J50 à J64 soit de J80 à J94. Enfin l’ensemble des animaux sera euthanasié, à un age de P110 au maximum afin de récupérer la moelle épinière.

Impact sur les animaux

Nous avons bien conscience que dans notre étude certains animaux mimant la maladie humaine vont développer certains signes de paralysie progressive et que l’aggravation de leur état conduira à un arrêt de toute procédure pour ces animaux. Ce projet impose également une douleur de courte durée à la suite du prélévement de queue (biopsie) afin de réaliser le génotypage

Devenir

L’ensemble des animaux (360 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (à P110 maximum) afin de procéder au prélévement de la moelle.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, la sclérose latérale amyotrophique résulte d'interactions pathogènes complexes entre les neurones moteurs et les autres constituants cellulaires de la moelle épinière, en particulier les cellules microgliales, les astrocytes et également les oligodendrocytes. L’étude de l’implication de ces différentes populations cellulaires dans le développpement de la maladie ne peut donc se faire que via l’utilisation d’animaux entiers vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué à partir d’études précédentes, à savoir que les expériences histologiques nécessitent un minimum de 6 à 10 animaux et les expériences fonctionnelles nécessitent un minimum de 10 animaux. Des tests statistiques seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=6 par groupe. L'utilisation de 10 animaux pour certaines expériences se justifie par la variation pouvant être observée notamment lors des tests fonctionnels.

Raffinement

Les expériences sont concues pour apporter le moins d’inconfort possible aux animaux. Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Nous avons défini un point limite ; score de 2 sur une échelle de 4 où la paralysie est modérée et a peu d'impact sur la vie de l'animal. Toutefois, par souci de précaution, afin de leur permettre aisèment d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.

Choix des espèces

La découverte d’un lien génétique chez certains patients a permis de développer des modèles murins de la sclérose latérale amyotrphique ou SLA. Nous utiliserons ici l'un de ces modèles de souris qui mime la maladie. Ces souris présentent une mort progressive des neurones permettant le controle moteur, reproduisant ainsi les caractéristiques de cette maladie. Cette souris est donc un modèle de choix pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SLA et l'effet de thérapies potentielles. Afin d’étudier la dégénérescence des cellules qui produisent la myéline, ces souris seront croisées avec un second modèle de souris de manière à pouvoir suivre ces cellules spécifiquement durant le développement de la maladie. Les animaux utilisés seront agées entre 15 et 110 jours. En effet, nous voulons étudier la dégénérescence des cellules myélinisantes et des neurones au cours du développement de la SLA chez la souris. Les premiers temps expérimentaux correspondent aux stade pécoces pré-symptomatiques (P15 et P30) de la maladie, puis à P50, P80 et P110 ; périodes qui correspondent respectivement à l’apparition des premiers signes notamment des symptomes locomoteurs et à l’apparition de la paralysie.

Secoués sous anesthésie générale à l'âge de sept jours pour reproduire le syndrome du bébé secoué, 909 souriceaux sont tous tués aux stades étudiés pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur liste les atteintes attendues : douleurs cérébrales liées aux lésions, difficulté à s'alimenter, retard du développement psychomoteur, rigidité corporelle, mouvements de convulsion, respiration anormale et anomalies du comportement. Une partie des souriceaux subit en plus une craniotomie d'une heure sous anesthésie, sans réveil. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative parfaite" à un organisme vivant pour étudier les conséquences du secouement, et présente ce modèle comme une préparation d'interventions de prévention chez les enfants.

Objectifs

Les violences faites aux enfants et adolescents sont un fléau sanitaire et sociétal mondial. Un quart des adultes déclarent en avoir été victime mais une minorité d’entre eux est repérée suffisamment précocement pour éviter les conséquences « vie entière » somatiques et neuropsychiatrique de ces violences et leur impact socio-économique majeur. Les violences faites aux enfants et adolescents sont définies par l’OMS comme toutes les formes de mauvais traitements physique et/ou affectifs, de sévices sexuels, de négligences ou d’exploitation, entraînant un préjudice réel ou potentiel pour la santé de l’enfant, sa survie, son développement ou sa dignité, dans le contexte d’une relation de responsabilité, de confiance ou de pouvoir. Dans les pays à économie développée, les estimations de fréquence usuellement acceptées indiquent que 4 à 16% des mineurs seraient victimes de maltraitance physique. Pour les enfants survivants aux violences physiques du syndrome du bébé secoué, les conséquences à long terme sont majeurs sur le plan neurologique et développemental (périmètre crânien diminué, épilepsie, déficiences motrices visuelles intellectuelles, trouble du langages, et anomalies comportementales). Enfin, la pandémie de COVID-19 a augmenté la fréquence et la gravité des violences. Le syndrome du bébé secoué a vu son incidence doubler en 2021 et la mortalité décupler par rapport à la période de prépandémie. Dans ce projet, nous modéliserons chez le souriceau le syndrome du bébé secoué (traumatisme crânien). Plusieurs analyses seront réalisées à des temps spécifiques de la maturation du cerveau : enfance, adolescence et adultes. Nous établirons un profil comportemental individuel sur plusieurs composantes (motrice, sociale, cognitive). Les effets au niveau moléculaires de ces maltraitances seront également étudiés afin de permettre un futur transfert vers la clinique chez l’humain. Les analyses seront ciblées sur les marqueurs moléculaires de deux axes identifiés chez l’humain comme étant tout particulièrement perturbés après exposition à des maltraitance dans l’enfance : la neuroinflammation et la production d’hormones. Les études de la génétique et des protéines sont réalisés sur le sang et le cerveau des animaux juvéniles, adolescents et adultes. Enfin des approches thérapeutiques telles que la thérapie comportementale et des tests de médicaments ciblant les régulateurs clés seront entreprises.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier les mécanismes et l'évolution du traumatisme crânien du syndrome du bébé secoué à l’échelle cellulaire comme comportementale pour mieux définir la période la plus propice pour les futures études thérapeutiques chez les enfants et adolescents. Il permettra de préparer des interventions de prévention secondaires adaptées et correctrices.

Procédures

Les souriceaux subiront un traumatisme crânien par secouement sous anesthésie générale. Après le traumatisme, des groupes d’animaux de différents âges seront anesthésiés, et une perfusion intra-cardiaque sera réalisée post- mortem pour éliminer le sang des vaisseaux du cerveau qui sera étudié. La perfusion est réalisée sous anesthésie générale et avec analgésie. Certains animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale pour réaliser des mesures d’imagerie du cerveau (durée 1 heure). Cette chirurgie consiste en une craniotomie afin de permettre le passage du signal. Cette procédure est sans réveil, les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation. Cette procédure sera réalisée exclusivement par des expérimentateurs aguerris, maîtrisant parfaitement toutes les techniques requises.

Impact sur les animaux

Tout d'abord le jour du traumatisme crânien par secouement : - Séparation d’avec la mère lors de l’anesthésie par inhalation - Une hypothermie causée par l’isolement d’avec la mère - Le secouement horizontale. Ensuite, suite au traumatisme du secouement : - Douleurs cérébrales suite aux lésions occasionnées par le secouement - Difficulté à s’alimenter engendrant un petit poids - Retard dans le développement psychomoteur - Hypertonique, ou rigidité corporel, mouvements anormaux de convulsions, - Respiration anormale - Anomalie du comportement

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt. Les cerveaux seront prélevés post-mortem pour les différentes analyses qui permettront d’étudier de manière approfondie le tissus cérébral après le traumatisme, ainsi que l’inflammation cérébrale.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternative parfaite à un modèle sur un organisme vivant pour étudier les conséquences du secouement sur le cerveau et les anomalies du développement qui en découle. Plusieurs analyses de notre projet ne peuvent être modélisée hors de l’organisme vivant, ni par des méthodes utilisant des modèles informatiques de théories de toxicité. Ce modèle, de bébé secoué, réalisé sur organisme vivant nous permet de s’intéresser à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés. Nos analyses sont réalisées régulièrement dans notre laboratoire, ainsi nous savons combien d’animaux sont nécessaires afin d’obtenir un résultat. En conséquence, le nombre d’animaux pour ce projet sera au maximum de 909 animaux afin d’obtenir des résultats analysables par les tests statistiques. Le cerveau des animaux issus de l’analyse de la connectivité neuronale et ceux issus des analyses du comportement seront prélevés pour les analyses du tissus cérébral ce qui a réduit le nombre d’animaux dans notre projet. Il est prévu de mettre en place le modèle avec 48 animaux, mais si la fréquence d’agitation est déterminée sur moins d’animaux nous en utiliserons moins ce qui réduira le nombre total d’animaux.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement de l’hébergement avec du papier doux absorbant pour la fabrication du nid comme cela est fait dans leur milieu naturel. Les animaux seront réchauffés à l’aide d’une lampe au moment de la procédure du secouement. On surveillera l’état général des animaux dans le nid à l’aide d’un document appelé « arbre décisionnel ». Il permet d’observer les souriceaux dans la portée sans les déranger à nouveau car les soins apportés par la mère sont importants. Dès qu’un animal ne va pas bien il est vite repéré car il est blanchâtre et/ou immobile, donc il attire l’œil. Pendant les protocoles nécessaires pour la mise en place des appareils d'imagerie, les animaux seront anesthésiés et surveillés : si l'animal présente une difficulté respiratoire, une variation importante de sa fréquence cardiaque ou une hypothermie importante, la procédure sera interrompue et l'animal euthanasié. Les animaux seront euthanasiés après administration d’un analgésique et d’un anesthésique. C’est quand la mort sera vérifiée (plus de réflexes) que nous procéderons alors aux prélèvements post-mortem.

Choix des espèces

Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. Le modèle de secouement sera fait à 7 jours de vie, ceci correspond à la petite enfance chez l’humain. Nous étudierons les interactions entre les cellules du cerveau en développement sur un modèle de bébé secoué, pour cela il est nécessaire d’utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l’homme. La souris remplit très bien cette condition. Notre objectif étant d’étudier l’effet du secouement sur le cerveau en développement, nous nous intéresserons à 3 temps de vie : 8 à 21 jours (petite et moyenne enfance), 45 jours (adolescence), et 6 mois de vie (adulte), afin d’étudier l‘évolution du traumatisme cérébrale et les effets à long terme.