Recherche appliquée

8 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à trois injections de virus ou de vésicules extracellulaires, la moitié une greffe de cellules tumorales, une partie des injections répétées d'immunothérapie sur trente et un jours, avec prélèvements de sang, pour caractériser la réponse immunitaire à ces candidats médicaments anticancéreux. Le porteur indique que les souris greffées peuvent voir leur état s'altérer (prostration, amaigrissement) et que les injections répétées sont source de stress. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour étudier ces processus complexes, sans détailler de test comportemental au-delà du suivi clinique.

Objectifs

Le cancer est la deuxième cause de décès dans les pays développés après les maladies cardiovasculaires. Les traitements conventionnels de nombreux cancers tels que la radiothérapie, la chimiothérapie et la chirurgie ont démontré des limites d’efficacité nécessitant un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les virus ou les vésicules extracellulaires (EV) libérées par des cellules infectées par un virus sont une nouvelle classe d’agent thérapeutique pouvant être une alternative au traitement des cancers. Les virus candidats vont servir de vecteurs pour permettre l’expression d’agents thérapeutiques et bioactifs au sein des tumeurs pour lesquelles il y a un fort besoin médical en clinique humaine. Sachant que le développement clinique de ces virus prévoit de les combiner avec de l’immunothérapie afin de potentialiser l’activité anti-tumorale, le projet se propose d’explorer dans les modèles murins les combinaisons de ces virus (ou EV) avec des traitements d’immunothérapie pour le traitement de cancers de différentes origines. Le but de ce projet sera d’évaluer l’effet sur le système immunitaire des virus candidats-médicaments en association ou non avec de l’immunothérapie. Ce projet vise à déterminer la production et l‘efficacité du médicament apporté par les vecteurs viraux et mettre en évidence la qualité de la réponse immunitaire suite à l’injection d’un virus ou EV en combinaison ou non avec un produit d’immunothérapie. Les données générées nous permettront d’améliorer notre compréhension des mécanismes d’action dans un organisme complexe et d’envisager le développement de ce candidat en déterminant sa chronologie d’action et son efficacité.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à caractériser la réponse immunitaire suite à l’injection de virus recombinants ou de vésicules extracellulaires de cellules infectées en combinaison ou non avec des produits d’immunothérapie. Il s’agit de mieux comprendre l’impact de l’injection de vecteurs viraux sur le type de cellules immunitaires recrutées dans l’organisme et le microenvironnement tumoral. Cette connaissance devrait nous permettre de mettre en place de nouvelles thérapies anti-cancéreuses chez l’Homme.

Procédures

Toutes les souris recevront au maximum 3 injections de virus. Chaque injection sera réalisée sur souris vigile mais geste rapide de l’ordre de la minute. Les injections seront séparées de 2 jours ou 8 jours maximum selon le virus ou EV candidat. La moitié des souris recevra une greffe de cellules qui sera effectuée sur souris vigile, durée environ 1 minute. 3840 souris recevront des injections de produits d’immunothérapie qui seront réalisées sur souris vigile, durée des injections environ 1 minute, maximum 3 injections par semaine durant 31 jours maximum. Sur toutes ces souris, lorsque cela sera nécessaire, il sera possible de prélever du sang. Trois prélèvements maximum sont envisagés à raison de 1 prélèvement maximum par semaine. Cette intervention sera de courte durée de l’ordre de la minute. Elle se fera sur souris anesthésiées ou vigiles.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu d’observer de nuisances chez la souris naïve injectée avec des virus ou EV car ceux-ci n’ont pas donné de signes de toxicité dans les études antérieures. Les souris greffées avec des cellules tumorales en sous-cutanée pourront potentiellement voir leur état général s’altérer avec des signes cliniques d’affaiblissement (prostration, poils hirsutes, amaigrissement…) Les injections répétées chez la souris peuvent également être source de stress et d’angoisse mais tout est mis en œuvre pour limiter cette nuisance (gestes rapides inférieurs ou égaux à 1minute par du personnel formé, utilisation tunnel de change, …). Le prélèvement de sang peut générer un stress et de la douleur mais le geste sera de courte durée (environ 1 minute) et le stress que transitoire. Une anesthésie pourra être réalisée. On ne peut pas exclure un effet secondaire des produits d’immunothérapie seuls ou en combinaison avec nos virus ou EVs. Si c’est le cas on peut s’attendre à une perte de poids transitoire ou un effet sur le comportement mais les doses seront choisies en fonction des données pharmacologiques publiées ou obtenues antérieurement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes (organes lymphoides et tumeur s'il y a lieu).

Remplacement

L’étude de l’effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que l’oncologie et le système immunitaire ne peut se faire sans l’utilisation de modèles animaux. En effet, des mécanismes complexes sont mis en place dans la réponse immunitaire et la croissance tumorale. Aucune alternative non animale n’est encore connue à ce jour permettant le remplacement.

Réduction

Avant d’être testés chez l’animal, les virus-candidats médicaments auront été évalués in vitro sur des modèles cellulaires de tumeurs humaines et murines établies et caractérisées, ainsi que dans des cellules primaires (non tumorales) pour sélectionner les virus candidats médicaments ayant une activité antitumorale et ne présentant pas de cytotoxicité. Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation des expériences a été déterminé en se basant sur les résultats obtenus lors de nos expériences antérieures. Nous avons retenu et validé le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats fiables et robustes. Les virus (ou EV) qui ne devraient pas avoir une activité suffisante et concluante ne seront pas testés ultérieurement. Leur étude sera stoppée.

Raffinement

Tout au long de leur vie, une attention particulière est portée au bien-être des animaux en particulier par un enrichissement de leur milieu de vie (matériel de nidification : bâtonnet et carré de coton dans chaque cage) qui leur permet d’assouvir les comportements liés à leur espèce. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant toute la durée des expérimentations, dans le but de préserver les interactions sociales entre congénères. A la réception des souris une phase d’acclimatation de 15 jours est prévue. Durant la première semaine les souris seront laissées dans leur nouvel environnement afin qu’elles se familiarisent avec celui-ci. Puis, au bout de 8 jours, l’expérimentateur habituera l’animal à la contention et aux gestes utilisés. L’utilisation d’un tunnel de change permettra également de réduire le stress et l’angoisse chez l’animal. La réalisation par des techniciens rompus à ses manipulations garantissent la bonne reproductibilité des expériences et un suivi optimal du bien-être des animaux. Les effets dus au traitement seront surveillés et des critères d’interruption de l’expérimentation en fonction de l’aspect clinique des animaux (volume tumoral, l’apparence de la tumeur, l’évolution pondérale, l’apparence physique générale, le comportement) sont mis en place afin de limiter le stress et la souffrance des animaux. Enfin, lorsqu’un prélèvement de sang sera envisagé, le recours à l’anesthésie pourra supprimer la douleur et l’angoisse sera réduite grâce à des gestes rapides et maitrisés.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence en oncologie. Il s’agit de mammifères au système immunitaire assez proche de l’homme pour pouvoir utiliser des données générées dans une approche translationnelle valide. Il existe de nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires chez cette espèce. Animaux adultes de 4 à 5 semaines minimum (à la réception), soit 6 semaines minimum au début de l’étude (avec 2 semaines de stabulation). Six semaines est l’âge où le système immunitaire est considéré comme suffisamment mature pour la réalisation de l’étude

102 poulets mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont placés en cage individuelle pendant sept jours et nourris avec des variétés de sorgho, pour comparer leur digestibilité et tester des méthodes de collecte des fientes alternatives à la cage. Le porteur indique que le changement d'aliment peut provoquer une néophobie alimentaire et que l'isolement en cage réduit les interactions sociales et peut modifier le comportement. Il affirme qu'observer les interactions entre l'aliment et le tube digestif rend le modèle animal incontournable, et prévoit la mise à mort des poulets pour analyser leurs contenus digestifs.

Objectifs

Aujourd’hui les réflexions sur la transition agro-écologique des élevages remettent en question l’utilisation de plantes fortement consommatrices d’eau comme le maïs ou importées comme le soja, toutes deux utilisées pour l’alimentation animale. De nombreuses recherches sont menées pour trouver de nouvelles matières premières susceptibles de permettre à l’alimentation animale une relocalisation des productions plus proches des élevages et une amélioration de la durabilité des systèmes. Dans ce contexte, le sorgho apparait être une plante d’intérêt pour ces objectifs car moins consommatrice d’eau et possédant des caractéristiques nutritionnelles proches du maïs. Ce projet vise donc en premier lieu à tester, dans une étude préliminaire, chez le poulet mâle, la digestibilité de 5 variétés de sorgho issus de la sélection végétale. Cette expérience permettra la sélection des deux variétés qui seront testées dans un protocole plus large d’évaluation de l’efficacité de nouvelles stratégies alimentaires incorporant du sorgho. En même temps que ce premier objectif, nous souhaitons également profiter de cette expérimentation pour développer de nouvelles méthodes d’évaluation de la digestibilité chez l’oiseau, alternatives à l’utilisation de la cage individuelle, toujours méthode de référence aujourd’hui pour ce type d’étude.

Bénéfices attendus

Ce projet présente deux grands bénéfices : - le premier sera de permettre l’évaluation de la digestibilité de nouvelles variétés de sorgho enrichit en protéïne susceptibles d’être intéressantes pour l’alimentation des volailles pour remplacer l’utilisation de maïs et de soja dans les régimes alimentaires. Pour cela des animaux en cage métabolique recevront différentes variétés de sorgho ou un régime contrôle et leur digestibilité sera comparée. - le second sera d’évaluer différents protocoles de mesure de la digestibilité fécale qui passe par la collecte de fientes. Pour cela les animaux en cage recevant l’alimentation témoin seront doublement utilisés car les coefficients de digestibilité fécale (matière sèche, azote, énergie…) seront comparés à ceux obtenus avec des systèmes alternatifs de collecte de fientes au sol qui visent à s’affranchir de l’utilisation de la cage dans ces procédures. Ainsi nous évaluerons si des contaminations des fientes par la litière (contenant de l’azote et en grande partie constituée de matière sèche) entraine un biais de mesure. Ce protocole permettra aussi d’évaluer si des données obtenues sur des lots d’animaux en parquet sont des mesures comparables à la mesure de référence actuelle qui est la cage individuelle. Cette expérience permettra d’orienter nos choix pour aller vers le développement d’un système de collecte alternatif pour la réalisation d’expérience de digestibilité des aliments.

Procédures

Les animaux seront soumis à un changement d’aliment allant d’un aliment adapté à l’âge des jeunes poussins vers un aliment couvrant leur besoin de croissance à partir de leur 10ème jour de vie. Ces aliments seront ceux contenant du sorgho. Les animaux seront placés en cage individuelle pendant 7 jours pour permettre la réalisation des procédures de digestibilité des aliments contenant du sorgho.

Impact sur les animaux

Le changement d’aliment entre l’aliment de démarrage et l’aliment contenant du sorgho pourra entrainer un stress de type néophobie alimentaire dû à la modification de la présentation de l’aliment. La mise en cage provoquera une réduction de la possibilité de déplacement par rapport à l’hébergement en parquet. La mise en cage individuelle entrainera une réduction des interactions sociales qui pourra engendrer un stress susceptible de se traduire par une modification du comportement alimentaire.

Devenir

Les 102 poulets mise en cage seront euthanasiés pour permettre la récupération des contenus digestifs dont la composition sera analysée à la suite de cette expérience.

Remplacement

La caractérisation de la digestibilité des matières premières nécessite de pouvoir observer les interactions entre cette matière et le tube digestif de l’organisme cible. Par conséquent, il n’est pas possible de s’affranchir ici du modèle animal.

Réduction

Au total 102 individus sont requis pour ce projet Nos effectifs ont été calculé sur la base de données publiées dans des journaux scientifiques reconnues. Nous avons estimé que 102 animaux sont nécessaires pour tester la digestibilité des variétés de sorgho que nous souhaitons tester. Il est important de noter que notre effectif total inclus aussi un taux de mortalité des poussins de 1 jour de 5%. Cette valeur est classiquement observée lors de la mise en place d’élevage de poussins ce qui rajoute 5 animaux à nos effectifs. Sur l’ensemble de ces animaux, seuls 102 sont soumis à une demande de saisine du comité d’éthique car seuls ces animaux seront hébergés en logement individuel

Raffinement

Raffinement de l’hébergement la phase de vie où les animaux sont élevés en parquet au sol : Les animaux seront élevés en groupe et au sol dans un bâtiment d’élevage standard enrichi avec des perchoirs et des mangeoires permettant aux animaux de grimper et de se cacher. Raffinement de l’hébergement la phase de vie où les animaux sont élevés en cage individuel : La période de mise en cage des animaux a été limiter au maximum. En effet, nous avons réduit cette période à 7 jours contre 10 jours classiquement observé dans un protocole de digestibilité. La disposition des cages permettra de maintenir un contact visuel et olfactif. Des contacts tactiles sera toujours permis avec les plus proches voisins. Ces cages seront enrichies avec une balle en plastique pour proposer aux individus un élément de jeu durant cette phase d’hébergement. Raffinement des procédures expérimentales : Le risque majeur au cours de ce protocole est d’observer une réduction du comportement alimentaire du soit à l’introduction du sorgho dans l’alimentation (néophobie alimentaire) soit au stress possible associé à la mise en cage Pour limiter le développement d’une néophobie alimentaire au moment de l’introduction des aliments contenant du sorgho (modification de la couleur, de la dureté des granulé) une période de transition alimentaire sera effectuée sur 12 jours afin de permettre une introduction progressive des aliments contenant du sorgho. Pour observer l’impact de la mise en cage sur le comportement des oiseaux, la prise alimentaire sera surveillée par la pesée des mangeoires des animaux afin d’évaluer leurs consommations d’aliment. Si un animal reste prostré plus de 24h et cesse de s’alimenter et de s’abreuver alors il sera euthanasié.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser dans cette étude des poules domestiques de 1 jour à 26 jour car nous nous intéressons à la digestibilité de nouvelles variétés de sorgho en vue d’une incorporation de cette céréale dans l’alimentation des volailles et que nous souhaitons développer de nouvelles méthodes de mesure de la digestibilité pour cette espèce. Cette expérience étant une présélection de deux variétés sur cinq de sorgho en vue d’une expérience de plus grande envergure nous avons fait le choix de n’utiliser que des mâles.

140 chiens vont être utilisés, gardés en vie et réutilisés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de six semaines, les chiots subissent des prises de sang répétées, des biopsies de peau et jusqu'à trois biopsies intestinales par ouverture de l'abdomen sous anesthésie générale, ainsi qu'une sensibilisation à la cacahuète poursuivie jusqu'à l'apparition d'un eczéma. Le porteur décrit l'induction volontaire d'une allergie alimentaire et d'une réaction cutanée comme la "preuve" recherchée, et indique un suivi sur deux ans. Il affirme que le chien est le "modèle idéal", seule espèce développant une dermatite atopique spontanée comparable à celle de l'humain.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont multiples : 1) Déterminer le rôle et les mécanismes de sensibilisation à travers la peau d’allergènes alimentaires chez le chien. 2) Evaluer la possibilité de rétablissement de la tolérance aux allergènes alimentaires chez les chiens allergiques. 3) Explorer les risques de rupture de la tolérance, induite par contact précoce digestif, par pénétration des allergènes par voie cutanée chez les chiens tolérants. 4) Déterminer si des modifications des micro-organismes présents au niveau digestif ou cutané, sont associées à la sensibilisation à des allergènes alimentaires et à l’allergie alimentaire. 5) Evaluer si la composition des micro-organismes présents au niveau digestif ou cutané est modifiée par la sensibilisation à des allergènes alimentaires ou l’allergie alimentaire, et déterminer si ces modifications sont réversibles. 6) Identifier des biomarqueurs de la sensibilisation à des allergènes, présents dans la couche cornée. 7) Comparer ces résultats avec les mêmes paramètres évalués à partir des modèles expérimentaux de dermatite atopique canine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront, en plus de la connaissance scientifique sur les mécanimes pathogéniques de ces allergies (dermatite atopique et allergie alimentaire), d’en améliorer la prise en charge. En effet, aujourd’hui, l’éviction alimentaire (croquettes hypo / anallergéniques strictes) semble la seule méthode de diagnostic fiable d’allergie alimentaire, qu’elle soit associée à une dermatite atopique ou pas. Nous souhaitons mettre en évidence des biomarqueurs diagnostiques dans le sang et dans la peau (désensibilisation par immunothérapie) qui évitera la lourdeur d’un régime d’éviction alimentaire et de nombreux dosages d’IgE sériques inutiles car non validés et permettront : 1) d’accélerer la démarche diagnostique et donc la prise en charge de cette dermatose, 2) de diminuer les frais pour les propriétaires car ces croquettes sont très onéreuses. Ces biomarqueurs pourront églement servir lors du suivi thérapeutique. De plus, le modèle actuel d’allergie alimentaire étudié est un modèle murin, très éloigné de l’Homme. Il serait intéressant de montrer une similarité avec notre modèle d’allergie alimentaire canin car le chien est un modèle plus pertinent, de part la proximité qu’il partage avec l’Homme : environnement, alimentation, pression allergénique.

Procédures

Chez chiots (actes étalés sur une période d’environ 33 semaines) : écouvillons cutanés et prélèvements de selles (à 5 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), prises de sang (à 8 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), biopsies cutanées (à 4 reprises, avec 3 biopsies à chaque fois, sous anesthésie locale, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 20 minutes à chaque fois), biopsies intestinales (à 3 reprises, avec 2 biopsies à chaque fois, sous anesthésie générale par ouverture de l’abdomen par une incision large, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 heure à chaque fois entre l’induction de l’anesthésie, l’acte chirurgical et le réveil des animaux). Un test cutané explorant la sensibilisation à divers allergènes sera également réalisé (sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 15 minutes). Application cutanée de cacahuète ou administration par voie orale en fonction des groupes, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines, avec rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés pour certains groupes (sur animal vigile, la durée de l’acte est d’environ 15 minutes par animal à chaque fois). Chez chiens (actes étalés sur une période d’environ 7 semaines) : prises de sang (à 2 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), prélèvements partie superficielle de la peau (à 2 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), biopsies cutanées (à 2 reprises, avec 3 biopsies à chaque fois, sous anesthésie locale, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 20 minutes à chaque fois). Application cutanée de l’allergène après rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines (sur animal vigile, la durée de l’acte est d’environ 15 minutes par animal à chaque fois). Injections sous-cutanées d’allergène 2 fois par mois (sur animal vigile, la durée de l’acte est d’environ 30 seconde par animal à chaque fois).

Impact sur les animaux

Prises de sang au début de la sensibilisation, puis en fin de sensibilisation 42 jours plus tard, puis environ 15 jours plus tard lors du déclenchement de l’allergie, puis le lendemain, puis environ 3 mois plus tard, puis le lendemain, puis environ 3 mois plus tard, puis le lendemain. Application cutanée de cacahuète ou administration par voie orale en fonction des groupes, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines (avec rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés pour certains groupes). Puis, environ 6 mois plus tard, sensibilisation à travers la peau 2 fois par semaine jusqu’à obtention d’un eczéma lors de la phase de rupture de la tolérance. Biopsies cutanées réalisées par voie sous-cutanée en début de sensibilisation, puis 42 jours plus tard en fin de sensibilisation, puis environ 15 jours plus tard lors du déclenchement de l’allergie, puis environ 3 mois plus tard lors du rétablissement de la tolérance, puis environ 3 mois plus tard lors de la rupture de la tolérance. Biopsies intestinales réalisées lors du déclenchement de l’allergie, puis environ 3 mois plus tard lors du rétablissement de la tolérance, puis environ 3 mois plus tard lors de la rupture de la tolérance. Ces biopsies impliqueront donc une ouverture de l’abdomen par une incision large sous anesthésie générale. La possibilité d’une éruption se manifestant par des plaques rouges au niveau des lèvres, d’un gonflement de zones de tissu sous la peau, voire d’une réaction allergique importante est attendue lors de la phase de déclenchement (administration par voie orale de la cacahuète) et cette réaction sera la preuve de l’allergie alimentaire induite par sensibilisation transcutanée. Pour les témoins positifs : réaction inflammatoire de la peau modérée possible au site d’injection se résolvant de façon spontanée.

Devenir

Après chaque procédure, les animaux seront gardés en vie, car les procédures ne devraient pas impacter l'état de santé des animaux sur le long terme. Le vétérinaire et le directeur d'étude valideront systématiquement le devenir des animaux, en tenant compte de leur utilisation, des leur état de santé, et des possibilités éventuelles de réutilisation. Certains animaux pourront entrer dans un programme d'adoption, en tenant compte de leur utilisation, des leur état de santé, des possibilités éventuelles de réutilisation, et de leur comportement. Il n'est pour le moment pas possible d'anticiper le nombre d'animaux qui seront adoptés.

Remplacement

Une première étude in vitro sur peau reconstruite permet de caractériser l’inflammation induite par le contact avec la cacahuète, mais il n’est pas possible de réaliser la phase de déclenchement (qui consiste à administer l’allergène par voie digestive), d’où la nécessité d’utiliser des animaux vivants. Ce projet repose sur l’étude de la voie d’administration de l’allergène et de la comparaison entre l’induction de tolérance digestive versus la sensibilisation par voie transcutanée, qui n’est possible que sur animaux vivants. Enfin, le projet utilise des animaux vivants car il fait intervenir des réactions locales, régionales et générales, pour lesquelles aucune méthode alternative n’est disponible. Pour atteindre les objectifs du projet, les résultats seront analysés statistiquement.

Réduction

L’étude repose sur la formation de 10 groupes de chiots. Le nombre de chiots nécessaires pour une puissance statistique satisfaisante est de 90. La comparaison avec des modèles expérimentaux de dermatite atopique se fera sur 50 chiens pour avoir un nombre assez proche de chiots et des résultats interprétables.

Raffinement

Période d’acclimatation systématique de 2 à 3 semaines avant le premier acte technique. Animaux hébergés en groupe et avec des jouets. Des points limites adaptés permettront de sortir un animal de l’étude afin de limiter la douleur à son minimum. Actes techniques réalisés par du personnel formé et habitué à travailler avec les chiens, toujours accompagnés de renforcement positif (calins, croquettes). Présence de vétérinaires et surveillance accrue des animaux lors du déclenchement de l’allergie alimentaire. Pour les chiots, des lampes chauffantes seront installées. Paramètres d’ambiance des salles surveillés avec possibilité de modifier la température, afin d’optimiser le bien-être des chiots. Les chiots seront en présence de leur mère jusqu’au sevrage complet. Biopsies cutanées réalisées sous anesthésie locale et biopsies intestinales réalisées sous anesthésie générale, avec observation quotidienne des sites après interventions et prise en charge de la douleur.

Choix des espèces

Chez le chien, l’allergie alimentaire est souvent évoquée, exceptionnellement confirmée, car surtout mal comprise, en particulier chez les chiens souffrant de dermatite atopique. C’est la seule espèce qui présente une dermatite atopique comparable (sur plans cliniques et pathogéniques) à celle de l’Homme. Ce modèle permettra de vérifier les données obtenues uniquement dans le modèle murin expérimental et permettra d’approfondir les connaissances de la dermatite atopique du chien et d’explorer le rôle des allergènes alimentaires, en particulier la voie de pénétration de l’allergène. Utilisation d’animaux vivants car intervention de réactions locales, régionales et générales, pour lesquelles aucune méthode alternative n’est disponible. Le chien est l’espèce cible mais le projet peut, par la suite, servir à l’étude de l’allergie alimentaire chez l’Homme. Le chien est l’espèce idéale pour réaliser un modèle d’allergie alimentaire et de dermatite atopique (de plus, c’est la seule espèce pouvant développer une dermatite atopique de manière spontanée). L’étude s’interesse à une sensibilisation de chiots dès l’âge de 6 semaines pour la comparaison avec l’Homme (les bébés se sensibilisant par voie transcutanée dès la naissance et ayant une diversification alimentaire le plus tôt possible pour induire une tolérance, c’est-à-dire dès 2 mois). Il est donc choisi de commencer à sensibiliser les chiots dès qu’ils commencent une diversification alimentaire et ne se nourrissent plus exclusivement de lait maternel. Ce phénomène se produit à l’âge de 6 semaines chez le chien. Ils seront suivis pendant 2 ans pour la sensibilisation, l’induction de tolérance, la rupture de la tolérance acquise et l’immunothérapie (ce qui renforce le besoin d’animal jeune). Les chiens permettant l’établissement d’un modèle de dermatite atopique seront des jeunes adultes qui seront ainsi comparés aux chiots ayant grandi et pour lesquels l’étape de déclenchement aura eu lieu. Ils présentent, à cet âge, un juste équilibre entre réponse physiologique et acclimatation en étude.

324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous la peau, puis des injections intrapéritonéales deux fois par semaine pendant quatre semaines, pour évaluer l'activité antitumorale d'anticorps polyclonaux. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une douleur si elle nécrose ou s'ulcère, et prévoit des points limites et une mise à mort en cas de signes cliniques. Il affirme que les études sur l'animal restent "indispensables" pour valider l'activité des traitements dans un environnement physiologique, malgré des tests in vitro disponibles.

Objectifs

L’immunothérapie antitumorale utilise les acteurs du système immunitaire pour s’attaquer aux cellules cancéreuses. L’objectif de ce projet est d’évaluer l'activité antitumorale d'anticorps polyclonaux dans des modèles murins de cancer.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de confirmer l’activité antitumorale des anticorps polyclonaux et d’offrir une alternative thérapeutique aux patients dans des pathologies où le besoin médical est important.

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur humaine via injection en sous-cutanée sous anesthésie. Le traitement sera effectué par injection en intrapéritonéal (2 fois par semaine pendant 4 semaines) sur animaux vigiles. L'anesthésie pour l'injection en sous-cutanée sera de courte durée :moins de 5 min par souris. Pour les injections en intrapéritonéal, la manipulation des souris n'excédera pas 1 min.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux sous-cutanés sont considérés comme des procédures modérées. Ils peuvent provoquer de la douleur si la tumeur nécrose ou s’ulcère (points limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal. Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. L’état clinique et le poids des souris seront suivis 3 fois par semaine. Une contention légère sera faite sur les souris pour l'administration intrapéritonéale par du personnel qualifié afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Cette manipulation ainsi que la piqure ne dureront que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères.

Devenir

Après chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.

Remplacement

Si des tests in vitro sont utilisés pour évaluer l'activité des nouvelles thérapies, les études chez l'animal restent indispensables pour valider leur activité dans un environnement physiologique. Ces études permettent aussi de repérer une éventuelle toxicité des traitements et éclairent sur les modes d'action engagés.

Réduction

Le choix de 12 animaux par groupe est le nombre nécessaire et suffisant pour nous permettre de faire des analyses statistiques robustes.

Raffinement

Les souris seront hébergées selon la règlementation en vigueur avec des enrichissements afin de réduire l’angoisse, éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. Des signes cliniques et points limites ont été définis afin de monitorer objectivement la soufrance des animaux. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux ou par injection d’analgésique selon les signes cliniques observés. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des frisottis sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher.

Choix des espèces

Les modèles xénogreffes décrits dans ce projet ont été validés et caractérisés dans des publications. Les animaux utilisés sont des souris immunodéficientes. Ces souris sont très largement utilisées pour la mise en place des modèles xénogreffes. Nous travaillerons avec des souris femelles (le sexe des animaux n'a pas d'impact sur les résultats mais les souris femelles étant plus légères elles permettent d'utiliser moins d'anticorps) jeunes adultes (la prise tumorale est plus homogène dans cette tranche d’âge).

224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein triple négatif humain, puis une injection de nanoparticules dans la tumeur suivie de séances d'irradiation aux rayons X sous anesthésie, réparties entre deux établissements, pour tester l'efficacité de cette combinaison. Le porteur indique une gêne à la mobilité et une nécrose tumorale possibles, ainsi qu'un stress lié aux contentions répétées. Il affirme que "la règle de remplacement ne peut être appliquée" et que le développement doit "impérativement" se faire chez l'animal, une présélection in vitro étant toutefois prévue.

Objectifs

Le cancer du sein est le plus fréquent des cancers chez la femme et le cancer du sein triple négatif parmi les plus agressifs, avec souvent des échecs aux thérapeutiques classiques du cancer. Le pronostic de ce type de cancer est mauvais et la recherche continue activement pour trouver des nouvelles thérapeutiques. Chez ces patientes, il est important de disposer de médicaments améliorant la survie et leur qualité de vie. Une thérapeutique innovante d’irradiation sélective à basse dose grâce aux rayons X a vu le jour. Elle permet de déclencher un processus de mort cellulaire en cascade grâce à des nanoparticules. Les nanoparticules sont spécifiquement conçues pour agir à la fois comme produit de contraste et agent thérapeutique. Un modèle animal murin pour le cancer du sein triple négatif sera utilisé afin d’investiguer 2 nanoparticules innovantes, pour évaluer l'efficacité thérapeutique après irradiation. Le projet est mené entre 2 établissements utilisateurs .Une injection intra tumorale de la nanoparticule sera réalisée dans des conditions de concentration du produit et de dose d’irradiation restreints, suite de précédentes études. Le développement et l’optimisation doit impérativement se faire chez l’animal pour pouvoir assurer la translation des résultats à terme chez l’être humain. La règle de remplacement ne peut être appliquée.

Bénéfices attendus

Chez les patientes atteintes d’un cancer du sein triple négatif , plusieurs stratégies de traitement existent telles que la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l'immunothérapie, mais les résultats sont souvent insuffisants. Au stade localement avancé ou métastatique, le besoin médical, en première ligne (chez les patientes n’ayant pas précédemment reçu de chimiothérapie en situation métastatique), est actuellement mal couvert par les alternatives disponibles. De plus, même si dans certains cas la survie à cinq ans après traitement peut être encourageante, les conditions de vie des patientes se dégradent du fait des effets secondaires des thérapies. De nouveaux traitements spécifiques, moins toxiques, plus puissants et surtout des approches thérapeutiques combinatoires constituées de différentes modalités et donc complémentaires les unes des autres représentent une approche extrêmement prometteuse pour améliorer la survie et la qualité de vie des patients atteints de cancer. L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité thérapeutique de cette nouvelle thérapie et de prouver que l'approche combinatoire offre un bénéfice maximal avec un profil de toxicité acceptable pour les animaux, ce qui justifierait les bases d'études cliniques chez l’homme. A court terme, une efficacité antitumorale démontrée au stade pré clinique dans cette méthode de traitement innovante, permettrait éventuellement d’envisager de futurs essais chez l’homme.

Procédures

EU 1 Anesthésie locale (1x, 30sec): identification des souris _Contention 3x/semaine 25sec- mesure de la taille/pied à coulisse EU 1 et 2 _ EU 2Injection intratumorale sous cutanée 1x 100µL 30sec_Procedure 1 : Injection intratumorale de nanoparticule (1injection, 30sec)_Irradiation : 1x/sem ou 4x/sem_ Anesthésie générale selon schéma expérimental d'irradiation: soit 1 anesthesie/jour soit 4anesthesies/4j._Procedure 2 : selon précédents résultats, choix schéma irradiation et nanoparticule (en 1x /sem ou en 4x/sem) en variant dose et concentration._Anesthésie générale selon schéma expérimental d'irradiation: soit 1 anesthesie/jour soit 4anesthesies/4j.

Impact sur les animaux

Dans de très rares cas, un phénomène de gêne à la mobilité peut être observé après injection des cellules cancéreuses. Dans de rares cas, une nécrose de la tumeur peut apparaitre . Douleur lors de l'injection intratumorale du traitement ( douleur inférieure à celle procurée par un traitement anesthésique + contention) . Les contentions multiples (lors des mesures au pied à coulisse, des anesthésies, des pesées) de l’animal peuvent générer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, car les tumeurs seront prélevées pour des analyses histologiques.

Remplacement

Une présélection des nanoparticules sera effectuée grâce à des expériences in vitro pour exclure les combinaisons de traitement inefficaces et éviter ainsi des expériences animales inutiles. Pour confirmer l'efficacité in vivo et assurer la possible translation chez l'humain à terme, le modèle murin est nécessaire car les expériences in vitro ne peuvent pas reproduire entièrement le l'environnement complexe de la tumeur

Réduction

La conception des expériences et les procédures par étapes conditionnelles permettent de réduire le nombre d'animaux calculés à l'aide d'un test statistique . De plus, nous testons uniquement 2 nanoparticules sur 4 intialement produites ; ce choix a été basé sur l’ensemble des résultats obtenus par nos précédentes expériences in vitro et celles de nos collaborateurs

Raffinement

Une anesthésie locale est prévue pour l’identification des souris. Une anesthésie générale est prévue lors des sessions d'irradiation avec l’imagerie. De la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. Les animaux seront hébergés par groupe de 5. Une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant l’entrée des animaux en protocole . Surveillance des points limites, et des souffrances possibles, via une grille de scoring établie avec la SBEA. Mesures de raffinement prévues pour le transfert entre les EU ( 5 maximum par cage pour le transport, trajet court,alimentation, abreuvement, aération des cages)

Choix des espèces

Le modèlede cancer du sein triple négatif par greffe de lignées cellulaires humaines de sein immortalisées est un des modèle le plus utilisé pour les études visant à étudier l’efficacité des thérapeutiques anticancéreuses. Les souris immunodéprimées permettent de greffer des tumeurs humaines, ce qui permet de tester la réponse des tumeurs d'origine humaine. Les greffes de tumeurs humaines représentent des modèles cliniquement pertinents de cancer humain, qui simulent de nombreuses caractéristiques du cancer, notamment un microenvironnement tumoral distinct avec des structures vasculaires mal organisées et des régions de cellules hypoxiques, ce qui affecte négativement la sensibilité des cellules cancéreuses aux radiations. Greffe chez des athymic nude femelles à l’âge de 6-7 semaines, ce stade permet d’optimiser la prise de la greffe

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, on leur pratique deux incisions dorsales pour insérer des membranes synthétiques sous la peau, seules ou avec des cellules, afin d'évaluer si ces implants favorisent la croissance de vaisseaux sanguins en vue d'une future greffe rétinienne. Le porteur indique des douleurs possibles après incision et un risque d'infection ou d'inflammation au site d'implantation. Il décrit des travaux préalables in vitro et affirme qu'aucun système ex vivo n'intègre les phénomènes de vascularisation d'un greffon, rendant les expériences in vivo "nécessaires".

Objectifs

La barrière hémato-rétinienne externe (BHRE) est la barrière la plus externe de l'oeil, protégeant ce dernier, notamment des infections. Dans de nombreuses pathologies de la rétine, comme la dégénérescence maculaire ou rétinopathie diabétique, la BHRE est endommagée conduisant à une perte irrémédiable des cellules la constituant, menant à terme à une perte de la vision. Plusieurs thérapies ont été envisagées, notamment une thérapie cellulaire visant à implanter de nouvelles cellules rétiniennes saines afin de reconstituer le tissu malade. Cependant, ces stratégies n'incluaient pas, au sein de l'implant, de pré-vascularisation. Cette dernière consiste en la formation in vitro de portions de vaisseaux sanguins, au sein d'un implant, qui peuvent ensuite être reliées par le corps humain pour former des vaisseaux fonctionnels. Des études ont récemment montré que la pré-vascularisation est nécessaire pour une bonne intégration et une bonne irrigation sanguine du greffon ainsi qu'à une survie optimale des cellules implantées. L'objectif global de notre projet est donc de proposer un nouveau greffon incluant à la fois les cellules rétiniennes et une pré-vascularisation. Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des membranes en polysaccharides qui sont des molécules naturelles organisées en de longues chaînes constituées à partir de différents types de sucres. L'objectif de cette étude in vivo est d'analyser si ces membranes sont propices à la croissance de vaisseaux sanguins dans le greffon pour garantir son irrigation et si la présence d'une pré-vascularisation des membranes grâce à l'ajout de cellules du système vasculaire permet une meilleure et plus rapide vascularisation de l'implant.

Bénéfices attendus

A travers ce projet, une nouvelle stratégie de thérapie cellulaire pourra être évaluée, en analysant le bénéfice de la pré-vascularisation de l'implant sur l'intégration du greffon chez l'hôte. Cette étude permettra d'évaluer la condition de pré-vascularisation optimale afin de conduire plus tard des implantations dans la rétine. A long terme, ce projet pourra permettre de proposer une nouvelle stratégie de thérapie cellulaire pour de nombreuses rétinopathies aujourd'hui sans traitement efficace.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique procédure menée sous anesthésie générale avec administration d'anti-douleur. Elle consiste à deux incisions cutanées au niveau dorsal, de chaque côté du dos, afin de créer deux poches sous-cutanées dans lesquelles seront placées les implants. Selon les conditions, les implants seront implantés seuls ou en présence de cellules. La procédure dure environ 10 minutes par animal (5-6 minutes pour l'épilation et 3-4 min pour l'implantation).

Impact sur les animaux

L'anésthésie réalisée pour les implantations sera faire par injection, pouvant induire un stress pour l'animal ainsi qu'une douleur au moment de la piqûre. Des douleurs peuvent être ressenties suite à l'incision et à l'implantation du greffon. De plus, même si les implants sont stérilisés puis conservés en milieu stérile et que les souris ont de bonnes capacités de cicatrisation de la peau, une infection pourrait être possible au niveau de l'incision. Enfin, une réaction inflammatoire est possible au niveau de l'incision au cours de la phase de cicatrisation, ainsi qu'au sein de l'implant, en réaction à l'implantation des cellules endothéliales et des péricytes.

Devenir

Pour les analyses prévues, nous avons donc besoin d'euthanasier les animaux à la fin de l'expérience. L'euthanasie sera effectué après anesthésie de l'animal. Le greffon sera alors explanté avec le tissu avoisinant (peau au-dessus et autour de l'implant).

Remplacement

Des études préliminaires in vitro ont été menées afin de montrer la possibilité de céllulariser les membranes. De plus, la cytotoxicité de la membrane a été évaluée in vitro et les résultats ont montré que les cellules ensemencées survivent durant plusieurs semaines sur les membranes. Afin d'évaluer la capacité de vascularisation de ces membranes, il n'existe cependant pas de système ex vivo permettant d'intégrer l'ensemble des phénomènes complexes à l'oeuvre dans les processus de vascularisation d'un greffon. Des expériences in vivo sont donc nécessaires.

Réduction

Des études in vitro ont permis d'optimiser la composition et la structure de la membrane ainsi que les protocoles utilisés afin d'ajouter les cellules dans la membrane afin de limiter le nombre de groupes à étudier chez l'animal, et donc de limiter le nombre d'animaux à utiliser. De plus, dans chaque animal, deux membranes seront implantées, de part et d'autre de la ligne médiane dorsale, afin de limiter le nombre d'animaux. En prenant en compte cet élément, le nombre minimum d’animaux à utiliser a été déterminé d’après le logiciel Invivostat: un nombre de 12 échantillons et donc de 6 animaux par groupe et par temps d'analyse est nécessaire pour assurer des résultats statistiquement pertinents.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un hébergement avec environnement enrichi et en groupe social, et seront surveillés quotidiennement par le personnel technique pour vérifier leur état de bien-être, avant et après la procédure. Pour réaliser la procédure, l'anesthésie se fera avec analgésie (buprénorphine) pour réduire la douleur durant la procédure et en post-opératoire. Après la procédure, les animaux seront surveillés tous les deux jours au cours des deux premières semaines par du personnel compétent grâce à une grille d'évaluation et la mise en place de points limites afin de surveiller la présence de potentiels effets secondaires potentiels de la procédure et de réduire les douleurs éventuelles.

Choix des espèces

Nous souhaitons conduire des implantations en sous-cutané chez la souris, modèle sélectionné grâce à l'importante vascularisation de la peau et aux bonnes capacités de re-cellularisation en sous-cutané, d'après des études reportées dans la littérature. De plus, nous souhaitons utiliser des souris immunodéficientes, c'est à dire qui possèdent un système immunitaire déficient, voire une absence de système immunitaire, afin de limiter la réaction inflammatoire après implantation. Nous utiliserons des souris adultes (environ 8 semaines) afin de maximiser les capacités de vascularisation.

958 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le modèle reproduit une ataxie héréditaire, les souris atteintes développant atrophie musculaire, troubles de la coordination et perte de poids avant une mort prématurée, aucun animal n'étant conservé au-delà de vingt-huit semaines. Elles subissent un prélèvement de queue pour génotypage, une injection intraveineuse d'un vecteur de thérapie génique sous anesthésie, parfois un prélèvement de sang, et huit tests comportementaux étalés sur dix jours, pour évaluer une protéine mitochondriale censée protéger les neurones. Le porteur renvoie l'application clinique à d'éventuelles études futures et affirme que la preuve d'efficacité "ne peut être obtenue" que chez des animaux malades.

Objectifs

Malgré les progrès de la génétique durant les dernières décennies, les maladies neurologiques héréditaires sont le plus souvent incurables. Il a été démontré que la progression des symptômes chez les patients est fréquemment associée à un déficit de la production d’énergie cellulaire. Dans les cellules, les structures responsables de la production de cette énergie sont les mitochondries ; elles sont considérées comme des centrales énergétiques et elles régulent des processus essentiels à la vie cellulaire, spécialement pour les neurones. En conséquence, nous avons émis l’hypothèse que préserver la fonction des mitochondries dans le système nerveux central chez des patients souffrant de pathologies neurologiques héréditaires serait une piste thérapeutique prometteuse pour aider les cellules nerveuses débilitées par la maladie. Une thérapie génique conduisant à la production abondante d’une protéine mitochondriale qui possède des propriétés intéressantes pour le fonctionnement neuronal est en cours de développement. Pour y parvenir, un vecteur comportant le gène correspondant à la protéine « candidate » a été injecté par voie intraveineuse chez des souris souffrant d’une maladie mitochondriale qui entraîne des troubles de l'équilibre, la coordination et la mémoire spatiale. Il a été montré des effets bénéfiques et durables de cette intervention sur les atteintes motrices et cognitives de ces souris. Encouragés par ces données, une thérapie génique avec cette protéine « candidate » sera testée dans un autre modèle de pathologie neurologique qui est également associé à un déficit de la production d’énergie, mais dont la cause génétique initiale ne concerne pas des gènes mitochondriaux. L’objectif sera de démontrer qu’en augmentant la quantité de cette protéine dans le système nerveux central, l’état de santé général de ces animaux sera préservé grâce à la diminution de leurs troubles moteurs et cognitifs. Si nous observons des bénéfices liés à la forte concentration de la protéine mitochondriale étudiée dans les neurones du modèle expérimental examiné, nous pourrions élargir les effets thérapeutiques à d’autres pathologies neurologiques héréditaires. In fine, une étude clinique pourrait être développée pour améliorer les conditions de vie des patients souffrant d'un éventail de maladies neurologiques.

Bénéfices attendus

Notre objectif scientifique est de prouver l'intérêt d'une thérapie génique entrainant l’augmentation d’une protéine mitochondriale possédant des propriétés de protection des neurones dans le cadre des maladies neurologiques héréditaires dont les symptômes s'aggravent suite à un déficit mitochondrial mais dont la cause génétique est au-delà des gènes mitochondriaux. Actuellement, les thérapies conçues pour ces patients ciblent l'anomalie génétique et non pas le déficit de la production d’énergie cellulaire ; ce qui ne garantit pas avec certitude une amélioration clinique même partielle. Notre stratégie consistera à réaliser une thérapie génique (traitement par modification d’un gène), à large spectre, permettant l’augmentation pérenne de la concentration d’une protéine à propriétés neuroprotectrices dans le système nerveux central. Cette protéine a déjà montré une efficacité incontestable dans un modèle expérimental dont les souris miment une maladie mitochondriale et souffrent de troubles moteurs et de mémoire. L’abondance accrue de la protéine candidate a permis de préserver l’intégrité des mitochondries et d’améliorer les paramètres physiques et neurologiques de ces souris. Le projet actuel vise à confirmer ces résultats dans un second modèle animal d’une maladie neurodégénérative héréditaire dont la cause génétique n’est pas une mutation liée à la fonction mitochondriale. Ainsi, nous déterminerons si la thérapie génique protègerait effectivement les neurones et la fonction mitochondriale ce qui permettrait une diminution chez ces souris des troubles de la locomotion, de l’équilibre, de la coordination des mouvements et de la mémoire. À terme, les données qui seront récoltées à l’issue du projet, si elles confirmaient le bénéfice pour des souris souffrant des troubles moteurs et cognitifs mais dont la cause génétique ne concerne pas les gènes mitochondriaux encourageront le développement d’études cliniques chez l’Homme pour traiter un large spectre des maladies neurologiques incurables. Ces études viseront à améliorer les conditions de vie de patients pour lesquelles aucune thérapie n’a démontré son efficacité à ce jour.

Procédures

Le modèle expérimental qui sera étudié présente des signes cliniques dommageables de par son altération génétique et ce dès 20 semaines d’âge : diminution du poids corporel, dégénérescence musculaire, déficit de l’apprentissage spatial, insuffisance respiratoire et apparition d’une ataxie (locomotion réduite, démarche anormale et troubles de la coordination). Cette dernière est évidente chez toutes les souris possédant la modification génétique à l’âge de 6 mois. Un petit fragment de l’extrémité de la queue sera prélevé sur les animaux engagés dans le projet âgés entre 7 et 10 jours afin d’identifier le génotype qui permettra de les intégrer dans les différents groupes expérimentaux. Cet acte ne sera réalisé qu’une fois et durera moins de 2 minutes par animal. Le gène médicament que nous testerons sera administré une fois aux souris âgées de 26 ou 28 jours par voie intraveineuse. Cette injection se fera sous anesthésie générale et ne durera au maximum que 5 minutes. Chez certains animaux, un prélèvement de sang sera réalisé 10 semaines après le traitement pour vérifier l’absence du médicament dans le sang périphérique et permettre la sortie des souris traitées de la zone de confinement. Ce prélèvement se fera sous anesthésie gazeuse et durera maximum 5 minutes. Une évaluation des capacités motrices et cognitives sera effectuée chez les souris traitées et certaines souris non traitées à 1, 3 et 6 mois d’âge. Cette évaluation sera composée de huit tests comportementaux pour les souris âgées d’un et 6 mois ou de quatre tests comportementaux pour les souris âgées de 3 mois. La réalisation de huit tests sera étalée sur 10 jours à raison d’un ou deux tests maximum par jour et un repos d’une nuit ou au minimum de 3 heures entre chaque test. Ils seront programmés au mieux pour éviter la fatigue, l’inconfort et le stress chez les souris. L’ensemble des animaux âgés de 6 mois sera euthanasié à la fin des procédures par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris sur lequel nous travaillerons est un modèle expérimental qui reproduit une pathologie neurologique s’aggravant avec le vieillissement des souris. Les animaux présentent donc dès 8 semaines un retard de croissance qui entraine par la suite une diminution du poids moyen des animaux (20 pourcent de moins qu’une souris saine). À 30 semaines de vie, ces animaux souffriront d’une atrophie musculaire généralisée, d’une locomotion réduite, d’une démarche anormale, des tremblements, des troubles de la coordination et de l’équilibre ainsi que d’une insuffisance de la mémoire spatiale. Enfin, ils décèdent prématurément entre 35 et 45 semaines de vie ; de ce fait nous ne conserverons aucune souris en vie au-delà de l’âge de 28 semaines. Entre 7 et 10 jours de vie, tous les mâles et une partie des femelles se verra prélever un fragment de l’extrémité de leur queue pour déterminer leur génotype (sain ou malade). Une légère et brève douleur pourrait être ressentie par l’animal lors du prélèvement. Les animaux subiront une injection unique par voie intraveineuse et certains de ces animaux subiront aussi un prélèvement de sang. Ces deux gestes seront réalisés sous anesthésie gazeuse et ne dureront que 5 minutes et ils pourraient entrainer, au site d’injection ou de prélèvement, de la douleur, de l’inconfort et plus rarement, une inflammation ou un saignement. En outre, l’anesthésie gazeuse présente des risques associés (arrêt respiratoire, hypothermie). Une évaluation des capacités motrices et cognitives sera effectuée chez les souris traitées et certaines souris non traitées à 1, 3 et 6 mois d’âge. Cette évaluation sera composée de huit tests comportementaux pour les souris âgées d’un et 6 mois ou de quatre tests comportementaux pour les souris âgées de 3 mois. La réalisation de huit tests sera étalée sur 10 jours à raison d’un ou deux tests maximum par jour et un repos d’une nuit ou au minimum de 3 heures entre chaque test. Ils seront programmés au mieux pour éviter la fatigue, l’inconfort et le stress chez les souris. Malgré les précautions prises, la réalisation de ces tests pourrait diminuer le bien-être animal de par leur fréquente manipulation mais aussi de la fatigue générée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet ; ils seront alors âgés de 6 mois. La majorité d’entre eux permettront d’étudier les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des cervelets et des cerveaux grâce aux expériences d’histologie, biochimie et biologie moléculaire. L’autre partie correspond aux animaux reproducteurs qui seront euthanasiés à la fin de leur période d’accouplement (lorsqu’ils seront âgés de 6 mois). De plus, quelques animaux sains correspondent à un surplus de production nécessaire pour l’obtention du bon nombre des souris malades à traiter avec le vecteur médicament. Certains de ces souris pourraient remplacer des souris engagées dans la procédure 2 mais perdues précocement, ou pourraient être testées pour l’optimisation des techniques. Enfin, certaines de ces souris pourraient être cédées à la plateforme pour être utilisées par d’autres équipes ou pour des projets de formation.

Remplacement

La démonstration de l’efficacité biologique de la thérapie génique avec la protéine « médicament » ne peut être obtenue que par une étude exhaustive chez des animaux souffrant d’une pathologie similaire à celle de l’Homme. Cette étude devra combiner des évaluations morphologiques et fonctionnelles des structures cérébrales mais aussi l’évaluation des capacités motrices et cognitives pour déterminer l’efficacité de la thérapie chez les souris traitées qui indiquera que leur système nerveux central fonctionne mieux. Pour compléter les études morphologiques des cultures de neurones ou des tranches de cerveau ou de cervelet pourraient être effectuées. Cependant, les données qui seraient récoltées à partir de ce type d’expériences ex vivo resteront insuffisantes et ne permettront pas d’apporter une preuve de concept suffisamment robuste dans le cadre de cette étude préclinique. En effet, notre objectif final est qu’elle aboutisse au développement et à l’autorisation d’une étude clinique chez des patients atteints des maladies neurodégénératives car des thérapies conduisant à l’amélioration de leur qualité de vie sont très peu nombreuses.

Réduction

Pour ce projet nous allons utiliser au total 958 souris, nous avons réduit au strict minimum le nombre de reproducteurs qui permettront l’obtention du nombre d’animaux nécessaires pour la réalisation de l’étude. Ces nombres ont été rigoureusement définis en fonction de nos expériences précédentes sur un modèle murin de pathologie mitochondriale et grâce à un calcul de puissance du nombre des souris nécessaires. Ainsi, la taille de chaque groupe de souris incluses dans les procédures a été défini pour pouvoir récolter suffisamment de données expérimentales qu’une fois évaluées sur le plan statistique seront significatives et robustes.

Raffinement

Les souris seront hébergées entre 2 et 4 par cage sur des portoirs ventilés, nourries et abreuvées à volonté. Chaque cage comportera un environnement enrichi (maisonnette en plastique ou en cellulose, coton et bâtonnet de bois). Les pièces de l’animalerie sont maintenues à 20-22 degrés avec contrôle de la température et de l’hygrométrie, et un cycle jour-nuit progressif de 12 heures. Les injections intraveineuses de gène médicament seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Si une détresse respiratoire est observée pendant celle-ci, la quantité d’anesthésiant sera diminuée pour permettre une meilleure oxygénation des souris. Afin de prévenir toute hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant à 37 degrés pendant la durée de l’intervention. Le site d'injection sera examiné pour s’assurer de l’absence d’un saignement ou un autre traumatisme. Chaque souris sera évaluée pendant les 2 jours qui suivent l’injection pour confirmer l’absence de blessure et d’inflammation ou un autre signe de souffrance dans l’œil injecté ; une grille de notation sera complétée pour chaque souris à la suite des observations. Une évaluation des capacités motrices et cognitives sera effectuée chez les souris traitées et certaines souris non traitées à 1, 3 et 6 mois d’âge. Cette évaluation sera composée de huit tests comportementaux pour les souris âgées d’un et 6 mois ou de quatre tests comportementaux pour les souris âgées de 3 mois. Ils seront programmés au mieux pour éviter la fatigue, l’inconfort et le stress chez les souris. Avant ces séances, les souris devront se familiariser à l’expérimentateur pendant une semaine. Le jour du test, les souris seront installées dans la pièce d’expérimentation 30 minutes avant celui-ci pour minimiser leur stress et assurer la fiabilité des données obtenues. Les huit tests comportementaux seront répartis sur 10 jours afin d’éviter l’anxiété, la fatigue ou le stress des animaux ; l’ordre de la réalisation de tests sera également choisi pour réduire au minimum les nuisances chez les souris testées. Par ailleurs, quotidiennement pendant ces séances et deux fois par semaine le reste du temps, les animaux seront observés et la grille de notation sera complétée de manière détaillée pour chaque souris ; des mesures adaptées seront prises si le bien-être des souris venait à être compromis.

Choix des espèces

Le modèle de souris sur lequel nous allons travailler est particulièrement adapté à notre projet de recherche puisqu’il reproduit fidèlement une maladie neurologique héréditaire chez l’Homme qui est associée au dysfonctionnement des structures cellulaires responsables de la production d’énergie, les mitochondries. Nous travaillerons uniquement sur les mâles car la mutation génétique responsable de la pathologie est moins stable chez les femelles. Toutes les souris engagées dans le projet proviendront de notre propre élevage. Les animaux impliqués dans le maintien de la lignée seront mis en accouplement à l’âge de 2 mois jusqu’à l’âge de 6 mois (début des symptômes chez les mâles reproducteurs). Entre 7 et 10 jours de vie, l’ensemble des animaux se verra prélevé un millimètre de l’extrémité de leur queue pour identifier leur génotype. Celui-ci nous permettra de sélectionner les femelles reproductrices (Wild-type), les mâles sains (Wild-type) et les mâles qui développeront la maladie à 6 mois d’âge. Une proportion de ces derniers servira à la reproduction et l’autre partie sera testée avec le gène médicament. Les souris mâles asymptomatiques et les mâles qui développeront la maladie à partir de 6 mois d’âge seront traitées à l’âge de 26 ou 28 jours afin d’optimiser le bénéfice potentiel de la thérapie génique qui permettrait, si efficace, une protection des neurones. En effet, la maladie débute à 8 semaines d’âge, donc nous interviendrons avec la thérapie génique précocement afin de prévenir la dégénérescence neuronale grâce à la protection de la fonction mitochondriale.

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une irradiation cérébrale à forte dose sous anesthésie sur trois jours, puis cinq mois de tapis de course, des prélèvements sanguins en contention et des séances d'IRM sous anesthésie, pour tester si l'activité physique et de faibles doses de rayonnements limitent les lésions dues à la radiothérapie. Le porteur décrit une batterie de tests comportementaux répétée quatre fois (fatigue, locomotion, anxiété, mémoire, apprentissage spatial) et indique que l'irradiation provoque fatigue, perte de poids et érythèmes cutanés, présentés comme transitoires. Les retombées pour les patients sont renvoyées au long terme, tandis que le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal pour une analyse intégrée.

Objectifs

La radiothérapie (RT) est un traitement de référence pour traiter les tumeurs cérébrales, mais celle-ci peut induire des déficits cognitifs et une fatigue altérant la qualité de vie des patients. Les travaux de recherche actuels soutiennent l'implication concomitante de plusieurs processus interconnectés (dommages vasculaires, modifications de la matrice extracellulaire, neuroinflammation, neurodégénerescence, démyélinisation) contribuant au développement du déclin cognitif. Proposer une stratégie thérapeutique pour remédier aux déficits cognitifs observés après RT est essentiel pour améliorer la prise en charge des patients et représente un enjeu sociétal majeur face à l’augmentation du nombre de patients survivants après un cancer. Bien que les irradiations ionisantes appliquées à fortes doses utilisées pour la RT soient délétères pour les cellules, une exposition à de faibles doses de rayonnements ionisants (FDRI) pourrait promouvoir la protection et la réparation tissulaire, par leurs effets antioxydants, anti-inflammatoires et anti-apoptotiques. Récemment, il a été proposé l'existence d'un effet hormétique des FDRI sur le cerveau, suggérant que les FDRI pourraient être une thérapie prometteuse dans le cadre de diverses pathologies cérébrales. Parmi les traitements proposés pour la prise en charge de la radiotoxicité cérébrale, l’activité physique adaptée (AP), outil de réadaptation non invasif et non médicamenteux, semble pertinente. Plusieurs études cliniques menées sur différents types de cancer ont montré un bénéfice de l’AP sur le pronostic et la qualité de vie des patients. Des études épidémiologiques et interventionnelles suggèrent que l’AP améliore des processus cognitifs liés aux processus mnésiques et aux fonctions exécutives. De plus, la pratique d’une AP permettrait de réduire le déclin cognitif associé au vieillissement à la fois normal et pathologique, notamment dans des conditions neurodégénératives. Dans ce contexte, le projet proposé vise à étudier l’intérêt d’une exposition aux FDRI et de l’AP, seules ou combinées, pour réduire les lésions cérébrales et les déficits cognitifs consécutifs à la RT cérébrale.

Bénéfices attendus

Cette étude préclinique doit permettre de 1/ d’apporter des preuves expérimentales robustes pour évaluer l'intérêt thérapeutique des FDRI et de l’AP sur les effets délétères induits par une irradiation cérébrale à fortes doses de rayonnements ionisants et 2/ de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux bienfaits des FDRI et de l’AP dans un contexte de radiotoxicité cérébrale. A la fin du projet, les résultats seront accessibles sous la forme d’articles scientifiques. De plus, des biobanques de tissus cérébraux et de sang seront établies lors de ce projet et seront mises à disposition de la communauté scientifique. A long terme, une transposition à la clinique pourrait être envisagée pour atténuer le déclin cognitif des patients traités par RT et améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes procédures : - irradiation cérébrale à fortes doses de rayonnements ionisants qui sera délivrée sur 3 jours consécutifs et qui durera 10 minutes pour chaque fraction d’irradiation, réalisée sous anesthésie générale des animaux. - exposition cérébrale aux faibles doses de rayonnements ionisants (traitement FDRI) qui sera délivrée sur 3 jours consécutifs et qui durera 10 minutes pour chaque fraction d’irradiation, réalisée sous anesthésie générale des animaux. - pratique régulière de l’activité physique via l’utilsiation d’un tapis de course (traitement AP). Chaque session d'activité physique durera 30 minutes et sera réalisée 3 fois par semaine pendant 5 mois. - tests comportementaux : fatigue, activité locomotrice et comportement de type anxieux, mémoire à court-terme, mémoire à long-terme et apprentissage spatial et mémoire de référence. Chaque animal réalisera 4 fois cette batterie de tests comportementaux (3 semaines, 5 semaines, 2 mois et 6 mois post-irradiation). L’ensemble des tests comportementaux seront échelonnés sur 2 semaines avec 1 seul test par jour. La durée de chaque test sera comprise entre 10 et 20 minutes. - prélèvements sanguins : ils seront réalisés sur animaux vigiles, en utilisant une boîte de contention, à 5 semaines et 2 mois post-irradiation cérébrale. La durée totale de la procédure (temps maximal pour réaliser le prélèvement) ne dépassera pas 5min. - examens en IRM cérébral qui seront réalisé à 2 mois et 6 mois post-irradiation. Ces examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale des animaux et l’examen durera 60 minutes pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Suite à l'irradiation cérébrale, les animaux seront fatigués, présenteront une perte de poids et pourront présenter des signes de dégradation de leur état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, érythèmes cutanés sur la tête) accompagnés d'une diminution de la prise alimentaire et hydrique. Cependant, ces effets indésirables sont transitoires et réversibles(de 5 jours à 14 jours après irradiation), comme cela est décrit chez les chez les patients traités par radiothérapie.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés seront mis à mort à la fin de l’étude afin de mener des études post mortem sur le sang et le tissu cérébral.

Remplacement

Les effets délétères de l’irradiation cérébrale sur l’organisation structurelle et fonctionnelle du cerveau ne sont pas seulement dus à des effets directs sur le cerveau, mais aussi à des phénomènes humoraux (stress oxydatif, inflammation, exosomes, hormones) et nerveux (dommages des voies nerveuses périphériques) qui ampflient les dommages cérébraux, les déficits cognitifs et la fatigue induits après l’irradiation cérébrale. Ainsi, il est indispensable d’avoir recours à l’expérimentation sur des animaux pour permettre une analyse intégrée des phénomènes complexes induits par l’irradiation cérébrale, d’évaluer l’intérêt des FDRI et de l’AP, et d’avoir des preuves expérimentales suffisamment robustes pour, à terme, tester ces traitements chez l’Homme.

Réduction

Grâce à l'utilisation au préalable de tests statistiques appropriés et à l'utilisation de techniques d'investigation non invasives (imagerie IRM et tests comportementaux), le nombre d'animaux nécessaire pour permettre une puissance des résultats sera réduit au minimum. Chaque animal subira ces examens non invasifs de façon séquentielle (suivi longitudinal pendant 6 mois post-irradiation), ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés. A partir de données du laboratoire obtenues sur ce modèle animal de radiotoxicité cérébrale, nous estimons que le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est N=20 rats/groupe pour les 4 groupes expérimentaux. Au total, 80 rats seront nécessaires pour réaliser l’ensemble du projet. Par ailleurs, l’ensemble de ce projet sera réalisé sur plusieurs cohortes d’animaux successives avec des effectifs par groupe plus réduit afin de réaliser une analyse statistique séquentielle des données obtenues en IRM et comportement, ce qui permettra si des différences significatives sont observées de ne pas atteindre le nombre maximal d’animaux par groupe fixé. Cette méthode d’analyse statistique séquentielle permettra éventuellement de réduire le nombre d’animaux initialement prévu dans ce projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en animalerie conventionnelle aux normes requises. Le personnel participant au projet est formé aux procédures en expérimentation animale. Des inspections du bien-être des animaux sont réalisées quotidiennement. De plus, toutes les mesures visant à réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux seront entreprises, notamment en appliquant une anesthésie et une analgésie appropriées. Concernant les effets indésirables liés à l’irradiation cérébrale qui peuvent affecter de façon transitoire l’état général des animaux, des mesures sont déjà mises en place dans le laboratoire et connues par les personnes impliquées dans ce projet. Pour limiter ces effets indésirables survenant uniquement pendant les 2 premières semaines après irradiation, le poids des animaux est relevé quotidiennement, une alimentation particulière est donnée aux animaux : croquettes mouillées dans une coupelle déposée directement dans la cage ainsi que de la gelée hyperprotéinée. Des injections intrapéritonéales de sérum physiologique sont réalisées 2 fois par semaine, pour éviter une éventuelle déshydratation. Concernant les érythèmes cutanés sur le haut de la tête, celles-ci sont bien connues et prises en charge selon les recommandations du vétérinaire de l’animalerie. Dès que la peau est bien sèche, une crème hydratante et cicatrisante est appliquée tous les 2 jours jusqu’à la cicatrisation cutanée. De plus, une échelle d’évaluation de l’état général des animaux (score défini par plusieurs items visuels) a été mise en place par le laboratoire sur ce modèle animal pour surveiller finement l’état général des animaux. Enfin, des points limites spécifiques et de critères d'arrêt de souffrance seront utilisés afin de réduire toute souffrance ou douleur chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat possède un cerveau dont la taille est supérieure à la souris et qui est compatible avec les appareils permettant une irradiation encéphalique ciblée ainsi qu’une imagerie de haute résolution. D’autre part, plusieurs tests comportementaux visant à évaluer les déficits moteurs et cognitifs sont bien décrits chez le rat. Enfin, nous avons développé au sein du laboratoire un modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat, pour lequel nous avons déjà très bien caractérisé les dommages cérébraux ainsi que les modifications comportementales (fatigue, locomotion, mémoire, comportements de type anxiété et de type dépression) jusqu’à 6 mois après irradiation encéphalique. Ainsi, nous maitrisons très bien ce modèle animal que ce soit dans le décours temporel de sa physiopathologie mais aussi en termes de prise en charge du bien-être animal. Les animaux utilisés dans ce projet seront âgés de 5 mois (correspondant à un poids d’environ 350 g) lors de leur arrivée à l’animalerie. Lors du 1er mois, les rats seront acclimatés dans leur nouvel environnement, habituer aux expérimentateurs et aux dispositifs expérimentaux (tests comportementaux et tapis de course pour l’AP). L’irradiation cérébrale sera réalisée sur des animaux âgés de 6 mois. . L’âge de 6 mois a été retenu puisqu’il correspond à l’âge adulte mature chez le rat et est équivalent à l’âge de 18 ans chez l’Homme. A ce stade de développement chez le rat, la substance blanche est complètement mature, ce qui représente un critère très important pour modéliser les atteintes cérébrales observées chez le patient adulte traité par radiothérapie.