Recherche appliquée

15 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le virus de la diarrhée épidémique porcine, puis reçoivent un antiviral en instillation nasale, avec des prises de sang et des écouvillonnages nasaux, rectaux et salivaires. Le porteur indique que l'infection peut provoquer diarrhées et vomissements, avec une mise à mort possible avant la fin selon les points limites, et que les porcs sont tués pour prélever leurs tissus. Il affirme que seuls les porcs sont sensibles à ce virus, ce qui rend selon lui leur utilisation 'indispensable'.

Objectifs

Le but de ce projet d’expérimentation animale est de valider l’utilisation d’antiviraux au niveau de la cavité nasale pour bloquer la transmission de virus à transmission aérosol. Il s'agit de démontrer la pertinence ou non d’un nouveau type de traitement antiviral, non invasif, pouvant être utilisé chez les porcelets pour prévenir la transmission des souches hautement pathogènes à transmission aeroportée du PEDV. Cette approche a été validée sur petits animaux (modèle rongeur avec le SARS-CoV-2). Le présent projet vise à valider cette approche sur de gros animaux (porcelets) en utilisant un virus porcin, le virus de la diarrhée épidémique porcine (PEDV), connu pour être transmis par voie respiratoire. Comme son action exacte dans la cavité nasale n’est pas décrite, le projet se déroulera en deux étapes. La première consistera à étudier les troubles provoqués par ce virus dans les fosses nasales. La seconde étape visera à valider un traitement antiviral en instillation nasale pour prévenir la contamination d’animaux par aérosol.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus à partir de l’expérimentation animale serviront preuve de concept et permettront de développer de nouvelles méthodes pour lutter contre les virus hautement pathogènes transmissibles par aérosol.

Procédures

Les prises de sang et les écouvillonnages (nasal, rectal et salivaire) à J0, J1 et J2 (et éventuellement à J3) seront réalisés par du personnel expérimenté. Administration d'un antiviral en intranasal.

Impact sur les animaux

L’infection pourrait engendrer dès le premier jour des symptômes de diarrhées et vomissement. Les animaux pourront être mis à mort avant la fin de l'expérimentation en fonction de la grille de points limtes définie.

Devenir

Les porcs seront mis à morts afin de prélever les tissus.

Remplacement

Le projet est basé sur la démonstration d’une faisabilité de traitement antiviral de la cavité nasal par antiviral pour bloquer une transmission aérosol d’un virus sur un animal de rente de grande taille. Seule une expérience sur animal permet de répondre à ces approches novatrices qui ont déjà été validées sur petit animal (Hamster). Les antiviraux développés contre le PEDV sont tout d’abord validés en systèmes in vitro (alternative qui est habituellement utilisées pour les infections virales de type lignées cellulaires et organoïdes) pour leur capacité à bloquer l’entrée du virus dans ses cellules cibles. Cette validation est un prérecquis pour envisager un blocage de la transmission par aérosol qui est au centre du présent projet. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun développement de ces alternatives in vitro, permettant d’étudier la transmission virale par aérosol qui doit donc être validée sur animal. Etant donné que seuls les porcs sont sensibles à l’infection par les virus de la PEDV et que nous voulons démontrer la pertinence d’un traitement d’antiviral sur des porcelets, l’utilisation de ces animaux est indispensable.

Réduction

La première procédure est exploratoire et nos expériences antérieures montrent que 3 porcelets est le minimum nécessaire pour étudier la présence ou non du virus dans les voies respiratoires. Pour la deuxième procédure le nombre d’animaux impliqué dans chaque groupe (n=4) constitue un minimum nécessaire pour des analyses statistiques compte tenu de la variabilité individuelle attendue sur les paramètres mesurés. De plus, l'équilibre des groupes en nombre permet d'offrir aux animaux des conditions de vie identiques en matière de surface et d’accès à l’auge par animal, évitant des soucis de concurrence, qui pourraient interférer avec les résultats de l'expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes stables avec enrichissement du milieu. Les animaux seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Des objets manipulables seront mis à leur disposition. Des lampes chauffantes et une plaque de couchage leur offriront un confort optimum.

Choix des espèces

Ici, seuls les porcs sont sensibles à l’infection par les virus de la PEDV et comme nous voulons démontrer la pertinence d’un traitement d’antiviral sur gros animaux, l’utilisation des porcs est indispensable. Utilisation de porcelets de 4 à 6 semaines d’âge maximum pour que les porcelets soient sevrés et pour diminuer le risque d’apparition de symptômes comme les vomissements et diarrhées tout en favorisant l’infection.

1566 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des cellules cancéreuses par voie sanguine ou sous-cutanée sous anesthésie, puis elles reçoivent divers traitements par injection ou gavage et des prélèvements de sang à la joue, pour évaluer un traitement sur cinq types de cancers. Le porteur indique que le développement tumoral peut entraîner une gêne pour se déplacer, un amaigrissement et un isolement, et que toutes les souris sont tuées pour analyser leurs organes. Il affirme que seul un modèle vivant entier permet d'étudier l'évolution tumorale et les récidives.

Objectifs

Pour traiter leucémie et tumeurs solides, il est important de trouver de nouvelles façons de soigner les patients tout en minimisant les effets secondaires. Récemment, il a été développé un médicament spécifique des cellules qui prolifèrent rapidement (comme les cellules cancéreuses). Aujourd’hui, ce traitement est testé en essai clinique sur des patients atteints de leucémie, et nous souhaitons élargir l’utilisation de notre traitement à d’autres cancers agressifs, comme celui du poumon, du sein, du pancréas et le mélanome. Dans des expériences préliminaires de laboratoire, ces cellules cancéreuses sont tuées efficacement par le médicament. L’utilisation de la souris nous permet de confirmer l’efficacité du médicament dans un environnement physiologique et vivant avant de tester le produit en clinique, chez l'homme. Dans une seconde partie du projet, comme il est souvent difficile de traiter totalement le cancer avec un seul médicament, nous souhaitons combiner notre traitement avec d’autres agents couramment utilisés en cliniques aujourd’hui. Ces combinaisons de plusieurs thérapies sont de plus en plus utilisées en clinique pour augmenter l’efficacité de traitement, réduire le risque que le cancer se redéveloppe et surtout réduire les effets secondaires. Nous avons déjà testé ces combinaisons en laboratoire et avons obtenus de résultats prometteurs. Avant de pouvoir appliquer notre traitement chez les patients atteints de cancers, seul ou en combinaison, il est nécessaire de valider nos résultats sur des modèles animaux qui récapitulent fidèlement ce que l'on observe chez l’homme. Ce projet nous aidera à mieux comprendre comment le cancer peut développer une résistance, comment notre traitement interagit avec le corps humain et d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du cancer.

Bénéfices attendus

Le processus de développement d’un nouveau traitement, de sa conception initiale jusqu’à son autorisation de mise sur le marché, peut nécessiter en moyenne entre 15 et 20 années. Il est donc impératif d’optimiser au maximum l’utilisation de chaque avancée thérapeutique. Ce projet permettra d’une part d’optimiser le développement de notre traitement en l’appliquant sur différents modèles de cancer agressifs, notamment sur un modèle de cancer de pancréas pour lequel seules la chirurgie et la chimiothérapie conventionnelle existent. D’autre part, ce projet apportera une meilleure compréhension de la résistance thérapeutique, et dans la récidive du cancer. Cette compréhension favorisera la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques, qui permettront de réduire la dose administrée de chaque traitement, et par conséquent réduire le coût, les effets indésirables, et surtout la résistance au traitement. En effet, ces bithérapies permettront d’offrir une alternative thérapeutique aux patients résistants à un agent, et donc cibler une plus large partie de la population. Ainsi, ce projet ouvrira de nouvelles perspectives dans le traitement des leucémies aiguës, de cancers solides, et offrira une alternative aux patients en quête de traitements plus efficaces et mieux tolérés.

Procédures

Les animaux seront soumis à des greffes de différentes cellules cancéreuses pour développer la maladie, par voie sanguine ou sous cutanée. Avant et pendant chaque greffe, les souris sont endormies. Les responsables du projet suivront l’évolution de la maladie 2 fois par semaine. Pour une des procédures, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins au niveau de la joue pour surveiller l’évolution de la maladie. Ces prélèvements seront effectués sur des animaux endormies une fois par semaine au maximum, soit un total de 3 à 12 prélèvements totaux selon la procédure. Les animaux seront divisés en plusieurs groupes pour leur administrer différents traitements par voie sanguine, sous-cutanée ou par gavage. L’administration de traitements ne nécessite pas le recours à l’anesthesie. Selon les procédures, les différents traitements seront administrés par voie orale, par injection sous-cutanée ou par injection sanguine. Toutes interventions sur la souris (injections de cellules tumorales en sous cutanée, gavages, injection du traitement et prélèvements) effectuées par des membres qualifiés dureront 1 à 5 minutes maximum par souris. Le temps de developpement de la maladie (en sous cutanée ou par voie sanguine) est estimé à deux semaines. Au moins 2 fois par semaine, les responsables du projet observeront les animaux pour détecter tout inconfort ou signe de douleur.

Impact sur les animaux

Les transplantations de cellules, les prélèvements de sang, et les administrations de traitement par voie intraveineuse se feront sous anesthésies gazeuses, ce qui peut occasionner un stress de courte durée à l’induction et au réveil. Certains traitements sont administrés par voie orale avec une technique appelée gavage qui peut entrainer une gêne physique en cas d’administration quotidienne. Comme attendu dans ce projet, les greffes de cellules vont aboutir à un développement tumoral, qui, à un certain stade, peut occasionner une gêne pour se déplacer, un amaigrissement, une isolation, une perte d’activité.

Devenir

A l'issue des expérimentations, tous les animaux seront sacrifiés pour réaliser des analyses sur les organes et évaluer la présence éventuelle de cellules cancéreuses résiduelles.

Remplacement

Nous avons déjà effectué plusieurs tests de laboratoire (qui ne nécessitent pas l'utilisation d'animaux) qui ont confirmé l’efficacité antitumorale de notre anticorps seul et en combinaison avec d’autres médicaments. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier en profondeur l’évolution tumorale, les récidives, et la réponse de l’organisme au traitement. De plus, il est important d’évaluer consciencieusement les potentiels effets secondaires de notre traitement et s’assurer de la non-toxicité avant son application chez l’homme. Enfin, nous souhaitons étudier l’effet de notre traitement sur la survie des individus. Pour ces raisons, seul un modèle vivant entier pourra répondre entièrement à notre projet. La souris reste donc aujourd’hui le modèle le plus pertinent pour répondre à nos objectifs scientifiques.

Réduction

Grâce à des études déjà réalisées au sein de notre laboratoire et à des tests statistiques réalisés on sait que pour interpréter les résultats obtenus, il faut utiliser au moins 8 animaux par conditions. Ces calculs sont confirmés aussi par d’autres laboratoires, et sont également présents dans la littérature. En plus, nous utiliserons les mâles et les femelles pour généraliser la réponse au médicament chez les deux sexes.

Raffinement

Toutes les procédures seront soumises au respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés en groupe pour privilégier leurs interactions sociales, dans des cages propres et contrôlées, contenant des jouets. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et 2 fois par semaine par les responsables du projet. Les protocoles ont déjà été optimisés pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les injections et prélèvements dures 5 minutes et sont réalisés par des membres qualifiés, sur les animaux endormis permettant la réduction du stress et douleur. En cas de douleur qui peut se développer à cause de l’évolution du cancer, des anti-douleurs leur seront administrés. Un score de douleur sera établi 2 fois par semaine selon une grille très spécifique. En cas de non-réponse aux antidouleurs, les animaux seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est considérée aujourd’hui comme un modèle pertinent pour étudier et comprendre l’évolution du cancer et la réponse aux traitements observée chez l’homme, notamment du fait de la similarité biologique. Pour ce projet nous utiliserons des souris adultes (>6 semaines) pour refléter l'âge de développement de ces tumeurs chez l'homme.

3069 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une neurotoxine leur est injectée dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique pour reproduire un comportement de type narcoleptique, puis leur activité est enregistrée en isolement individuel pendant 48 heures avant la chirurgie et 21 jours après, avant l'administration quotidienne d'un candidat médicament pendant 23 jours. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, perte de poids et posture voûtée, et que les rats sont tués pour prélever leur cerveau. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer le cycle circadien dans la narcolepsie et que le recours à l'animal est 'nécessaire'.

Objectifs

La narcolepsie est une maladie chronique rare et non curable survenant le plus souvent dans l’enfance et l’adolescence. Ce trouble du sommeil est caractérisé par un sommeil nocturne de qualité médiocre, une somnolence diurne excessive et des endormissements irrépressibles pouvant survenir à tout moment de la journée, même en pleine activité, généralement avec des épisodes soudains et passagers de faiblesse musculaire. Des études ont montré qu’une injection d’une neurotoxine dans le cerveau, chez le rat, induisait un comportement de sommeil de type narcoleptique. Le rat est un animal nocturne présentant une activité locomotrice qui est 4 à 5 fois plus élevée pendant la phase nocturne que pendant la phase diurne. L’activité circadienne est donc un indice fiable du cycle de sommeil/éveil. De ce fait, une diminution de l’activité durant la phase nocturne est un indicateur d’une augmentation du sommeil c’est-à-dire d’un comportement de sommeil de type narcoleptique. L’objectif de ce projet est (1) d’examiner si une injection bilatérale d’une neurotoxine dans le cerveau induit un comportement de sommeil de type narcoleptique chez le rat et (2) dans le cas où l’injection de la neurotoxine entraîne une perturbation de l’activité circadienne pendant la phase nocturne, d’examiner l’efficacité de candidats médicaments sur ces perturbations préalablement observées. Actuellement, aucun traitement curatif n’existe. Il subsiste cependant la possibilité de traitements médicamenteux pour traiter par exemple la somnolence diurne excessive. Cependant, ces traitements ne traitent pas la cause mais seulement les symptômes et ils sont de plus inconstamment efficaces et parfois associés à des effets secondaires. Ce modèle est donc pertinent pour le développement de cibles thérapeutiques pouvant améliorer la qualité de vie des patients atteints de narcolepsie.

Bénéfices attendus

La narcolepsie est une maladie neurologique chronique rare, débutant le plus souvent dans l’enfance et l’adolescence et provoqué par une perte des neurones synthétisant la protéine hypocrétine. Elle se caractérise par un sommeil nocturne de qualité médiocre, d’une somnolence diurne excessive et des endormissements irrépressibles pouvant survenir à tout moment de la journée, même en pleine activité, généralement avec des épisodes soudains et passagers de faiblesse musculaire (cataplexie). Il existe actuellement peu de médicaments pour améliorer les symptômes de la narcolepsie. De plus, les traitements ne traitent pas la cause mais seulement les symptômes et ils sont de plus inconstamment efficaces et parfois associés à des effets secondaires. Ainsi ce modèle est pertinent pour le développement de cibles thérapeutiques pouvant améliorer la qualité de vie des patients atteints de narcolepsie.

Procédures

1- Avant l’injection bilatérale dans le cerveau, le rythme circadien des animaux est étudié de façon individuelle, dans un test de comportement moteur/exploratoire, pendant 48 heures. 2- Les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale (injection d’une neurotoxine dans le cerveau) qui dure dans sa totalité environ une heure (de l'anesthésie jusqu'au réveil). 3- Après l’injection bilatérale de la neurotoxine dans le cerveau, le rythme circadien est étudié sur chaque animal de façon individuelle dans un test de comportement moteur/exploratoire, pendant 21 jours consécutifs. 4- L’effet d'un candidat médicament sur la perturbation de l'activité circadienne induite par l’injection bilatérale de la neurotoxine dans le cerveau est étudié. Selon le groupe, les animaux reçoivent une administration par jour soit d'une solution saline soit du candidat médicament (durée totale du traitement 23 jours - durée du geste moins d’une minute). 5- A la fin de l’expérience, les animaux sont mis à mort. Cet acte est réalisé sous anesthésie générale profonde (soit anesthésie gazeuse soit anesthésie par injection).Puis le cerveau de l’animal est prélevé post-mortem et des coupes histologiques sont réalisées sur le cerveau pour des analyses immunohistochimiques. Dans sa totalité, l'intervention dure en moyenne 40 minutes.

Impact sur les animaux

(1) Chirurgie : l’injection bilatérale stéréotaxique d’une neurotoxine dans le cerveau. Le type de douleur attendue est uniquement de la douleur lié à la chirurgie stéréotaxique. En cas de douleurs, on remarquera chez l’animal : la présence de porphyrine (pigment rouge autour des yeux et du nez), une diminution des mouvements, une perte de poids et une posture voutée ; (2) Administration de candidats médicaments. Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. De par notre expérience, les effets indésirables sont rares car la toxicité des candidats médicaments est généralement testée en amont avec des doses croissantes de la molécule ; et (3) L’isolement des animaux. Avant l’injection bilatéral, dans le cerveau, le rythme circadien est étudié sur chaque animal de façon individuelle (un animal par enceinte) dans un test de comportement moteur/exploratoire, pendant 48h. Après l’injection bilatérale de la neurotoxine, dans le cerveau, le rythme circadien est étudié sur chaque animal de façon individuel (un animal par enceinte) dans un test de comportement moteur/exploratoire, pendant 21 jours consécutifs.

Devenir

A la fin de l’expérience, les animaux sont mis à mort. Cet acte est réalisé sous anesthésie générale (soit anesthésie gazeuse, soit anesthésie par injection). Le cerveau de l’animal est ensuite prélevé post-mortem et des coupes histologiques sont réalisées sur le cerveau pour des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucune méthode alternative permettant d’évaluer le cycle circadien dans la narcolepsie. Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Etant donné la variabilité probable, 11 animaux par groupe au maximum sont prévus dans ce projet pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable – tout en prenant en compte le bien-être animal. Cet effectif correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Pour chacune des étapes, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Toutes les expériences sont réalisées après une période d’acclimatation de 14 jours. Les animaux sont hébergés par deux dans des cages transparentes de type III contenant de la litière et des enrichissements (matériel de nidification : sizzle dri kraft et brique de peuplier) afin de réduire le stress. Ils sont quotidiennement observés par des techniciens/ingénieurs formés et attentifs. Les soins pré et post opératoires sont les suivants : (1) Trente minutes avant l’acte chirurgical, les animaux reçoivent une administration sous-cutanée d’un analgésique puis ils sont anesthésiés (anesthésie gazeuse) ; (2) Durant l’acte chirurgical, les animaux ont un soutien thermique (couverture chauffante) de façon à éviter l’hypothermie et du gel oculaire stérile est également déposé sur les yeux des animaux, formant une couche protectrice, une humidification et une lubrification de la surface cornéenne de l’œil et (3) juste après la chirurgie, les animaux reçoivent une administration sous-cutanée d’un anti-inflammatoire et une administration sous-cutanée d’une solution saline (1ml). Une coupelle contenant du « Gel Diet Energy » mélangé à de la nourriture mouillée est déposée sur le sol de la cage pour stimuler l’appétit et la mobilité gastro-intestinale de l’animal. La cage d’hébergement est placée sur une plaque chauffante jusqu’au réveil de l’animal. Par ailleurs, lors des soins post- opératoires, les animaux reçoivent une administration sous-cutanée d’un anti-inflammatoire pendant 2 à 5 jours (selon leur état général), comme indiqué dans la formation réglementaire en chirurgie expérimentale, pour garantir le bien-être animal. Ici, le type de douleur attendue est uniquement de la douleur lié à la chirurgie stéréotaxique. Les animaux sont également pesés et leur état général est évalué durant toute la durée de l’expérience, selon notre grille de surveillance, pour détecter tous signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. Par ailleurs, le rat est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer facilement les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. 5 semaines au moment de la chirurgie. Dans ce projet, seuls des animaux adultes seront utilisés car il n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation pulmonaire leur est induite par injection de bléomycine ou de LPS, puis elles reçoivent un agent de contraste par un cathéter posé sous anesthésie pour tester une technique d'imagerie à particules magnétiques. Le porteur indique que la fibrose pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, de la prostration et une perte de poids, les animaux perdant plus de 15 % de leur poids étant tués. Il affirme que les procédures ont un caractère de stricte 'nécessité' et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux vivants.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester in vivo l'imagerie à particules magnétiques (MPI) pour le diagnostic précoce de l'inflammation pulmonaire en utilisant un nouvel agent de contraste composé de microparticules de polydopamine couplées à un anticorps anti-VCAM-1. Ces molécules d’adhésion endothéliales VCAM-1 sont exprimées à la surface des cellules endothéliales lors d’un épisode inflammatoire aigu ou chronique comme une inflammation systémique, une atteinte rénale ou une maladie rénale chronique. Des tests préliminaires sur cet agent de contraste en imagerie à particules magnétiques ont montré que les propriétés magnétiques de cet agent de contraste permettaient une sensibilité de détection en MPI supérieur à celle de l’imagerie par résonance magnétique (IRM). D’autres part, des études in vitro et in vivo ont montré les propriétés biocompatibles et biodégradables de cet agent de contraste et il a été également démontré que cette stratégie était efficace pour cibler les cellules endothéliales activées humaines, ouvrant la voie à une potentielle translation en clinique. L'utilisation de cet agent de contraste semble donc être un outil prometteur pour la détection en pré-clinique de l'inflammation en MPI et nous prévoyons de tester dans ce projet la capacité de détecter l’inflammation pulmonaire dans différents modèles chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce nouvel agent de contraste a montré une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter l'inflammation in vivo dans le cerveau, les reins et la muqueuse intestinale. Nous savons que ces microparticules ont un signal en MPI du fait de leur propriété magnétiques spécifiques. Il est donc attendu de la technique d'imagerie MPI utilisant les M3P qu'elle puisse elle aussi permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation pulmonaire par rapport aux animaux contrôles n'ayant pas d'inflammation.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Imagerie MPI avec injection de produit de contraste (durée : environ 30min).

Impact sur les animaux

Les deux modèles présentés peuvent en effet induire des effets indésirables sur les animaux. La bléomycine est un agent anti-cancéreux dont un de ces effets secondaire est d’induire de la fibrose pulmonaire, d’où son utilisation courante en recherche préclinique pour l’induction d’inflammation pulmonaire. Le LPS est un sucre que l'on trouve à la surface des bactéries dont l'injection simule la présence de bactérie et induit ainsi une réaction immunitaire forte. Il est important de noter que la dose de LPS choisie pour ce projet (100 µL à 0.5 mg/mL) n'induit pas de mortalité chez les souris. L'induction de l’inflammation pulmonaire et la fibrose pulmonaire peuvent entrainer des difficultés respiratoires. Dans ces deux modèles, les animaux peuvent être en mal-être qui peut alors être repéré par de la prostration, une inactivité dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids. Lors du protocole d'imagerie MPI, celui-ci se déroulera sous anesthésie générale des animaux mais la pose du cathéter veineux pour l'administration de l'agent de contraste peut provoquer un hématome.

Devenir

Tous les animaux de cet étude sont mis à mort à l’issue des 2 procédures.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisées sur l'gent de contraste en imagerie à particules magnétiques (utilisation de "fantômes") et ont permis de montrer que les propriétés magnétiques des microparticules conféraient un signal spécifique en imagerie à particules magnétiques (MPI). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour les molécules d'adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires ainsi que les temps de ciblage et de détectabilité de l'agent de contraste en imagerie MPI lorsqu'elles sont injectées dans un organisme. D'après les études pilotes citées, on sait que l'agent de contraste cible efficacement l'inflammation dans d'autres pathologies et l'on souhaite savoir si ce ciblage sera détectable en imagerie MPI pour révéler l'inflammation pulmonaire. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets, ayant utilisé des protocoles d'imagerie similaires pour évaluer l'inflammation dans d'autres tissus avec les mêmes types de microparticules. Dans ces deux études précédentes il a été montré que 5 animaux par modèle étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Les données de ces 5 animaux étaient comparées à 5 autres animaux du groupe contrôle. Il semble intéressant d'étudier l'effet sexe sur le développement de ces modèles d'inflammation ainsi que l'efficacité du ciblage de l'agent de contraste et de leur détection par imagerie photoacoustique, nous prévoyons donc de réaliser chaque modèle sur 5 souris mâles et 5 souris femelles. Avec les animaux contrôles (recevant des injections de liquide physiologique), cela fait donc 20 animaux par modèle. De plus, nous aurons besoin d'évaluer la sensibilité et la spécificité de la méthode en utilisant des microparticules non ciblées, en utilisant 20 autres animaux (10 animaux pour chaque modèle d'inflammation (5 mâles et 5 femelles) et 10 animaux contrôles (5 mâles et 5 femelles aussi) ), amenant au total à 40 animaux par modèle. Ces effectifs ont été confirmés par un calcul de taille d'échantillons avec pour paramètres : moyenne anticipée groupe 1 (modèle) = 10 +/- 5 et groupe 2 (contrôle) = 1, alpha = 0.05, ayant donné un résultat de 5 animaux nécessaires par groupe. Les moyennes de signal obtenues seront analysées par un test de Mann-Whitney.

Raffinement

Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des animaux de type boite à œuf, tunnel PVC et/ou igloo PVC est prévu. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure (points limites cités plus loin) ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Une coupelle de croquettes humides aura été préalablement placée dans la cage afin de permettre aux animaux malades de s'alimenter et de s'hydrater plus facilement. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite 15 minutes après les instillations (LPS ou bléomycine), puis 1 heure après et 2 fois par jour jusqu’à l’euthanasie des animaux. De plus, pendant la durée des modèles et avant la perfusion intracardiaque réalisée pour le prélèvement des organes d'intérêt (reins), la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir ces temps d'étude par une analgésie. En amont de ce projet, pour limiter la douleur engendrée par l’intubation lors de l’injection intratrachéale, nous avons choisi de n'utiliser qu'une dose de LPS, connue pour ne pas induire de mortalité chez les souris. Les points limites suivants et les décisions prises en conséquence sont définis comme suit : Niveau 1 : diminution de l’activité dans la cage, réduction de l’interaction avec les congénères, absence de toilettage, dos vouté, rétrécissement de l’ouverture orbitaire, changement de position des oreilles et des moustaches (oreilles vers l’extérieur, moustaches vers l’avant ou vers l’extérieur) --> Augmentation de la surveillance (4 fois par jour). Niveau 2 : perte de poids de plus de 15 %, prostration dans la cage, absence de réaction au toucher, tremblements/convulsions, saignements rectaux --> Mise à mort de l’animal par administration d’une dose létale d’anesthésique.

Choix des espèces

D’un point de vue scientifique cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic d’un mauvais état de santé chez l'homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un diagnostic positif d'inflammation cérébrale doit s’effectuer sur des modèles in vivo.

1359 souris vont être utilisées dans un élevage impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire une lignée modèle de la maladie d'Alzheimer à phénotype dommageable. Sur ce total, le porteur indique que 990 seront transférées vivantes vers un autre site pour y être utilisées dans des expériences, tandis que 270 reproductrices et 99 souris à phénotype dommageable seront tuées. Les souriceaux sont identifiés par tatouage des phalanges et génotypés par un prélèvement au bout de la queue au septième jour de vie. Le porteur décrit que ces souris transgéniques peuvent développer des crises d'épilepsie et devenir agressives avec l'âge, et affirme qu'aucun modèle cellulaire n'est assez complexe pour se substituer à l'étude de la rétine menée ensuite.

Objectifs

Le but du présent projet est de faire un élevage d’une colonie de souris modèle. Il s’agit d’un modèle murin de la maladie d'Alzheimer à phénotype dommageable. La production de cette colonie servira ensuite à caractériser le phénotype rétinien chez le modèle dans le but d’identifier de nouveaux marqueurs de diagnostic précoce non-invasive de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Élevage de la colonie de souris modèle à phénotype dommageable. Cette colonie de souris servira par la suite à mettre en place une nouvelle méthode de diagnostic de la maladie d’Alzheimer et aussi améliorer le parcours de soin des patients.

Procédures

Les animaux transgéniques présentent un phénotype dommageable. Ces souris peuvent souffrir d’épilepsie à l’âge précoce et devenir agressive avec l’âge. Au 7ème jour de vie, un prélèvement caudal sera réalisé pour le génotypage. La procédure ne dure que quelques secondes mais peut générer un stress pour l’animal du fait de la contention ainsi qu’un saignement au niveau de la biopsie. Tous les animaux de l'élevage seront prélevés pour le génotypage une seule fois.

Impact sur les animaux

Les animaux transgéniques développant la maladie d’Alzheimer peuvent présenter des troubles épileptiques à l’âge d’environ 3 mois, cela représente moins de 5 pour cent des cas. Aussi ces souris transgéniques peuvent devenir agressifs avec l’âge. Le prélévement caudal pour le génotypage peut générer un stress pour l’animal du fait de la contention ainsi qu’un saignement au niveau de la biopsie. Une infection locale pourrait survenir suite au prélèvement caudal pour génotypage.

Devenir

Gardé en vie et transféré vers un autre site agrée pour les 990 souris pour expérimentation. Euthanasie des 270 souris reproductrice. Euthanasie ou mort des 99 souris à phénotype dommageable.

Remplacement

Les souris issues de cet élevage serviront à comprendre la réponse physiologique de la rétine ainsi que le développement de nouveaux marqueurs rétiniens lors de la maladie d’Alzheimer. La fonction rétinienne sera étudiée par imagerie et électrophysiologie in-vivo chez ce modèle. L’objectif de ces études concerne l’exploration des relations cellulaires au sein de la rétine à ce jour aucun modèle cellulaire n’est assez complexe pour se substituer à mimer la fonction rétinienne.

Réduction

Compte tenu de la nature de ce projet d’élevage, il ne nécessite pas d’approche statistique. Néanmoins, les projets dans lesquels seront affectés les animaux par la suite (utilisation continue) feront quant à eux l’objet d’un calcul de puissance et d’une analyse statistique adapté. Les élevages seront adaptés afin de produire le nombre adapté d’animaux dans le respect des 3Rs. La production d’animaux a été estimée à 1359.

Raffinement

Les animaux en provenance d’éleveurs agrées seront hébergés par trois (Un mâle reproducteur et deux femelles reproductrices) dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (papier kraft, bâton à ronger et éventuellement maisonnettes rouges). Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie. Avec une mise en place d’étiquettes au niveau des cages pour un meilleur suivie (note d’observation au cas de blessure, présence de souris gestante ou naissance). Les animaux transgéniques développant la maladie d’Alzheimer peuvent présenter des troubles épileptiques à l’âge d’environ 3 mois. Cela représente moins de 5 pour cent des cas. Si l’animal présente des crises d'épilepsies une euthanasie sera effectuée. Aussi, ces souris transgéniques peuvent devenir agressifs avec l’âge. Dans ce cas, l’isolement des souris est envisagé ou une euthanasie au cas de blessure grave. Aucun autre effet indésirable n’est décrit ou connu d’après notre expérience. Les animaux seront stabulés dans un environnement avec une alternance jour (7h-19h)/nuit (19h-7h), une température de 22+/-2 degrés Celsius et une hygrométrie à 50 +/- 10.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être physiologiquement similaire à l’Homme. En plus cette souris modèle présente un transgène humain. Ce modèle fait partie des modèles les plus utilisés pour l’étude de la maladie d’Alzheimer. Les souriceaux de 7 jours seront identifiés par tatouage au niveau des phalanges. Dans le même temps, un prélèvement caudal d’environ 1 mm sera réalisé pour le génotypage. Les animaux seront étudiés à l’âge de 3, 6, 9,12, 15 et 18 mois dans une autre animalerie agrée. Les animaux seront répartis par lot. Age de 3 mois : stade de début de perte synaptique. Age de 6 mois : stade de début d’apparition des protéines amyloïdes et de gliose. Age de 9 mois : stade de début de mort cellulaires. Age de 12 mois : stade de perte cognitif. Age de 15 à 18 mois : stade ou les symptômes sont exacerbés. Ces âges ont été bien définis dans la littérature.

100 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections de vecteurs de thérapie génique dans le cerveau ou en intraveineuse, suivies de chirurgies sous anesthésie, d'examens IRM, d'électromyogrammes et de multiples prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien. Le porteur indique des risques d'arrêt cardiaque, de fuite de liquide céphalorachidien, d'hématomes et de douleurs postopératoires, et prévoit de tuer tous les animaux pour analyser leurs organes. Il justifie le recours au macaque par la proximité de son cerveau avec celui de l'humain et par le caractère réglementaire de l'étude avant un essai clinique.

Objectifs

Dans ce projet notre objectif sera d’évaluer la biodistribution, la tolérance et l’efficacité de thérapies géniques dans le domaine des maladies neurodégénératives. Ces thérapies consisteront en l’injection de gènes dans différentes régions du cerveau variant en fonction de la pathologie d’intérêt (maladie de charcot, Alzheimer, Parkinson, Huntington, Ataxie, etc).

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d’obtenir toutes les données précliniques d’efficacité, de tolérance et de toxicité de l’utilisation d’une thérapie génique fondée sur l’injection intracérébrale ou intraveineuse de vecteurs Adéno- Associés (AAV) sur un modèle animal extrêmement proche de l’être humain afin de pouvoir proposer sur les différentes pathologies d’intérêt, un traitement et sa mise en place, au cours d’un essai clinique chez l’Homme, dans les prochaines années.

Procédures

- Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : injection intracérébrale de vecteurs suivi d’une imagerie par résonance magnétique post-opératoire immédiate (durée globale environ (5h)) ou une injection intraveineuse de 45min max - 6 à 8 prélèvements sanguins maximum respectivement pour les études à court et long terme , 5 à 7 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (durée du geste maximum 30min) respectivement pour les primates participants aux études à court et long terme, sous anesthésie générale et analgésie. - 4 à 6 examens par Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h), sous anesthésie générale respectivement pour les primates participants aux études à court et long terme pour l’injection intracérébrale-3 à 5 électromyogrammes (EMG) (environ 10min) sous anesthésie générale respectivement pour les primates participants aux études à court et long terme Dans ce projet, comme décrit précédemment, une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien + IRM + EMG selon les temps d’intérêt de l'étude).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont: - Une chirurgie sous anesthésie générale ou une injection intraveineuse avec un risque anesthésique (dépression respiratoire, arrêt cardiaque), un risque de contamination post opératoire et de douleurs post opératoires (pour l’injection intracérébrale) - Plusieurs prélèvements de sang et de liquide cephalo rachidien (LCR) sous anesthésie générale avec un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques) et la formation possible d’hématomes, l’anémie transitoire d’une dizaine de jours -La réalisation d’un electromyogramme qui nécessite d’être fait sous anesthésie générale pour des raisons de contention et de bonne réalisation sur un animal sauvage - stress lié aux Injections intra-musculaire avec contention en cage pour le suivi (anesthésies, analgésiques, immunomodulateurs, antibiotiques) - potentiellement des douleurs post opératoires pour la chirurgie

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour permettre les études post-mortem des tissus et des organes et vérifier la distribution du vecteur médicament dans les organes afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de cette approche.

Remplacement

Les études in vitro pour valider la cible thérapeutique sont effectuées en amont de ce projet afin de valider l’utilisation de notre cible thérapeutique dans les modèles murins de la pathologie. Enfin, notre stratégie thérapeutique et la fonctionnalité de nos vecteurs ont été réalisées chez la souris en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude d’efficacité, de toxicité, sur un modèle ayant un système nerveux plus développé que le rongeur et le plus pertinent pour reproduire ce qui se passera chez l’Humain, est le primate non humain. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’Agence francaise du médicament pour toute demande d’autorisation pour la réalisation d’étude clinique (chez l’homme).

Réduction

Il y a 100 animaux maximum sur ce projet, correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité des différentes approches avec des lots d’animaux allant de 2 pour une étude d’évaluation de diffusion et d’expression à 12 pour une étude de toxicité. Le temps de l’étude (suivi longitudinal) peut varier entre 6 semaines et 6 mois post injection. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié. Selon le nombre d’animaux inclus par étude cela peut représenter de 10 à 50 projets

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement, perchoir, échelle, hamac…). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie. L'utilisation d’un analgésique pour les ponctions lombaires et les injections virales, permettra d’éviter au maximum les inconforts. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Si un animal ne présente pas d'amélioration suite à une prise en charge vétérinaire, il sera euthanasié (avec avis vétérinaire) après avoir été anesthésié. Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, elles sont réalisées par du personnel formé et expérimenté́. Enfin, les étapes du suivi sont prévues pour optimiser le nombre d'anesthésies en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandations en termes de Bien-être animal), ponction lombaire, imagerie par résonance magnétique et Electromyogramme (EMG) si besoin en fonction des étapes du suivi) au sein de la même anesthésie générale. Les prélèvements, les examens type EMG ne sont réalisés que lorsqu'ils sont nécessaires au suivi planifié, il se peut que certaines études contractualisées avec nos collaborateurs demandent moins de prise de sang ou ne nécessitent pas la réalisation d'EMG, il y aura alors moins d'actes pratiqués sur les animaux que le schéma maximal décrit ici

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du macaque en particulier le cerveau, se rapprochent le plus du cerveau Humain en termes de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur médicament dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres (volume de vecteur à injecter, vitesse d’injection etc) du protocole qui sera réalisé chez l’Homme. L'injection de vecteurs adeno associés chez le macaque est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance pour l’Homme d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (1-15 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́ compte tenu des patients ciblés par nos approches

368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une déficience génétique en lipase acide lysosomale, elles subissent un génotypage par biopsie de la queue, une destruction de leur moelle osseuse par deux injections de Busulfan ou une irradiation létale, puis une greffe de cellules souches et jusqu'à quatre prélèvements de sang sous anesthésie. Le porteur indique que la destruction de la moelle peut provoquer une perte de poids et des plaies cutanées, et que les souris seront tuées pour prélever leur moelle osseuse et leur rate. Sur le remplacement, il affirme que les cellules de patients disponibles in vitro ne suffisent pas à reproduire la complexité du compartiment hématopoïétique, et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Le déficit en enzyme (=protéine) : lipase acide lysosomale (LAL) est une maladie génétique rare. Elle induit une accumulation de gras (=lipides) au niveau des organes, notamment dans le foie qui est fatal chez les patients. La transplantation de cellules souches de la moelle osseuse d’un donneur sain peut être bénéfique après déplétion au préalable des cellules du patient. Les cellules saines du sang produisent la protéine manquante et corrige l'accumulation de gras. Le manque de donneur compatible et le risque de rejet de greffe limitent le recours à cette procédure. Nous souhaitons développer un traitement curatif à long terme de la déficience en LAL (LAL-D) en utilisant une traitement génétique pour corriger les cellules souches de la moelle osseuse du patient. Les cellules corrigées du patient pourront à nouveau produire la protéine manquante et corriger l'accumulation de gras sans risque de rejet de greffe. Pour mettre au point cette stratégie, nous souhaitons tester différents méthodes de déplétion de cellules souches de la moelle osseuse afin de garantir une greffe de cellules souches optimales chez notre modèle de souris LAL-D.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de raffiner la méthode de déplétion des cellules souches de la moelle osseuse dans notre modèle de souris LAL-D afin de développer à terme un traitement génétique de la maladie. Les effets bénéfiques du traitement chez la souris devraient permettre de développer un traitement curatif pour les patients souffrant de LAL-D.

Procédures

Les animaux seront génotypés par une biopsie de queue faite à 6 jours après la naissance. Les animaux subiront soit 2 injections de Busulfan par voie intra péritonéales réalisé 48h avant la transplantation et espacée de 24H ou une irradiation létale réalisée 3h avant la transplantation de cellules. Pour l’irradiation, les souris seront disposées dans un irradiateur Faxitron (Rayon X, débit : 0,8Gy/min) pendant environ 12 min. Les animaux subiront une injection de cellules souches et des prélèvements de sang (au maximum 4 prélèvements) sous anesthésie gazeuse. Les prélèvements de queue, les injections des cellules ou Busulfan et les prélèvements de sang sont des procédures rapides, et ne devrais pas prendre plus de 10 min par souris.

Impact sur les animaux

Le maintien de la colonie LAL-D correspond à une nuisance légère car bien que les animaux LAL-D souffrent d’hépatosplénomégalie, il n’y a pas de modification de leur comportement (mobilité et alimentation). Les animaux seront génotypés par une biopsie de queue faite à 6 jours après la naissance ce qui est une nuisance légère de courte durée et seront sacrifiés à 8 mois pour éviter toutes souffrances. La nuisance lors des procédures de transplantation sera modérée et dura 16 semaines, en effet, les souris subiront une déplétion de cellules souches hématopoïétiques et seront transplantées par des cellules souches pour reconstituer la moelle osseuse. La déplétion peut entrainer une perte de poids des animaux et d’éventuelle plaies cutanées mais la transplantation de cellules souches permettra aux souris de se développer normalement.

Devenir

A la fin des procédures expérimentales, les souris seront euthanasiées afin de récupérer la moelle osseuse et la rate pour faire les analyses de prise de greffe.

Remplacement

Pour évaluer de nouveaux traitements innovants basées sur la correction de cellules souches hématopoïétiques de patient pour la LAL-D, nous devons d’avoir étudier la transplantation des cellules souches dans un modèle de souris. En effet, seuls des cellules de patient sont disponibles actuellement in vitro, ce qui n’est pas suffisant pour reproduire la complexité du compartiment hématopoïétique.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction du nombre de souris, nos prévisions d'effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à comparer nos valeurs de prise de greffe à nos valeur observée de référence à savoir 80% de prise de greffe en utilisant l’irradiation létale. Nous souhaiterions atteindre un pourcentage de prise de greffe similaire, à savoir 80% en moyenne, avec un minimum de prise de greffe de 50% plus ou moins 25% (variance). Nous avons utilisé test statique calculé par le logiciel G Power et conclut que 10 animaux par groupe sont nécessaires.

Raffinement

Les souris LAL-D sont plus petites que les souris saines, mais sans souci de motricité ou de douleur donc pas de condition particulière d’hébergement. Lors de la réalisation des procédures expérimentales, l’état général des souris (apparence, posture, comportement...) et leur poids seront surveillés tous les deux jours pendant 20 jours, puis toutes les semaines. En cas de plaies cutanées, une pommade sera appliquée tout au long de la cicatrisation. Toutes les procédures potentiellement douloureuses seront effectuées sous anesthésie gazeuse. En cas de plaies oculaires, les prélèvements de sang seront suspendus et une application locale de gel cicatrisant sera effectuée. Si les plaies oculaires ne cicatrisent pas (infection, œil blessé) dans la semaine après traitement, les souris seront euthanasiées. De plus, afin de raffiner nos études, nous allons évaluer une méthode de myéoablation ayant moins d’effets d’indésirables pouvant ainsi améliorer la survie des animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris LAL déficiente car ce modèle mine l’accumulation de lipides observés chez les patients. Afin d’étudier la prise de greffe, les animaux seront greffés à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines pour reproduire les procédures de thérapie génique appliqués à l’homme adulte.

950 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce projet est un élevage d'une lignée transgénique modèle d'Alzheimer à phénotype dommageable, dont les animaux développent une paralysie progressive entre sept et dix mois et une mortalité élevée, avec tatouage des phalanges et coupe de la queue pour le génotypage. 800 souris sont transférées vers un autre établissement pour d'autres projets, 150 étant tuées en fin de reproduction ou pour atteinte des points limites. Le porteur présente cet élevage comme le support d'une future méthode de diagnostic.

Objectifs

Le but du présent projet est de faire un élevage d’une colonie de souris modèle. Il s’agit d’un modèle murin de la maladie d’Alzheimer à phénotype dommageable. La production de cette colonie servira ensuite à caractériser le phénotype rétinien chez ce modèle dans le but d’identifier de nouveaux marqueurs de diagnostic précoce non-invasive de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Élevage de la colonie de souris modèle à phénotype dommageable. Cette colonie de souris servira par la suite à mettre en place une nouvelle méthode de diagnostic de la maladie d’Alzheimer et aussi améliorer le parcours de soin des patients.

Procédures

Les animaux transgéniques présentent un phénotype dommageable. Ces souris peuvent souffrir de déficit moteur à partir du 7ème mois. Au 7ème jour après la naissance, les souris seront identifiées par tatouage au niveau des phalanges à l'aide d'une pince Aramis. Dans le même temps, un prélèvement caudal coupé au ciseau chirurgical à bout pointu sur animal vigile pour génotypage sera réalisé. Quelques secondes seront nécessaires pour réaliser ces actes. Tous les animaux naissants seront soumis à ces deux actes une seule fois dans leurs vies.

Impact sur les animaux

Les animaux transgéniques développent une faiblesse des membres. Ces déficits moteurs évoluent vers une paralysie entre 7 à 10 mois, associée à une posture voûtée. Suite à ce déficit, les souris peuvent souffrir de mal nutrition. Environ 80 pour cent de la mortalité survient au bout de 12 mois chez les souris à fond mixte, avec une survie médiane d'environ neuf mois. Une infection locale et une douleur pourrait survenir suite au prélèvement caudal pour le génotypage.

Devenir

Les 800 animaux produits dans le cadre de ce projet seront transférés dans un autre établissement et impliqués dans différents projets dédiés à la mise en place d’une nouvelle méthode de diagnostic de la maladie d’Alzheimer. En revanche, 150 animaux seront euthanasiés en fin de période de reproduction ou pour atteinte des points limites (estimation)

Remplacement

Les souris issues de cet élevage serviront à comprendre la réponse physiologique de la rétine ainsi que le développement de nouveaux marqueurs rétiniens lors de la maladie d’Alzheimer. La fonction rétinienne sera étudiée par imagerie et électrophysiologie in-vivo chez ce modèle. L’objectif de cette étude concerne l’exploration des relations cellulaires au sein de la rétine à ce jour aucun modèle cellulaire n’est assez complexe pour se substituer à mimer la rétine.

Réduction

La production d’animaux a été estimée à 950. Le nombre d’animaux nécessaire pour les différentes études scientifiques a été définis en tenant compte des éventuelles pertes dues à une atteinte des points limites.

Raffinement

Les animaux en provenance d’éleveurs agrées seront hébergés par trois (Un mâle reproducteur et deux femelles reproductrices) dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (papier kraft, bâton à ronger et éventuellement maisonnettes rouges). Les animaux seront stabulés dans un environnement avec une alternance jour (7h-19h) /nuit (19h-7h), une température de 22+/-2 degrés Celsius et une hygrométrie à 50 +/- 10. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie. Avec une mise en place d’étiquettes au niveau des cages pour un meilleur suivie (note d’observation au cas de blessure, présence de souris gestante ou naissance). Les animaux transgéniques développent une faiblesse des membres. Ces déficits moteurs évoluent vers une paralysie entre 7 à 10 mois, associée à une posture voûtée. Suite à ce déficit, les souris peuvent souffrir de mal nutrition. Environ 80 pour cent de la mortalité survient au bout de 12 mois chez les souris à fond mixte, avec une survie médiane d'environ neuf mois. Un raffinement spécifique tel qu’un apport de nourriture à hauteur de la souris, un suivie du poids hebdomadaire à partir du 7 ème mois ainsi qu’une surveillance quotidienne par un personnel qualifié seront mis en place. Une infection locale pourrait survenir suite au prélèvement caudal pour le génotypage. Dans ce cas, les souris seront traitées par vétédine.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être physiologiquement similaire à l’Homme. En plus cette souris présente un transgène humain. Ce modèle fait partie des modèles les plus utilisés pour l’étude de la maladie d’Alzheimer. Les animaux seront étudiés à partir de 3, 6 et 9 mois dans une autre animalerie agrée. Les animaux seront répartis par âge. Les souris seront étudiées à trois différents âges : - 3 mois : âge où un début de gliose et de perte synaptique sont observé - 6mois : âge auquel les enchevêtrements sont observés avec un début de déficit cognitif - 9 mois : âge correspondant à une perte neuronale Ces âges ont été bien définis dans la littérature.