Recherche appliquée

Une chirurgie du thorax de trois heures pour implanter des sondes de mesure et un câble de stimulation cardiaque, puis, deux mois plus tard, deux interventions par voie percutanée à trois jours d'intervalle, la seconde s'achevant par la mise à mort : 80 porcs vont être utilisés, tous tués pour l'étude de leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une période de repos, une insuffisance cardiaque leur est provoquée par une pression artérielle et une stimulation cardiaque élevées, et certains devraient mal la supporter selon le porteur, avec baisse d'activité, perte d'appétit et poids qui stagne ou baisse en fin de protocole. Une thérapie cellulaire censée régénérer le cœur est le premier traitement testé. Le texte ne dit ni comment la pression est élevée, ni combien de temps dure la stimulation, ni par quelle voie la thérapie est administrée, et qualifie d'"indolores" tous les autres actes.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est une maladie grave qui se définit par l’incapacité du coeur à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins de l’organisme. Elle survient généralement chez des individus majoritairement âgés dont la santé est fragilisée depuis plusieurs années par des troubles cardiaques ou respiratoires ou par de l’hypertension. Elle se présente par un essoufflement et une fatigue disproportionnés par rapport à l’effort produit, d’abord uniquement à l’effort, puis aussi au repos. Dans les cas les plus avancés apparaissent d’autres symptômes plus invalidants tels toux nocturne, oedème (des poumons, des membres inférieurs). Le nombre de cas d’insuffisance cardiaque a augmenté au cours des 30 dernières années, en raison du prolongement de l’espérance de vie des personnes atteintes. L’insuffisance cardiaque est une cause importante de mortalité chez les personnes âgées, et le taux de survie 5 ans après le diagnostic est d’environ 50%, avec au moins 165000 hospitalisations et plus de 70000 décès annuels en France. C’est pourquoi nous étudions l’insuffisance cardiaque (à fonction systolique conservée) avec un modèle de porc à pression artérielle et stimulation cardiaque élevées, car nous avons grand besoin de comprendre sa physiopathologie et de trouver de nouvelles stratégies visant à prévenir ou à réduire la progression du dysfonctionnement du coeur. Notre projet prévoit d’utiliser au maximum 80 porcs sur 5 ans. La fréquence cardiaque, la taille du cœur, l’anatomie coronaire, l’innervation, la circulation collatérale native du porc sont très proches de celle de l’Homme. Le plan général du projet est de pratiquer une chirurgie afin d’implanter des sondes de mesure de l’activité cardiaque et un câble de stimulation de pacemaker, et après une période de repos, d’induire une insuffisance cardiaque afin d’évaluer l’effet d’un traitement thérapeutique grâce aux sondes implantées, mais aussi grâce à des mesures échocardiographiques et aux analyses de sang et de tissus cardiaques prélevés. Le premier traitement prévu est une thérapie cellulaire permettant une régénération du tissu de l’organe. D’autres traitements pourront être testés par la suite.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer de manière très prédictive des stratégies de protection cardiaque, dont les résultats bénéfiques à long terme valent autant pour la santé humaine que pour la santé animale, et jouent sur l’amélioration globale de la qualité de vie, grâce à une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Chaque animal sera soumis 1 seule fois à une chirurgie thoracique réalisée sous anesthésie générale d’environ 3 heures, puis environ 2 mois plus tard à un acte chirugical percutané sous anesthésie générale d’environ une demie-heure, puis 3 jours plus tard à un acte chirugical percutané sous anesthésie générale se terminant par la mise à mort. Tous les autres actes sont indolores et consistent en des soins, ou à des échocardiographies ou à des enregistrements de paramètres hémodynamiques effectués sous sédation légère afin que l’animal soit bien calme.

Impact sur les animaux

L’insuffisance cardiaque se caractérisant essentiellement par une fatigue chronique, il est probable qu’un certain nombre d’animaux supportent moins bien ce traitement, ce qui entrainera une baisse d’activité et une perte d’appétit avec une stabilisation, voire une légère baisse de leur poids en toute fin de protocole.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour récupérer le coeur afin d'en faire l'étude histologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de tester totalement une stratégie de protection cardiaque sans passer finalement par l’expérimentation animale. Les traitements envisagés ont déjà été testés in vitro ou sur des animaux de petite taille (rongeurs) aux caractéristiques cardiaques trop dissemblables de l’Homme. Seuls des essais effectués sur un modèle d’étude cardiaque proche de l’Homme sont scientifiquement acceptables pour envisager une extrapolation vers la pratique clinique humaine.

Réduction

Il est prévu d’utiliser le minimum d’animaux pour chaque stratégie testée, et le nombre par lot est fixé à 8. De plus, à chaque fois que c’est possible, les animaux des lots témoins sont mutualisés pour chaque stratégie.

Raffinement

Des antalgiques, des anesthésiques et des tranquillisants sont utilisées à des doses adaptées (voir détails plus bas). Nous ne pensons pas observer de différences comportementales entre avant et après les actes chirurgicaux. Des signes indicatifs de gêne inhérents au modèle expérimental seront probablement observés en fin de protocole, et cette période sera particulièrement surveillée afin qu’elle soit le plus courte possible pour l’animal. Ils sont suivis quotidiennement et bénéficient de sciure pour satisfaire leurs réflexes de fouissage, et d’objets « manipulables » pour améliorer leur qualité de vie. Ils sont logés à plusieurs avant leur chirurgie.

Choix des espèces

L’animal choisi est le modèle le plus adapté pour ce projet, et validé depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Le porc, par sa fréquence cardiaque, la taille de son myocarde, son anatomie coronaire, son innervation et l’absence de circulation collatérale native, est un modèle proche de l’Homme. Il permet de réaliser des études précliniques très prédictives sur le plan cardiovasculaire. A 2 mois ½ (25kg), âge minimal souhaité et poids maximal souhaité.

32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après un jeûne de douze heures, une diarrhée est provoquée par gavage d'huile de ricin, puis chaque animal est isolé quatre heures dans une cage à métabolisme pour recueillir ses selles, le porteur reconnaissant un inconfort et un stress liés à l'isolement. Les intestins sont prélevés après la mise à mort. Le projet teste deux souches de probiotiques et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne peut remplacer l'animal, dans la perspective d'un futur essai clinique.

Objectifs

La diarrhée est trouble digestif qui touche près de 4,5 milliards de personnes dans le monde chaque année et qui se manifeste notamment par l’émission de selles généralement liquides ou molles, dans une quantité et à une fréquence plus élevée que la normale. Les épisodes de diarrhées aiguës peuvent être la conséquence d’une infection bactérienne, virale ou parasitaire, ou survenir suite à une intolérance alimentaire ou médicamenteuse, notamment suite à la prise d’antibiotiques. Ces épisodes peuvent s’accompagner de déshydratation, de douleur abdominale, de fièvre ... Des médicaments peuvent faire cesser la diarrhée en ralentissant les mouvements intestinaux mais peuvent entrainer par la suite une constipation. D’autres diminuent la secrétion d’eau dans les intestins. Au besoin, des antibiotiques peuvent venir à bout d’une diarhhée causée par une bactérie ou un parasite. Les probiotiques sont des bactéries ou des levures qui modulent la prolifération bactérienne de l’intestin. Ils sont largement utilisés comme compléments alimentaires et comme médicaments dans le traitement et la prévention des diarrhées. Les objectifs de cette étude sont d’évaluer les effets sur la diarrhée et sur la douleur induite de 2 nouvelles souches de probiotiques chez des rats soumis à l’induction d’une diarrhée. Les effets observés seront comparés à ceux obtenus chez des rats traités avec un placebo ou avec un médicament de référence. A l’issue de l’étude, les rats seront euthanasiés et les intestins seront prélevés pour la réalisation d’analyses biologiques.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette étude va permettre d’évaluer les effets de 2 nouvelles souches de probiotiques chez le rat soumis à l’induction d’une diarrhée expérimentale, et de comparer ces effets avec un placebo et un médicament de référence utilisé pour le traitement de la diarrhée aigüe. Les données des différents paramètres observés au cours de la mise en cage spéciale, temps de latence d’émission des premières selles, nombre et consistance des selles émises, ainsi que les données comportementales concernant l’activité, la posture, l’aspect de la fourrure et l’ouverture des yeux, et les analyses biologiques qui seront effectuées sur les intestins et le colon prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets bénéfiques ou non de traitements avec ces 2 nouvelles souches de probiotiques sur leur activité anti-diarrhéique et sur les effets sur la douleur perçue chez le rat. Cela permettra d’envisager la réalisation d’une étude clinique chez l’Homme avec l’une ou l’autre de ces 2 nouvelles souches de probiotiques, et à terme de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de diarrhée aigüe.

Procédures

Les rats seront placés à jeun pendant 12 heures avant la réalisation des essais. Après cette mise à jeun, un traitement par voie orale avec les composés à évaluer sera effectué, geste effectué en quelques secondes par une personne expérimentée. Une heure après le traitement, la diarrhée sera induite par administration par voie orale d’un composé induisant une diarrhée expérimentale (huile de ricin), geste également effectué en quelques secondes par une personne expérimentée. Après induction de la diarrhée, les rats seront placés individuellement dans des cages spéciales (cages à métabolisme) pendant 4 heures afin de recueillir les selles émises par chacun d’entre eux et d’observer leur comportement, permettant ainsi d’évaluer l’effet des composés administrés.

Impact sur les animaux

La mise à jeun des animaux la veille au soir de la réalisation des traitements et de l’induction de la diarrhée, nécessaire pour que l’ensemble des animaux soient dans les mêmes conditions physiologiques, va induire une légère perte de poids des animaux. Cette perte de poids sera en effet peu importante car les animaux étant placés en cycle de lumière inversé, la période de jeûne correspondra à la phase lumineuse du cycle au cours de laquelle les animaux sont peu actifs voire inactifs, avec une prise alimentaire très limitée voire nulle. L’induction de la diarrhée va quant à elle induire un inconfort des animaux, se traduisant par l’émission plus ou moins rapide et importante de selles au cours des 4 heures de mise en cage spéciale, et par des modifications du comportement des animaux se traduisant par une baisse de l’activité, une posture plus prostrée, une fourrure plus hérissée, et des yeux moins ouverts. Le traitement avec les 2 souches de probiotiques devraient limiter cet inconfort. La mise en cage spéciale, nécessaire pour recueillir individuellement les selles de chaque rat et observer individuellement le comportement de chaque rat pendant 4 heures suivant l’induction de la diarrhée, va induire un stress modéré par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 32 rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement des intestins pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer les effets anti-diarrhéiques et comportementaux de composés. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de diarrhée, dont certains ont été publiés. Une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée à l’issue des expérimentations.

Raffinement

Au cours de la semaine d'acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux seront placés à 2 par cage avec de l'enrichissement pour assurer leur bien-être, et avec accès libre à la nourriture et à l’eau de boisson. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après la réalisation des traitements, l’induction de la diarrhée et la mise en cage spéciale, les animaux étant observés en continu pendant les 4 heures de mise en cage spéciale. L’expérimentation étant de très courte durée, sur 5 heures le jour des essais, les seuls points limites identifiés seraient des convulsions, tremblements ou paralysie des animaux suite à l’administration orale des produits à tester. Cela ne serait pas le cas après administration orale du médicament de référence et du composé induisant la diarrhée car nous avons une très bonne expérience de ce modèle et nous n’avons jamais observé de trouble des animaux traités avec ces composés. Ce modèle étant validé et ayant été utilisé de nombreuses fois en plaçant les animaux individuellement en cage spéciale pour une durée de 4 heures sans habituation à ces dispositifs, aucune habituation des animaux aux cages spéciale n’est envisagée. Les rats seront placés dans une salle d’expérimentation attenante à leur pièce d’hébergement, placée en lumière blanche attenuée pour ne pas les perturber et maintenir des conditions proches de celles de leur hébergement.

Choix des espèces

Le Rat est l’espèce animale la plus adaptée et majoritairement utilisée pour la mise en évidence des effets anti-diarrhéiques de candidats médicaments et de compléments alimentaires. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8-9 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines pour la réalisation des expérimentations, correpondant à l’âge de rats que nous utilisons pour la réalisation d’expérimentations sur ce modèle de diarrhée.

816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation du gène Kcnq2 reproduisant une épilepsie infantile, elles reçoivent jusqu'à vingt molécules candidates par gavage, injection ou alimentation, certaines étant implantées d'une puce sous anesthésie, et le porteur indique que des crises spontanées peuvent provoquer leur mort. Le système nerveux central est prélevé en fin de procédure. Le porteur revendique un modèle "premier et seul" disponible pour tester des traitements sur "organisme entier", les bénéfices pour les enfants restant renvoyés à une éventuelle demande d'essai clinique.

Objectifs

Des variants pathogènes dans le gène KCNQ2 provoquent une épilepsie dans l'espèce humaine. Cette épilepsie se manifeste par de fréquentes crises survenant durant les tous premiers mois de vie (avant l'âge de 3 mois). Cette activité épileptique est accompagnée d'une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Il n'existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle knock-in porteuse d'un variant récurrent du gène KCNQ2 (T274M). La souris hétérozygote pour ce variant reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Ce modèle permet de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de tester de nouvelles approches thérapeutiques. Ce modèle est le premier (et le seul pour le moment) qui puisse permettre de tester des approches thérapeutiques sur organisme entier dans un contexte valide par rapport à la pathologie humaine. Le projet comporte la stabulation d'animaux à phénotype dommageable, leur traitement par des candidats médicaments et l'évaluation de leur phénotype sur le plan des crises d'épilepsie et des capacités cognitives. A l'heure actuelle, il existe des molécules qui vont atténuer les crises d'épilepsie chez les enfants présentant une épilepsie liée au gène KCNQ2 (par exemple la carbamazépine). La multiplicité des traitements subis par ces enfants et leur hétérogénéité (clinique et génétique) ne permet cependant pas d'établir clairement si les traitements efficaces sur les crises le sont aussi sur le développement neurologique. Il s'agit pourtant d'une question essentielle. Pour l'ensemble de ce projet, nous envisageons de tester 20 molécules. Nous avons pour objectif d'identifier des molécules qui apporteront un bénéfice en terme de neurodéveloppement. Si le traitement est efficace, nos souris modèle devront présenter moins de crise mais aussi avoir un neurodéveloppement le plus normal possible.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans un modèle unique d'encéphalopathie épileptique. Si un candidat médicament s'avère efficace pour diminuer les crises d'épilepsie et pour améliorer les déficits cognitifs dans le modèle, les résultats serviront de base à une demande d'essai clinique dans l'espèce humaine.

Procédures

Traitements pharmacologiques par l'alimentation, par gavage ou injection intrapéritonéale en fonction des candidats médicaments. Traitements aigus (1 à 3 jours) ou chroniques (entre P25 et P90) en fonction de la pharmacocinétique des composés testés. Les animaux qui passent dans le test LMT seront anesthésiés et implantés avec une puce RFID. Prélèvements sanguins en fin de protocole pour estimer la biodisponibilité des composés ou de leurs métabolites et confirmer l'exposition.

Impact sur les animaux

Etant donné que les molécules administrées sont censées avoir un effet antiépileptique, nous attendons une amélioration du phénoptype des animaux (moins de crises, meilleures capacités d'apprentissage). Aucun effet indésirable particulier n'est attendu. Dans le pire des cas, les candidats médicaments n'auront pas d'efficacité. S'ils aggravent le phénotype (voir suivi des animaux ci-dessous), les traitements seront alors immédiatement interrompus. Dans ce modèle, il est également possible que les animaux présentent une crise spontannée conduisant à la mort de l'animal.

Devenir

Les animaux sont conservés pendant la durée de la procédure (traitement, évaluation des améliorations phénotypiques, prélèvement sanguin) puis euthanasiés en fin de procédure afin de prélever le système nerveux central pour réaliser des analyses histologiques, transcriptomiques et protéomiques.

Remplacement

Les épilepsies sont provoquées par des décharges inadaptées de cellules excitables en réseau. Les crises ainsi générées se traduisent, le plus souvent, par des mouvements anormaux. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'espèce humaine, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le gène Kcnq2 est très conservé entre la souris et l'Homme. Les tests phénotypiques sont bien développés dans cette espèce. Le modèle que nous utilisons est le premier et le seul disponible pour le moment pour cette pathologie. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les médicaments candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de modèles iPS avant d'en préciser les caractères de d'efficacité et de toxicité éventuelle. L'étude des capacités d'apprentissage et de mémorisation ne peut être effectuée que sur l'animal vivant.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera optimisé et calculé de façon à ce que les effets attendus puissent être détectés avec un niveau de significativité suffisant tout en garantissant la sécurité des résultats s'ils doivent être utilisés ultérieurement pour justifier un essai clinique pédiatrique.

Raffinement

L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées dans des cages de 530cm2 (5 souris maximum), avec 2 enrichissement différents (dôme et bandelettes de cartons), eau et nourriture ad libitum. La méthode d'administration des traitements la moins contraignante possible sera utilisée (dans les croquettes servant d'alimentation à chaque fois que cela est possible). Nous réalisons une anesthésie profonde des animaux avant l'implantation des puces RFID. Des points limite clairs sont définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu'ils atteindront les critères d'interruption.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s'agit de mammifères disposant d'un répertoire génétique très similaire à celui de l'espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Les souris seront traitées au moment où apparaissent les crises d'épilepsie spontanées dans ce modèle et uniquement chez des animaux sevrés (entre P25 et P30). La suppression des crises d'épilepsie est le premier critère de jugement d'efficacité de la molécule testée. Le traitement pourra se poursuivre quotidiennement jusqu'à P90 où l'évaluation finale de leur comportement sera effectuée (tests d'apprentissage et mémorisation). Dans l'espèce humaine, la maladie est sporadique (sans histoire familiale) et n'est donc détectée chez un nourrisson qu'au moment où les premières crises apparaissent. Nous nous placerons donc dans ce même cas de figure avec les animaux modèles étudiés ici, traités au moment où leur pathologie se manifeste.

88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime riche en graisses et en sucres pendant douze semaines, avec des gavages de sucre et d'huile, des prélèvements de sang répétés et une prise de poids réduisant leur mobilité, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à montrer un effet protecteur de lipides végétaux contre l'obésité. Le porteur présente le résultat comme une "preuve de concept" pour de futures études chez l'humain.

Objectifs

La transition nutritionnelle vers des systèmes alimentaires sains et plus durables est en faveur de la végétalisation des régimes alimentaires. Il est devenu important de mieux comprendre le rôle et les mécanismes d’action des nutriments d’origine végétale d’un point de vue de la santé métabolique. Si les protéines végétales ont suscité un vif intérêt ces dernières années, certains lipides spécifiques des végétaux verts restent encore méconnus et peu exploités. Leur absorption et métabolisme in vivo sont jusqu’ici peu décrits. Des travaux préliminaires suggèrent néanmoins des effets anti-inflammatoires, des effets de réduction des lipides sanguins circulants, ainsi qu’une potentielle utilisation par les bactéries intestinales. Les lipides végétaux naturellement présents dans différents aliments végétaux pourraient donc constituer de potentiels prébiotiques (susbtrats pour les bactéries intestinales) avec des bénéfices importants pour la santé, et avoir ainsi un rôle à jouer dans le cadre de stratégies nutritionnelles préventives dans la lutte contre l’obésité. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de mettre en évidence les potentiels effets protecteurs des lipides végétaux sur la mise en place de l’obésité chez la souris. Pour cela, nous étudierons leurs effets sur : le métabolisme des lipides et des glucides, la santé intestinale (absorption, fonction barrière, bactéries) et l’inflammation.

Bénéfices attendus

Cette étude animale devrait permettre de montrer pour la première fois que la consommation de certains lipides végétaux peut éviter une altération du métabolisme, un déséquilibre des bactéries intestinales et une augmentation de l’inflammation. Les résultats de cette approche pourront alors constituer une preuve de concept pour de futures études cliniques d’intervention nutritionnelle chez l’Homme, notamment chez des personnes souffrant d’obésité.

Procédures

- Alimentation riche en graisses et en sucres pour 3 groupes de 12 souris pendant 12 semaines ; alimentation d’entretien pour 1 groupe contrôle de 8 souris pendant 12 semaines. - Mesure de la composition corporelle sur toutes les souris vigiles, contention dans un tube, moins de 2 minutes par souris, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Collecte de crottes de toutes les souris vigiles, 30 minutes dans une cage individuelle, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Mise à jeun (6h ou 12h) des animaux avant les gavages de toutes les souris, deux fois à 1 semaine d’écart. - Un gavage avec du sucre pour tester le métabolisme des glucides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage de sucre/souris sur les 12 semaines d’étude). - Un gavage avec de l’huile pour tester le métabolisme des lipides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage d’huile/souris sur les 12 semaines d’étude). - Les deux gavages seront espacés d’une semaine. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec du sucre (15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) sur toutes les souris vigiles lors de la 10ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun quelques secondes par souris. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec de l’huile (1, 2 et 4heures) sur toutes les souris vigiles lors de la 11ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun environ 30 secondes par souris. - Une injection dans l’abdomen des anesthésiques (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : quelques secondes. - Un prélèvement de sang sous anesthésie profonde sur toutes les souris (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une prise de poids est attendue chez les souris suivant une alimentation riche en graisses et en sucres. Cette prise de poids pourra entraîner une diminution de la mobilité des animaux concernés. Un isolement court (30 min) sera nécessaire pour la récupération des fécès et pourra induire un léger stress aux animaux. La mise à jeun (12h ou 6h avant gavage d’huile ou sucre) peut également induire un stress chez les animaux. Lors des deux gavages, léger stress dû à la contention de l’animal et gêne/irritation potentielle de l’œsophage liée au passage de la sonde. Les prélèvements sanguins réalisés après les gavages pourront induire un stress chez les animaux. Pour la mesure de composition corporelle, les souris sont introduites dans un tube cylindrique (espace réduit) pendant moins de 2 minutes, ce qui peut induire un léger stress aux animaux. L’injection dans l’abdomen des anesthésiants (avant le prélèvement terminal) peut induire une douleur transitoire.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier les effets des lipides végétaux sur le métabolisme de différents organes et l’inter-communication entre tous ces organes. Il est à l’heure actuelle impossible de reproduire dans des modèles de culture cellulaire les mécanismes métaboliques et inflammatoires en lien avec la modification des bactéries intestinales, et l’implication de toutes les voies de régulation au centre de la communication entre les différents organes. Par conséquent, le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à notre question scientifique. De plus, une étude clinique chez l’Homme ne peut pas être envisagée directement à ce stade car les comités d’évaluation des études cliniques demandent des résultats préliminiares précliniques (à l’échelle d’un organisme entier) pour démarrer une étude chez l’Homme.

Réduction

A notre connaissance, aucune étude sur la souris n’a encore été réalisée pour évaluer les effets de lipides spécifiques des végétaux verts dans un contexte d’obésité induit par une alimentation riche en graisses et en sucres. Nous ne disposons donc pas de données de la littérature pour réaliser un calcul d’effectif. S’agissant d’une étude pilote et exploratoire, une dizaine de souris par groupe semble nécessaire et suffisante (8 souris pour le groupe contrôle et 12 souris pour chacun des groupes avec alimentation riche en graisses et en sucres). De plus, l’étude sera lancée tout d’abord sur des souris mâles, et si les résultats sont significatifs chez les mâles alors la même étude sera réalisée sur des souris femelles (n=44) pour extrapoler ou non les résultats aux deux sexes

Raffinement

Plusieurs mesures seront mises en place pour veiller au bien-être des animaux et réduire au minimum toutes les nuisances potentielles : 1/ Ajout des lipides végétaux à l’alimentation des animaux pour éviter manipulation et contention quotidiennes des souris (contrairement à une supplémentation par gavage quotidien). 2/ Avoir le même expérimentateur (maximum 2) tout au long de l’étude et habituer les animaux à sa/leur présence (odeurs, voix, etc) pour diminuer leur stress face aux humains. 3/ Avoir du personnel expérimenté et formé aux gestes techniques des différentes procédures (tests métaboliques, mise à mort), et à l’observation de comportements « normaux » des animaux. 4/ Surveillance étroite des animaux 2 fois par semaine (apparence physique, comportement, poids, prise alimentaire), 5/concernant les gavages : - l’administration par voie orale est une méthode moins invasive que l’injection par voie intraveineuse ; - pour limiter la potentielle irritation de l’œsophage des animaux lors des gavages une sonde de gavage coudée au bout arrondi sera utilisée par un personnel expérimenté - les volumes de gavage seront réduits au minimum pour éviter tout incomfort aux animaux. - une surveillance étroite du comportement des animaux sera réalisée suite aux gavages, - les gavages seront espacés d’une semaine afin de réduire le stress des animaux, 6/ Les contentions prévues lors des pesées, gavages ou lors de la mesure de la composition corporelle seront toujours effectuées de manière brève par un expérimentateur formé, 7/ En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour éviter toute douleur au moment du dernier prélèvement sanguin, 8/ Mise en place de points limites précoces permettant, si l’un est atteint, d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

En raison de la grande similitude de régulation du métabolisme entre la souris et l’Homme, la souris est un modèle de choix pour étudier et caractériser les effets santé des lipides végétaux en situation d’obésité. Les souris débuteront l'étude à 8 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Le passage à une alimentation riche en graisses et en sucres à cet âge est très bien toléré par les animaux, et les perturbations du métabolisme attendues les semaines suivantes sont bien décrites et maîtrisées.

300 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés après une période de repos. Ils subissent 10 à 20 prélèvements de sang, des administrations d'un médicament vétérinaire en développement et des examens cliniques, des effets comme des vomissements ou des troubles respiratoires pouvant apparaître. Le projet évalue la toxicocinétique de produits destinés aux chiens, le chien étant l'espèce visée. Le porteur affirme que le test sur l'espèce visée est une étape "obligatoire" pour la mise sur le marché.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier la toxicocinétique de différentes concentrations de formulations systémiques de produits vétérinaires canins chez le chien adulte mâle ou femelle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la mise à disposition de nouveaux médicaments canins permettant de mieux soigner les chiens face à différentes maladies canines.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées : - prélèvements sur animaux vigiles : 10 à 20 prélèvements sanguins pour la réalisation de l’analyse toxicocinétique sur la durée de l'étude et 1 à 4 prélèvements sanguins pour l’analyse hémato-biochimique. - administrations de traitement sur animaux vigiles selon la posologie et la voie d’administration recommandée par le fabricant - Examens cliniques sur animaux vigiles : diverses mesures non invasives tels que pression artérielle, électrocardiogramme, prise de température rectale, pesée.

Impact sur les animaux

Le but de ce projet est d’évaluer les effets toxiques après administration systémique d’un nouveau médicament vétérinaire chez le chien. Des premiers tests réalisés sur d'autres espèces comme les rongeurs ont déjà permis de sélectionner les formulations les moins toxiques sur ces espèces. Cependant, s’agissant des premiers tests sur l’espèce canine, différents effets indésirables peuvent apparaître et ne peuvent pas être définis à l’avance. Il pourrait par exemple s’agir de vomissement, de trouble de l’alimentation ou de perturbation respiratoire entraînant un mal être/inconfort de l’animal. Les nuisances attendues liées aux prélèvements sanguins des animaux sont celles liées au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille sous la peau entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction.

Devenir

A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.

Remplacement

Le recours aux chiens sur ce projet est justifié car ils représentent l’espèce cible du produit et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. L’étude toxicologique du produit d’essai a déjà été conduite sur d'autres espèces comme des rongeurs, et n’a pas révélé d’effets toxiques majeurs. L’étude sur l’espèce cible est une étape obligatoire pour le développement et la mise sur le marché d’un nouveau médicament.

Réduction

Aucune approche statistique ne sera réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum pour que chaque test inclut le nombre d’animaux requis afin d’obtenir des résultats interprétables. Selon les guidelines européennes, ce nombre est de 6 animaux par groupe pour une étude réglementaire. Pour une étude exploratoire, ce nombre pourra être ajusté en fonction des besoins définis par les objectifs scientifiques. Le nombre d’animaux pourra être réduit avec des études en cross-over, une optimisation des groupes selon le sexe (ratio 50/50), ou avec des études pilotes pour évaluer les doses ou concentrations maximales.

Raffinement

Les concentrations des formulations seront augmentées progressivement afin de pouvoir arrêter les tests en cas de réactions sévères observées pour l’une des concentrations testées. Les conditions d'hébergement sont adaptées à l'âge des animaux avec divers enrichissements (jouets suspendus, tunnel/plateforme). Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués dans les quatre heures suivants l’administration du traitement. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Tout au long de la procédure, les animaux auront accès à volonté à l'eau et à une nourriture adaptée à leur âge et répondant à leur besoin énergétique. Les interventions effectuées dans ce projet sont réalisées par des personnes compétentes et les techniques utilisées visent à limiter au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. . Les animaux auront été habitués aux équipements de monitoring permettant les mesures de paramètres cliniques tels que la pression artérielle ou l’électrocardiogramme afin d’obtenir des résultats fiables durant le projet. Les prélèvements sanguins seront réalisés par des personnes compétentes avec du matériel adapté. Les volumes prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations du Gircor en fonction de la voie d’administration. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique sévère chez l’animal (exemple : vomissements très intenses à répétition, prostration de l’animal, difficultés respiratoires…), il sera pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra recevoir un traitement adapté pour soulager ses maux.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce cible du produit en développement. De précédents tests ont été conduits sur d'autres espèces comme des rongeurs, l’étape suivante pour la validation des dossiers de mise sur le marché est le test sur l’espèce cible. Chiens adultes d'âge et de poids correspondant à celui indiqué pour le traitement.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections directement dans le cerveau sous anesthésie et des prélèvements de sang, avant d'être tuées pour prélever leurs organes, afin de valider des vecteurs censés faire passer des médicaments vers le système nerveux. Une lignée de souris est génétiquement humanisée pour le récepteur ciblé. Le porteur, une société, met en avant un "gain de temps considérable" et "donc économique", à côté de l'argument scientifique.

Objectifs

-Introduction : Les maladies neurodégénératives (pathologies affectant les neurones), et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. A l’heure actuelle, les besoins médicaux restent malheureusement sans solutions, traitements curatifs, ou palliatifs (qualité de vie). Ainsi, ces neuropathies sont de très bons exemples d’enjeux de santé publiques. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste à attacher des protéines ou peptides avec un fragment d’anticorps (aussi appelé VHH), l’ensemble couplé à un médicament afin de passer plus efficacement les barrières physiologies, notamment la Barrière Hémato-Encéphalique du cerveau (BHE). Ces molécules ou vecteurs, appelés VHH pourront ainsi atteindre le tissu cible du système nerveux central et traiter les cellules malades. Pour l’instant, la plupart des médicaments utilisés en thérapie restent inefficaces par manque de passage de ces barrières sélectives et donc d’accès aux tissus à traiter. Concept général : L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaître spécifiquement leurs partenaires naturellement exprimés (endogènes), au niveau des barrières cellulaires de l’organisme et d’utiliser leurs mécanismes naturels de passage pour ainsi, délivrer les médicaments au niveau central (cérébral). Par cette technique du cheval de Troie, nous faciliterons le passage de médicaments du sang vers le système nerveux central (SNC). -Objectif du projet : Les études pharmacologiques passent par différentes étapes de validation avant tout développement pré-clinique, elles utiliseront des voies d’administrations simplifiées pour qu’elles puissent être facilement applicables à grandes échelles et moins contraignantes pour les patients. Ces traitements sont généralement administrés par voie périphérique, sous-cutanée, intra-veineuse ou par voie orale. L’optimisation de nos vecteurs (VHH) devra avant tout développement périphérique passer par une étape de validation et confirmation de l'efficacité au niveau central. A travers cette demande de projet et la réalisation d’injections intra-cérébrales, nous tenterons d’améliorer l'action de nos molécules VHH-médicaments sur souris consanguines, dites « standards », puis, de le confirmer ces résultats sur ce même fond, humanisé pour le récepteur cible.

Bénéfices attendus

-Validation de l'efficacité pharmacologique de nos molécules VHH pour améliorer les traitements actuels et apporter des solutions thérapeutiques contre les pathologies à enjeux de santé publique. Ce nouvel axe de recherche pré-clinique pourrait ainsi servir de levier dans le traitement des maladies du système nerveux, au même titre que les derniers vaccins innovants développés pour la lutte contre la COVID-19. -Choix d’une lignée de souris humanisée pour le récepteur ciblé : La transposition de nos recherches sur un modèle murin pour lequel nous avons humanisé le récepteur cible permet, non seulement d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos vecteurs (VHH), mais aussi d’anticiper les possibles effets secondaires ou toxicités associées. Son utilisation assure de développer au maximum les études sur le modèle murin (souris) avant d’engager la phase préclinique et la transposition à l’homme, lesquelles auraient certainement nécessité des séries de tests supplémentaires sur divers modèles animaux de plus grandes tailles. De plus, cela constitue un excellent outil stratégique et scientifique, permettant in fine, une réduction importante du nombre d’animaux au sein des cohortes, sans parler du gain de temps considérable pour la société, et donc économique.

Procédures

Au cours de cette procédure, nous allons avoir une étape d'anesthésie et analgésie pour réaliser les administrations centrales : -Analgésie : Anti-douleur administré 30 minutes avant le début de l’anesthésie (durée 1h) -Anesthésie générale : Anesthésie gazeuse (voie aérienne) par induction en chambre (5 minutes), puis relais au masque (durée 15-20 minutes maximum) pour réaliser les administrations. Puis, au cours de la cinétique, nous aurons trois étapes de prélèvements : -Un premier prélèvement de sang sur des temps intermédiaires en cours de cinétique (maximum X3 espacés de minimum 24h). Réalisés sur animal éveillé et immobilisé dans une contention spécialisée (durée 2 minutes), par une micro incision de l'extrémité de la queue. Cette étape très rapide et peu invasive se fait sans trop de contraintes, ni stress pour l’animal. Le saignement est ensuite stoppé par un point de pression à l’aide d’un papier absorbant stérile pour une cicatrisation rapide. -Un deuxième avec le prélèvement sanguin en point final en toute fin de cinétique (durée 3 minutes), en post-mortem. -La troisième étape consiste à récupérer les organes et tissus d’intérêts, toujours en post-mortem (durée 5 à 10 minutes en fonctions de la quantité de tissus à prélever pour les tests post-expérimentaux) .

Impact sur les animaux

Dans ce projet nous chercherons à limiter au maximum le stress induit aux animaux. Les possibles sources de stress, angoisse et/ou douleurs sont ici listées avec une description des principaux actes engagés afin d’éviter leurs apparitions qui seront détaillés ci-après dans la partie procédure correspondante. -Transport et adaptation : Arrivée des animaux et stabulation qui peuvent engendrer du stress et un impact sur l’alimentation et le comportement -Tonte avant chirurgie et constitution des groupes : manipulation qui pourrait générer une source de stress -Chirurgie et injection (infusion lente) : Pas de risques notables avec une bonne maîtrise des antalgiques et anesthésiques. -La pose de points et période de cicatrisation : Pas de risques par une bonne réalisation de points individuels. -Effets secondaires toxiques et immunogènes des composés en suivi post-administration : Pas de risques majeurs pour les animaux (et études) car ces paramètres sont anticipés. -Nettoyage et traitement des plaies à la vétédine savon : Source de stress. -Prélèvements sanguins intermédiaires sur animaux éveillés : Source de stress, qui sera considérablement réduite par le geste expert du manipulateur. -sacrifice par injection létale : Source de stress au moment de l'injection intrapéritonéale.

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires en post-mortem (voir 5.6.1).

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien de la liaison avec le récepteur cellulaire cible, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos vecteurs conjugués. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique, ou suffisamment informel tel que les organoïdes (micro-tissus en culture chargés de reproduire le fonctionnement d'un organe). Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Dans notre cas, le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit alors de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. L’utilisation de faibles cohortes d'animaux permettra d’aller en ce sens, tout en allant exploiter un maximum de résultats et par l’obtention de données statistiques significatives.

Réduction

L’optimisation de nos molécules et l’injection intra-cérébrale permettent d'envisager une médication optimisée et réduite (dose infime par animal), de limiter les possibles effets secondaires, mais aussi le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 8 groupes par étude et 5 études par an, sur le fond standard et sur la lignée humanisée, nous n’aurons besoin que de 320 animaux par an, soit un total de 1600 souris sur 5 ans. Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus), sera suffisant et nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, ou encore une analyse de variance. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile des souris et permettra d’optimiser la procédure sur plusieurs types de post-expérimentations. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet d'obtenir des données de stabilités pharmacologiques supplémentaires, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal. Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 7 jours (fond standard) voire 14 jours (lignée humanisée) dès réception. 48h à 72h avant les administrations, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce spécialisée. Elles sont ainsi maintenues dans un contexte familier. Par la suite, les animaux seront tondus (partie supérieure du crâne) la veille des administrations (sous anesthésie gazeuse) pour éviter l’accumulation des anesthésies le jour même (J0) et le stress associé. A J0, les administrations intra-cérébrales seront réalisées sous anesthésie. Les manipulations sur animal éveillé, en cours d’étude, seront précises et rapides (≤ 2min). Une couveuse chauffante (env.37°C) sera utilisée pour assurer le bon réveil lors de la phase post-opératoire et une attention quotidienne (nettoyage vétédine savon) sera portée durant 72h à 1 semaine (fonction avancement cicatrisations) pour assurer une bonne cicatrisation et récupération des animaux. Des points limites seront malgré tout établis en cours de chirurgie, puis lors du réveil et tout au long de la cinétique. Tout comme son contrôle standard, la lignée humanisée utilisée n’a jusqu’alors jamais présenté d’apparitions de phénotypes dommageables.

Choix des espèces

-Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques. A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) et une diminution des posologies. Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux car il présente une cible endogène humanisée (récepteurs) tout en gardant les avantages cités précédemment. Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des validations pharmacologiques centrales et des échantillonnages de sang et tissus. -Pour notre procédure et nos deux lignées utilisées, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 10 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Cet âge présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).