Recherche appliquée

18 450 rongeurs, 17 200 souris et 1 250 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux subissent l'implantation d'un transpondeur, des prélèvements sanguins répétés dont des ponctions cardiaques et des gavages, dans des modèles d'allergie cutanée, alimentaire et d'anaphylaxie pour tester des composés. Le porteur indique que la stimulation par l'allergène peut provoquer une hypothermie, des atteintes respiratoires et cardiaques et une anaphylaxie "pouvant être mortelle". Tous les animaux sont tués à l'issue, le porteur affirmant qu'il n'existe "pas de modèles in silico ou in vitro" pour évaluer ces composés.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés dans des modèles d’allergie chez le rongeur. Les pathologies allergiques sont actuellement placées au 4ème rang mondial des maladies inflammatoires chroniques par l’OMS et selon les estimations statistiques réalisées la moitié de la population mondiale sera concernée d’ici à 2050. Il est donc primordial de poursuivre la recherche de nouvelle thérapies et l’évaluation de l’efficacité de ces traitements dans ce domaine. Ce projet visera particulièrement les allergies cutanées (urticaire, dermatite, …), alimentaires et généralisées telles que les anaphylaxies dont la prévalence a largement augmenté avec l’industrialisation mondiale. L’allergie est une pathologie complexe et multifactorielle, associée à un dérèglement du système immunitaire, nommée hyperréactivité, à l’égard de substances banales de l’environnement : les allergènes, conduisant à une perte de tolérance. L’allergie peut toucher de nombreux organes, néanmoins la peau et les muqueuses sont les tissus les plus souvent atteints de par leur interaction directe avec l’environnement. Elle se définit par une cascade d’événement qu'il est important d'identifier et de charactériser afin de développer des stratégies innovantes efficaces. Durant la première phase, dite de sensibilisation, l’individu est exposé pour la première fois à un allergène et va synthétiser des immunoglobulines E (IgE) spécifiques de cet allergène. La seconde phase, dite effectrice, induite lors de l’exposition secondaire ou chronique où l’individu pourra développer les symptômes d’une allergie (rougeurs, démangeaisons...). Des IgE seront produites et leurs interactions avec le récepteur FceRI permettront l’activation de cellules immunitaires innées telles que les mastocytes, basophiles, neutrophiles principalement retrouvées dans la peau, le tube digestif et les poumons. cette activation conduira à la libération très rapide de médiateurs pré-stockés tels que l’histamine, des leucotriènes ou des prostaglandines, responsables des symptômes engendrés dans les premières minutes de la réaction allergique : rougeurs, démangeaison, sécrétion et œdèmes. Puis la sécrétion de médiateurs lipidiques et protéiques permettra de soutenir cette inflammation locale qui peut à long terme être responsable d’altérations tissulaires et d’une anaphylaxie correspondant à une réaction allergique hyper-aiguë pouvant être mortelle.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels des pathologies allergiques ou anaphylactiques (utilisation d’anti-histaminiques, de bronchodilatateurs, injection intramusculaire d’adrénaline) réduisent les symptômes mais affectent peu la progression de la maladie. Les traitements biologiques récents sont plus efficaces mais très couteux et tous augmentent le risque d'infection. En outre ces traitements peuvent engendrer une immunogénicité et une perte d'efficacité due à la production d'anticorps neutralisants par le patient. Les procédures qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans les pathologies inflammatoires. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux :  Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études.   Mesure de la température corporelle : Durée 1 minute sur animal vigile ou sous anesthésie générale, par le biais d'un transpondeur implanté ou via une sonde rectale pour rongeur, pourraient être effectuées toutes les heures au cours des 24 heures ou sur une durée de 15 jours suivant le challenge avec les antigènes.   Implantation de transpondeur pour la mesure de la température : Durée 1 minute, sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.   Prélèvements de sang   par voie retro orbitale au cours des procédures : Durée 30 secondes sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.   Via la submandibulaire : Durée 30 secondes sur animal vigile ou sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.    via la veine caudale : Durée 30 secondes sur animal vigile ou sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.    via ponction cardiaque : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.   Les volumes et la fréquence des prélèvements seront généralement de 20 à 50 µl chez la souris et de 20 à 200 µl chez le rat. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place pouvant aller jusqu'à une semaine. •    Administrations des composés à potentiel thérapeutiques   par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, sous-cutanée, par application topique ou via la veine caudale : Durée 30 secondes sur animaux vigiles.   Administrations intraveineuses par voie retro orbitale : Durée 30 secondes Sous anesthésie générale (Isoflurane ou kétamine/xylazine).

Impact sur les animaux

Ces procédures peuvent engendrer une dégradation rapide de l’état de santé de l’animal pouvant se traduire par une modification du comportement animal (inactivité, absence de réaction aux stimuli, des vocalisations), une hypothermie, des atteintes respiratoires (angio-œdème, baisse de la fréquence respiratoire, baisse du volume courant, hypoxie), cardiaques (hypotension, tachycardie, vasodilatation, diminution de la perméabilité vasculaire), cutanées (érythème, œdème, épaississement de la peau), intestinale (diarrhée), une perte de poids. Ces effets surviennent suite à la stimulation avec l’allergène et s’établissent très rapidement (en quelques minutes ou heures). Les animaux seront également soumis à une anesthésie, des administrations et des prélèvements sanguins sous anesthésie générale qui peuvent constituer des nuisances.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des études. Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux.

Remplacement

A notre connaissance, il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent d’évaluer une potentielle efficacité thérapeutique de composés dans des pathologies allergiques. Seul un modèle animal peut permettre de mimer de manière séquentielle le développement de la pathologie et contenir tous les acteurs cellulaires et moléculaires nécessaires à ces diverses étapes.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles rongeurs de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards réglementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire ou mis à mort selon les recommandations définis dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Le stress lié à la manipulation peut avoir un impact sur la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rat et la souris. De nombreuses données sur les modèles d’allergie chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l'avancement des projets (doses de l'agent allergènes, effets de molécules de références etc.) Adulte : Les données de la littérature indique clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l'évaluation de l'efficacité de composés dans le domaine des pathologies allergiques

10 chiens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs de la même mutation que les enfants atteints de la maladie de Sanfilippo B, ils reçoivent une injection intracérébrale et intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie de quatre heures, puis des prélèvements sanguins, des ponctions de liquide céphalorachidien et des IRM répétés sur trois à douze mois, avant leur mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable des injections et présente cette étape comme "indispensable" avant un essai clinique chez l'enfant. Il justifie le chien par sa prédisposition naturelle à cette mutation et sa proximité neurologique avec l'humain.

Objectifs

La mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB), ou maladie de Sanfilippo B, est une maladie rare dite de surcharge lysosomale, et qui affecte 0.7 à 1.8 nouveau-nés pour 100000 naissances en Europe. La maladie survient lorsque des enzymes nécessaires à la dégradation et au stockage de molécules de sucres complexes font défaut à l’organisme : ainsi le déficit d’une enzyme nommée l’α-N acétylglucosaminidase (NaGlu), requise dans la voie de dégradation du sucre, l’héparane sulfate, engendre une accumulation toxique de ce dernier dans de nombreux organes dont le foie, la rate et surtout le cerveau. La maladie de Sanfilippo B est caractérisée par une atteinte sévère du Système Nerveux Central (SNC). La maladie débute le plus souvent entre 2 et 6 ans avec un retard du développement psychomoteur, des troubles du comportement, un défaut d'attention, une hyperactivité et une agressivité. La régression des acquisitions intellectuelles est rapide et sévère et dans la phase finale, ils deviennent grabataires, perdent tout contact avec leur entourage et développent une encéphalopathie profonde. Le décès survient généralement au décours d'une surinfection respiratoire. L’espérance de vie des enfants atteints de cette pathologie est de l’ordre de 15 à 20 ans. Actuellement, aucun traitement approuvé ne peut aboutir à la guérison. Les seuls soins apportés visent à traiter les complications liées à la maladie et améliorer la qualité de vie des malades et de leur entourage. Le produit de thérapie génique que nous souhaitons tester vise à corriger le déficit de l’enzyme NaGlu à l’origine de la maladie. L’objectif principal de ce projet est de réaliser une étude de biodistribution, d’efficacité et d’évaluation de la tolérance chez le modèle animal du chien MPSIIIB après administration combinant une injection intracérébrale et une injection intraveineuse (IV) du produit de thérapie génique, sur un suivi de 3 mois et de 12 mois post-injection.

Bénéfices attendus

Le syndrome de Sanfilippo est la conséquence d’une accumulation de molécules d’un sucre, l’héparane sulfate, partiellement dégradées, dans les tissus de l’organisme. Ceci est le fait d’une mutation génétique qui affecte l’activité d’une enzyme, l’α-N acétylglucosaminidase (NaGlu), nécessaire pour la dégradation de l’héparane sulfate. Ces molécules mal dégradées, qui ne peuvent pas être éliminées, entravent le développement normal du cerveau puis détruisent les cellules du cerveau. Les premiers symptômes de la maladie associent un retard du développement cognitif associé à une hyperactivité, un comportement autistique et des troubles du sommeil. Ils apparaissent habituellement avant l’âge de 3 ans. Par la suite, l’atteinte neurologique entraîne une déficience intellectuelle et une réduction des capacités motrices qui aboutissent à la perte d’autonomie vers l’âge de 10 ans et un décès survenant le plus souvent entre 10 et 20 ans. Actuellement, cette pathologie est incurable, le traitement n'est que symptomatique. L'évaluation d'approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d'un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, avoir un modèle animal pertinent est nécessaire pour pouvoir réaliser des études précliniques nécessaires (preuves de concept de l’efficacité des produits thérapeutiques, études de dose…). Le présent projet vise à évaluer l’efficacité d’un traitement de thérapie génique sur des chiens atteints de la maladie. C’est une étape essentielle dans le développement préclinique qui permettra à terme de proposer un traitement curatif aux patients atteints. Elle permettra ainsi de générer toutes les données précliniques telles que les données de biodistribution du produit de thérapie génique dans le cerveau et les organes périphériques des animaux injectés, l'étude histologique, mais aussi la tolérance globale de cette approche avec le suivi IRM (Imagerie par Résonance Magnétique), les données des bilans biologiques sanguins et de dosage de biomarqueur spécifique. Le but global de l'étude étant de soutenir la demande d'un essai clinique de phase I/II chez les patients souffrant de la maladie de Sanfilippo.

Procédures

Chaque animal inclus dans cette étude sera soumis aux interventions suivantes : - Une procédure d’injection intra-cérébrale et intraveineuse concomitante, effectuées par des spécialistes sous anesthésie générale et analgésie. Durée intervention : environ 4h - Des prélèvements sanguins effectués soit vigiles sous légère contention (animaux sociabilisés et habitués aux manipulations) soit sous anesthésie (anesthésie destinés aux autres gestes décrits). Pour un total de 7 prélèvements sanguins pour les animaux suivis 3 mois, et 10 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l’acte : environ 5 min - Des prélèvements du liquide céphalo rachidien (LCR) seront effectués par ponction, soit au niveau lombaire, soit au niveau atlanto-occipital. Ils seront réalisés par des vétérinaires spécialistes sous anesthésie générale et analgésie. Pour un total de 6 prélèvements pour les animaux suivis 3 mois, et 9 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l’acte : environ 10-15 minutes - Des imageries par résonnance magnétique (IRM) qui seront faites sous anesthésie générale et analgésie. Pour un total de 4 examens pour les animaux suivis 3 mois, et 5 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l’acte : environ 1h30 - Un traitement immunosuppresseur tout au long de l’étude par administration orale de corticostéroïdes et d’un immunosuppresseur

Impact sur les animaux

- L’injection du vecteur thérapeutique par voie intraveineuse et les prélèvements sanguins sont des gestes peu invasifs pour lesquels aucun effet indésirable est attendu. Ces 2 actes seront réalisés lors des anesthésies prévues pour les autres gestes. - L’injection du vecteur thérapeutique par voie intracérébrale (IC) sera réalisée par des neurochirurgiens experts et maitrisant cette technique. Elle se fera sous anesthésie générale et analgésie. Avec ce protocole et par les expériences passées, il n’est pas attendu de réaction douloureuse. - Les IRMs, examens non invasifs, seront réalisées sur les animaux anesthésiés - La ponction de LCR sera réalisée par des vétérinaires spécialistes maitrisant ce geste technique sous anesthésie et analgésie adaptées. Il n’est pas attendu d’effet indésirable. - Afin de limiter toute réaction inflammatoire au moment des injections d’AAV, un protocole d’immunosuppression sera mis en place, à base de corticoïdes de façon temporaire (D-1 à D+8) et d’un immunosuppresseur tout au long de l’étude . Il n’est pas attendu d’effet secondaire à ce traitement. -Le phénotype ne devient dommageable qu’après 15 mois. L’évolution de la maladie est très lente. Si le phénotype se déclarait, il restera léger au vu de la période de suivi des animaux.

Devenir

Les 10 animaux concernés par la procédure décrite dans ce projet seront suivis 3 mois ou 12 mois puis mis à mort pour prélèvements de tissus post-mortem. La mise à mort de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements de tissus afin de réaliser les analyses moléculaires et histologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l’animal.

Remplacement

Toutes les études in vitro possibles ont été́ effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité́ du vecteur Adeno-Associated Virus (AAV), produit de thérapie génique. Nous arrivons ici aux dernières étapes précliniques nécessaires pour une demande d’essai clinique de phase I/II pour lesquelles l’utilisation d’un modèle gros animal, permettant la mise en place d’approche chirurgicale similaire à celle effectuée sur les patients dans l’essai clinique est indispensable et nécessite donc l’utilisation de cette lignée de chiens MPSIIIB. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d’administration utilisé et la dose administrée. L'utilisation d’un modèle animal est donc essentielle pour l'évaluation préclinique de produits thérapeutiques pour le traitement de la Mucopolysaccharidose de type III B

Réduction

10 animaux au total maximum comprenant : 2 animaux injectés avec du véhicule (l’un sacrifié 3 mois post injection et l’autre sacrifié 12 mois post injection), 6 animaux recevant la double administration (IC + IV) dont 3 nécropsiés à 3 mois post injection et 3 nécropsiés à 12 mois post injection, et 2 animaux non injectés (un suivi 3 mois et un suivi 12 mois).Le nombre d'animaux par groupe (3 injectés vecteur AAV par temps de suivi – 3 et 12 mois, ; 1 injecté véhicule par temps de suivi ; 1 non injecté par temps de suivi ) a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience de précédents projets et des données sur les autres modèles, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de cette taille. Une analyse statistique (Test t et ANOVA) sera réalisée pour les mesures où le nombre d’échantillons permettra d’avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, et sont réalisées par du personnel formé et expérimenté. Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur. Pour leur bien-être les animaux seront hébergés en groupe et recevront un enrichissement adapté (jeux divers disponibles dans les box, sociabilisation avec présence humaine, éducation, toilettage). Cet enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) .3) Afin de suivre efficacement l'état de santé des animaux et mettre rapidement en place une action, une liste de points limites a été établie. Elle permet de définir une conduite à tenir afin d’arrêter, minimiser ou diminuer toute souffrance à l’aide de mesures comme un traitement adapté ou une euthanasie anticipée. 4) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire, antibiothérapie). De plus, le nombre d'anesthésie sera minimisé en regroupant les procédures (prise de sang - volume adapté à la taille des animaux et validé par le vétérinaire, ponction lombaire) au sein d'une même anesthésie.

Choix des espèces

La race de chien choisie (mix beagle et fox hound) est naturellement prédisposée à la même mutation génétique que chez l’homme lors de la Mucopolysaccharidose de type III B. Elle conduit comme chez l’homme au développement anormal du cerveau et à des troubles moteurs. Le choix de l’espèce est également basé sur son homologie avec l’homme, au niveau des plans anatomiques et fonctionnels du système nerveux central (SNC) et du point de vue immunitaire (tolérance semblable). Dans l’étude clinique, les enfants seront traités entre 4 et 12 mois. Les animaux seront injectés à l'âge de 3 mois. C'est un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles", et mimant donc le stade auquel des patients atteints du syndrome de Sanfilippo pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants de moins de 5 ans). Les animaux injectés seront ensuite suivis sur une durée de soit 3 mois, soit 12 mois après injection pour documenter l’efficacité du traitement à 2 temps différents. Ce planning nous permettra d’effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre un âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère. En effet, cette maladie de surcharge est associée à une dégradation progressive de l’état général de l’animal. Cette dégradation peut devenir visible (troubles locomoteurs, troubles cognitifs) pour les animaux au delà de 15 mois.

154 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 114 tués à l'issue et 40 reproducteurs maintenus en vie pour l'élevage. Modèles de la myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections intracardiaques ou intramusculaires de cellules souches humaines et un traitement immunosuppresseur, et subissent des prélèvements sanguins, des échographies et des tests musculaires, avant la mise à mort de la plupart pour prélever muscles et organes. Le porteur affirme n'attendre pas d'effets indésirables majeurs de ces injections, en s'appuyant sur des essais antérieurs chez le chien. Il justifie le rat dystrophique par les limites du modèle souris et le coût du modèle chien.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne est la plus fréquente des dystrophies musculaires avec un garçon nouveau-né sur 3500. C’est une maladie génétique caractérisée par une mutation du gène codant une protéine musculaire : la dystrophine et entrainant son absence dans les fibres musculaires. Ceci entraîne une destruction des fibres puis le remplacement du muscle par du tissu fibreux et graisseux. Cliniquement, une réduction de la masse musculaire et une faiblesse musculaire sont observées conduisant au décès des patients vers l’âge de 20-30 ans. Il n’existe aucun traitement de la maladie à ce jour. L’injection de cellules saines fait partie des orientations thérapeutiques prometteuses. L’identification de populations de cellules souches au sein de tissus adultes ces dernières années et la démonstration de leur potentiel myogénique (capacité à régénérer des fibres musculaires, à en former de nouvelles ou des progéniteurs myogéniques de réserve) offrent des perspectives intéressantes. Notre équipe a isolé une population de cellules souches dérivées du muscle squelettique (cellules MuStem) et démontré son efficacité chez le chien malade en montrant des propriétés phénotypiques (propriétés à exprimer un ensemble de marqueurs de lignées cellulaires) et comportementales similaires à celles décrites pour la population canine. L’objectif du projet est de poursuivre la caractérisation des potentialités de la population hMuStem pour renseigner si celle-ci peut être présentée comme un support de biothérapie innovante pour les dystrophies musculaires. Pour cela, nous souhaitons déterminer l’innocuité (absence de caractère nuisible) et l’efficacité de son administration dans la circulation sanguine chez le rat dystrophique (DMDmdx). Ce modèle se révèle être un très bon modèle animal de la DMD pour réaliser les 1ères phases d’évaluation de nouveaux produits thérapeutiques. C’est la raison pour laquelle l’étude de biodistribution (dissémination au sein de l’organisme avec étude du comportement de l’agent à coloniser les tissus musculaires et/ou s’accumuler dans les organes filtres comme le poumon, le foie ou encore le rein) et d’impact de la population hMuStem sur la fonction et la reconstruction du muscle a été définie dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Le projet décrit ici repose sur un ensemble conséquent de résultats in vitro et in vivo (chien, rongeurs, primate-non-humain) acquis progressivement ces 12 dernières années et qui tendent à montrer un potentiel thérapeutique des cellules MuStem dans le cadre de la prise en charge des affections musculaires et en particulier de la DMD. Pour progresser sur la qualification de cet agent dans le but de statuer sur son positionnement ou non comme médicament innovant, des données in vivo sur sa biodistribution et son efficacité de réparation musculaire (fonction et tissu) en contexte dystrophique sont fondamentales à ce stade du programme de recherche et pourraient permettre de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique pour une pathologie musculaire qui reste à ce jour sans traitement curatif.

Procédures

Partie I : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem par injection intracardiaque (IC) unique, sous anesthésie générale et analgésie, plus contrôle échographique. Durée : 2 min. (ii)3 prises de sang en ante mortem, sous anesthésie, au niveau de la veine cave. Durée : 1 min. (iii)4 animaux supplémentaires auront une injection intraveineuse de produit de contraste afin de calibrer le protocole d’administration par voie IC sous contrôle échographique, pendant l’anesthésie générale préalablement au sacrifice. Durée : 1 min. Partie II : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem, en une seule fois, par injection intramusculaire (2 injections sur 3 muscles différents d’un membre), sous anesthésie générale et analgésie. Le même protocole d’injection sera mené sur le membre opposé avec du sérum physiologique. Durée : 10min (ii)3 jours au préalable, un traitement immunosuppresseur sera administré par voie sous-cutanée (SC) sur animaux vigiles ou sous légère tranquillisation, à raison de 4 injections à 10 jours d’intervalle. Durée : 3min (iii)5 prises de sang sur animal tranquillisé, à la veine jugulaire ou sous anesthésie avant sacrifice, au niveau de la veine cave. Durée : 1 min. Partie III A : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem ou du sérum physiologique sous forme de 3 IC espacées de 6 à 9 jours, sous anesthésie générale et analgésie. Durée : 2 min. (ii)un traitement immunosuppresseur identique à la Partie II (iii)prises de sang : n= 6 pour les suivis 2 mois, n=8- pour les suivis 4 mois. (iv) Un électrocardiogramme (ECG) et une échocardiographie en pré- injection, et avant sacrifice. Durée : 2 min (v)Une évaluation musculaire : 2 tests d’exploration fonctionnelle (test d’agrippement et test d’endurance) et un test d’évaluation motrice (test d’actimétrie) seront réalisés sur chaque animal à raison d’une fois au cours de son suivi . Durée : 25 min. Partie IIIB : Même protocole que la partie IIIA, mais avec un suivi des animaux de 7mois post injection. Les interventions seront donc identiques mais en nombre plus élevés : (i) prise de sang : n=11 (ii) 4 ECG et 4 échocardiographies en pré-injection, J60, J120 et J210 (iii) 3 évaluations musculaires (motrices et fonctionnelles) à J60, J120 et J210

Impact sur les animaux

L’administration par voie intra-cardiaque des cellules hMuStem ne devrait pas occasionner d’effets indésirables si on s’en réfère aux résultats que nous avons obtenus précédemment avec ce type cellulaire dans le cadre de protocoles d'injection systémique (intra-artérielle et intraveineux) chez le chien dystrophique. Néanmoins, nous serons attentifs à la formation d’agrégats cellulaires comme cela a été relaté pour d’autres types cellulaires, lesquels peuvent être à l’origine de troubles de la circulation sanguine. L’administration intra-musculaire des cellules hMuStem induira un dommage local avec le passage de l’aiguille. La mise en place du traitement immunosuppressif par voie sous cutanée ne devrait pas non plus occasionner d’effets indésirables majeurs mais un point de vigilance sera porté sur l’apparition d’éventuels dérèglements biochimiques et/ou hématologiques. L’échocardiographie et l’électrocardiogramme, les tests de force et d’endurance et le test d’actimétrie sont des techniques d’abord non invasives pour lesquelles il n’est pas identifié d’effet indésirable.

Devenir

A l'issue des procédures décrites dans ce projet, tous les animaux inclus dans cette étude (n=114 maximum) seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses qui ne peuvent pas se faire du vivant de l'animal. Les prélèvements concerneront certains muscles squelettiques, diaphragme, coeur et organes filtres correspondant au poumon, foie, rein et rate, et comporteront au moins 4 fragments par tissu. Seuls les animaux reproducteurs, au nombre de 40, seront maintenus en vie pour maintenir la production de l'élevage de rats DMDmdx.

Remplacement

Il ne sera pas possible dans cette étude dans la mesure où il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pertinente et robuste pour tester l’effet d’un traitement de médecine régénérative in vivo. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact de cette thérapie dans différents organes et sur le phénotype de l’animal malade.

Réduction

Le nombre d’animaux qui a été fixé par groupe dans les 3 parties du projet repose sur notre expérience précédente dans la mise en place de protocoles de médecine régénérative lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Ainsi, ces nombres, validés par un agent agrégé en biostatistiques, sont minimaux et permettent d’assurer la robustesse (au sens de l’analyse statistique) des résultats sans être excessif en termes d’animaux à inclure. Les jeux de données acquis seront analysés selon des modèles linéaires généralisés qui pourront être complétés par des analyses multivariées type « analyse factorielle multiple - AFM. Par ailleurs, le projet a été structuré en 3 parties séquentielles afin de réduire au maximum l’utilisation d’animaux dans le sens où les parties I (biodistribution) et II (preuve de concept) seront déterminantes pour la suite du projet.

Raffinement

En ce qui concerne le raffinement (3R), le bien-être animal passera par : - de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation avec enrichissement du milieu (tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois et hébergement à deux animaux). - un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement), - l'instauration de points limites pertinents avec mise en place de mesures adaptées (anesthésies, analgésie ou euthanasie), - une réactivité accrue du personnel animalier avec mise en place d’une grille d'évaluation de la douleur par une liste de comportements /constatations à évaluer dès que nécessaire pour détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates - la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions (anesthésie et analgésie).

Choix des espèces

Les modèles animaux de la DMD les plus souvent utilisés sont des modèles rongeurs et plus spécifiquement le modèle de la souris mdx. Ce modèle souffre néanmoins de sérieuses limitations, notamment la mise en place de mécanismes de compensation aboutissant à des lésions musculaires très limitées et une faiblesse musculaire quasiment inexistante. Ces éléments limitent grandement la transposition des résultats obtenus sur ce modèle à l’Homme. Le chien Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD, mais reste un modèle de gros animal coûteux et lourd à manipuler. Ainsi, le choix du modèle de rat DMDmdx s’avère pertinent dans le sens où ce dernier présente un phénotype fonctionnel et tissulaire proche de celui décrit chez le patient DMD, caractérisé par une nécrose des fibres musculaires, une fibrose, une adipose ainsi qu’une faiblesse musculaire et une cardiomyopathie dilatée. Les rats seront inclus à l’âge 2 mois afin de se placer dans un contexte de lésion musculaire suffisamment avancé pour pouvoir détecter un éventuel effet sur la fonction musculaire et/ou le remodelage tissulaire. Par ailleurs, la mortalité des rats DMDmdx étant observée particulièrement à partir de 8 mois d’âge, il était important que l’inclusion des animaux se fasse précocement pour être en mesure d’avoir un suivi de l’impact éventuel sur une période satisfaisante mais aussi de possiblement observer une répercussion sur la durée de vie des animaux traités.

298 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de pose d'une broche puis une découpe du fémur pour simuler une fracture, suivie de radiographies répétées sous anesthésie et d'injections sous-cutanées quotidiennes, avant sa mise à mort pour prélever les os. Le porteur reconnaît que la fracture provoquée est douloureuse à court terme et met en avant l'analgésie mise en place. Il justifie le rat par l'absence de modèle in vitro reproduisant une fracture et par la possibilité d'y poser des broches de chirurgie humaine.

Objectifs

La réparation des fractures a fait l’objet d’études antérieures et certaines molécules ont été développées et approuvées pour traiter les complications osseuses associées aux fractures (retard de consolidation, non consolidation, etc…). Cependant, l’utilisation de ces molécules est associée à de fortes contraintes ou effets secondaires indésirables (implantation locale via un dispositif médical nécessitant une chirurgie correctrice, augmentation localisée de la résorption osseuse, formation osseuse anarchique et anormale et quelques fois un œdème) avec en plus un fort coût économique qui ne semble pas justifié par rapport aux bénéfices apportés aux patients. Aujourd’hui, il n’y a pas de molécule, administrable par injection, permettant de faciliter la réparation des fractures et de réduire le risque de complications et de chirurgies correctrices. La consolidation des fractures osseuses nécessite une activation contrôlée des voies de la formation osseuse. La différentiation des cellules impliquées dans la réparation osseuse est conditionnée par la qualité du matériau osseux sur lequel ces cellules reposent et un changement de dureté/raideur du matériau osseux est suffisant pour activer le programme de différentiation de ces cellules. Cependant, aujourd’hui, aucune donnée sur la qualité du matériau osseux au site de fracture ou adjacent au site de fracture n’est disponible. Récemment, de nouvelles molécules ont été développés et leurs mécanismes d’action suggèrent une augmentation de la résistance osseuse dans les semaines qui suivent l’initiation du traitement. In vitro, ces composés stimulent la formation osseuse et augmente la qualité du matériau osseux déposé, résultant in fine en une meilleure résistance osseuse. Ces composés sont administrables par voie sous-cutanée et l’hypothèse de travail est qu’ils pourraient améliorer la réparation et consolidation des fractures osseuses réduisant ainsi les complications associées. Les objectifs de ce projet sont : (1) de générer un modèle animal de fracture fémorale afin d’évaluer la qualité du matériau osseux au site de fracture et juste à côté ; et (2) d’investiguer si les nouvelles molécules pourraient représenter une solution thérapeutique innovante dans la prévention des complications osseuses associées aux fractures.

Bénéfices attendus

Les principaux bénéfices de ce projet sont une meilleure compréhension de la qualité du matériau osseux afin de comprendre la contribution dans la différentiation cellulaire. Le second bénéfice est représenté par l’évaluation de nouvelles molécules qui a terme peuvent apporter un réel plus dans la prise en charge des patients avec fractures osseuses.

Procédures

Les animaux subiront une procédure chirurgicale afin de réaliser l'implantation d'une broche osseuse pour stabiliser la fracture et une découpe du fémur afin de simuler une fracture osseuse. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale et une administration de médicaments anti-douleur sera réalisée avant incision de la peau. De même, un antibiotique sera administré aux animaux avant la procédure chirurgicale afin de réduire le risque d'infection. Un suivi longitudinal des animaux sera réalisé par radiographie (3 radiographies pour les temps court et 8 radiographies pour le temps long) après anesthésie gazeuse. Des traceurs fluorescents non toxiques seront injectés aux animauxpar voie sous-cutanée afin de standardiser les mesures avant mise à mort. Les nouvelles molécules seront administrées quotidiennement par voie sous-cutanée. Les injections sous cutanée seront réalisées sur animaux vigiles avec une contention adaptée.

Impact sur les animaux

La réalisation chirurgicale de la fracture osseuse et de l’ostéosynthèse pourra être perçue comme une procédure douloureuse à court terme. Cependant, il est à noter ici que la séquence utilisée, pose d’une broche pour stabiliser le fémur avant fracture, a été choisi afin de ne pas engendrer de lésions des tissus entourant le fémur et de ne pas entrainer de mouvements des fragments osseux. Ceci dans un but de réduire la douleur ressentie par les animaux. Afin de réduire la souffrance des animaux, ce geste sera réalisé sous anesthésie générale et des médicaments anti-douleur seront administrés au moment du geste (analgésie péri et post-opératoire immédiate) et maintenu sur une période de 48h. Les animaux recevront également une dose cumulative de rayons x estimé au maximum à 0.020 mSv, équivalente à 60h d’irradiation naturelle. Enfin une grille de points limites adaptés a été mise en place et sera utilisée pour évaluer l’inconfort/souffrance des animaux. Le cas échéant, une administration de médicament anti-douleur pourra être réalisée. Les administrations de traceurs fluorescents et de nouvelles molécules thérapeutiques seront réalisées par voie sous-cutanée.

Devenir

Le but de l'étude étant d'étudier le retentissement d'une fracture osseuse, avec ou sans traitement, sur la qualité de la matrice osseuse, nous devons collecter des pièces osseuses à des temps bien précis. Les animaux de l'ensemble des procédures expérimentales seront mis à mort à la fin des 4 procédures de ce projet.

Remplacement

Malheureusement, à ce jour, aucune donnée de la littérature n’est disponible et ne permet pas de développer un modèle in vitro ou in silico permettant de reproduire les conséquences moléculaires, cellulaires et tissulaires d’une fracture osseuse. Le recours à l’emploi d’un modèle de petit animal est requis pour évaluer ces questions. Le rat est un modèle animal reconnu, peu coûteux et facilement maintenu en captivité. La physiologie de réparation des fractures chez cet animal est également transposable à l’homme. De plus, la taille des os longs et notamment du fémur, rend possible l’utilisation de broches osseuses utilisées en chirurgie osseuse humaine pour la stabilisation des fractures de phalanges.

Réduction

Le modèle de fracture osseuse proposé dans ce programme (stabilisation par broche osseuse et découpe du fémur pour simuler la fracture) est maitrisé dans notre laboratoire. Les investigations osseuses sont également toutes maitrisées. Les données de la littérature permettent d’établir un échec de la procédure (non-récupération de l’anesthésie, infection osseuse, mauvaise pose de la broche osseuse, points limites) d’environ 18%. Nos études antérieures de qualité osseuse dans des modèles animaux précliniques nous ont permis de réaliser un calcul d’échantillonnage (test d’inférence statistique) afin de déterminer le nombre minimum d’animaux à inclure par groupe pour observer une différence significative de la résistance osseuse et donc in fine de la vitesse de réparation osseuse. En tenant compte de l'ensemble des paramètres, un nombre de 13 animaux par groupe devraient nous permettre d’atteindre la significativité des résultats obtenus. Des tests statistiques seront utilisés et une valeur de p

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon les conditions d’hébergements au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages normalisées, dans une pièce ventilée à hygrométrie et température contrôlées. Les animaux auront à leur disposition de l’eau et de la nourriture à volonté. Un cycle automatique jour/nuit – 12h/12h sera respecté. Il sera mis à la disposition des animaux un abri et de la cellulose pour la constitution d’un nid. Des frisottis de cartons et/ou des petits morceaux de bois à ronger seront mis à disposition. La fracture (stabilisation et découpe osseuse) sera réalisée sous anesthésie générale. Des médicaments anti-douleur seront administrés avant ouverture de la peau et renouvelés pendant les premières 48h post-opératoires. Un antibiotique sera injecté avant ouverture de la peau pour réduire les risques d’infection. Une grille de points limites, adaptée au modèle, sera mise en place et comportera les items suivants : expression faciale, activité, posture, respiration, automutilation, aspect des matières fécales et déshydratation. Le cas échéant une palpation de la zone opérée pourra être effectuée afin de s’assurer que celle-ci n’est pas douloureuse et ne présente pas de signe d’infection osseuse.

Choix des espèces

Une étude préliminaire préclinique sur un modèle rongeur est un prérequis des agences de régulation du médicament pour le développement d’une thérapie osseuse. Le rat est un modèle animal reconnu, peu coûteux et facilement maintenu en captivité. La taille des pièces osseuses rend l’utilisation des dispositifs biomédicaux humains possible pour la stabilisation des fractures. La réparation des fractures chez le rat présente également des mécanismes physiopathologiques similaires à ceux observés chez l’homme. De plus, notre équipe a depuis maintenant 10 ans développés et validés des outils d’analyse de la qualité osseuse directement applicable aux modèles de rongeurs. Les animaux seront utilisés à un âge d’environ 10 semaines +/- 1 semaine. Ce stade correspond à l’entrée dans le plateau de croissance des animaux et le tissu osseux est considéré comme significativement mature à partir de cet âge. De plus, cet âge est couramment employé pour ce modèle, ce qui permettra de faire une comparaison des données obtenues avec les données de la littérature obtenus avec d’autres agents thérapeutiques.

156 macaques, à longue queue et rhésus, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une à deux chirurgies cérébrales par injection stéréotaxique, des prélèvements sanguins tous les quinze jours, des ponctions mensuelles de liquide céphalorachidien et des IRM répétées, avant sa mise à mort par perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico ni cellulaire ne permet d'étudier ces maladies et présente le primate comme "nécessaire" du fait de sa proximité avec l'humain. Les bénéfices annoncés, de nouvelles cibles thérapeutiques contre Alzheimer et Parkinson, restent formulés au conditionnel.

Objectifs

De nos jours dans le monde environ 36 millions de personnes sont atteintes de démences, dont 25 millions pour la maladie d’Alzheimer et 6 millions pour la maladie de Parkinson. En raison du vieillissement progressif de la population et de l'absence de traitement, le nombre de personnes souffrant de maladies neurodégénératives augmente considérablement et devrait croître de manière régulière dans les années à venir. Qu'elles soient génétiques ou acquises, leurs mécanismes d’initiation liés à des causes multifactorielles sont mal connus. Ainsi, il est nécessaire de créer et maîtriser des modèles le plus proche possible de la réalité pathologique. L’étude proposée ici permettra aux travers de différents modèles de primates non-humains de maladies neurodégénératives, d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de l’initiation et de l’installation des différentes pathologies afin de définir des nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les maladies neurodégénératives sont une cause majeure d’invalidité, de dépendance, d’institutionnalisation et d’hospitalisation. Elles ont un impact très important sur la qualité de vie des personnes atteintes ainsi que sur celle de leurs proches et de leurs aidants, et touchent ainsi une part importante de la population. Les traitements actuellement disponibles sont à visée symptomatique et d’efficacité relative. Mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces pathologies c’est trouver les traitements de demain.

Procédures

Une chirurgie (2 heures environ), ou deux maximum espacées de 1 mois. Prélèvements sanguins de quelques minutes tous les 15 jours sur animaux vigiles en contention légère. Prélèvements de liquide céphalorachidien de l'ordre de 5 minutes une fois par mois sous anesthésie légère. IRM, avant l’injection stéréotaxique, 48 heures après et tous les 6 mois. La durée de l'IRM est de 1h30 à 2h.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou aux prélèvements biologiques. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible et infection au niveau des points de sutures. Pour l’imagerie : anesthésie. Pour les prélèvements liquide céphalorachidien (LCR) et sang : stress de l’anesthésie pour le LCR et de la contention (légère et rapide) pour le sang.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque aux temps expérimentaux définis. Le cerveau et éventuellement d’autres tissus seront alors prélevés puis mis à disposition pour réaliser les analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH car il n’existe pas de modèles mathématiques ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier les processus neurodégénératifs. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à mimer la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus est une étape nécessaire à la découverte de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité (cadre stéréotaxique, Imagerie, stabulation) nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude sont destinés de prime abord aux études histologiques visant à identifier des marqueurs pour déterminer de nouveaux traitements, et servent également à renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque) afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’état des animaux est observé et quantifié selon des critères objectifs permettant d’établir des scores de bien-être et de déterminer des points limites à partir desquels les actions adaptées sont menées (des massages, le maintien de l’animal au chaud à l’aide d’une couverture, la modification de la nature et le change plus régulier de la litière, l’augmentation de la fréquence des pesées, le gavage avec des complément alimentaire, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons en dehors de la sphère médicamenteuse pour améliorer l’état de santé de nos animaux).. . Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adapté au poids de l’animal, Les prélèvements de LCR sont faits sur animaux sédatés. Les prélèvements de sang sont réalisés sur animaux vigiles avec une légère contention. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. L’échelle de bien être est là aussi utilisée pour estimer la gêne occasionnée par ce geste. Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.).

Choix des espèces

Ces modèles ont déjà été réalisés et validés chez les rongeurs (rats, souris), comme base d’étude des maladies neurodégénératives, mais la proximité d’espèce avec l’homme en fera toujours un modèle de choix, surtout dans la détermination de marqueurs prédictifs. Les maladies neurodégénératives sont des maladies chroniques progressives qui touchent le système nerveux central. Leur fréquence augmente avec l'âge chez l’homme. Afin d’être au plus près de cet état, dans ce projet, les animaux utilisés seront donc adultes.

75 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie par voie vaginale de trois à quatre heures pour l'implantation d'un filet, matrice biologique ovine ou prothèse synthétique, puis est gardé en vie de deux à six mois avant sa mise à mort et le prélèvement des organes du bassin. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer un non-réveil, des saignements abondants, des infections et des douleurs. Il justifie le recours à la brebis par la proximité anatomique de sa région pelvienne avec celle des femmes et par l'absence d'alternative in vitro reproduisant le système immunitaire.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’apporter des preuves expérimentales qu’un greffon de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) a le potentiel de devenir une solution chirurgicale alternative pertinente au traitement du Prolapsus des Organes Pelviens (POP). Une comparaison avec les traitements chirurgicaux standards actuels (prothèse synthétique ou chirurgie autologue) est donc essentielle. Nous proposons un nouveau paradigme qui repose sur l’utilisation d’un matériau complètement biologique qui n’est ni chimiquement ni autrement dénaturé tel que son ultrastructure, similaire à un tissu natif, soit préservée pour favoriser sa biointégration. Nous souhaitons montrer qu’un filet de MAC ovine peut être implanté avec succès dans un modèle de gros animal pertinent et allogénique. Pour cela, nous souhaitons évaluer le remodelage du filet de MAC, incluant sa stabilité mécanique et la réponse immunitaire (innée et adaptative) de l’hôte, dans la région urogénitale de brebis en comparaison avec une prothèse synthétique (Ex : Restorelle® de Coloplast Corp.). Les brebis seront opérées d’une cure de rectocèle (prolapsus du rectum) par voie vaginale. Une réparation de la paroi vaginale postérieure sera réalisée. Les greffons seront implantés entre le vagin, le péritoine pariétal et le rectum et fixés avec des sutures non résorbables. Notre hypothèse est que le greffon de MAC entraine moins de complications qu’une prothèse synthétique (réponse immunitaire moins importante, pas d’exposition et moins de contraction de la prothèse, etc.) démontrant ainsi la supériorité de ce matériau. Après euthanasie des animaux, les implants seront récupérés et des analyses mécaniques et histologiques à différents temps de suivi (2 et 6 mois) seront effectuées. Les temps de suivi de 2 et 6 mois ont été choisis car ce sont des temps classiquement décrits dans la littérature pour suivre l’évolution de prothèses implantées dans la région urogénitale de brebis permettant la comparaison des résultats obtenus. Cette première expérimentation permettra de montrer le potentiel clinique du greffon de MAC, c’est-à-dire valider si le filet de MAC présente des propriétés mécaniques suffisantes pour traiter le POP dans un modèle de gros animal. En effet, les données récoltées permettront la comparaison directe des greffons de MAC avec un traitement standard du POP en termes de stabilité mécanique, de réponse immunitaire, d’intégration tissulaire et de taux de complications.

Bénéfices attendus

Le Prolapsus des Organes Pelviens (POP), aussi appelé descente d’organe, est un problème médical important pour les femmes. On estime qu'1 femme sur 10 subira une intervention chirurgicale pour traiter un POP au cours de sa vie. Bien que des chirurgies autologues existent, c’est-à-dire qui utilisent les tissus de la patiente pour soutenir l’organe « descendant », elles ont été moins favorisées en raison de la disponibilité et de la commodité des prothèses synthétiques. De plus, ces prothèses synthétiques robustes et rigides permettent d’apporter un soutien mécanique plus durable que les chirurgies autologues (jusqu’à 3x moins de récidive). En revanche, depuis 2019, les prothèses synthétiques implantables par voie vaginale ont été retirées du marché dans de nombreux pays, comme la France, les Etats-Unis…, en raison d’un taux de complications élevé (douleurs, expositions, infections). Il existe donc un besoin médical et sociétal important pour des innovations. Cette étude permettra de sélectionner le procédé de création et de conditionnement des filets de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) les plus adaptés pour produire un greffon de MAC aux caractéristiques cliniques pertinentes pour traiter le POP. Les gains attendus par la nouvelle technologie à long terme sont les suivants : (1) Pour les patientes : cette approche biologique apportera une grande amélioration de leur qualité de vie en limitant les risques de complications et de récidives. (2) Pour la société : la réduction des complications/récidives bénéficiera économiquement au système de santé en évitant les coûts des réopérations.

Procédures

Une intervention chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée sur les animaux. Les brebis seront opérées d’une cure de rectocèle (prolapsus du rectum) par voie vaginale. Une réparation de la paroi vaginale postérieure sera réalisée. Nous prévoyons un temps d’intervention d’environ 3 à 4h sur chaque animal. Les brebis seront donc opérées 1 par 1 sur chaque demi-journée pendant 12 jours (non consécutifs). Chaque brebis recevra une condition expérimentale : un filet de matrice extracellulaire assemblée par des cellules ou une prothèse synthétique. Après réveil, les animaux seront gardés en vie sur des périodes différentes : 2 à 6 mois. Dans le cas où l’une des brebis ne se réveillerait pas suite à l’intervention, nous prévoyons un animal supplémentaire pour remplacer l’animal décédé (pour chaque lot). Aucun prélèvement n'est prévu.

Impact sur les animaux

Le transport et la chirurgie peuvent générer de l'angoisse. Les brebis seront transportées dans un véhicule adapté par deux afin de limiter l’isolement social. La durée du trajet est limitée (45 minutes maximum). Des risques de complications au cours de la chirurgie ou en post-opératoire peuvent être attendus comme : non-réveil de l'animal du fait de l'anesthésie, saignements (abondants), infections, constipations, douleur, souffrance et angoisse. La durée de ces nuisances ou effets indésirable sera réduite au maximum pour n’être que passagère en portant une attention particulière aux brebis tout au long du projet.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort (sauf les animaux supplémentaires prévus en cas de décès d’un animal à la suite de l’anesthésie et qui n’auraient donc pas été implantés) à l'issue de la procédure, les organes du bassin seront prélevés à des fins d'analyses histologiques.

Remplacement

Bien qu’un modèle humain puisse être largement étudié in vitro, son étude in vivo à long terme chez l’animal reste limitée. À ce jour, aucun système de modélisation ne peut suppléer à l'utilisation d'un modèle animal étant donné la complexité du système immunitaire. Des modèles animaux immunosupprimés, notamment souris ou rats, ne peuvent pas mimer l’anatomie ni la physiologie humaine car ils sont trop petits. Ces modèles permettent d’évaluer la prothèse implantée dans la région abdominale uniquement. Ainsi, le recours au modèle de gros animal permettra d’évaluer, à long terme, la réponse immunitaire innée de l’hôte combinée à la réponse immunitaire adaptative (indisponible chez les animaux immunosupprimés) dans un contexte de greffe allogénique et une région anatomique pertinente simulant les conditions cliniques.

Réduction

Au total, 75 brebis sont nécessaires (3 lots de 25 brebis). Chaque animal recevra un filet de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) ou une prothèse synthétique. Nos objectifs sont de démontrer l'implantabilité et l'intégration supérieure des greffons de MAC dans la paroi vaginale en comparaison avec une prothèse synthétique sur la base d'une observation directe (exposition et contraction de la prothèse) et d’une évaluation histologique du remodelage et de la réponse immunitaire (innée et adaptative). Nous souhaitons également montrer que les greffons de MAC possèdent des propriétés mécaniques suffisantes pour traiter le prolapsus des organes pelviens dans un modèle de gros animal (pas de récidive). Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables sur le plan statistique. D’après la littérature, nous avons sélectionné 6 brebis par groupe et par temps de suivi pour montrer une différence significative entre le filet de MAC et la prothèse synthétique standard, principalement au niveau des complications liées à l’implant (exposition et contraction de la prothèse) et de la réponse immunitaire. En effet, nous estimons la probabilité d’exposition prothétique avec une prothèse synthétique standard à environ 33%, 100% de cas de contraction de l’ordre de 30 à 50% pour les prothèses synthétiques avec, autour, des marqueurs de la réaction à corps étranger (cellules géantes à corps étranger). Nous attendons des résultats similaires. En revanche, nous n’attendons pas d’exposition avec le filet de MAC, ni de marqueurs de la réaction à corps étranger et moins de contraction du filet, ce qui démontrerait une grande supériorité de ce matériau. Selon la variabilité observée avec les premiers animaux, nous pourrons répéter l’expérience pour ajouter des animaux à l’étude. Ces expérimentations seront potentiellement effectuées jusqu’à 3 fois afin de confirmer certains résultats, de tester des conditions de production des greffons de MAC supplémentaires, ou ajouter une condition expérimentale (Ex : chirurgie autologue). Concernant l’analyse statistique, nous comparerons les résultats pour les échantillons non appariés avec le test t de Student.

Raffinement

Tout au long de l’expérimentation, une attention particulière visant à réduire douleurs, souffrance et angoisse chez les brebis sera apportée. La douleur, la souffrance et l’angoisse seront réduites par une prémédication et seront gérées par une anesthésie générale durant toute la procédure chirurgicale. Les paramètres vitaux seront suivis pendant l’intégralité de la chirurgie. Un protocole d’analgésie post opératoire prédéfini est réalisé pour chaque animal. En dehors de cette période, les animaux seront gérés par l’unité d’hébergement et de stabulation de l'établissement utilisateur (EU). Les animaux seront suivis dans des locaux agréés, avec du personnel dédié et expérimenté, et les périodes d’isolement limités au strict minimum nécessaire afin de réduire l’angoisse. Un suivi quotidien sera réalisé. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie pré, per et post- opératoire par admission d’antalgiques. Cependant, l’animal sera rapidement euthanasié (Pentobarbital sodique en IV pour l'euthanasie indiqué dans le paragraphe 3.3.3., soit 80 mg/kg) si : - le rythme cardiaque est >150 bpm ou 41°C ou < 32°C - une hémorragie importante est constatée. Les points limites identifiés se situent principalement au niveau de la phase longitudinale, lors de l’hébergement. • Perte d’appétit, anorexie • Altération du comportement, grincements de dents excessifs • Apathie, abattement • Position anormale ou prostration • Locomotion ou déplacements anormaux • Difficulté respiratoire • Auscultation et/ou examen cardiaque anormaux • Décubitus prolongé ou isolement • Hypovigilance ou hypervigilance anormale Si les premiers animaux présentent une défaillance des fonctions vitales dans les heures ou premiers jours qui suivent l’intervention, le protocole sera interrompu. Si l’état de santé d’un animal est concerné par l’un des points cités ci-dessus ainsi que par toute autre observation jugée anormale, un examen vétérinaire approfondi est réalisé et le responsable du projet est contacté par l’EU assurant l’hébergement pour définir la conduite à tenir (prescription d’un traitement médical adapté, examens complémentaires, etc.). Si l’état de santé est préoccupant, le vétérinaire de l’EU assurant l’hébergement et le responsable du projet décideront de l’euthanasie.

Choix des espèces

Le modèle ovin montre de grandes similitudes anatomiques avec l’humain au niveau de sa région pelvienne. De plus, il s’agit d’un modèle de prolapsus des organes pelviens bien établi dans la littérature. Par ailleurs, les cellules ovines sont les seules cellules qui ont permis d’obtenir des feuillets de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) similaires à ceux produits par les cellules humaines, en comparaison avec d’autres modèles animaux comme le chien et le cochon. L’espèce a donc été sélectionnée pour permettre l’étude de la réaction immunitaire et le remodelage des greffons de MAC par les cellules de l’hôte, implantés en tant qu’allogreffes. Nous souhaitons réaliser une cure du prolapsus. Pour que les brebis aient une descente d’organe, nous sélectionnerons des brebis âgées (≥ 5 ans) et grandes multipares (≥ 3 mises bas).