Recherche appliquée

423 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du côlon leur est induite par greffe sous-cutanée, puis traitée par ultrasons focalisés et injections répétées, la tumeur pouvant "gêner la locomotion et être douloureuse". Les tumeurs sont récupérées après mise à mort. Le porteur affirme que le micro-environnement tumoral est "impossible à reproduire in vitro" et ne présente l'application clinique qu'au conditionnel ("pourrait découler").

Objectifs

Les immunothérapies actuelles sont en plein essor dans le cadre du traitement contre le cancer. Cependant, malgré un effet démontré sur la régression tumorale et l’augmentation de la survie globale, ces thérapies ne sont effectives que chez 20 % à 40 % des patients. L’hypothèse est qu’il faut activer le système immunitaire. Il est proposé ici de l’activer avec les ultra-sons avec une application locale et ciblée. Les ultrasons thérapeutiques sont aujourd’hui utilisés en clinique pour de nombreuses applications. Selon la modalité du traitement, les ultrasons peuvent activer le système immunitaire. L’objectif de notre étude est donc de caractériser le potentiel des ultrasons en complément d’immunothérapie pour améliorer la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait découler sur l’utilisation d’ultrasons en clinique pour réduire les risques de récidive dans le traitement de cancer avec l’immunothérapie mais aussi combinés à d’autres types de traitement.

Procédures

Les animaux subiront une injection sous cutanée de cellules tumorales qui conduira au développement d’une tumeur. L’animal sera épilé (jusqu’à 3 fois ; 1 à 2 minutes de manipulation) et recevra un traitement par ultrasons (5min) par semaine (soit maximum 6) et des injections dans l’abdomen ou dans la tumeur de traitement (jusqu’à 12 maximum) à raison de 2 par semaine maximum.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir du stress lors des contentions en amont des gestes techniques. Le traitement par ultrasons pourra générer en cas de problème de ciblage un échauffement de la peau (rare). Les injections génèreront de la douleur courte et la tumeur pourra gêner la locomotion et être douloureuse (rare).

Devenir

L’ensemble des animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs et d’analyser les réponses immunitaires par cytométrie.

Remplacement

Nous avons en amont réalisé des études in vitro afin de s’assurer de la non toxicité de l’immunothérapie et son efficacité. Ceci étant, l’interaction entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales est un phénomène biologique complexe faisant intervenir différents types cellulaires particulièrement sensibles au micro-environnement de la tumeur qui est impossible à reproduire in vitro. De plus, des traitements destructifs et immunomodulateurs de la tumeur et de son environnement amènent à divers effets biologiques complexes et nombreux, également impossibles à reproduire in vitro.

Réduction

Les effectifs des groupes ont été déterminés grâce à des outils statistiques. Chaque procédure soulève une question à laquelle nous souhaiterions répondre, sans laquelle nous ne passerons pas à l’étape suivante. Ceci aura pour but d’obtenir les résultats attendus avant de passer à l’étape suivante, ce qui permet de ne pas gaspiller d’animaux lorsque les résultats observés ne sont pas ceux attendus.

Raffinement

Si nécessaire, de la crème cicatrisante sera appliquée sur la peau , là où les ultrasons seront passés. Les souris sont surveillées trois fois par semaine. Dès qu'un des points limites définis est atteint, pour réduire la douleur et l'angoisse, l'animal est mis à mort.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car elles contiennent le fond génétique d'où est issue la lignée cellulaire du modèle de cancer qui sera implanté. Des animaux de 5 à 7 semaines seront utilisés car l’âge de l’animal est une variable importante à contrôler pour caractériser la réponse immunitaire.

24 souris Hairless vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois formulations à principe actif leur sont appliquées quotidiennement sur le dos pendant 14 jours, ce qui "pourrait induire avec le temps le développement de rougeur (érythème) ou de gonflement (œdème)". La peau est prélevée après mise à mort pour évaluer la tolérance cutanée et la biodistribution. Le porteur affirme que le remplacement "n'est pas envisageable", aucun modèle cellulaire ne reproduisant selon lui le microenvironnement cutané sur un temps prolongé.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer chez la souris la tolérance cutanée et la biodistribution dans la peau de 3 formulations différentes appliquées quotidiennement sur le dos des souris pendant 14 jours consécutifs. Chacune des 3 formulations à évaluer possédera un pricincipe actif différent mais avec les mêmes composants permettant une meilleure diffusion et distribution dans le tissu cutané. Pour effectuer l’évaluation de la tolérance de ces 3 formulations, en comparaison avec une formulation neutre dépourvue de principe actif, une observation quotidienne de la zone traitée sera effectuée avec un scorage de différents paramètres. Un suivi pondéral régulier des souris et une observation de leur comportement seront effectués au cours des 14 jours de traitement. A l’issue des 14 jours de traitement, un prélèvement cutané au niveau de la zone d’application des différentes formulations sera effectué afin de réaliser un ensemble d'analyses qui permettront de caractériser la tolérance, par le tissu cutané, des traitements effectués, et la biodistribution dans la peau des produits appliqués. Cette étude permettra ainsi de sélectionner la formulation ayant la meilleure tolérance cutanée et la meilleure biodistribution au niveau du tissu cutané pour la réalisation d’une étude d’efficacité sur un modèle de lésion précancéreuse de la peau (kératose actinique).

Bénéfices attendus

La kératose actinique est une lésion cutanée développée à partir de cellules constituant 90 % de la couche superficielle de la peau (épiderme), est dont les deux facteurs de risque principaux sont l’exposition solaire avec les rayonnements ultraviolets, ainsi qu’une peau sensible, personnes ayant une peau et des yeux clairs. En France, il s’agit d’une des premières causes de consultation chez le Dermatologue et son incidence double tous les 10 ans proportionnellement au vieillissement de la population. Une kératose actinique se traduit par un épaississement de la surface de la peau aux endroits du corps exposés au soleil pendant une période prolongée. Elle est considérée comme précancéreuse et peut évoluer de différentes manières : elle peut se résorber spontanément, persister ou augmenter de volume plus ou moins rapidement. Dans 16 à 20 % des cas, elle peut évoluer vers un cancer cutané. Différents traitements locaux sont possibles en fonction de la localisation, des caractéristiques du patient et de celles de la kératose actinique. Cependant les effets indésirables varient en fonction du type de kératose actinique et de la durée des traitements nécessaires. Il est donc important et nécessaire de développer de nouvelles thérapies permettant de traiter ces lésions précancéreuses avant qu’elles ne se transforment en lésions cancéreuses, avec la meilleure tolérance possible, par des approches simples et sur des modèles expérimentaux représentatifs de la pathologie humaine. Ces nouvelles thérapies pourront ainsi être évaluées par la suite chez l’Homme et elles permettront d’améliorer la prise en charge de personnes atteintes de kératose actinique.

Procédures

Les 24 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront soumises à une application cutanée quotidienne sur le dos pendant 14 jours d’une formulation neutre ou d’1 des 3 formulations contenant chacune un principe actif différent. Ces applications cutanées effectuées sur animal vigile seront effectuées en 1 minute environ chaque jour. Pour chaque souris, la zone d’application des formulations sera observée quotidiennement tout au long de l’expérimentation afin de suivre la tolérance cutanée au cours du temps. Ces observations seront effectuées sur animal vigile, en 1 à 2 minutes environ chaque jour.

Impact sur les animaux

Les applications cutanées quotidiennes des formulations effectuées sur animaux vigiles pourront engendrer un léger stress mais qui devrait s’estomper progressivement au cours des 14 jours de traitement, celles-ci étant réalisées en moins d’une minute par du personnel expérimenté et en limitant le nombre de personnes manipulant les animaux et réalisant les traitements. Ces applications cutanées répétées des formulations à évaluer pourraient induire avec le temps le développement de rougeur sur la peau (érythème) ou de gonflement de la peau (œdème) mais avec une douleur induite très limitée du fait des propriétés anti-inflammatoires des principes actifs qui la composent. Les observations quotidiennes effectuées avant chaque traitement n’engendreront pas de douleur et seront réalisées en un temps très court (1 à 2 minutes environ). Un suivi quotidien du comportement des animaux et régulier de leur évolution pondérale sera effectué tout au long de l’étude mais aucune modification comportementale notoire et aucune perte de poids significative ne sont attendues.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 24 souris seront toutes euthanasiées après les 14 jours de traitement cutané. Un prélèvement de peau sera effectué au niveau de la zone traitée pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser la tolérance cutanée et la biodistribution des 3 formulations évaluées.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles cellulaires permettant de caractériser sur un temps prolongé la tolérance cutanée et la biodistribution de formulations (influence du microenvironnement cutané et processus immunitaire), et ses effets éventuels sur le comportement. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. L’utilisation de souris mâles et femelles permettra d’obtenir suffisamment de données et d’échantillons pour la réalisation des analyses envisagées. S’agissant d’une étude observationnelle et le nombre d’animaux étant limité, aucune analyse statistique ne sera effectuée.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux suite à la réalisation des traitements quotidiens. Les animaux et la région d’application des formulations à évaluer seront observés chaque jour tout au long de l’expérimentation. Le poids sera relevé 3 fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 10% entre 2 pesées ou 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’intolérance cutanée (érythème ou œdème important, ulcération de la peau) ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, prostration, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Les souris seront placées par 3 dans des cages de 18.9x29.6x12.8 cm dans une animalerie dédiée au souris immunocompétentes. Elles seront maintenues en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie), des morceaux de papier absorbants étant placés dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être, remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris et plus particulièrement la souris Hairless, dépourvue de poils, est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet. Elle est très utilisée pour les études dans le domaine de la Dermatologie notamment pour les études de tolérance cutanée et d’efficacité sur différents modèles de pathologies dont la kératose actinique. C’est donc l’espèce animale la plus appropriée pour ce projet afin d’évaluer la tolérance cutanée et la biodistribution de nouvelles formulations. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris classiquement décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de tolérance cutanée et de biodistribution (généralement 6 à 8 semaines).

16 lapines vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à deux anesthésies, la pose d'un cathéter dans la veine de l'oreille et une chirurgie abdominale avec incision de 3 cm, pour mettre au point de nouvelles méthodes de stérilisation par obstruction des trompes utérines. Le porteur indique que la chirurgie peut entraîner "une gêne au niveau de la cicatrice et des douleurs pelviennes". Les trompes sont prélevées après mise à mort pour analyse, et le porteur revendique un passage "rapide" possible vers un essai clinique.

Objectifs

La stérilisation tubaire est une technique de stérilisation féminine définitive à visée contraceptive. Le but est de créer une barrière physique entre les spermatozoïdes et l’ovocyte au niveau de la trompe et par conséquent, éviter la fécondation". 11% des femmes à travers le monde souhaitent recourir à une obstruction tubaire en vue d'une contraception permanente. Ces demandent de stérilisation définitive sont encadrées avec la signature d'un consentement par la patiente ainsi qu'un délai de réflexion de 4 mois. Ces techniques ont ensuite été détournées pour une autre utilisation : le traitement des hydrosalpinx. En effet, en assistance médicale à la procréation, « l’hydrosalpinx » empêche l’implantation embryonnaire. Le but de cette recherche est le traitement des hydrosalpinx mais cela passe nécessairement par la stérilisation définitive. Actuellement la méthode de référence est la ligature des trompes ou la pose de clip nécessitant une chirurgie par cœlioscopie. En 2000, une nouvelle technique, la méthode Essure®, émergeait, et permettait une obstruction tubaire par voie naturelle sans incision ni anesthésie, réalisable en hospitalisation de jour. Elle consistait à mettre en place un ressort dans chaque trompe. Ce ressort obstruait les trompes en créant une inflammation locale. Suite à l’observation d’effets secondaires dus, probablement, à la matière de l’implant (nickel et titane), cette méthode n'est plus commercialisée en Europe depuis 2017. La méthode de référence reste donc à ce jour la ligature des trompes ou la pose de clip par chirurgie. En s’inspirant de la méthode Essure®, il est proposé ici de tester un matériau biocompatible naturel connu dans le domaine de l’agroalimentaire et médical. L’hypothèse est qu’un granulome inflammatoire sera formé en 3 mois ce qui obstruera les trompes et empêchera la fécondation. Un précédent projet a déjà été déposé et réalisé mais le granulome inflammatoire n’était pas présent. La formulation du gel a donc été retravaillée. Un traitement pas ultrasons focalisés sera testé également pour créer une légère brulure de la trompe pour causer une inflammation qui bouchera la trompe.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait découler rapidement sur un essai clinique en cas de résultats positifs car le composé est biocompatible ainsi la phase d’essai de toxicité sera réduite. Les ultrasons focalisés sont déjà largement utilisés pour le cancer de la prostate. Ce procédé pourra également être rapidement proposé en clinique.

Procédures

Les animaux subiront au maximum 2 anesthésies par injection intramusculaire, une insertion de cathéter à la veine de l’oreille à chaque anesthésie et une petite chirurgie (incision de 3 cm maximum sur le bas de l’abdomen). Ils seront manipulés une fois par semaine soit 12 fois pour être pesés.

Impact sur les animaux

La chirurgie pourra entrainer une gêne au niveau de la cicatrice et des douleurs pelviennes. Ils pourront également ressentir su stress lors des contentions pour les pesées, les anesthésies et les suivis échographiques.

Devenir

Les animaux seront mis à mort car les trompes doivent être prélevées et analysées anatomopathologiquement.

Remplacement

La réaction inflammatoire attendue va faire intervenir différents types cellulaires et ceci n’est pas faisable in vitro ni modélisable. Toute la mise au point préliminaire a été et sera effectuée sur cadavres d’autres projets. Le fait d’utiliser un produit biocompatible va permettre de s’affranchir des étapes d’étude de toxicité. Les paramètres de traitement par ultrasons seront déterminés par simulation informatique.

Réduction

Le projet sera réalisé en séquentiel afin de vérifier de ne pas engager trop d’animaux si jamais, l’hypothèse n’était pas vérifiée. Le groupe contrôle de fécondation dans le projet précédent visant à valider la technique de reproduction ne sera pas refait ici car le taux de fécondation était de 100%. Le groupe contrôle permettant de vérifier si la chirurgie n’influe pas la fécondité ne sera pas refait non plus car le taux de fécondation était aussi de 100%.

Raffinement

Dans le cas d’incompatibilité entre individus, les animaux bénéficieront d’un programme de sociabilisation dans un enclos enrichi plus spacieux que leur cage d’hébergement par session de 30 minutes qui leur permet de stimuler leur comportement de curiosité. Lors de la chirurgie, le mélange anesthésique/analgésique sera complété par un anesthésique local qui permet de réduire les douleurs. Des points limites définis permettront de ne pas entrainer les animaux dans des souffrances non prévus et non traitables. Une fiche de score permettra d’évaluer le bien-être des animaux de façon objective.

Choix des espèces

Le lapin est un modèle chirurgical qui permet d’avoir accès à un appareil reproducteur d’une taille suffisamment importante afin de pouvoir exécuter des techniques transposables chez la femme. Afin d’être sûr d’avoir des animaux sans anomalie de l’appareil reproducteur, il sera demandé à l’éleveur des lapines ayant déjà procréé. Les lapines pèseront donc entre 4 et 6 kg.

330 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des sensibilisants chimiques par application cutanée et par voie respiratoire, cette dernière réalisée en tube de contention, ce qui peut provoquer une irritation de la peau, des voies aériennes et des signes d'asthme. Les ganglions lymphatiques sont prélevés après mise à mort à des temps successifs. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire n'est validé pour ce travail et présente le projet lui-même comme une étape vers un tel modèle alternatif.

Objectifs

L’allergie est classée au 4ème rang des affections chroniques les plus fréquentes par l’Organisation Mondiale de la Santé. Les symptômes allergiques peuvent prendre des formes cutanées ou respiratoires et font suite à l'exposition répétée des sujets à une substance dite sensibilisante. Jusqu'à 25% des cas d'asthme déclarés sont d'origine professionnelle et font suite à une exposition répétée, par voie respiratoire ou cutanée, à des substances sensibilisantes chimiques. A ce jour, aucune méthode n'a été validée par les instances règlementaires européennes pour identifier les substances chimiques avec un potentiel sensibilisant respiratoire. Or, ces substances présentent un danger pour les individus exposés. La différenciation des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques locaux est une étape déterminante dans le développement de la maladie allergique. L’objectif de ce projet est d’identifier des gènes régulant la différenciation des lymphocytes T au cours du processus de sensibilisation respiratoire chez la souris. Afin d’atteindre cet objectif, deux voies d’exposition seront utilisées sur un modèle murin de sensibilisation qui sera combiné à des outils d’analyse de l’expression des gènes afin d’identifier les gènes cibles exprimés par les cellules immunitaires d’intérêt activées par des sensibilisants respiratoires et des sensibilisants cutanés. L’objectif final est de développer un modèle de culture cellulaire, alternatif au modèle animal, qui permettra d’identifier spécifiquement les substances chimiques ayant le potentiel de déclencher une maladie allergique respiratoire, grâce aux biomarqueurs qui auront été identifiés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes immunologiques mis en jeu au cours de la sensibilisation respiratoire. Ces connaissances sont nécessaires pour améliorer la description des évènements clés menant au développement de l’allergie respiratoire. En outre, de nouveaux biomarqueurs seront identifiés au cours de ce projet, ils permettront de développer un modèle de culture cellulaire alternatif au modèle in vivo permettant de prédire le potentiel sensibilisant respiratoire des substances chimiques. De telles méthodes sont nécessaires, pour identifier le risque associé à l'exposition aux substances sensibilisantes, afin de prévenir le développement de maladies allergiques. Aucun modèle de culture cellulaire n’est validé à ce jour par les instances européennes pour identifier les substances chimiques avec des propriétés sensibilisantes respiratoires.

Procédures

Un lot de 52 souris vigiles sera exposé par application cutanée à 2 sensibilisants allergiques et au solvant approprié. La veille de la première application, les flancs des animaux seront tondus sous anesthésie gazeuse. Les produits seront appliqués sur les flancs des souris à J0 et J5, puis derrière les oreilles à J10, J11 et J12. Les animaux seront mis à mort J0, J3, J7, J10 et J13 après sédation suivie d’une anesthésie profonde (comme pour tous les animaux mis à mort dans ce projet) et les ganglions lymphatiques locaux seront prélevés pour être analysés en cytométrie en flux (analyse des protéines d’intérêt par marquage fluorescent). Ensuite, trois lots de 28 souris et un lot de 20 souris vigiles seront exposées par application cutanée à 7 substances et au solvant approprié. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps déterminés par les analyses en cytométrie en flux. Les ganglions lymphatiques locaux seront prélevés pour les analyses d’expression génétique. Un lot de 10 souris sera exposé par voie respiratoire à un mélange d’acétone et d’huile d’olive dans un but de formation. Ces animaux, ainsi que tous ceux qui seront exposés par voie respiratoire au cours du projet, bénéficieront d’une anesthésie légère précédée d’une sédation. Leur réveil sera ensuite induit par injection médicamenteuse après l’instillation. L’exposition respiratoire sera faite à J0, J5, J10, J11 et J12 dans cette procédure. Les animaux seront mis à mort à J13. Un lot de 68 souris sera exposé à un sensibilisant respiratoire et au solvant approprié comme suit : trente-deux de ces animaux seront exposés de façon vigile par voie cutanée à J0 et J5 et 32 autres animaux seront exposés par voie respiratoire à J0 et J5. Tous les animaux seront ensuite exposés à J10, J11 et J12 par voie respiratoire. Les animaux seront mis à mort à J0, J3, J7, J10 et J13. Un lot de 36 animaux sera utilisé pour tester un sensibilisant cutané selon la méthode définie à l’issue du 1er lot de 68 souris. Ensuite, trois lots de 28 souris et 1 lot de 20 souris seront exposés aux mêmes 7 substances que pour l’exposition cutanée par voie respiratoire. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps pour les analyses d’expression génétique.

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux seront principalement dues aux voies d’administration des substances chimiques. Malgré le plus grand soin apporté pour limiter l’inconfort des animaux, la procédure de sensibilisation par application cutanée pourra induire de l’irritation cutanée. L’exposition des animaux par voie respiratoire pourra induire de l’irritation des voies aériennes. L’exposition par inhalation, qui sera faite par voie oro-nasale, pourra induire du stress chez les animaux qui seront mis en tubes de contention. Avec les deux procédures, des signes d’asthme pourront également apparaitre. Dans tous les cas, dès l’apparition de signes de souffrance non réversibles, les animaux seront mis à mort.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort dans le but de prélever les différents tissus nécessaires aux analyses prévues dans ce projet.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux à des fins expérimentales car le modèle animal permettra d’étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la différenciation des lymphocytes T lors du processus de sensibilisation in vivo. Aucun modèle de culture cellulaire n’est à ce jour établi et validé pour étudier ces mécanismes. C’est d’ailleurs l’objectif au terme de ce projet : le développement d’un modèle de culture cellulaire à partir des données issues de ce projet afin de proposer un modèle alternatif pour l’évaluation du potentiel sensibilisant respiratoire.

Réduction

Nous avons réduit au minimum le nombre d’animaux utilisés afin de pouvoir effectuer des analyses statistiques valables entre les groupes expérimentaux. En accord avec la littérature, nous avons porté à 4 le nombre de souris par groupe. En outre, nous allons collecter le maximum de tissus afin de pouvoir effectuer les analyses post-mortem nécessaires à ce projet en utilisant un nombre minimal de souris. L’analyse sur cellule unique permet de diminuer la variabilité entre les individus, car environ 2000 cellules seront analysées dans chaque échantillon, ce type d’analyse permet donc de réduire le nombre d’animaux à inclure par groupe expérimental.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué chaque jour lors des soins quotidiens apportés par les zootechniciens et lors des contrôles quotidiens effectués par les autres membres participant à ce projet (techniciens de recherche et chercheurs). Les souris seront manipulées par préhension dans le creux des mains. Toutes les personnes intervenant dans ce projet sont formées initialement et de façon continue à l’expérimentation animale et en particulier au bien-être animal. Les gestes réalisés seront maitrisés afin de garantir le confort maximum des animaux lors des traitements. Les animaux seront hébergés par groupe dans des cages répondant aux exigences de la réglementation en terme de dimensions. Un enrichissement varié (maisonnette et éléments de nidification) leur sera apporté. Une observation renforcée après les expositions aux substances chimiques permettra la prise en charge rapide des animaux en cas de souffrance ou d’atteinte de point limite.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est justifiée pour plusieurs raisons : -la souris est l’espèce couramment utilisée pour les études de toxicologie, elle est notamment l’espèce sélectionnée dans la ligne directrice 429 de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economiques) portant sur le modèle Local Lymph Node Assay qui permet d’identifier les substances chimiques allergéniques; -la composition et le fonctionnement du système immunitaire de la souris sont semblables à celui de l’Homme et les résultats issus des expériences pourront donc être extrapolés raisonnablement aux effets attendus chez l’Homme ; -la souche BALB/c est choisie car son système immunitaire est adapté aux études de sensibilisation allergique. Cette souche, bien qu’orientée Th2, permet d’étudier la différenciation des lymphocytes T en ses différents sous-types et plusieurs études ont montré qu’elle permet le développement d’une réaction allergique respiratoire aux substances chimiques. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8-10 semaines, stade de développement auquel la souris atteint l’âge adulte. Nous souhaitons étudier la réponse allergique sur des animaux ayant un système immunitaire mature.

42 macaques à longue queue vont être utilisé·es, 5 tués pour prélèvement d'organes et 37 réutilisés ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des injections intradermiques, une immunisation, l'injection intraveineuse d'une molécule anti-inflammatoire, jusqu'à 16 prélèvements de sang sur 48 jours dont une anesthésie prolongée de deux heures, ainsi que des ponctions de moelle osseuse et de ganglions. Le porteur décrit le protocole d'anesthésies répétées sur 24 heures comme "inconfortable" et affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer un "système immunitaire complet", ce qui rendrait l'animal "indispensable". Il justifie le macaque par sa "proximité phylogénétique" avec l'Homme.

Objectifs

Les traitements anti-inflammatoires actuels visent à éteindre une inflammation chronique préexistante mais cette atténuation de la réponse du système immunitaire n’est souvent que transitoire et s’accompagne très souvent de rechutes. Les études scientifiques visant à déterminer les mécanismes associés à l’inflammation ont mis en lumière un processus actif de l’extinction de l’inflammation s’appelant résolution de l’inflammation Nous avons déjà démontré dans notre laboratoire que le traitement prorésolutif constitué par notre molécule d'intérêt (anticorps monoclonal ciblant un des récepteurs de la résolution exprimé par les neutrophiles et les macrophages) est cliniquement actif chez la souris dans de nombreux modèles inflammatoires. En effet, dans des modèles de colite induite ou spontanée, nous avons pu apprécier un retour plus rapide ou une stabilisation/amélioration de la colite lorsque les animaux ont été injectés avec ce traitement prorésolutif. Par ailleurs nous avons chez l’Homme, observé in vitro un effet de cette même molécule sur les neutrophiles et les macrophages. En outre, dans une précédente étude chez le primate non humain, nous avons pu apprécier la pharmacocinétique ainsi qu’un effet biologique du produit sur un modèle d’inflammation réalisée par l’injection intradermique de bactéries inactivées aux UV. Ce projet sera dans la continuité du précédent pour évaluer les doses minimales et maximales requises pour observer un effet biologique et évaluer la toxicité du produit ainsi qu’identifier des biomarqueurs d’activité permettant de suivre la pharmacodynamique du produit et orienter les analyses chez l’Homme lors d’essai clinique. En outre, l’étude de biodistribution du traitement n’a pas été réalisée et pourra être évaluée dans cette étude, paramètre indispensable pour l’évolution du produit vers la clinique. Enfin, de manière complémentaire, un modèle de vaccination et rechallenge sera évalué pour répondre à la question d’un éventuel impact du traitement sur la vaccination, notamment la réponse humorale liée aux anticorps.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’une part d’évaluer la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’un produit destiné à la médicamentation humaine permettant ainsi d’anticiper un schéma d’administration et d’estimer d’éventuels effets secondaires liés à l’injection de ce médicament. En outre, la réalisation en parallèle d’un modèle inflammatoire intradermique permettra d’apprécier un effet biologique de la molécule sur un modèle déjà utilisé dans une phase I lors d’essais cliniques et pour lequel nous avons obtenu des résultats préliminaires encourageants nécessitant d’être confirmés. Enfin, l’étude sur la capacité vaccinale après injection de la molécule permettra de mieux appréhender les mécanismes d’action du médicament et s’assurer que l’administration d’une telle drogue de manière concomitante à une vaccination de trouble pas la réponse immunitaire primaire et/ou secondaire.

Procédures

Certains animaux seront soumis sous anesthésie à l’induction d’une inflammation suite à des injections intradermiques (sur 5 min) sur une seule journée. D’autres animaux seront soumis sous anesthésie à une injection intramusculaire ou sous-cutanée (5 min) d’une protéine immunogène de mollusque puis une injection sous-cutanée de cette même protéine (5 min) à 8 jours d’intervalle. Les animaux seront soumis également, sous anesthésie, après injection intraveineuse de la molécule thérapeutique d’intérêt (30 min), à plusieurs prélèvements sanguins (au maximum 6 dans une même journée, 16 sur la totalité de la procédure expérimentale sur 48 jours), notamment lors d’une anesthésie prolongée de 2h, quelques prélèvements de moelle osseuse (N=3, avant traitement, j10 et j21) et de ganglions (N=3, avant traitement, j7 et j21).

Impact sur les animaux

Les protocoles d’anesthésie répétés sur 24h lors de l’injection de la molécule pour évaluer la pharmacodynamique seront inconfortables et à ce titre, les animaux spécifiquement lors de cette journée seront suivis de manière accrue et l’inconfort le plus adéquatement maîtrisé. Les modèle d’inflammation pourrait créer une démangeaison locale qui sera alors protégée si tel est le cas.

Devenir

Les protocoles utilisés dans cette étude permettent une réutilisation de l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet après accord du vétérinaire pour une nouvelle procédure légère ou modérée exceptés ceux utilisés pour évaluer la biodistribution de la molécule qui nécessite un prélèvement de différents organes après euthanasie (N=5 animaux).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule. Les résultats obtenus lors d’études préliminaires in vivo chez la souris nous permettent maintenant d’étudier la molécule de façon plus précise chez le primate non humain.

Réduction

Ce genre de protocole chez le macaque ne peut être réalisé comme une étude statistique, en effet, dans le respect de la règle des 3R et d’un point de vue éthique, nous limitons le nombre d’animaux au strict minimum, à savoir 3 animaux par groupe, ce qui rend impossible tout test statistique. Cependant, compte tenu de la variabilité individuelle, le nombre de 3 animaux/groupe est essentiel pour obtenir une relevance scientifique quant à l’interprétation des résultats obtenus et l’identification d’un éventuel effet thérapeutique tout en réalisant de manière fiable une étude cinétique dans le sérum de la molécule. De plus, si le modèle d’inflammation cutanée (injection bactéries inactivées) n’a pas d’impact sur la cinétique, l’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé. D’autre part, de façon à réduire le nombre d’animaux, il s’agit de réutilisation d’animaux dans le cadre strict de la loi après avis vétérinaire.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées chez le macaques sous anesthésie. La douleur sera dans la mesure du possible évitée par injection d’analgésique qui devra toutefois ne pas être dans la catégorie des anti-inflammatoires pour ne pas perturber ou annihiler l’effet de la molécule thérapeutique injectée et évaluée. Les animaux sont hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Au cours du protocole expérimental les individus traités sont hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. Il est en effet fondamental pour ne pas stresser davantage aussi bien l’animal traité que les autres animaux, de pouvoir lui faire facilement (sous anesthésie légère) des injections ou prélèvements qui seraient impossibles dans un environnement commun. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.

Choix des espèces

Les primates non humains, et plus précisément les macaques dans cette étude, représentent l’espèce animale de choix comme modèle préclinique étant donné leur morphologie, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’Homme. Différents modèles chez le macaque peuvent être ainsi développés pour mimer des situations cliniques connues, voire des protocoles similaires déjà existants chez l’Homme comme c’est le cas pour cette étude tout en étant moins douloureux, et tester différents protocoles thérapeutiques innovants en conditions précliniques. La constitution du système immunitaire est dépendante de l’âge des animaux donc il s’agira de préférence d’animaux jeunes adultes (3 à 4 kg) dont le système immunitaire est alors mature.

Nourries d'un régime pauvre en protéines qui leur fait perdre environ 15 % de leur poids et bloque leur croissance, 360 jeunes souris subissent sept jours de gavage quotidien et reçoivent pendant 50 jours, cinq minutes par jour dans une cage vide, un aliment thérapeutique ou un aliment standard. Au total, 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec pesée et mesure quotidiennes sous contention, huit prises de sang sous anesthésie, cinq séjours de dix heures en cage à fond grillagé et deux passages de dix minutes dans une boîte de 40 cm de côté pour évaluer leur anxiété. L'équipe veut montrer qu'un aliment thérapeutique qu'elle a développé, sans huile de palme, fait mieux que la formule actuelle contre la malnutrition aiguë sévère de l'enfant. Le porteur ne précise pas ce que les souris reçoivent par gavage pendant ces sept jours.

Objectifs

Selon un récent rapport de l’Organisation des Nations Unies, 828 millions de personnes ont été touchées par la faim dans le monde en 2021. Parmi les affections liées à la faim, la malnutrition aiguë sévère (MAS), qui se caractérise par une perte de poids très importante et une dysfonction du tube digestif, est une pathologie qui touche à l’échelle mondiale plus de 13 millions d’enfants âgés de moins de 5 ans. La perte de masse sévère chez les enfants de moins de 5 ans cause un cinquième de la mortalité infantile mondiale. Afin de lutter contre cette pathologie un aliment thérapeutique prêt à l’emploi (ATPE) a été développé à la fin du XXème siècle. La composition de cet ATPE n’a pas évolué depuis sa première formulation et pourrait être considérée comme désuète compte tenu des connaissances actuelles en physiologie de la digestion. Ce projet propose de montrer l’efficacité accrue d’un nouvel ATPE par rapport à l’ATPE existant sur la reprise de poids, la fonction intestinale et les fonctions cognitives de souris atteintes de malnutrition aiguë sévère.

Bénéfices attendus

Au terme de cette étude nous espérons apporter la preuve d’une meilleure efficacité d'un nouvel aliment prêt à l'emploi (ATPE2) par rapport à un ATPE1 de souris atteintes de malnutrition aiguë sévère et valider l’ATPE testé en tant qu’aliment thérapeutique pour combattre la malnutrition aiguë sévère. En plus d'apporter une nouvelle solution pour lutter contre la malnutrition aiguë sévère, la composition de l’ATPE2 est plus respectueuse de l’environnement car il ne contient pas de graisses hydrogénées ou d’huile de palme.

Procédures

Interventions sur animaux : 1) Alimentation hypo-protéinée à volonté pour 360 souris vigiles. 2) Administration par gavage sur 360 souris vigiles (Durée 15 sec ; 1x tous les jours pendant 7 jours) 3) Administration à volonté de l’aliment thérapeutique prêt à l’emploi sur 360 souris vigiles (Durée 5 min/jours pendant 50 jours). Les souris seront placées dans une cage vide avec une boite de pétri contenant l’aliment thérapeutique prêt à l’emploi ou d’aliment standard. 4) Contention pour mesure de la masse (1x/jours tous les jours, 10 sec), de la longueur de la queue (1x/jours tous les jours, 10 sec) sur 420 souris vigiles. 5) Prélèvement sanguin (1x/7 jours, soit 8 fois, durée 2 min) sur 420 souris anesthésiées. 6) Mesure de l’activité métabolique (cage avec un fond grillagé permettant de collecter l’urine et les fèces) avec une durée de 10h sur 420 souris vigiles (5x) 7) Mesure de l’anxiété et de l’activité locomotrice (1x avant traitement et 1x en fin de traitement, durée 10 min) sur 420 souris vigiles. Les souris sont placées dans une boite de 40x40 cm et sont libres d’explorer cette boite pendant 10 min.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de la malnutrition aiguë sévère est l’importante perte de poids qui, pour la souris, est de l’ordre de 15%. Cet effet est visible après 4 jours de régime hypo-protéiné. De plus, les souris modèles de malnutrition aiguë sévère n’ont pas une courbe de croissance normale, leur masse n’augmentant pas en fonction du temps. Les aliments thérapeutiques prêts à l’emploi sont des produits alimentaires destinés à l’humain et pourraient avoir des effets indésirables sur les souris (Ex : diarrhée). L’induction de la dysfonction intestinale peut provoquer une inflammation du système digestif chez la souris, ce qui pourrait aussi nuire à la digestion normale de l’animal. Enfin, les prélèvements sanguins répétés sur les souris (1 fois par semaine) lors de nos expérimentations pourraient engendrer des nuisances.

Devenir

A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs organes pour des analyses biologiques. Ces analyses permettront de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’effet thérapeutique du nouvel ATPE. Les animaux ne seront donc pas gardés en vie car nous allons collecter l’appareil digestif, le foie, la rate, les reins et le cerveau pour procéder à des analyses biologiques.

Remplacement

L’utilisation de l’animal est inévitable pour notre projet car nous cherchons à caractériser l’effet bénéfique d’un régime alimentaire au niveau systémique. Actuellement aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité.

Réduction

L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 20 souris par groupe expérimental et nous répéterons les expériences 3 fois afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres biologiques sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera suivi tout au long de nos expériences et fera l’objet de procédures strictes. Les souris seront toujours hébergées en groupes dans des cages avec une surface réglementaire, avec un libre accès à l’eau et la nourriture. Un suivi des animaux a été mis en place en accord avec le comité de suivi du bien–être animal de notre établissement pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les animaux auront à disposition des igloos, des bâtons à ronger et cotons pour la nidification. Les animaux seront suivis quotidiennement, permettant la détection précoce d’anomalies éventuelles. Des périodes d’acclimatations à l’hébergement comme à la manipulation permettront de limiter l’angoisse des animaux. Dans le cadre de notre projet la perte de poids est l’élément majeur à prendre en compte. Dans le cas d’un animal montrant une perte de poids supérieur à 20% de son poids initial, l’animal sera exclu de l’étude le temps de son rétablissement et à nouveau alimenté pendant la période de convalescence. Si ce nouveau régime alimentaire ne permet pas une reprise de poids et que l’animal atteint les points limites définis il sera euthanasié. Par exemple, un animal sera euthanasié s’il présente une prostration continue, une déshydratation ou une perte de poids supérieure à 20% de son poids initial. Enfin, les études sont systématiquement optimisées (durée du régime) d’après la littérature. De plus, les traitements sont administrés de la façon la moins invasive possible : alimentation (Administration à volonté). Enfin, les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale gazeuse afin de minimiser le stress induit par cet acte sur les animaux.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux vivants est un jalon nécessaire dans la conception de nouveaux médicaments, en particulier pour obtenir la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique du produit que nous avons développé. Ce projet a pour but de démontrer qu’un nouvel aliment thérapeutique prêt à l’emploi est efficace dans un modèle de malnutrition aiguë sévère (MAS). Les rongeurs et en particulier les souris, sont fréquemment utilisés pour modéliser les maladies humaines. La pathologie dans notre étude est induite par une diminution de l’apport journalier en protéine. Les souris présentent, dans ce cas, bon nombre des signes physiopathologiques caractéristiques de la maladie (dont la perte de poids, ralentissement du développement). Le choix d’utiliser des souris a aussi été conforté par le fait qu’il est simple, rapide d’utiliser cette espèce et qu’il existe un plus grand nombre d’outils d’analyse disponibles, par rapport aux autres espèces. La malnutrition aiguë sévère est une pathologie qui peut affecter les individus à tout âge. Nous focaliserons notre étude sur la période de développement post-sevrage jusqu’à l’âge adulte. Les symptômes induits par la MAS, ainsi que les effets indésirables, ont une influence délétère à long terme lorsque cette pathologie intervient pendant l’enfance. Il s’agit donc ici de modéliser cette affection durant le développement, ce qui correspondra à la MAS observée durant l’enfance. De plus, des paramètres de développement pourront être mesurés durant l’expérimentation et comparés à ceux d’un développement normal (Poids, dimension des organes) en fonction de l’âge des animaux.