Recherche appliquée

100 souris et rats vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée pour la formation, une partie placée à l'adoption, le reste autopsié. Chaque animal subit des prélèvements de sang à la veine submentale, d'abord sous anesthésie puis, une fois le geste maîtrisé, sur animal vigile. Le projet met au point cette technique de prélèvement présentée comme moins invasive et vise à réduire l'anesthésie et le nombre d'animaux servant à former le personnel. Le porteur indique qu'aucune alternative n'existe pour une technique propre au modèle animal.

Objectifs

Le but de ce projet est d‘évaluer la mise en place d’une nouvelle méthode de prélèvement de sang chez le rat et la souris : le prélèvement sanguin à la veine submentale ("sous le menton "). Cette nouvelle voie de prélèvement remplacerait et/ou compléterait le prélèvement sublingual et rétro-orbitale dans une démarche de raffinement générale des techniques de prélèvement sanguin en fonction de l’espèce (rat/souris), de l’âge de l’animal et de son statut (gestant par exemple) afin de disposer d’une technique moins invasive pour l’animal. Même si la technique de prélèvement est documentée et présentée par d’autres laboratoires, il est nécessaire d’évaluer en interne la possibilité de réaliser ces prélèvements en tenant compte des compétences techniques internes et des exigences en matière de qualité du sang recueilli.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de disposer d’une technique de prélèvement de sang répondant aux critères éthiques, la moins invasive possible pour l’animal et facile à réaliser techniquement. Celle-ci permettrait de raffiner les techniques actuellement en cours dans l'installation d'essai. A terme, cette technique ne nécessiterait pas systématiquement l'anesthésie de l'animal . De plus, comparer aux techniques actuelles, cette technique devrait permettre une utilisation moindre d’animaux pour la formation et le maintien des compétences.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins à la veine submentale . Dans un premier temps les animaux seront anesthésiés pour la mise en place de la technique de prelevement. La durée de cette procédure est comparable aux méthodes de prélèvements validées en interne : environ 2 minutes d’anesthésie suivi d’un prélèvement d’environ 1 minute et d’un réveil sous surveillance accompagné d’un point de compression. Dans un deuxième temps, lorsque le geste sera maitrisé, une évaluation de la technique sans anesthésie sera faite. Les volumes et la fréquence de ces prélèvements seront définis au fur et à mesure du déroulement du projet et pourront varier de la façon suivante : de 7.5% du volume sanguin total de l’animal 1 fois par semaine maximum (soit une période de récupération de 7 jours minimum entre chaque prélèvement) à 15% du volume sanguin total de l’animal 1 fois toutes les 4 semaines maximum (soit une période de récupération de 28 jours minimum entre chaque prélèvement). Le volume prélevé et la fréquence de ces prélèvements ne dépasseront pas les recommandations des publications éthiques.

Impact sur les animaux

La mise au point de cette technique de prélèvement de sang peut induire un léger inconfort lors de la contention, une douleur et un stress légers, des hématomes et/ou de légères blessures au point de prélèvement ainsi qu’une perte de sang un peu plus importante que prévue. L’anesthésie de l’animal permettra dans un premier temps d’atténuer ces nuisances puis ensuite au fur et à mesure de la maitrise de la technique ces nuissances auront tendance à diminuer voir à disparaitre rapidement et l’anesthésie ne sera plus nécessaire.

Devenir

La procédure ne nécéssite pas l'euthanasie systématique des animaux (sauf en cas de mal-être). Afin de permettre une diminution du nombre d’animaux utilisés dans le laboratoire, les animaux ne présentant aucun signe de mal être en fin de projet pourront être utilisés dans le projet formation et maintien des compétences du personnel ou gardés en vie pour être adoptés. D'autres animaux seront autopsiés en vue d’acte de formation ou pour prélever des organes utilisables pour le développement de méthodes ex-vivo(in-vitro). Cette décision est prise par le vétérinaire sanitaire, le responsable projet, le directeur d’étude ou la structure du bien être animal.

Remplacement

Le projet portant sur une technique de prélèvement de sang spécifique au modèle animal, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation animale.

Réduction

Cette mise au point de technique se fera dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d’animaux qui seront commandés au fur et à mesure des tests. Ces animaux seront réceptionnés jeunes afin d’être utilisés tout au long de leur développement (jeune adulte à adulte, males et femlles) en respectant les volumes de prélèvements et les répétitions éthiquement acceptables. Une fois la technique maîtrisée, ces mêmes animaux pourront également être utilisés pour la formation technique et le maintien des compétences. Dans un premier temps, afin de réduire la douleur, les animaux seront anesthésiés jusqu'à la validation et la maitrise de la technique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et dans des cages adaptées avec un enrichissement du milieu approprié à leur espèce. Ils recevront une alimentation contrôlée dont la traçabilité est assurée. Dans un 1er temps, afin d’adapter le geste technique et de réduire le stress et la douleur éventuels, les animaux seront anesthésiés le temps du prélèvement. Une fois le geste technique maitrisé, des tests seront pratiqués sans anesthésie. Les animaux sont observés tous les jours (week-end compris). Ils sont pesés à intervalles réguliers pour vérifier leur croissance et leur bien-être. Les prélèvements de sang sont réalisés à la veine submentale, en respectant le volume et les périodes de récupération recommandés pour le bien-être animal. Les essais de contention et de prélèvements seront réalisés par des techniciens expérimentés. Un suivi journalier des animaux est réalisé et des points limites précoces ont été identifiés par le laboratoire pour éviter la souffrance de l'animal. Un suivi et un bilan du bien-être animal est réalisée par la structure du bien-être animal sur tous les projets.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont les espèces utilisées dans le laboratoire pour les études de toxicologie. Le but de ce projet est de raffiner les techniques de prélèvements de sang que nous utilisons dans ces études. Toutes les études de toxicologie nécessitant ce type de prélèvement de sang utilisent des rongeurs de 6-7 semaines jusqu'à 2 ans dont des femelles gestantes pour les études de toxicologie du développement. Ainsi, ce projet utilisera des animaux jeunes qui seront gardés pour évaluation de la technique aux différents stades de développement.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris immunodéficientes reçoivent une greffe de peau humaine sous anesthésie, une irradiation, une injection de lymphocytes T régulateurs et des prélèvements sanguins répétés sur trois mois. Le projet valide une thérapie cellulaire censée remplacer les immunosuppresseurs pour éviter le rejet de greffe. Le porteur qualifie ces expériences d'"indispensables" pour obtenir l'autorisation de l'agence du médicament et convaincre les financeurs de l'essai clinique.

Objectifs

Les immunosuppresseurs induisent des effets secondaires graves chez les patients transplantés avec un organe solide ou atteints de maladie auto-immune tels que des cancers et infections fréquentes et graves et ne sont pas efficaces chez les patients greffés avec des cellules souches après chimiothérapie. La thérapie cellulaire a pour but de remplacer les traitements immunosuppresseurs pour éviter leurs effets secondaires et être plus efficaces, par une injection unique de cellules régulatrices. Les essais cliniques de phase I/IIa avec ces cellules ont montré des résultats encourageants. Il existe plusieurs types de cellules que nous pourrions associer et dont l'efficacité thérapeutiquepeut être optimisée. Nous avons précisé ces associations et optimisations in vitro et nous devons évaluer la dose thérapeutique et l'absence d'effet secondaire dans les modèles pré-cliniques de souris avant de pouvoir les administrer chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Cette thérapie vise à empêcher le rejet d'organe et soigner les patients greffés avec des cellules souches après chimiothérapie, sans immunosuppresseurs pharmacologiques et sans effets secondaires. Ces expériences précliniques sont indispensables pour évaluer la sécurité d'emploi et l'efficacité de cette thérapie cellulaire pour obtenir l'approbation de l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé de leur application chez l'Homme, et pour convaincre les agences nationales de financer l'essai clinique.

Procédures

Des animaux seront greffés avec de la peau sous anesthésie générale gazeuse durant environ 30 minutes et analgésie générale et locale chimique. Des animaux seront irradiés une fois pendant 3 minutes. Les animaux seront injectés une fois avec des cellules sous anesthésie gazeuse de quelques minutes. Du sang sera prélevé toutes les 2 semaines sous anesthésie générale gazeuse de quelques minutes et analgésie locale chimique. Les souris seront manipulées quotidiennement quelques minutes pour suivre leur poids et le rejet de greffe. Les souris seront euthanasiées après anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

L'administration unique des cellules nécessite une immobilisation de la souris de quelques minutes et peut induire une perte de poids. Les souris seront manipulées quotidiennement pour suivre leur poids et le rejet de greffe. Les souris seront anesthésiées par inhalation gazeuse pendant environ 30 minutes pendant la greffe de peau, ce qui peut diminuer la température corporelle. La chirurgie de greffe peut causer des douleurs. Un pansement sera maintenu sur la greffe pendant 12 à 14 jours après chirurgie et l’animal sera anesthésié le temps de refaire un bandage si besoin et lors du retrait du bandage. Du sang sera prélevé au sinus toutes les 2 semaines pouvant causer une douleur. Les souris immunoincompétentes seront par groupe de 5 maximum par cage ventilée pour éviter les infections opportunistes.

Devenir

Les souris injectées avec des cellules ne pourront pas être utilisées à nouveau. Les injecter avec les cellules d'un second donneur induirait une reconnaissance des cellules entre elles et serait ininterprétable.

Remplacement

Les études fonctionnelles in vitro sont limitées par l’absence du contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire et ne peuvent remplacer les études in vivo. La preuve de concept a été faite dans ces modèles de souris, et ces thérapies doivent être évaluées dans les mêmes modèles. Ces modèles de souris avaient été choisis en remplacement de modèles primates non humains, et sont plus pertinents (test direct de cellules humaines et non de cellules de primates non humains).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est réduit à 10, nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de groupes a été réfléchi de sorte à avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus.

Raffinement

Pour le modèle de greffe, les souris seront sous anesthésie générale gazeuse et analgésie chimique durant la chirurgie de la greffe de peau. Les animaux seront ensuite placés sur tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil, le greffon sera recouvert de tulle gras et d’une compresse stérile maintenue par un pansement puis d’un bandage pendant 12 à 14 jours. L’animal sera anesthésié quelques minutes de façon gazeuse le temps de refaire un bandage si besoin ou pour son retrait. Pour les prélèvements de sang, les souris seront anesthésiées quelques minutes sous forme gazeuse, analgésiées localement, et prélevées d' un faible volume de sang avec 2 semaines de récupération entre 2 ponctions. Les souris seront par groupe de 5 maximum par cage ventilée sur un portoir à l'animalerie. Tous les animaux seront suivis pour leur poids, leur comportement, leur intégrité, le développement de la GVH et/ou du rejet de greffe et seront euthanasiés après anesthésie gazeuse à l’atteinte des points limites définis selon une grille de score ou 100 jours après l’injection des cellules.

Choix des espèces

Nous avons choisi les souris immunoincompétentes qui permettent l'acceptation de cellules immunes et/ou d'un greffon de peau humain. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules et tissus humains seraient détruites par le système immunitaire d'une souris. Ces souris présentent aussi des facilités de reproduction, d'hébergement et de manipulation. Les souris doivent avoir atteint un poids adulte pour le suivi de perte de poids résultant de l'injection des cellules, les expériences sont standardisées telles que les cellules sont injectées chez des souris agées de 8 à 12 semaines.

6 020 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit expédiées, soit tuées. Il s'agit du deuxième site d'un élevage de la lignée C3-PMP porteuse d'une duplication du gène PMP22, modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, dont les souriceaux développent dès trois semaines une atteinte neuromusculaire. Le génotypage se fait par biopsie de la queue ou de l'oreille sur animal vigile. Le porteur décrit ces animaux comme produits pour un partenaire développant un traitement et affirme que le modèle in vivo ne peut être remplacé.

Objectifs

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) correspond à un groupe hétérogène de neuropathies périphériques chroniques héréditaires rares avec déficits moteurs et sensoriels. C’est l'un des troubles neurologiques dégénératifs les plus courants qui, tout en étant qualifié de rare, présente un taux de prévalence "élevé" (prévalence moyenne de 2,63 / 10 000 personnes). La CMT se caractérise par une diminution de la force musculaire et une fonte des muscles au niveau des extrémités, une déformation du pied, des douleurs musculo-squelettiques et neuropathiques, la perte de dextérité, la fatigue et la perte sensorielle. A ce jour, il n’existe aucun traitement pour inverser ou ralentir le processus de la maladie. Le but de ce projet est d’élever des modèles de rongeur pertinents pour l'étude de cette pathologie ; ces modèles peuvent développer spontanément un ou plusieurs caractéristiques du modèle ou être génétiquement altérés. Les animaux issus de ces developpements serviront à favoriser la compréhension des mécanismes pathologiques, cognitifs et comportementaux suite à ces altérations ciblées, à identifier des substrats moléculaires et biologiques caractéristiques et à développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Certaines anomalies génétiques à l’origine de la CMT entraînent la démyélinisation des nerfs périphériques. A chacun des gènes mutés entrainant la démyélinisation, correspond un sous-type de CMT. Le but de cette étude est de produire des animaux pour un partenaire cherchant à développer un traitement pharmacologique capable de diminuer le stress cellulaire associé à la duplication du gène PMP22 afin de protéger les cellules de Schwann et ainsi palier au dysfonctionnement des nerfs périphériques.

Bénéfices attendus

L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ce modèle de souris C3-PMP, au plus proche de la maladie humaine, est donc très pertinent pour le développement de traitements pharmacologiques.

Procédures

Les souris présentent un phénotype dommageable de troubles de la locomotion. Une biopsie caudale et/ou d'oreille est réalisée sur l'animal vigile pour son génotypage.

Impact sur les animaux

Ces animaux commencent à developper les premiers signes de la maladie à 3 semaines, ils développent une insuffisance neuromusculaire associée à une capacité motrice anormale, des défauts de coordination ainsi qu’une hypoactivité. Ces signes de locomotion perturbée sont observables principalement chez la femelle. Ils n'handicapent pas l'animal pour sa prise de nourriture, d'eau et ses interactions sociales. Par ailleurs, une douleur légère peut être induite lors de biopsies pour génotypage.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés soit mis à mort.

Remplacement

Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ces hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal. En effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de la maladie de CMT, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

Un hébergement standard sera réalisé. Une attention particulière sera apportée à chacun des animaux qui seront surveillés quotidiennement dès leur naissance afin de confirmer le degré de sévérité du phénotypage de la lignée. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Si, par exemple, une difficulté de locomotion apparait, cela entrainera une facilitation à l'accès à l'eau et la nourriture directement dans la cage d'hébergement (croquettes et gel dans la cage). Les animaux seront évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. La souris est un modèle animal simple à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Elle est un modèle de choix pour les études précliniques en raison de sa petite taille, de sa courte gestation, de sa durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d'ovocytes, des adultes matures sexuellement seront utilisés.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever les tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après greffe de cellules cancéreuses sous la peau, chaque animal reçoit jusqu'à quatre traitements par ultrasons sous anesthésie, susceptibles de provoquer une brûlure au niveau de la tumeur, plus des injections d'immunothérapie et un gavage d'hormonothérapie. Le projet teste si les ultrasons désorganisent l'environnement de la tumeur pour rendre le traitement plus efficace dans un cancer du sein. Les bénéfices sont annoncés pour la santé humaine "à long terme" et "en cas de succès".

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes dans le monde. L’hormonothérapie est un traitement efficace du cancer du sein mais pas pour tous les types de cancer ni pour toutes les patientes. L’environnement de la tumeur semble être responsable de cet échec. Il est proposé ici d’utiliser les ultrasons pour désorganiser cet environnement tumoral et permettre à un traitement combiné hormonothérapie et immunothérapie de pouvoir atteindre la tumeur de manière plus efficace.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite que la stratégie ultrasons + traitement anti cancéreux soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patientes atteints de cancer du sein.

Procédures

- une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 4 traitements par ultrasons maximum 15 minutes sous anesthésie à raison d’un par semaine - 4 injections intrapéritonéales d'immunothérapie à raison d’un par semaine dans l’abdomen, 30 secondes - 4 injection sous cutanée d’antidouleur dans l’abdomen (30 secondes) - Au maximum 8 pesées et mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de deux par semaine – 5 gavage d’hormonothérapie, 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). Une injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de tumeur peut rarement entrainer une gêne à la locomotion. Les injections intrapéritonéales hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale gazeuse et un traitement aux ultrasons une fois par semaine, les ultrasons pouvant induire une brûlure au niveau de la tumeur. Le traitement avec l’immunothérapie et l'hormonothérapie n’ont pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris (pas de réaction auto-immune).

Devenir

Suite à la procédure les animaux en études seront mis à mort pour les prélèvements de tumeurs pour analyses

Remplacement

Plusieurs informations ont été données via des études culture de cellules : les effets des ultrasons sur l’élasticité de la tumeur, amélioration de la diffusion de drogue après traitement aux ultrasons. Les paramètres de traitement aux ultrasons ont été évalués par simulations informatiques. Cependant, les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité). L’étude de l’efficacité de la combinaison ultrasons et immunothérapie ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Le calcul du nombre d’animaux a été déterminé par un outil statistique et les résultats seront interprétés grâce à des tests statistiques. Cela nous a permis de déterminer qu'il nous faudra 8 animaux par groupe en suivi de l'efficacité et de la survie.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en leur faisant une contention une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. L’état général des souris sera aussi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation. Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 60 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Par ailleurs, le personnel animalier inspecte quotidiennement les animaux et renseignent une grille de suivi basé sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos vouté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour se cacher et se reposer). En prévision d’éventuelles brûlures cutanées à cause de la cavitation, les souris recevront une injection d’antalgique au préalable du traitement aux ultrasons. Pour les composés administrés en gavage, des sondes de gavage flexibles et à usage unique seront utilisées.

Choix des espèces

La souris est la plus petite espèce qui développe des tumeurs suffisamment grosses pour être traitées par ultrasons. La souche est choisie car nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 6 semaines au moment de l’implantation du modèle, car d’une part la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part, le traitement débutera entre 7-8 semaines, 7 semaines étant l’âge auquel leur système immunitaire est mature, et donc actif.

6 020 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit expédiées à un partenaire, soit tuées. Ce projet consiste à élever une lignée porteuse d'une duplication du gène PMP22 reproduisant la maladie de Charcot-Marie-Tooth, les souriceaux développant dès trois semaines une atteinte neuromusculaire et des troubles de la coordination. Le génotypage passe par une biopsie de la queue ou de l'oreille sur animal vigile. Le porteur indique produire ces animaux pour un partenaire cherchant un traitement pharmacologique et affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer le modèle in vivo.

Objectifs

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) correspond à un groupe hétérogène de neuropathies périphériques chroniques héréditaires rares avec déficits moteurs et sensoriels. C’est l'un des troubles neurologiques dégénératifs les plus courants qui, tout en étant qualifié de rare, présente un taux de prévalence "élevé" (prévalence moyenne de 2,63 / 10 000 personnes). La CMT se caractérise par une diminution de la force musculaire et une fonte des muscles au niveau des extrémités, une déformation du pied, des douleurs musculosquelettiques et neuropathiques, la perte de dextérité, la fatigue et la perte sensorielle. A ce jour, il n’existe aucun traitement pour inverser ou ralentir le processus de la maladie. Le but de ce projet est d’élever des modèles de rongeur pertinents pour l'étude de cette pathologie ; ces modèles peuvent développer spontanément un ou plusieurs caractéristiques du modèle ou être génétiquement altérés. Les animaux issus de ces developpements serviront à favoriser la compréhension des mécanismes pathologiques, cognitifs et comportementaux suite à ces altérations ciblées, à identifier des substrats moléculaires et biologiques caractéristiques et à développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Certaines anomalies génétiques à l’origine de la CMT entraînent la démyélinisation des nerfs périphériques. A chacun des gènes mutés entrainant la démyélinisation, correspond un sous-type de CMT. Le but de cette étude est de produire des animaux pour un partenaire cherchant à développer un traitement pharmacologique capable de diminuer le stress cellulaire associé à la duplication du gène PMP22 afin de protéger les cellules de Schwann et ainsi palier au dysfonctionnement des nerfs périphériques.

Bénéfices attendus

L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ce modèle de souris C3-PMP, au plus proche de la maladie humaine, est donc très pertinent pour le développement de traitements pharmacologiques.

Procédures

Les souris présentent un phénotype dommageable de troubles de la locomotion. Une biopsie caudale et/ou d'oreille est réalisée sur l'animal vigile pour son génotypage.

Impact sur les animaux

Ces animaux commencent à developper les premiers signes de la maladie à 3 semaines, ils développent une insuffisance neuromusculaire associée à une capacité motrice anormale, des défauts de coordination ainsi qu’une hypoactivité. Ces signes de locomotion perturbée sont observables principalement chez la femelle. Ils n'handicapent pas l'animal pour sa prise de nourriture, d'eau et ses interactions sociales. Par ailleurs, une douleur légère peut être induite lors de biopsies de génotypage.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés soit mis à mort.

Remplacement

Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ces hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal. En effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de la maladie de CMT, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

Un hébergement standard sera réalisé. Une attention particulière sera apportée à chacun des animaux qui seront surveillés quotidiennement dès leur naissance afin de confirmer le degré de sévérité du phénotypage de la lignée. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Si, par exemple, une difficulté de locomotion apparait, cela entrainera une facilitation à l'accès à l'eau et la nourriture directement dans la cage d'hébergement (croquettes et gel dans la cage). Les animaux seront évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. La souris est un modèle animal simple à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Elle est un modèle de choix pour les études précliniques en raison de sa petite taille, de sa courte gestation, de sa durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d'ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.

40 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres études après une période de repos. Sous anesthésie générale, chaque animal peut subir jusqu'à cinq fois sur deux ans des prélèvements de moelle osseuse, de liquide cérébrospinal, des lavages broncho-alvéolaires ou des prises de sang. L'objectif est de fournir du matériel biologique de primate pour mettre au point des techniques d'analyse. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, la proximité des primates avec l'humain étant présentée comme sans équivalent.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre à disposition de la communauté scientifique du matériel biologique de primate (liquide cérébrospinal, échantillons pulmonaires ou de moelle osseuse, accompagnés ou non de prélèvement sanguin), qui ne peut être collecté que sous anesthésie générale des animaux. Ces prélèvements sont nécessaires à la mise au point de techniques d'analyses sur ces échantillons, à la sélection d'animaux sur certains critères physiologiques, ou encore à la réalisation de test in vitro afin d’appréhender la toxicité ou l'efficacité d’un produit, au lieu de ou avant de le tester chez l’animal. Ce projet vise donc à pouvoir prélever certains échantillons biologiques de primate sous anesthésie, dans le but de réaliser des tests préliminaires ou en remplacement d'études in vivo sur cette espèce.

Bénéfices attendus

Tout test de matériel biologique obtenu lors de protocoles expérimentaux utilisant l'animal nécessite au préalable d'être mis au point, affiné, voir validé selon un certain cadre réglementaire. Ces mises au point nécessitent elles-mêmes l'utilisation de matériel biologique, qui doit être obtenu sur la même espèce. Beaucoup de tests sont basés sur des produits sanguins, mais certains nécessitent d'autres matrices biologiques plus difficile d'accès, comme la moelle osseuse, le liquide cérébrospinal ou les lavages pulmonaires. La moelle osseuse pourrait par exemple être utilisée dans le cadre de la mise au point d'un test visant à caractériser les cellules progénitrices du sang, pour le développement d'une thérapie contre des maladies héréditaires. Le liquide cérébrospinal pourrait être utilisé pour mettre au point une méthode de mesure d'un produit injecté dans le sang d'un patient, pour évaluer sa capacité à passer dans le cerveau. Cela peut avoir des implications pour évaluer la potentielle neurotoxicité d'un produit, ou au contraire sa capacité à atteindre le cerveau pour lutter contre des maladies neurodégénératives. Finalement, les lavages pulmonaires permettent d'avoir accès à du liquide et à des cellules de poumons, sans pour autant sacrifier l'animal : cela permettrait d'étudier le microbiote pulmonaire d'animaux, ou encore d'utiliser ces échantillons pour mettre au point des méthodes d'investigation de virus pulmonaires comme le SARS-CoV-2 (ex: PCR). Ces prélèvements sous anesthésie de matrices biologiques spécifiques pourront potentiellement être accompagnés de prélèvements sanguins dans la limite des recommandations de volume et fréquence pour l'espèce. Ces prélèvements de sang pourront être réalisés seulement s'il est jugé scientifiquement ou éthiquement pertinent de les faire sur le même animal plutôt que sur une cohorte différente. Dans certains cas, ces échantillons pourraient être utilisés pour réaliser des tests in vitro remplaçant l'utilisation de l'animal, comme par exemple dans le cadre de tests de toxicité d'un produit sur les cellules progénitrices de la moelle. Dans ce contexte, les différents prélèvements réalisés sont nécessaires pour mettre au point ou améliorer des méthodes d'analyses existantes. Ce projet contribuera donc à réduire le nombre d’animaux utilisés en étude, en permettant le développement de méthodes d'analyses plus fines ou de test in vitro remplaçant l'animal lors de phases expérimentales précoces.

Procédures

Les animaux seront manipulés afin de réaliser une injection d’anesthésique. Les procédures se déroulent entièrement sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à une parmi les 4 procédures différentes, chacune nécessitant entre moins d’une minute et trois minutes . Les prélèvements possibles seront : prélèvement de moelle osseuse, prélèvement de liquide cérébrospinal, lavage broncho-alvéolaire et prélèvements sanguins. Le temps entre l’induction de l’anesthésie de l’animal et son réveil est d’environ 1h.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de liquide cérébro-spinal est réalisé sous anesthésie. Une légère gêne au lieu de ponction peut être ressentie au réveil par l’animal. Le lavage broncho-alvéolaire peut provoquer une gêne chez l'animal suite à l'administration de liquide dans les poumons. De plus, dans le cadre de ce protocole, les prélèvements seront par définition ponctuels et donc non répétés dans le temps. Le prélèvement de moelle osseuse peut quant à lui provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement. ire un hématome sur la zone de prélèvement.

Devenir

Après une période de repos adéquate, les animaux seront disponibles pour intégrer d'autres études, sur avis vétérinaire.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'animal dans le cadre de ce projet. L'utilisation de celui-ci est indispensable afin d'obtenir le matériel biologique nécessaire à la mise au point, la calibration et la validation de méthodes d'analyses biologiques. Ces méthodes visent en effet directement les cellules de l'espèce animale concernée (cytométrie en flux, tests de stimulation de cellules immunitaires, caractérisation de l'expression de certains gènes…), ou peuvent être fortement influencées par le milieu biologique dans lequel elles sont réalisées (mesure de la quantité d'un anticorps ou d'une protéine exogène par ELISA ou spectroscopie de masse). Le raffinement de ces méthodes d'analyses sert d'une part à transférer des protocoles d'analyses d'une espèce à l'autre, et à améliorer leurs sensibilité et spécificité, réduisant ainsi potentiellement le nombre d'animaux nécessaires lors d'études subséquentes. De plus, la disponibilité de matériel biologique permet de la réalisation d'étude d'efficacité ou de toxicité in vivo, qui pourront potentiellement permettre de remplacer ou réduire le besoin d'études in vivo.

Réduction

Afin de ne pas surestimer le nombre d'animaux utilisés, le nombre d’animaux pour ce projet a été défini par une analyse rétrospective des prélèvements de liquide cérébrospinal et de prélèvements pulmonaires fait au sein de l’entreprise au cours des dernières années, modulée par la trajectoire de croissance de notre activité . Afin d’assurer un nombre minimum d’animaux, les animaux pourront être prélevé un maximum de 5 fois sur une période de 2 ans dans le cadre de cette DAP.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets sont mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises sont distribuées quotidiennement aux animaux (après les manipulations et fin de journée) dans la litière et dans des dispositifs à friandises (tube, jouets...). Les fruits et légumes frais qui leurs seront fournis seront variés d'un jour à l'autre, tout comme la façon de les préparer, afin de stimuler les animaux. Un fond musical sera diffusé dans l'animalerie tout au long de la journée afin d'habitue les animaux à la voix humaine et de masquer les sons liés à l'utilisation quotidienne de l'animalerie. Toutes les procédures décrites dans ce protocole auront lieux sous anesthésie, accompagnées de mesures de soutien en fonction de la procédure en question. Par exemple, les prélèvements de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal seront précédés d'injection d'analgésique, les prélèvements pulmonaires seront accompagnés de monitoring dédié et de supplémentation en oxygène. Les animaux seront gardés sur coussin chauffant durant la procédure afin de ne pas occasionner d'hypothermie. Les volumes maximum de matrice biologique à prélever sont basés sur une analyse de la littérature disponible, ou sur les pratiques utilisées en clinique humaine le cas échéant. L'animal sera suivi par le personnel d’étude tout au long de l'anesthésie et surveillé au moment de son réveil ainsi que durant les heures suivantes. Un suivi clinique quotidien ainsi que la mise en place de points limites spécifique à chaque procédure permet d’évaluer quotidiennement le bien-être de l’animal. En fonction de la procédure réalisée, un score neurologique pourra aussi être réalisé, si nécessaire, les jours suivant les prélèvements afin d’assurer qu’il n’y ait pas de dommage neurologique.

Choix des espèces

Par leur origine phylogénétique, les primates non humains présentent une forte proximité avec les humains en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Cette proximité permet de les utiliser dans le cadre de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et/ou prophylactiques. Cette espèce est donc particulièrement utilisée pour tester l'efficacité ou la toxicité de drogues visant des processus biologiques spécifiques à l'homme ou aux espèces proches. Ces études peuvent couvrir les thérapies géniques ou cellulaires visant à corriger l'expression de gènes défectueux, les études infectieuses sur des virus n'infectant que l'homme ou certains primates, ou encore les thérapies visant le système nerveux central (la barrière hémato-encéphalique de l'humain étant très proche de celle du singe). Ce type d'étude nécessites la mise au point de méthodes d'analyses dédiées, pour lesquelles l'accès au matériel biologique de l'espèce cible est nécessaire. Ainsi, des études visant des maladies génétiques ou des leucémies auront besoin d'analyser la moelle osseuse des animaux, les études infectieuses de virus respiratoire (le singe étant le modèle de référence pour l'infection au SARS-CoV-2) auront besoin d'échantillons pulmonaires, et les études visant le système nerveux auront besoin d'échantillons de liquide cérébrospinal pour mettre au point leur méthode de dosage. Les mises au point et/ou test préliminaires de ce projet concerneront des candidats médicaments humains. Les animaux pourront être des juvéniles à mature, en fonction des besoins de l’étude. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou des matures en fonction des objectifs des études. Par exemple, des prélèvements de moelle osseuse peuvent chercher certaines populations de cellules précurseurs plus fréquentes chez le juvénile que chez l'animal mature.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour accepter des cellules humaines, elles reçoivent une chimiothérapie puis une greffe de cellules souches sanguines humaines corrigées, avec des prélèvements sanguins mensuels, avant d'être tuées pour analyser leur moelle osseuse et leur rate. Le porteur indique que la modification génétique affaiblit leur système immunitaire et que la greffe et les prélèvements sont sources de stress. Il affirme que la capacité de greffe et la reconstitution du système sanguin ne peuvent être reproduites en laboratoire, rendant selon lui l'usage d'un modèle murin "requis".

Objectifs

La drépanocytose, maladie génétique du sang la plus répandue, altère la structure des globules rouges, posant un problème de santé mondial avec près de 300 000 nouveaux cas diagnostiqués annuellement. Une mutation génétique affectant la production d'hémoglobine, composant essentiel des globules rouges, provoque leur déformation, entraînant coagulation, obstruction vasculaire et dommages multi-organiques, réduisant sévèrement l'espérance de vie. Les traitements actuels, tels que les transfusions sanguines ou les greffes de cellules souches hématopoïétiques, ne sont accessibles que pour une fraction des patients et présentent des résultats insatisfaisants, se concentrant sur la gestion des symptômes. Ce projet permettrait d'apporter aux patients un traitement curatif afin de supprimer leurs symptômes tout en réduisant le coût de la prise en charge de leur maladie. En effet, grâce à une greffe unique de cellules souches hématopoïétiques modifiées, prélevées directement chez la personne atteinte de la maladie pour éviter les risques de rejet associés aux greffes issues de donneurs, les globules rouges seront, in fine, capables de remplir leur fonction de véhiculer l’oxygène vers tous les organes, le tout sans risque de rejet. Notre laboratoire travaille sur une nouvelle approche thérapeutique axée sur la récupération et la correction des cellules affectées chez les patients souffrant de drépanocytose. Cette méthode vise à corriger de manière permanente le défaut génétique dans les cellules souches sanguines afin d'obtenir une hémoglobine fonctionnelle. Ces dernières se trouvent dans la moelle osseuse et sont capables de générer toutes les cellules nécessaires aux fonctions sanguines. En utilisant une technique basée sur des outils et des ciseaux moléculaires, nous avons réussi à corriger l’erreur génétique responsable de la drépanocytose. Notre stratégie a été développée, en laboratoire, sur des cellules souches hématopoïétiques humaines. Ce projet a donc pour but d’évaluer les caractéristiques fonctionnelles des cellules modifiées après transplantation. Ainsi, une fois les cellules souches hématopoïétiques corrigées par notre traitement, il sera nécessaire de vérifier leur capacité à se greffer dans la moelle osseuse dans un organisme entier et à re-fabriquer ensuite différents types de cellules. Pour ces raisons, le recours à un modèle murin permettant la greffe de cellules souches humaines est désormais nécessaire pour valider ces protocoles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les effets bénéfiques du traitement chez la souris devraient permettre aux cellules humaines de retrouver une hémoglobine fonctionnelle, tout en s’assurant que notre traitement permet une greffe stable et efficace au cours du temps. Le projet s’effectuant directement sur des cellules humaines (et non murines), l’efficacité de notre traitement reflètera directement l’applicabilité aux patients. Seules la dose de chimiothérapie et le nombre total de cellules à transplanter seront à adapter. Ce projet permettrait d'apporter aux patients drépanocytaires un traitement curatif permettant de supprimer définitivement leurs symptômes tout en réduisant significativement le coût total de la prise en charge de leur maladie tout au long de leur vie. En effet, grâce à une autogreffe de cellules souches hématopoïétiques modifiées (permettant d’éviter les rejets observés lors des greffes issues de donneurs), leurs globules rouges seront, in fine, capables de remplir leur fonction de véhiculer l’oxygène vers tous les organes, le tout sans risque de rejet.

Procédures

Les souris recevront une injection de traitement chimiothérapeutique pour les préparer à recevoir des cellules souches sanguines humaines. Après la transplantation de ces cellules, un prélèvement sanguin sera réalisé chaque mois pour surveiller la réussite de la greffe. Enfin, une injection d'un médicament favorisant la production de globules rouges sera administrée.

Impact sur les animaux

Les animaux possèdent une modification génétique, afin de faciliter la transplantation de cellules souches humaines, ce qui affaiblit leur système immunitaire. Pour prévenir les infections, les souris seront logées dans des cages dotées d'une ventilation, contribuant ainsi à réduire la présence de pathogènes dans leur environnement. Pendant ces procédures, deux actes peuvent causer du stress: l'injection de cellules modifiées et le prélèvement de sang.

Devenir

Les animaux seront mis à mort. En effet, il sera nécessaire de récolter notamment les informations suivantes dans les organes suivants : - Le sang des souris sera récupéré, afin d’analyser la quantité et la qualité de ces globules rouges humains. - La moelle osseuse et la rate seront récupérées. Ces organes, cruciaux pour le fonctionnement du système sanguin, seront analysés afin d'évaluer la prise de greffe et leur capacité à produire toutes les cellules présentes dans le système sanguin.

Remplacement

Le projet consiste à évaluer notre stratégie thérapeutique sur un organisme entier car il n’est pas réalisable de reproduire en laboratoire, la complexité d’un organe comme la moelle osseuse, ainsi que la complexité du système sanguin, notamment en termes de prolifération et de différenciation en différents types de cellules sanguines.

Réduction

Dans le but de limiter l'utilisation d'animaux dans ce projet, nous avons évalué diverses stratégies visant à corriger ce défaut génétique sur des cellules souches sanguines humaines en laboratoire. Les quatre meilleures stratégies ont été retenues pour leur efficacité et seront testées sur modèle animal. Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, nous avons estimé le nombre minimal d'animaux permettant de tester et de conclure sur l'efficacité de nos stratégies. Cette démarche s'appuie sur les taux de réussite de la prise de greffe issus d'une référence établie. Notre objectif est d'atteindre une prise de greffe similaire à ce modèle mentionné. Afin de viser ces résultats, les calculs statistiques conduisent à estimer que 8 souris par groupe sont nécessaires. Ainsi, notre plan prévoit l'utilisation de 8 souris par groupe, totalisant 400 souris sur 5 ans, tout en visant des résultats scientifiquement robustes.

Raffinement

Les souris, présentant un système immunitaire affaibli, seront placées dans un environnement exempt de pathogènes. Après le traitement chimiothérapeutique et la greffe des cellules, l'état général des souris (apparence, posture, comportement...) ainsi que leur poids seront surveillés tous les deux jours pendant 20 jours. Les procédures expérimentales potentiellement inconfortables (greffe des cellules corrigées et prélèvement sanguin pour suivre la prise de greffe) seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de minimiser le stress et l'inconfort des animaux. En cas d’inconfort trop important, les procédures seront interrompues.

Choix des espèces

Pour évaluer l’efficacité de nos stratégies, nous sommes obligés de réaliser des études sur l’animal, car la capacité de greffe ainsi que la reconstitution et la différenciation complète du système sanguin en différentes cellules sanguines ne peuvent pas être reproduites par des modèles cellulaires en laboratoire. De plus, seule l’utilisation d’animaux peut nous permettre d’observer les éventuels effets secondaires sur le long terme de notre traitement au niveau de l’ensemble des organes. Pour ce faire, l’utilisation d’un modèle murin permettant la greffe de cellules humaines est requis. Les animaux seront greffés à l’âge adulte, de plus de 8 semaines. L'âge des animaux receveurs pour obtenir et conclure sur une efficacité optimale de la greffe des cellules souches sanguines dans la moelle osseuse se situe à 16 semaines.