Recherche appliquée

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par gavage puis une injection de toxine diphtérique destinée à détruire les cellules de leur épithélium intestinal, pour étudier la régénération de la paroi de l'intestin. Le porteur décrit une simple étude pilote visant à établir la dose de toxine, en amont d'un projet ultérieur. Il affirme que l'infection provoque une colite modérée et transitoire et qu'aucune alternative non animale n'est possible pour ce processus.

Objectifs

Il s'agit d'une étude pilote visant à évaluer les effets de la toxine diphtérique chez les animaux sauvages par rapport aux animaux déficients en molécule SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier), vise à déterminer l'importance de la sumoylation dans le processus de régénération de l'épithélium intestinal après une lésion induite. Dans un contexte pathologique où des lésions mal réparées de l’épithélium conduisent à des maladies intestinales chroniques, telles que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, ce projet participera également dans le futur à contribuer à l’avancée des recherches pour l’élaboration de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude pilote, nous allons déterminer la cinétique de la toxine diphtérique dans le modèle de souris déficient en SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier). Cela nous permettra de réaliser un projet ultérieur, dans lequel nous administrerons de la toxine diphtérique à ce modèle pour générer une lésion intestinale, ce qui nous permettra de déterminer le rôle de SUMO dans la régénération intestinale. En effet, on sait que ces maladies sont dues à des lésions de la paroi intestinale qui ne sont pas réparées efficacement et qui conduisent ainsi à une inflammation chronique de l’intestin. Mais les mécanismes exacts à l’origine de ces maladies sont encore mal compris et les traitements actuels, qui soignent uniquement les symptômes, ne permettent pas de guérir réellement les patients. Ce modèle murin offre ainsi une bonne opportunité pour explorer les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la maladie puisqu’il permet d’induire une lésion ponctuelle et ciblée dans l’intestin, qui entraînera la mort des cellules épithéliales associée à une inflammation marquée et d’ainsi reproduire chez la souris un phénotype proche de la maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration orale de tamoxifène par gavage (20s), trois frois ; une tous les 5 jours puis il y aura une seule injection intrapéritonéale de toxine diphtérique à J17 (5s).

Impact sur les animaux

Le projet soumis est basé sur l'étude de la régénération intestinale à la suite d’une lésion induite par injection de toxine diphtérique, qui entraîne l'élimination de tous les types de cellules épithéliales de l’intestin. Les effets attendus seront ceux provoqués par la perte de l'épithélium intestinal. Comme aucun autre type cellulaire n'est affecté par la toxine, nous n’attendons ainsi que des effets indésirables de nature modérée. Il est possible que les animaux puissent néanmoins souffrir d'une légère colite, dérivée de la perte transitoire de la capacité d'absorption de l’intestin. Cependant, l'épithélium intestinal a la capacité de se régénérer complètement en seulement 3 jours à la suite d’une blessure, de telle sorte que les animaux ne subiront pas d'effets indésirables sur une durée prolongée. De plus, comme aucun effet secondaire n’est induit par le tamoxifène ou son véhicule et que les animaux seront maintenus en expérience seulement une semaine au maximum après l’administration de toxine diphtérique, nous n’attendons pas de perte de poids des animaux ni d’effets secondaires additionnels durant cette courte période. Le stress lié au gavage/contention, douleur au point de piqure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure afin de récupérer les organes pour étudier les effets de la toxine diphtérique en fonction des doses sur l’animal. Dans le but de déterminer pour l’avenir, la dose idéale à utiliser afin d’étudier les processus de régénération musculaire sans induire de souffrance aux souris.

Remplacement

Il n'existe pas et il ne peut y avoir d'alternatives non animales dans l'étude du processus de régénération de l'épithélium intestinal, car il s'agit d'un processus auquel participent une multitude d'organes et de types de cellules, ainsi que le microbiote lui-même, présent à l'intérieur de l'intestin lumen, qui joue un rôle clé. Pour cette étude, des animaux vivants sont nécessaires car le maintien de l'ensemble du microenvironnement intestinal est essentiel, afin d'établir le rôle de chaque élément dans le dit processus.

Réduction

Les animaux auront le même fond génétique pour limiter les variations entre les lignées. - Le plus grand nombre d'analyses possible sera effectué sur chaque animal, afin d'éviter d'en utiliser inutilement. - Chaque expérience sera réalisée 3 fois, à des jours différents, pour assurer la reproductibilité des expériences. Cependant, si les deux premières expériences génèrent des résultats identiques, la troisième ne sera pas effectuée. - Les analyses statistiques seront effectuées en prenant en compte la structure des données (cages et répétition principalement) en utilisant es modèles à effets mixtes. Les animaux témoins seront comparés aux animaux de laboratoire expérimentaux par groupes de 10 (5 mâles + 5 femelles), ce qui permettra de mettre en évidence les effets attendus avec suffisamment de puissance. - La deuxième répétition d'une expérience ne sera réalisée que si les effets néfastes sur l'animal sont minimes. En cas de découverte d'effets secondaires sévères au cours d’une expérience, le traitement sera interrompu. Les animaux ne peuvent pas être réutilisés car ils seront mis à mort au cours du processus.

Raffinement

En ce qui concerne le futur projet, cette procédure nous permettra d'effectuer un affinage important puisque, grâce à cette étude pilote, nous connaîtrons la cinétique de la toxine diphtérique dans notre modèle, et nous établirons les temps d'étude et le dosage, de sorte que dans le projet sur l'étude du rôle de SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier), dans la régénération intestinale, les animaux auront les conditions optimales impliquant moins de souffrance, sans effets secondaires attendus. En ce qui concerne cette procédure : - Les animaux seront gardés dans un nombre maximum de 5 par cage. - Les injections et gavages seront administrés par une personne formée et compétente dans ce type de techniques. - Un criblage de différentes doses de toxine diphtérique sera effectué afin d'établir une dose minimale de toxine qui ne cause ni douleur ni stress aux animaux. - L'état de santé des animaux sera contrôlé 2 fois par jour tous les jours pendant toute la durée de l'expérience. Des points limites seront mis en place, basés sur une observation clinique de l’animal, des seuils d’intervention et des interventions adaptées (utilisation d’analgésique, mise à mort).

Choix des espèces

La souris de laboratoire Mus musculus est l’espèce indispensable dans la réalisation de ce projet. Il s'agit tout d’abord d'un mammifère, dont le système digestif est essentiellement composé des mêmes structures et des mêmes types de cellules que ceux de l’Homme. L’étude de la régénération intestinale dans cette espèce est donc tout appropriée. De plus, la création de lignées génétiquement modifiées est un processus établi et relativement facile à mettre en place. Elle génère ainsi des modèles spécifiques pour étudier par exemple des types cellulaires donnés, ici cellules épithéliales intestinales et cellules souches, nous permettant ainsi de répondre à plusieurs questions. Les souris sont également faciles à entretenir et à manipuler et se reproduisent relativement rapidement. Toutes ces caractéristiques font de la souris de laboratoire un modèle idéal pour nos besoins. De jeunes souris adultes (entre 8 et 12 semaines) seront utilisées car il est nécessaire que le développement et la maturation de l'animal soient terminés, afin qu'il n'interfère en aucune façon dans l'obtention de résultats, ainsi qu'ils soient pas trop âgé, de sorte que, de la même manière, le processus de vieillissement ne le fasse pas.

4 000 poulets de chair vont être utilisés, tous envoyés à l'abattoir ou vendus au personnel à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole vise à provoquer volontairement des boiteries douloureuses, par nécrose des têtes fémorales, au moyen d'un sol modifié pendant les quarante-deux jours d'élevage. L'objectif est de tester une trentaine de solutions alternatives aux antibiotiques et de réduire une pathologie fréquente en élevage industriel. Le porteur qualifie les nuisances de légères tout en euthanasiant les animaux dès qu'une boiterie atteint un stade modéré, et décrit l'espèce visée comme le seul modèle possible.

Objectifs

Depuis plusieurs années, les boiteries avec composante bactérienne (nécroses des têtes fémorales) constituent un problème majeur en élevages de poulets de chair. Les germes associés à cette pathologie sont multiples (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus caecorum etc.) et conduisent à des utilisations d’antibiotiques qui peuvent être importantes. En effet, une émergence de maladies avicoles liées au germe Escherichia coli, avec davantage de problèmes locomoteurs a été observée depuis les années 2000, passant de 0.3% en 2006 à 8% en 2017 et 7% en 2018. L’infection et la nécrose des cellules du cartilage de l’os sont douloureuses pour l’animal, qui réduit ses déplacements, donc sa fréquentation des abreuvoirs et des mangeoires, ce qui peut conduire à la mort par déshydratation et/ou arrêt de la prise alimentaire. Il s’agit donc à la fois d’un problème de bien-être animal, d’un problème sociétal lié à l’utilisation d’antibiotiques et d’un problème économique, les pertes (mortalité, morbidité, baisses de croissance) pouvant être conséquentes. La compréhension de ce phénomène fait l’objet de quelques travaux dans la littérature mais la recherche de solutions est complexe, notamment car nous ne disposons pas à ce jour d’un modèle expérimental reproductible et représentatif du problème terrain en station expérimentale. Un tel modèle permettrait de comparer rapidement et avec une intensité de symptômes contrôlée un grand nombre de solutions alternatives aux antibiotiques potentielles.

Bénéfices attendus

Ce modèle présente plusieurs avantages : - il est représentatif du problème observé sur le terrain. Il assure que les solutions mises en évidence pour leur efficacité en station le soient également dans le futur dans les élevages. - il est mis en œuvre dans une station avec des conditions d’élevage standardisées et homogènes. Il permet ainsi de comparer en un minimum de temps un maximum de solutions potentielles, sans biais lié à l’environnement de travail. Les 5 essais réalisés permettront de tester 30 solutions différentes (avec dans chaque essai un témoin négatif et un témoin positif pour en valider le bon déroulement), et pourraient conduire en 5 ans à l’élaboration d’une solution permettant de réduire notablement les problèmes de boiteries sur le terrain. Il faut également noter que la mise en évidence d’une solution efficace à travers ces tests sur 4000 poulets permettra à terme de réduire une pathologie qui concerne plusieurs milliers d’animaux sur le terrain.

Procédures

Les animaux seront soumis à des conditions spécifiques d'hébergement (strucuture du sol modifié) pendant 42 jours (durée d'élevage des animaux). Aucune autre intervention ne sera réalisée sur les animaux hormis des relevés de poids par parquet 8, 21, 35 et 42 jours après le début de l’essai (environ 5 minutes par parquet).

Impact sur les animaux

Le modèle a pour but de favoriser l’apparition de troubles locomoteurs chez le poulet de chair. Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont donc des douleurs/lésions/maladies au niveau des pattes des poulets, douleurs liées à un environnement non adapté (qualité de la litière). Ces nuisances seront de classe légère. Un animal qui présentera une de ces nuisances à un niveau de classe modérée sera retiré de l'étude (euthanasie).

Devenir

L’élevage des poulets jusqu’à 42 jours en station conduit à un poids vif équivalent aux poulets lourds engraissés jusqu’à 49 jours sur le terrain. Les animaux sont donc envoyés en abattoir dans des conditions identiques à celles des poulets élevés sur le terrain ou vendus au personnel de la station.

Remplacement

Les nécroses des têtes fémorales sont une pathologie complexe, d’origine multifactorielle, et dont les causes ne sont pas encore clairement établies. De ce fait, il n’est pas possible à ce jour de développer un système prédictif des boiteries ou un modèle mathématique (qui supposerait d’ailleurs que nous connaissions les solutions efficaces pour réduire cette pathologie, alors qu’il s’agit justement de l’objectif du projet). De même, il n’existe pas de modèle in vitro validé sur ce sujet. Pour le moment, seul un modèle in vivo peut permettre d’évaluer des solutions transposables sur le terrain, c’est-à-dire qui seront aussi efficaces en élevages qu’en essai.

Réduction

Lors de leur mise en place, les poussins sont placés à raison de 50 individus par parquet. Cela permet de tenir compte du taux de mortalité « naturelle » avant 14 jours (poussins porteurs de pathologies ou de défauts non décelées au couvoir), mais aussi d’éliminer les animaux présentant des symptômes de pathologies non liées au modèle expérimental, qui pourraient fausser les résultats. Le dispositif permet de tester 8 traitements, à raison de 2 parquets par traitement, ce qui constitue un compromis entre tester plusieurs solutions simultanément et avoir au moins 2 répétitions pour assurer la fiabilité des données.

Raffinement

La capacité de déplacement des animaux est régulièrement évaluée sur une échelle de 0 (déplacement normal) à 3 (incapacité à se déplacer). A minima 2 fois par semaine, les poulets présentant un score de boiteries supérieur ou égale à 2 (défaut évident qui affecte la capacité de déplacement) sont euthanasiés selon la méthode décrite au point 3.3.3. Ainsi, aucun animal présentant une boiterie affectant visiblement sa capacité à accéder à l’eau ou à l’aliment n’est laissé en souffrance. Afin de réduire le stress des animaux dans les conditions particulières de cet essai : - L’eau et l’aliment sont laissés en accès libre et les niveaux nutritionnels couvrent les besoins d’entretien et de croissance des animaux. - Les manipulations d’animaux vivants sont réduites au minimum et le modèle n’est pas invasif : pesée collective à la mise en lot, trois fois pendant l’essai (J8, J21, J35) et une fois à la fin de l’essai (J42).

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible. Par ailleurs, la méconnaissance des processus métaboliques à l’origine des nécroses des têtes fémorales chez l’oiseau ne permet pas d’établir un parallèle avec une autre espèce. Enfin, le cycle d’élevage court de la volaille permet de limiter la durée des dommages dans les conditions de la procédure expérimentale. Il est communément admis que les nécroses des têtes fémorales trouvent leur origine dès la phase de démarrage de l’élevage des poulets, ce qui nécessite de commencer l’essai dès 1 jour d’âge. L’expression maximale des boiteries s’observe en fin d’élevage, et elles sont plus marquées sur des poulets dits « lourds », élevés jusqu’à 49 jours sur le terrain. Les conditions sanitaires préservées de la station permettent néanmoins d’obtenir un poids vif proche du poids final du terrain dès 42 jours. De ce fait, la durée de l’essai sera de 1 jour d’âge jusqu’à 42 jours d’âge, afin de permettre l’expression des boiteries jusqu’au poids vif représentatif du terrain.

338 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur cœur est irradié à des doses faibles à modérées, puis leur fonction cardiaque est suivie par échographie, électrocardiogramme et stimulation transœsophagienne sous anesthésie, sur une durée pouvant atteindre quinze mois. Le projet cherche à comprendre les troubles du rythme observés après radiothérapie du sein droit chez les femmes. Le porteur affirme que l'irradiation à faibles doses n'entraîne ni douleur ni brûlure et fixe un point limite de mise à mort à 20 % de perte de poids.

Objectifs

Après une exposition du cœur à des rayons X (comme dans le cas de la radiothérapie pour les cancers du sein), des problèmes cardiaques (troubles du rythme, insuffisance cardiaque) peuvent être observés. Notre hypothèse est que le développement de ces troubles cardiaques est lié à l’irradiation par des doses faibles à modérées de petites structures du cœur. L’objectif du projet est d’obtenir de nouvelles connaissances sur l’effet d’une exposition de doses faibles à modérées d’irradiation et de constater de façons fonctionnelle, cellulaire et moléculaire les effets de cette irradiation sur le système nerveux sympathique cardiaque et sur le développement de troubles du rythme radio-induite à long terme ; afin d’améliorer et d’actualiser les connaissances en radioprotection.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un projet multi-site se déroulant sur 2 EU différents. Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances d’un point de vue mécanistique sur l’effet d’une exposition de doses faibles à modérées d’irradiation du système nerveux sympathique cardiaque et sur le développement de troubles du rythme radio-induite afin d’améliorer et d’actualiser les connaissances en radioprotection et plus particulièrement chez des patientes cancer du sein : 1) Confirmer les données épidémiologiques de développement de trouble du rythme post-irradiation du sein droit. 2) Obtenir des données de caractérisation structurale, cellulaire, moléculaire ainsi que des mécanismes impliqués dans le remodelage du tissu cardiaque à des doses faibles à modérées d’irradiation pouvant conduire à des maladies cardiaques et surtout des problèmes de rythme cardiaque. 3) Définir un seuil dose/effets sur le développement d’un trouble du rythme dans ce modèle expérimental avec l'utilisation d'une gamme de doses allant de 250 à 2000 mGy, Tous ces résultats permettront d’améliorer, d’actualiser les connaissances sur les effets de la radiothérapie sur les femmes traitées pour un cancer du sein droit.

Procédures

Plusieurs interventions seront réalisées sur les souris notamment une irradiation localisée sous anesthésie. L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de brulure aux animaux, seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque a été observée à long terme. Les animaux seront suivis par échographie doppler sous anesthésie pour contrôler leur fonction cardiaque, leur rythme cardiaque (ECG) et enfin une mesure de stimulation transoesophagienne sous anesthésie sera également réalisée pour se rendre compte d’un potentiel trouble du rythme.

Impact sur les animaux

L’irradiation à de faibles doses n’entraine ni douleur ni brulure pour les animaux que ce soit pendant l’irradiation ou après. Seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque ont été observée à long terme. Les anesthésies sont réalisées pour chaque intervention sous isoflurane, sauf la stimulation transoesophagienne qui nécessite une injection d’anesthésique. Les anesthésies sont répétées mais éloignées dans le temps évitant l’apparition d’effets secondaire indésirable chez les souris.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir réaliser des prélèvements sanguins et des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Pour mimer des modèles d’irradiations localisées au niveau cardiaque comme lors des cancers du sein, il est nécessaire d’avoir recours à un modèle intégré pour comprendre la réponse des doses faibles à modérées sur le développement des troubles du rythme post-irradiation à long terme. L’évaluation de la fonction cardiaque par échodoppler, nécessite des modèles murins. De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus de développement de la maladie. En effet, il est très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.

Réduction

Au total, 338 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un logiciel « GPower » qui calcul le nombre d’animaux suffisant pour obtenir la meilleure puissance statistique avec le nombre minimum d’animaux. L’analyse indique que 8 animaux/groupe pour les mesures de stimulation électrique de la partie haute du cœur et l’étude de la fonction cardiaque par Echographie doppler pour observer les effets attendus. Néanmoins si on considère une mortalité possible due à la longévité des souris pour nos groupes qui seront gardés pendant 15 mois post-irradiation, on constituera des groupes de 10 animaux pour conserver un nombre d’animaux suffisant pour nos analyses statistiques

Raffinement

Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids constituent un point limite, ainsi que l’observation des certains signes d’atteinte de l’état général.

Choix des espèces

Pour mimer des modèles d’irradiations localisées au niveau cardiaque comme lors des cancers du sein, il est nécessaire d’avoir recours à un modèle intégré pour comprendre la réponse des doses faibles à modérées sur le développement des troubles du rythme post-irradiation à long terme. Notamment l’évaluation de la fonction cardiaque par écho-doppler nécessite des modèles animaux. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature. Les animaux arriveront entre 4-6 semaines pour limiter les bagarres. Le sexe des animaux doit être justifié, en particulier si un seul des deux sexes est sélectionné. Des souris C57BL/6J femelle seront utilisées pour mimer les femmes traitées par radiothérapie dans les cas de cancer du sein.

1 440 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par voie intraveineuse ou intra-tibiale, puis subissent des prélèvements sanguins répétés, jusqu'à trente-six ponctions étalées sur dix-huit mois. Le projet vise à anticiper la rechute de patients atteints de leucémie aiguë en amplifiant leurs cellules chez la souris pour tester des médicaments. Le porteur affirme que ni les cellules de patients en culture ni les lignées cellulaires ne conviennent et conclut que la xénogreffe reste le modèle "indispensable".

Objectifs

Les leucémies aiguës sont des cancers agressifs et rares du sang. Les rechutes surviennent dans ~40% des cas et sont presque systématiquement mortelles à défaut de traitement codifié efficace. Pourtant de nouveaux traitements émergent, en particulier les thérapies ciblées. Mais nous ne savons pas quels patients peuvent en bénéficier en situation de rechute. Il est impossible de de réaliser des tests de nouveaux médicaments directement sur la leucémie du patient. La seule méthode actuellement validée dans la littérature est d’injecter les cellules leucémiques du patient au diagnostic dans un modèle de souris immunodéprimée pour amplifier les cellules leucémiques et modéliser la rechute. Aussitôt la greffe obtenue et la leucémie amplifiée, l’expérimentation est arrêtée pour récupérer les cellules leucémiques et réaliser les tests de drogues en laboratoire dont il est établi qu’ils sont parfaitement corrélés avec la réponse thérapeutique du patient en rechute. Il s’agit par conséquent d’anticiper la rechute avec ce modèle afin de proposer au patient un traitement efficace aussitôt qu’il rechute. Nous n’injecterons chez les souris que des leucémies pour lesquelles nous avons identifié qu’elles étaient à haut risque de rechute (~40% des patients).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus se situent à deux niveaux. Le premier niveau est individuel : nous pourrons identifier avant même la survenue de la rechute du patient un traitement prédit efficace par le modèle qui pourra alors être proposé dès la rechute du patient. Le deuxième niveau est collectif : nous pourrons corréler les données de ce modèle avec d’autres informations biologiques collectées dans le laboratoire afin d’identifier des biomarqueurs prédictifs de la sensibilité à chacune des thérapies ciblées. C’est un atout majeur, car les patients qui rechuteraient sans avoir bénéficié d’un tel modèle pourront disposer d’un traitement ciblé sur la base de ces biomarqueurs ; et nous pourrons ne plus utiliser le modèle murin lorsque nous aurons identifié des biomarqueurs capables de se substituer à l’utilisation du modèle animal.

Procédures

Injection de cellules leucémiques dans la veine caudale (90% des cas soit 1296 souris) sur souris vigile contentionnée, sous anesthésie locale : 1 injection unqiue/souris (durée : 30sec). Injection de cellules leucémiques par voie intra-tibiale (10% des cas soit 144 souris) sur souris endormie (anesthésie par voie gazeuse) et sous couverture antalgique locale : 1 injection unique/souris (durée 2 min). Prise de sang au niveau de la veine sub-mandibulaire (90% des cas soit 1296 souris) sur souris vigile : 2 fois par mois, puis 1 fois par semaine (durée : 30 sec) jusqu'à atteinte d'un point limite (maximum : 36 prélèvements de 30 sec étalés sur 18 mois). Prise de sang au niveau intra-tibial (10% des cas soit 144 souris) sur souris endormie (anesthésie par voie gazeuse) et sous couverture antalgique locale : 1 fois/mois à partir de 3 mois après injection des cellules leucémiques (durée : 2 min, maximum : 15 prélèvements de 2 min étalés sur 18 mois).

Impact sur les animaux

Les éventuels nuisances/effets indésirables peuvent se produire à 3 niveaux : -1/injection (éventuelle douleur post-injection, rapidement résolutive). -2/prise de greffe (éventuelles douleurs, perte de poids, changement de comportement). -3/monitorage biologique (éventuel stress momentané). -4/Le cas échéant, survenue de pathologies liées à l'âge.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les cellules leucémiques de patients (dites cellules primaires) ne peuvent pas être obtenues en quantité suffisante pour tester in vitro l’efficacité des médicaments innovants. Ces cellules sont fragiles et ne peuvent être maintenues en culture suffisamment longtemps pour les besoins des expériences. L’utilisation de lignées cellulaires de leucémies aigues ne constitue pas une alternative, car elles ne représentent pas les spécificités individuelles des patients. Le modèle murin est le seul pertinent dans cette étude pour modéliser la rechute des patients individuels dans le cadre de la médecine personnalisée. Pour toutes ces raisons, l’utilisation de xénogreffes dérivées de patients reste le modèle préclinique indispensable pour l’étude des leucémies aiguës, et pour tester l’efficacité de nouveaux traitements, comme rapporté dans la littérature scientifique.

Réduction

6 prélèvements de patients à haut risque de rechute seront reçus par mois. La prise de greffe se produit pour environ 50% des souris injectées. Pour chaque patient, il est nécessaire de récupérer les cellules leucémiques provenant de 2 souris pour espérer avoir suffisamment de cellules leucémiques pour tester notre panel de médicaments innovants en duplicats et ainsi avoir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, afin de maximiser les chances de greffe et pour espérer obtenir suffisamment de cellules pour tester leur sensibilité aux traitements innovants, les cellules leucémiques de chaque patient seront injectées dans 4 souris âgées de 8 à 12 semaines (âge auquel le taux de prise de greffe est le plus haut).

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux : Les cages sont ventilées et enrichies à l’aide de cotons, petits bouts de bois et tunnels rouges, afin de répondre aux besoins des souris (nidification, entretien des dents, jeux). Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Nous avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille de score que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi visuel quotidien des animaux sera assuré par un zootechnicien Les responsables du projet tiendront une fiche d'observation des points limites 1 fois/semaine ou plus, si un animal présente des signes de mal-être ou de souffrance. La manifestation de tout signe évoquant une douleur définie par les points limites préalablement évoqués sera particulièrement surveillée. Le volume des injections et des prélèvements sera réduit au minimum possible. Afin de limiter la douleur, l'injection des cellules leucémiques au niveau de la veine caudale se fera sous anesthésie local. Les injections et prélèvements au niveau intra-tibial seront effectués sous anesthésie gazeuse (durée totale d'environ 2 minutes) avec couverture antalgique générale (30 min avant l'injection/prélèvement) et locale (immédiatement avant et après l'injection/prélèèvement) au point d'injection. Les prélèvements au niveau de la veine sub-mandibulaire et au niveau tibial pour le suivi de la prise de greffe seront réalisés en alternant successsivement les côtés gauche et droit pour chaque souris.

Choix des espèces

Voici les facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) Les souris immunodéprimées ont été abondamment décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des leucémies humaines et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouveau traitements. 2) L'hématopoïèse (=la fabrication des cellules du sang) et la leucémogénèse (=l'apparition de la leucémie) ont été largement étudiés chez la souris. Nous pourrons donc analyser nos résultats à la lumière de toute cette connaissance accumulée chez la souris. 3) Leur durée de vie est particulièrement adaptée par rapport à la cinétique de prise de greffe et pour un programme de recherche sur 5 ans. 4) Les 2 sexes seront utilisés sans distinction car il n'y a pas d'influence des hormones sexuelles sur la survenue des leucémies. Afin de maximiser les chances de greffe et d'obtenir suffisamment de cellules, chaque prélèvement de patient sera injecté dans 4 souris, âgées de 8 à 12 semaines (car présentent le plus haut taux de succès de prise de greffe).

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est exposée aux fumées de cigarette deux heures par jour, cinq jours sur sept pendant quatre semaines, puis toutes subissent trois séances d'imagerie TEP sous anesthésie et l'injection d'un vaccin anti-tabac, pour mesurer les effets de quatre vaccins en développement. Les retombées annoncées se limitent à compléter une étude clinique en cours, l'objectif immédiat restant l'imagerie du métabolisme cérébral. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut modéliser ces mécanismes et conclut que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Le tabagisme fait plus de 8 millions de morts dans le monde chaque année et est reconnu comme un fléau mondial. Il est la première cause évitable de mortalité en France. La lutte contre le tabagisme est une priorité de santé publique. A ce jour, les options pharmacologiques pour arrêter le tabac sont limitées. Un vaccin anti-tabac, qui permettrait de faciliter le sevrage tabagique, serait novateur dans la lutte contre le tabagisme. L’objectif de ce projet est de mesurer les effets de différents vaccins anti-tabac (4 au total) en cours de développement par une approche d’imagerie non-invasive, la tomographie par émission de positons (TEP), qui offre la possibilité d’explorer in vivo les mécanismes moléculaires impliqués dans le fonctionnement cérébral, notamment les modifications du métabolisme cérébral en présence et en absence d’une addiction au tabac (avec et sans vaccin anti-tabac). Cette étude sera menée chez un modèle murin : des animaux seront exposés deux heures par jour aux fumées de cigarette pendant 4 semaines puis la moitié recevra une dose de d’un vaccin anti-tabac.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude complèteront une étude clinique en cours et fourniront de nouvelles informations sur l'utilisation de certains vaccins anti-tabac pour faciliter le sevrage tabagique.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : Mise à jeun 6h avant l’imagerie • Réalisation 3 sessions d’imagerie (injection d’un radiotraceur durée 10 secondes) sous anesthésie gazeuse (durée 60 minutes au maximum) • Pour la moitié des animaux, exposition quotidienne aux fumées de cigarette (2 heures par jour, 5 jours sur 7 pendant 4 semaines). • Injection d’un vaccin anti-tabac (durée 10 secondes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Mise à jeun 6h avant l’imagerie pouvant entrainer une perte de poids inférieure à 5%. • Exposition quotidienne aux fumées de cigarettes entrainant une perte d’appétit (ralentissement de la courbe de prise de poids) et une irritation des voies respiratoires. • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances, modéliser in vitro ou in silico des tissus complexes en présence et en absence à une addiction au tabac en prenant en compte la distribution périphérique, les transporteurs, l’élimination hépatique ou hépatobiliaire, le métabolisme etc.., afin d’évaluer le métabolisme cérébral par le radiotraceur avec et sans vaccin anti-tabac n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier le métabolisme cérébral par le radiotraceur avant et après vaccin anti-tabac.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique. L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisation des mêmes animaux tout au long de l'expérience ; chaque animal est son propre témoin, ce qui divise par 3 le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les rongeurs seront hébergés par groupes. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. Cette espèce fait partie des modèles animaux les plus décrits dans la littérature pour les études sur le tabac. En effet, cette espèce a été choisie puisqu'elle permet de modéliser l’exposition au tabac ainsi que d'évaluer les différents effets des vaccins testés. Les animaux seront des adultes âgés de 10-11 semaines, étant donné que nous sommes intéressés aux effets cérébraux du tabac à l'âge adulte.