Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude et vectorisation de nouvelles molécules à visée anti-fibrotique
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Toute souris qui perd 20 % de son poids est sortie de l'étude et tuée par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. 220 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère, toutes mises à mort à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Une administration par la trachée, sous anesthésie, déclenche chez une partie d'entre elles une fibrose pulmonaire suivie par cinq séances de microscanner, et les souris traitées reçoivent sept injections intrapéritonéales et une ou trois administrations des composés, par la veine ou par la trachée, avec une gêne respiratoire et des douleurs attendues. Le porteur affirme que la fibrose "ne peut se concevoir que sur organisme entier" et que "le recours à l'animal reste une étape indispensable", et prévoit aussi d'évaluer les composés sur des cellules pulmonaires de patients "pour valider ce médicament dans un contexte humain".
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique fibrosante associée à un déclin progressif de la fonction pulmonaire et a une durée médiane de survie inférieure à 5 ans après le diagnostic. Il n'existe pas de traitement curatif et les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la fibrose pulmonaire sont encore peu connus. Dans ce projet, nous proposons d’optimiser l'administration de nouveaux composés anti-fibrose et de tester leur efficacité dans des modèles murins de fibrose pulmonaire. Le développement de la fibrose sera suivi de manière non invasive par imagerie. Seuls les composés validés sur cellules seront évaluées chez l'animal. Les composés porteront un marqueur fluorescent afin de suivre leur comportement dans l’organisme en temps réel et de façon non-invasive par imagerie de fluorescence. L’efficacité des composés sera evaluée pour le traitement de la fibrose. De plus, l'efficacité, la spécificité et le mécanisme d'action des composés dans les différentes populations cellulaires du poumon atteint de fibrose seront évalués sur les poumons. Les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, et le recours à l’animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel traitement anti-fibrose d’un candidat médicament. Ces composés seront également évalués dans des cellules pulmonaires primaires provenant de patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique pour valider ce médicament dans un contexte humain.
Bénéfices attendus
La fibrose est un processus complexe mettant en jeu de nombreux types cellulaires. Les options de traitement pour la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) sont limitées avec seulement deux médicaments approuvés, le nintedanib et la pirfénidone, qui ralentissent la progression de la fibrose pulmonaire mais sont incapables d'inverser ou même d'arrêter la maladie. Ce projet permettra d'optimiser l'administration de composés anti-fibrose pour augmenter l'efficacité de traitement. Il pourra également ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour d'autres types de fibrose, comme la fibrose rénale, hépatique ou musculaire.
Procédures
Dans le cadre de l'administration des composés, les animaux subiront soit une injection intraveineuse (1 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse), soit une administration par voie intratrachéale (1 fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse). Dans le cadre de la cinétique sanguine, les animaux auront des prélèvements sanguins répétés dans la veine caudale (5 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse). Dans le cadre de la détermination de la biodistribution des composés, les animaux subiront une injection intrapéritonéale (1 à 2 fois, 1 minute) et une anesthésie gazeuse le temps de l'imagerie de bioluminescence (1 à 2 fois, 5 minutes). Dans le cadre des procédures d’imagerie de fluorescence, les animaux seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie (6 fois, 5 minutes). Dans le cadre du développement de la fibrose, les animaux subiront une administration par voie intratrachéale (1 fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse), puis les animaux seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie µCT (5 fois, 10 minutes). Dans le cadre des procédures d'efficacité thérapeutiques, les animaux avec fibrose subiront des injections intrapéritonéales (7 fois, 1 minute), et soit des injections intraveineuses (1 ou 3 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse), soit des administrations par voie intratrachéale (1 ou fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse).
Impact sur les animaux
Dans cette étude, les nuisances ou effets indésirables attendus sont : douleurs et conséquences de l'administration intratrachéale pour déclencher la fibrose, des injections intrapéritonéales et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies répétées (pour l'imagerie et les traitements), gène respiratoire et/ou douleurs induites par la présence de fibrose.
Devenir
Les animaux issus des procédures seront mis à mort, afin de prélever leurs organes, les imager et les conserver pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Les paramètres de biodistribution sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques. De plus, les processus biologiques à l’origine du développement de la fibrose sont mal connus. La fibrose étant un processus dynamique mettant en jeu de nombreux types cellulaires, son étude ne peut se concevoir que sur organisme entier. Les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, et le recours à l’animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel anti-fibrose d’un candidat médicament. Les rongeurs constituent un modèle de choix pour l’étude de la fibrose, on retrouve de nombreuses similitudes avec la pathologie humaine et nous disposons d’une grande variété d’outils moléculaires pour mener à bien nos expérimentations. Le consensus actuel est que l'utilisation du modèle murin de fibrose par instillation de bléomycine par voie oropharyngée représente le modèle animal le mieux caractérisé disponible pour les tests précliniques.
Réduction
Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de composés à tester in vivo. Les modèles utilisés dans ce projet utilisent des procédures couramment décrites, et qui ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et valides. Les nombres de souris indiqués par condition sont nécessaires pour une analyse statistique fiable, évitant de refaire l’expérience. Le nombre des groupes sera ajusté en fonction des premiers résultats de biodistribution. La mise en place du modèle murin de référence pour la fibrose sera effectuée dans une étude pilote qui permettra de déterminer les doses optimales de bléomycine (dépendante de chaque lot de bléomycine) à administrer pour l’induction de la fibrose pulmonaire et la durée du suivi par imagerie non invasive afin d’observer une résolution totale. Cette étude nous permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux dans les procédures suivantes. De plus, seuls le meilleur composé et la meilleure voie d’administration seront testés dans des modèles de fibrose, ce qui permettra aussi de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques en expérimentation animale. Les animaux seront maintenus dans des cages ventilées. Les animaux seront hébergés par fratries afin de limiter les bagarres. Les conditions standards de luminosité, hygrométrie et température seront appliquées. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, enrichi avec des tunnels en carton et morceaux de papier pour y faire un nid. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La gravité des procédures est légère pour les biodistributions, cinétiques sanguines et traitements. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. Des points limites pertinents seront déterminés et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. La mise à mort sera faite sous anesthésie générale. Nous réaliserons une étude pilote afin d’optimiser et calibrer finement le modèle de fibrose et permettre un suivi non-invasif par imagerie. Les animaux seront anesthésiés afin de réduire le stress et la douleur. Un suivi quotidien accru des animaux sera effectué au cours de l’établissement de la fibrose. Les paramètres observés seront la prostration, la diminution de la mobilité, la forte baisse de température et la perte de poids. Tout animal présentant une perte de poids de 20% par rapport aux pesées précédentes sera sorti de l’étude et euthanasié par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Les modèles animaux permettent d’avancer dans la mise au point de nouvelles thérapies et procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Les rongeurs constituent un modèle de choix pour l’étude de la fibrose tissulaire, on retrouve en effet de nombreuses similitudes avec la pathologie humaine. Plus particulièrement, nous utiliserons des souris de 8 semaines mâles en raison de leur sensibilité notamment aux atteintes pulmonaires induites par la bléomycine. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes, de taille et de poids suffisants pour être facilement manipulables.
Immuno-virothérapie du cancer du foie 1/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
Greffées de cellules tumorales du foie sous la peau ou, après une incision de l'abdomen, directement dans le foie, 882 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Certaines passent ensuite sept anesthésies en six semaines pour des échographies ou de l'imagerie par bioluminescence, et une partie des lots reçoit trois injections d'un vaccin à ARNm dans le péritoine, trois injections d'un virus oncolytique dans la tumeur ou le foie, ou les deux. Le projet doit établir une preuve de concept pour cette association contre le carcinome hépatocellulaire. Sur la douleur des souris, le porteur invoque des "données cliniques chez l'homme" selon lesquelles les tumeurs intrahépatiques "ne sont pas douloureuses", et écrit aussi que le niveau de nuisance "dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur".
Objectifs
Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale ciblant un antigène associé aux tumeurs hépatiques : l’alpha-fœtoprotéine, avec l’action de virus oncolytiques (virus capable d’éliminer préférentiellement les cellules cancéreuses) dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm codant l’alpha-fœtoprotéine, qui est l’antigène candidat reconnu le plus prometteur pour les vaccins cancer du foie. L’ARNm utilisé comportera les modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’ARNm sera associé à des NanoParticules Lipidiques pour servir de vaccin à des groupes de souris, porteuses de tumeurs du foie. L’effet protecteur et curatif de la vaccination ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus oncolytique seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les essais de vaccination contre les antigènes associés aux tumeurs du carcinome hépatocellulaire reposent essentiellement sur l’utilisation de peptides ou de protéines recombinantes. Des avancées récentes dans l’utilisation d’ARNm modifié dans la composition de vaccins, notamment par le développement de vecteurs de nano particules lipidiques, ouvrent de nouvelles perspectives vaccinales. La récente démonstration pour les mélanomes de l’efficacité de l’association de l’immunothérapie des points de contrôle immunitaire avec la vaccination par des nanoparticules lipidiques chargées avec des ARNm codant des antigènes associés aux tumeurs des mélanomes ouvre la voie à de nouvelles thérapies pour d’autres cancers. L’originalité du projet repose sur la combinaison de l’action de virus oncolytiques provoquant la destruction de la tumeur ouvrant ainsi l’accès aux cellules tumorales pour les réponses immunitaires spécifiques induites par le vaccin ARN. La combinaison de thérapies impliquant différents mécanismes d’action anti-tumoraux apportera 1) la spécificité antigénique initiale grâce à la vaccination favorisant l’infiltration lymphocytaire intra-tumorale, et 2) la lyse tumorale amplifiée grâce aux virus oncolytiques favorisant ultérieurement la réponse immunitaire.
Procédures
La moitié des lots de souris subira une anesthésie gazeuse d'environ 5 minutes puis une injection sous-cutanée de 30 secondes. L'autre moitié des lots subira une anesthésie gazeuse d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre., puis une injection (30 secondes) dans le foie. Certains animaux subiront ensuite 7 anesthésies gazeuses d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie par bioluminescence, sur une durée totale de 6 semaines. Parmi les lots décrits précédemment, certains lots subiront en plus trois injections intrapéritonéales et/ou 3 injections intratumorales ou intrahépatiques (30 secondes pour chaque injection) entre J+3 et J+17 post greffe. Les animaux traités avec le virus oncolytique subiront 3 anesthésies gazeuses rapides (inférieures à 5 minutes) suivies à chaque fois d’une injection intrahépatique/tumorale per cutanée.
Impact sur les animaux
La greffe de tumeur en sous-cutané est un geste rapide et peu douloureux pour l'animal (piqure d’aiguille dans le flanc) et sera réalisé sous anesthésie générale. Pour cette procédure, un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal et une douleur légère au point d'injection. La taille des tumeurs sera mesurée tous les deux ou trois jours à l’aide d’un pied à coulisse digital. Un stress lors de la préhension de l'animal pourrait survenir. La greffe de tumeur en intrahépatique implique une anesthésie générale de l’animal. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. Ensuite, l’animal endormi subira une laparotomie mineure. Une douleur au niveau de la suture pourrait apparaître et sera prise en charge par une analgésie adaptée. Les données cliniques chez l’homme montrent que les tumeurs intrahépatiques ne sont pas douloureuses. Les effets indésirables particuliers en réponse aux traitements seront quasiment absents. En effet, la stratégie vaccinale par nanoparticules lipidique (NPL) et l’utilisation de virus oncolytiques (VO) ont déjà été validées dans des protocoles précédents et ces traitements n'ont pas engendré d'effets indésirables notoires lors de leur mise en œuvre. L’administration des traitements engendrera une douleur légère au point d’injection (intrapéritonéal pour les NPL, ou intra-tumoral pour les VO). Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur. Les compétences des manipulateurs et des points limites adaptés permettent de limiter et prendre en charge efficacement douleur et stress. Enfin, le suivi longitudinal de la taille des tumeurs en greffes orthotopiques sera réalisé sur animal anesthésié sur une courte période (quelques minutes) par échographie et bioluminescence. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. La suite de la procédure est non invasive, non douloureuse. Pour la bioluminescence, une injection IP est réalisée pourra engendrer une douleur légère au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses biochimiques et moléculaires ultérieures.
Remplacement
Le foie est un organe très complexe du point de vue tissulaire et comporte une haute diversité cellulaire. En effet, les hépatocytes, principale composante cellulaire du foie, sont des cellules épithéliales donc polarisées. Les cultures in vitro en 2D ne peuvent reproduire cette polarisation, limitant ainsi les modèles de remplacement à des cultures d'organoïdes ou d'organe sur puce. Ces modèles reproduisent bien les fonctions métaboliques des hépatocytes et permettent des études de toxicité des molécules à visée thérapeutique (ils seront d'ailleurs utilisés en amont de ce projet dans ce but). De nombreuses autres cellules participent à l'homéostasie du tissu hépatique, notamment les cellules immunitaires (macrophages, lymphocytes...). A ce jour, quelques modèles in vitro proposent de reproduire une partie cette complexité cellulaire. Notre projet étant une investigation thérapeutique reposant sur l'immunité de l'organisme et impliquant la communication entre différents compartiments tissulaires (cellules tumorales, microenvironnement tissulaire, système immunitaire de la souris), nous ne pouvons remplacer ce modèle animal par aucune méthode alternative actuelle, même les plus complexes.
Réduction
Les formules moléculaires des nanoparticules lipidiques et des virus oncolytiques seront analysées et présélectionnées par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleures formules moléculaires contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans l’expérimentation animale et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seules les formules présentant un intérêt entreront dans les traitements chez la souris. Un suivi longitudinal de la taille des tumeurs de chaque animal sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance tumorale par sacrifice des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (taille de la tumeur) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.
Raffinement
Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse (greffe ectopique) ou d'une imagerie non invasive (échographie, bioluminescence, pour les greffes orthotopiques) afin de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Afin de raffiner notre approche in vivo, nous nous basons sur des études précédentes qui montrent une excellente tolérance des complexes Lipidots-ARNm et sur une étude qui montre que la prise de greffe est influencée par le moment de la journée où elle est pratiquée. Nous choisirons donc le moment de la journée le plus favorable à la greffe. De plus, les animaux seront toujours hébergés en groupes avec un enrichissement du milieu. Un suivi quotidien des animaux sera effectué. L’utilisation d’analgésique sera réalisée si nécessaire et suivant les procédures décrites dans ce projet afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur comptétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.
Choix des espèces
Le développement de tumeur par greffe syngénique chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Nous disposons de différentes cellules issues de tumeurs du foie chez ces souris, qui pourront donc être greffées dans des souris immunocompétentes (modèle syngénique) et présentant des différences de réponses inflammatoires intéressantes pour ce projet. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.
Immuno-virothérapie du cancer du foie 3/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
882 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour le prélèvement de leurs organes. Elles reçoivent sous anesthésie une greffe de cellules de tumeur du foie, sous la peau ou directement dans le foie après une incision de l'abdomen, puis, selon les lots, des injections de traitement, et pour certaines sept anesthésies en six semaines pour suivre la tumeur par imagerie. Mené dans trois établissements, le projet teste l'association d'un vaccin à ARNm contre l'alpha-fœtoprotéine et de virus censés éliminer de préférence les cellules cancéreuses. Pour décrire la douleur des souris greffées dans le foie, le porteur invoque des "données cliniques chez l'homme" selon lesquelles les tumeurs intrahépatiques "ne sont pas douloureuses", tout en écrivant que la nuisance "peut augmenter avec la taille de la tumeur".
Objectifs
Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale ciblant un antigène associé aux tumeurs hépatiques : l’alpha-fœtoprotéine, avec l’action de virus oncolytiques (virus capable d’éliminer préférentiellement les cellules cancéreuses) dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm codant l’alpha-fœtoprotéine, qui est l’antigène candidat reconnu le plus prometteur pour les vaccins cancer du foie. L’ARNm utilisé comportera les modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’ARNm sera associé à des NanoParticules Lipidiques pour servir de vaccin à des groupes de souris, porteuses de tumeurs du foie. L’effet protecteur et curatif de la vaccination ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus oncolytique seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les essais de vaccination contre les antigènes associés aux tumeurs du carcinome hépatocellulaire reposent essentiellement sur l’utilisation de peptides ou de protéines recombinantes. Des avancées récentes dans l’utilisation d’ARNm modifié dans la composition de vaccins, notamment par le développement de vecteurs de nano particules lipidiques, ouvrent de nouvelles perspectives vaccinales. La récente démonstration pour les mélanomes de l’efficacité de l’association de l’immunothérapie des points de contrôle immunitaire avec la vaccination par des nanoparticules lipidiques chargées avec des ARNm codant des antigènes associés aux tumeurs des mélanomes ouvre la voie à de nouvelles thérapies pour d’autres cancers. L’originalité du projet repose sur la combinaison de l’action de virus oncolytiques provoquant la destruction de la tumeur ouvrant ainsi l’accès aux cellules tumorales pour les réponses immunitaires spécifiques induites par le vaccin ARN. La combinaison de thérapies impliquant différents mécanismes d’action anti-tumoraux apportera 1) la spécificité antigénique initiale grâce à la vaccination favorisant l’infiltration lymphocytaire intra-tumorale, et 2) la lyse tumorale amplifiée grâce aux virus oncolytiques favorisant ultérieurement la réponse immunitaire.
Procédures
La moitié des lots de souris subira une anesthésie gazeuse d'environ 5 minutes puis une injection sous-cutanée de 30 secondes. L'autre moitié des lots subira une anesthésie gazeuse d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre., puis 3 injections successives (30 secondes chacune) dans le foie. Certains animaux subiront ensuite 7 anesthésies gazeuses d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie par bioluminescence, sur une durée totale de 6 semaines. Parmi les lots décrits précédemment, certains lots subiront en plus trois injections intrapéritonéales et/ou 3 injections intratumorales ou intrahépatiques (30 secondes pour chaque injection) entre J+3 et J+17 post greffe.
Impact sur les animaux
La greffe de tumeur en sous-cutané est un geste rapide et peu douloureux pour l'animal (piqure d’aiguille dans le flanc) et sera réalisé sous anesthésie générale. Pour cette procédure, un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal et une douleur légère au point d'injection. La taille des tumeurs sera mesurée tous les deux ou trois jours à l’aide d’un pied à coulisse digital. Un stress lors de la préhension de l'animal pourrait survenir. La greffe de tumeur en intrahépatique implique une anesthésie générale de l’animal. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. Ensuite, l’animal endormi subira une laparotomie mineure. Une douleur au niveau de la suture pourrait apparaître et sera prise en charge par une analgésie adaptée. Les données cliniques chez l’homme montrent que les tumeurs intrahépatiques ne sont pas douloureuses. Les effets indésirables particuliers en réponse aux traitements seront quasiment absents. En effet, la stratégie vaccinale par nanoparticules lipidique (NPL) et l’utilisation de virus oncolytiques (VO) ont déjà été validées dans des protocoles précédents et ces traitements n'ont pas engendré d'effets indésirables notoires lors de leur mise en œuvre. L’administration des traitements engendrera une douleur légère au point d’injection (intrapéritonéal pour les NPL, ou intra-tumoral pour les VO). Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur. Les compétences des manipulateurs et des points limites adaptés permettent de limiter et prendre en charge efficacement douleur et stress. Enfin, le suivi longitudinal de la taille des tumeurs en greffes orthotopiques sera réalisé sur animal anesthésié sur une courte période (quelques minutes) par échographie et bioluminescence. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. La suite de la procédure est non invasive, non douloureuse. Pour la bioluminescence, une injection IP est réalisée pourra engendrer une douleur légère au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses biochimiques et moléculaires ultérieures.
Remplacement
Le foie est un organe très complexe du point de vue tissulaire et comporte une haute diversité cellulaire. En effet, les hépatocytes, principale composante cellulaire du foie, sont des cellules épithéliales donc polarisées. Les cultures in vitro en 2D ne peuvent reproduire cette polarisation, limitant ainsi les modèles de remplacement à des cultures d'organoïdes ou d'organe sur puce. Ces modèles reproduisent bien les fonctions métaboliques des hépatocytes et permettent des études de toxicité des molécules à visée thérapeutique (ils seront d'ailleurs utilisés en amont de ce projet dans ce but). De nombreuses autres cellules participent à l'homéostasie du tissu hépatique, notamment les cellules immunitaires (macrophages, lymphocytes...). A ce jour, quelques modèles in vitro proposent de reproduire une partie cette complexité cellulaire. Notre projet étant une investigation thérapeutique reposant sur l'immunité de l'organisme et impliquant la communication entre différents compartiments tissulaires (cellules tumorales, microenvironnement tissulaire, système immunitaire de la souris), nous ne pouvons remplacer ce modèle animal par aucune méthode alternative actuelle, même les plus complexes.
Réduction
Les formules moléculaires des nanoparticules lipidiques et des virus oncolytiques seront analysées et présélectionnées par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleures formules moléculaires contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans l’expérimentation animale et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seules les formules présentant un intérêt entreront dans les traitements chez la souris. Un suivi longitudinal de la taille des tumeurs de chaque animal sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance tumorale par sacrifice des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (taille de la tumeur) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.
Raffinement
Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse (greffe ectopique) ou d'une imagerie non invasive (échographie, bioluminescence, pour les greffes orthotopiques) afin de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Afin de raffiner notre approche in vivo, nous nous basons sur des études précédentes qui montrent une excellente tolérance des complexes Lipidots-ARNm et sur une étude qui montre que la prise de greffe est influencée par le moment de la journée où elle est pratiquée. Nous choisirons donc le moment de la journée le plus favorable à la greffe. De plus, les animaux seront toujours hébergés en groupes avec un enrichissement du milieu. Un suivi quotidien des animaux sera effectué. L’utilisation d’analgésique sera réalisée si nécessaire et suivant les procédures décrites dans ce projet afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur comptétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.
Choix des espèces
Le développement de tumeur par greffe syngénique chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Nous disposons de différentes cellules issues de tumeurs du foie chez ces souris, qui pourront donc être greffées dans des souris immunocompétentes (modèle syngénique) et présentant des différences de réponses inflammatoires intéressantes pour ce projet. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.
Immuno-virothérapie du cancer du foie 2/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
Anesthésie gazeuse, puis greffe de tumeur du foie sous la peau du flanc pour la moitié des lots, ou incision de l'abdomen et trois injections dans le foie pour l'autre moitié : ainsi commence le protocole pour les 882 souris de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Entre J+3 et J+17, certains lots reçoivent trois injections intrapéritonéales ou intratumorales d'un vaccin à ARNm contre l'alpha-fœtoprotéine ou de virus oncolytiques, et certaines souris subissent sept anesthésies sur six semaines pour des échographies ou de l'imagerie par bioluminescence. Les tumeurs sous la peau sont mesurées au pied à coulisse tous les deux ou trois jours. Toutes les souris sont tuées à l'issue de chaque procédure, et leurs organes prélevés pour des analyses biochimiques et moléculaires.
Objectifs
Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale ciblant un antigène associé aux tumeurs hépatiques : l’alpha-fœtoprotéine, avec l’action de virus oncolytiques (virus capable d’éliminer préférentiellement les cellules cancéreuses) dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm codant l’alpha-fœtoprotéine, qui est l’antigène candidat reconnu le plus prometteur pour les vaccins cancer du foie. L’ARNm utilisé comportera les modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’ARNm sera associé à des NanoParticules Lipidiques pour servir de vaccin à des groupes de souris, porteuses de tumeurs du foie. L’effet protecteur et curatif de la vaccination ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus oncolytique seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les essais de vaccination contre les antigènes associés aux tumeurs du carcinome hépatocellulaire reposent essentiellement sur l’utilisation de peptides ou de protéines recombinantes. Des avancées récentes dans l’utilisation d’ARNm modifié dans la composition de vaccins, notamment par le développement de vecteurs de nano particules lipidiques, ouvrent de nouvelles perspectives vaccinales. La récente démonstration pour les mélanomes de l’efficacité de l’association de l’immunothérapie des points de contrôle immunitaire avec la vaccination par des nanoparticules lipidiques chargées avec des ARNm codant des antigènes associés aux tumeurs des mélanomes ouvre la voie à de nouvelles thérapies pour d’autres cancers. L’originalité du projet repose sur la combinaison de l’action de virus oncolytiques provoquant la destruction de la tumeur ouvrant ainsi l’accès aux cellules tumorales pour les réponses immunitaires spécifiques induites par le vaccin ARN. La combinaison de thérapies impliquant différents mécanismes d’action anti-tumoraux apportera 1) la spécificité antigénique initiale grâce à la vaccination favorisant l’infiltration lymphocytaire intra-tumorale, et 2) la lyse tumorale amplifiée grâce aux virus oncolytiques favorisant ultérieurement la réponse immunitaire.
Procédures
La moitié des lots de souris subira une anesthésie gazeuse d'environ 5 minutes puis une injection sous-cutanée de 30 secondes. L'autre moitié des lots subira une anesthésie gazeuse d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre., puis 3 injections successives (30 secondes chacune) dans le foie. Certains animaux subiront ensuite 7 anesthésies gazeuses d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie par bioluminescence, sur une durée totale de 6 semaines. Parmi les lots décrits précédemment, certains lots subiront en plus trois injections intrapéritonéales et/ou 3 injections intratumorales ou intrahépatiques (30 secondes pour chaque injection) entre J+3 et J+17 post greffe.
Impact sur les animaux
La greffe de tumeur en sous-cutané est un geste rapide et peu douloureux pour l'animal (piqure d’aiguille dans le flanc) et sera réalisé sous anesthésie générale. Pour cette procédure, un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal et une douleur légère au point d'injection. La taille des tumeurs sera mesurée tous les deux ou trois jours à l’aide d’un pied à coulisse digital. Un stress lors de la préhension de l'animal pourrait survenir. La greffe de tumeur en intrahépatique implique une anesthésie générale de l’animal. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. Ensuite, l’animal endormi subira une laparotomie mineure. Une douleur au niveau de la suture pourrait apparaître et sera prise en charge par une analgésie adaptée. Les données cliniques chez l’homme montrent que les tumeurs intrahépatiques ne sont pas douloureuses. Les effets indésirables particuliers en réponse aux traitements seront quasiment absents. En effet, la stratégie vaccinale par nanoparticules lipidique (NPL) et l’utilisation de virus oncolytiques (VO) ont déjà été validées dans des protocoles précédents et ces traitements n'ont pas engendré d'effets indésirables notoires lors de leur mise en œuvre. L’administration des traitements engendrera une douleur légère au point d’injection (intrapéritonéal pour les NPL, ou intra-tumoral pour les VO). Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur. Les compétences des manipulateurs et des points limites adaptés permettent de limiter et prendre en charge efficacement douleur et stress. Enfin, le suivi longitudinal de la taille des tumeurs en greffes orthotopiques sera réalisé sur animal anesthésié sur une courte période (quelques minutes) par échographie et bioluminescence. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. La suite de la procédure est non invasive, non douloureuse. Pour la bioluminescence, une injection IP est réalisée pourra engendrer une douleur légère au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses biochimiques et moléculaires ultérieures.
Remplacement
Le foie est un organe très complexe du point de vue tissulaire et comporte une haute diversité cellulaire. En effet, les hépatocytes, principale composante cellulaire du foie, sont des cellules épithéliales donc polarisées. Les cultures in vitro en 2D ne peuvent reproduire cette polarisation, limitant ainsi les modèles de remplacement à des cultures d'organoïdes ou d'organe sur puce. Ces modèles reproduisent bien les fonctions métaboliques des hépatocytes et permettent des études de toxicité des molécules à visée thérapeutique (ils seront d'ailleurs utilisés en amont de ce projet dans ce but). De nombreuses autres cellules participent à l'homéostasie du tissu hépatique, notamment les cellules immunitaires (macrophages, lymphocytes...). A ce jour, quelques modèles in vitro proposent de reproduire une partie cette complexité cellulaire. Notre projet étant une investigation thérapeutique reposant sur l'immunité de l'organisme et impliquant la communication entre différents compartiments tissulaires (cellules tumorales, microenvironnement tissulaire, système immunitaire de la souris), nous ne pouvons remplacer ce modèle animal par aucune méthode alternative actuelle, même les plus complexes.
Réduction
Les formules moléculaires des nanoparticules lipidiques et des virus oncolytiques seront analysées et présélectionnées par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleures formules moléculaires contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans l’expérimentation animale et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seules les formules présentant un intérêt entreront dans les traitements chez la souris. Un suivi longitudinal de la taille des tumeurs de chaque animal sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance tumorale par sacrifice des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (taille de la tumeur) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.
Raffinement
Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse (greffe ectopique) ou d'une imagerie non invasive (échographie, bioluminescence, pour les greffes orthotopiques) afin de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Afin de raffiner notre approche in vivo, nous nous basons sur des études précédentes qui montrent une excellente tolérance des complexes Lipidots-ARNm et sur une étude qui montre que la prise de greffe est influencée par le moment de la journée où elle est pratiquée. Nous choisirons donc le moment de la journée le plus favorable à la greffe. De plus, les animaux seront toujours hébergés en groupes avec un enrichissement du milieu. Un suivi quotidien des animaux sera effectué. L’utilisation d’analgésique sera réalisée si nécessaire et suivant les procédures décrites dans ce projet afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur comptétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.
Choix des espèces
Le développement de tumeur par greffe syngénique chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Nous disposons de différentes cellules issues de tumeurs du foie chez ces souris, qui pourront donc être greffées dans des souris immunocompétentes (modèle syngénique) et présentant des différences de réponses inflammatoires intéressantes pour ce projet. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.
Programme d’immunisation de lapins pour la génération d’anticorps polyclonaux suite à une injection unique
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
150 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinquante protocoles de trois animaux, ils reçoivent une injection sous-cutanée d'antigène couplé à l'adjuvant complet de Freund puis trois prélèvements de sang, avant mise à mort à dix jours, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et un inconfort. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et présente la production sur animal vivant comme "indispensable", au service d'une activité commerciale répondant aux "besoins" des laboratoires.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole envisagé est particulier, car il vise à récupérer uniquement les anticorps générés lors d'une réponse primaire. Par conséquent, la procédure expérimentale est plus courte que des protocoles classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et ne nécessitera qu'une seule injection. Les anticorps seront récupérés à l'aide de prélèvement d'échantillons de sang, dont les volumes seront adaptés au poids de l'animal en suivant des recommandations. Le protocole durera 10 jours, ce qui est plus court que les protocoles classiques de 63 jours.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une subtsance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 50 protocoles sont envisagés.
Procédures
1 injection en sous cutanée de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 2% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J10.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (3 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquilisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments dans le domaine de la douleur chez la souris, à l’aide d’un outil de screening basé sur une batterie de modèles et tests.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
3000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque animal subit un des sept modèles de douleur, aiguë, inflammatoire, neuropathique ou postopératoire, avec chirurgies, injections et prélèvements sanguins, le porteur décrivant des brûlures des pattes ou de la queue, des crampes abdominales et une possible automutilation de la patte opérée. Il précise que les animaux restent douloureux et ne peuvent être replacés, d'où leur mise à mort en fin d'étude. Il s'agit d'une "prestation de service" commerciale d'évaluation de candidats médicaments pour des "clients", la douleur étant délibérément provoquée sur des souris de cinq semaines.
Objectifs
Le développement de médicament passe par de nombreuses étapes. Un médicament peut avoir plusieurs activités. Il est intéressant dès les premiers stades de développement de tester le principe actif dans différentes douleurs afin d’évaluer son efficacité. Ceci va permettre d’orienter le candidat-médicament vers un domaine d’application. Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons proposer un service d'évaluation de la douleur chez la souris. Le but est de tester sur un minimum d’animaux des composés actifs sur des modèles/tests prédictifs de différentes aires de douleurs. Cette offre s’appuie sur une sélection de 7 modèles dans différents types de douleur (douleur aigue, inflammatoire, neuropathique et post-opératoire) et tests comportementaux permettant d’appréhender les multiples composantes de la douleur. Ces études d’efficacité antalgique sont exclusivement réalisées chez la souris offrant des mesures robustes et reproductibles sur la base de modèles parfaitement décrits, calibrés et admis par la communauté scientifique. Compte-tenu de la problématique traitée par le laboratoire et du fait que la caractérisation d’une molécule d’intérêt ne permet pas actuellement de remplacer l’étude de son efficacité chez l’animal vigile, la Direction de l'entreprise expose clairement son engagement de qualité scientifique, de professionnalisme et d’intégrité dans le respect de la Directive Européenne 2010/63/UE, la loi française et le comité régional d'éthique sur l'expérimentation animale. Dans le cadre de ses activités expérimentales de prestation de service, elle est amenée à administrer des candidats médicaments chez la souris. De ce fait, l'entreprise s’engage à respecter les points limites présentés pour chaque procédure et à informer le comité d'éthique a posteriori de tout effet majeur induit par l’administration du candidat médicament portant préjudice au bien-être de l’animal. Le projet est découpé en 6 procédures décrivant les 7 modèles et tests.
Bénéfices attendus
Ce service permettra aux clients, d’évaluer rapidement des candidats médicaments efficaces dans différents types de douleur.
Procédures
Les animaux peuvent recevoir un traitement par voie orale (p.o), intrapéritonéale (i.p), sous cutané (s.c) intraveineuse (i.v), sous-cutané plantaire (s.c.pl), Intramusculaire (i.m). Ces administrations se réalisent sur animal vigil. Des traitements en co-adminsitration peuvent également se réaliser. Ces injections durent entre 30 secondes et 1minute. Pour certaines procédures les souris subissent une chirurgie. La chirurgie du modèle post-opératoire dure entre 5 et 7 minutes. La chirurgie du modèle de neuropathie dure environ 15minutes. Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie. Ces prélèvements sont rapides et durent quelques minutes. Il peut également y avoir des prélèvements répétés, limités à 6 sur une cinétique.
Impact sur les animaux
Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, l’induction des modèles entraîne inévitablement l’apparition de symptômes douloureux. Les effets attendus sont différentes tyesde douleurs en fonction des modèles : douleur locale, crameps abdominables, brulures au niveau des pattes, de la queue. Pour les chirurgies, les effets indésirables peuvent être un non-réveil suite à l’anesthésie ou une mauvaise cicatrisation de la plaie. Les effets indésirables peuvent être une automutilation de la patte opérée ou une mauvaise cicatrisation. Les animaux peuvent recevoir un traitement par voie orale (p.o), intrapéritonéale (i.p), sous cutané(s.c) intraveineuse (i.v), sous-cutané plantaire (s.c.pl), Intramusculaire (i.m). Pour l’ensemble des tests, des points limites/nuisances associés à la pharmacologie peuvent aussi apparaitre (tremblement, sédation …). Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie (IC, jugulaire, retro-orbital). Le volume de sang total estimé est de 0.7ml/10g pour une souris. En prélèvement unique, 1.2mL de sang peut être prélevé sans réveil de l'animal. Les prélèvements répétés sont limités à 1% de volume de sang total de la souris sur 24h.
Devenir
Une grande partie des modèles utilisés ici sont des modèles stables dans le temps. Les animaux restent donc douloureux. Il n’est donc pas concevable de les replacer. Les autres modèles font mettre en place des processus inflammatoires et donc une réaction immunitaire qui peut interférer avec les autres modèles présents au sein du laboratoire. Il n’est donc pas cohérent de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité de la société.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Selon sa définition par le IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements anti-douleur doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=8 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle et confirmé lors des études subséquentes réalisées par l'entreprise. Cet effectif par groupe a été confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance via BiostaTGV. De plus, cet outil vise à fournir une évaluation rapide des composés testés dans des conditions très calibrées, il est donc réalisé sans les groupes contrôles usuels (groupe recevant le véhicule des composés, groupe recevant une molécule de référence), ce qui permet une réduction du nombre d’animaux et une démarche 3R.
Raffinement
Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation, habituation des animaux aux compartiments de tests). Les tests possèdent des valeurs de maximales afin de limiter le temps d’exposition d’un animal à un stimulus douloureux. De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, sizzle nest et briquettes en bois à ronger). L’anesthésie et un suivi post-opératoire sont appliqués pour les chirurgies. Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés sont âgés d’environ 5 semaines pour toutes les procédures. Ces âges et gamme de poids correspondent à ceux d’animaux jeunes adultes couramment utilisés dans les différents modèles de douleur sur lesquels les procédures ont été validées dans l’entreprise. De plus, des souris plus âgées pourraient présenter des pathologies supplémentaires et interférer avec le screening de molécules.
Impact d’un enrichissement sur le comportement et les réponses au stress des truites
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
1000 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 400 tuées par anesthésie létale pour prélèvements et 600 réutilisées dans d'autres projets. Les poissons sont filmés puis soumis à un test comportemental de réactivité émotionnelle par isolement social de quarante minutes, décrit comme un stress aigu, et à un abaissement du niveau d'eau pendant cinq minutes par jour. Le porteur présente l'étude comme un moyen d'améliorer le bien-être des truites d'élevage grâce à une structure d'enrichissement amovible. Il reprend une communication de la Commission européenne sur la "nécessité" d'améliorer le bien-être des poissons d'élevage, l'application visée étant la pisciculture commerciale.
Objectifs
Le bien-être animal est une notion importante, qui suscite un intérêt croissant depuis quelques années, notamment en élevage. Elle ne fait plus seulement appel à la notion d’équilibre et d’homéostasie nécessaires entre l’animal et son environnement, à l’absence d’expériences négatives et contraignantes, mais implique dorénavant également la possibilité pour l’animal d’accéder à des émotions positives et de diminuer ses états mentaux négatifs. Bien que des progrès ont été mis en place pour améliorer le bien-être des animaux dans la plupart des filières d’élevage, certaines en nécessitent encore pour une prise en compte optimale. Une manière d’améliorer le bien-être des poissons d’élevage est d’incorporer des éléments d’enrichissements dans leur environnement. L’enrichissement physique consiste à apporter des éléments complexifiant physiquement (plantes, structures) ou sensoriellement (visuel, auditif…) l’habitat. Cependant, l'ajout de divers objets dans les bassins peut s'avérer contraignant pour les pisciculteurs lors de la pêche ou de l'entretien. Ce projet a pour vocation de tester une stratégie d’enrichissement physique dans le but d’améliorer le bien-être des truites en élevage par l'ajout dans les bassins d'une structure amovible et donc facile d'entretien, composée de plantes fixées à une plaque servant d'abri. Nous analyserons le comportement des poissons et leur réponse au stress selon que leur environnement ait été enrichi ou non pendant 3 mois, dès les jeunes stades.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de tester une structure d'enrichissement du milieu de vie des truites visant à améliorer leur bien-être et leur réponse au stress en élevage. La structure d'enrichissement est composée de plantes fixées à une plaque servant d'abri et serait facile à mettre en place en élevage car amovible limitant ainsi les contraintes liées à l'entretien et à la pêche. En cas de succès du projet et de résultats prometteurs (moins de stress et de comportements agressifs, meilleure croissance), notre stratégie d'enrichissement pourra être testée en élevage commercial, afin d’évoluer vers des systèmes plus respectueux du bien-être des poissons. Ce projet rejoint les consignes données par la commission Européenne lors de sa communication 236 du 12/05/2021 sur la nécessité de trouver des moyens d’améliorer le bien-être des poissons d’élevage et en particulier pendant la phase d’élevage pour ensuite les communiquer à la filière piscicole.
Procédures
Il n'y aura pas de prélèvement sur animal vivant pour ce projet. Les prélèvements de sang auront lieu après anesthésie à dose létale de l’animal.
Impact sur les animaux
Nous faisons l'hypothèse que les effets générés par la structure d'enrichissement pendant 3 mois sur l'un des deux traitements seront au contraire bénéfiques pour les animaux. Les truites seront simplement filmées pendant leur élevage. Lors du test comportemental de réactivité émotionnelle, le stress induit par l'isolement social en environnement nouveau pendant 40 minutes est inévitable puisque nous cherchons précisément à mettre en évidence les réponses émotionnelles des poissons. Par expérience, nous savons que ce test crée un stress aigu mais le pic de cortisol reste bien en-deçà des niveaux atteints lors des procédures classiques (confinement prolongé) et aucun point limite n'a jamais été atteint lors des 40min de test pendant lesquelles les poissons sont observés à l'écran en direct. Le transfert des poissons depuis leur bac d’élevage jusqu’au bac de test est limité à son maximum car les bacs sont disposés à proximité immédiate, et il est réalisé par du personnel compétent et expérimenté. Les animaux seront également mis à jeun 24 heures avant toute manipulation pour éviter les régurgitations (procédure classique d'élevage). Le stress modéré d'abaissement du niveau de l'eau appliqué au groupe en fin d'expérimentation dure seulement 5 minutes par jour. S'il permettra une légère élévation du cortisol nécessaire pour mettre en évidence une différence éventuelle de résistance au stress entre nos 2 traitements après 5 jours, il sera modéré dans la mesure où les poissons resteront dans leur environnement avec leurs congénères.
Devenir
Les poissons prélevés pour les analyses plasmatiques et morphologiques seront mis à mort selon les normes réglementaires. Les animaux surnuméraires nécessaires pour atteindre la densité optimale par bac et filmés pendant les observations du groupe pourront être réutilisés dans d'autres projets de l'Unité.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale puisque le but de cette étude est d’observer le comportement des poissons en réponse à la présence ou à l’absence d’un enrichissement de l'environnement dans l’optique d’une application future en élevage. Les réponses émotionnelles des poissons nécessitent également de manipuler des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux prélevés ainsi que le nombre de bacs d'élevage par traitement ont été réfléchis pour permettre des analyses statistiques fiables. Le nombre d'animaux par bac a aussi été ajusté au mieux pour se rapprocher des conditions réelles en élevage mais également pour assurer une densité optimisant la stabilité hiérarchique des poissons au sein des bacs (
Raffinement
Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, nourriture). L’enrichissement de l'environnement d'élevage permet précisément d'améliorer le bien-être des truites, ce que nous chercherons à confirmer avec la structure facile d'entretien proposée. Néanmoins, pendant toute cette période d’élevage, le comportement des animaux sera surveillé de près par les animaliers quotidiennement. Les manipulations sont réalisées par du personnel compétent le plus rapidement possible pour limiter le stress. Les bacs de tests comportementaux sont situés à proximité des bacs d'élevage afin de limiter le stress du transfert.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce. La question du bien-être de cet animal de rente est donc primordiale en France mais aussi en Europe. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). Les expérimentations démarreront un mois après la première alimentation des alevins, soit 3 mois après la fécondation des oeufs. Cela représente un stade charnière visé pour l'application en pisciculture. De plus, l'application de l'enrichissement à des stades précoces a montré qu'elle était mieux assimilée et plus efficace compte tenu de la flexibilité comportementale des jeunes animaux.
Impact d’une reproduction au sol sur les performances et le bien-être des poulets
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
320 poulets de chair vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis vendus vivants à l'issue. Chaque animal subit jusqu'à trois prélèvements sanguins au sinus occipital à l'âge adulte, pour comparer les effets d'une reproduction au sol et en cage sur la fertilité et le comportement. Le porteur présente l'étude comme une réponse aux "demandes sociétales de bien-être animal", tout en la reliant à des enjeux de sélection génétique et de performances de reproduction. Il indique que la reproduction au sol peut s'accompagner de picage, d'agressivité et de cannibalisme, et cible deux lignées de poulets à croissance lente et rapide.
Objectifs
En sélection, les lignées de volailles sont, pour une partie de leur vie, hébergées en cage individuelle. La reproduction en cage permet un suivi individuel de la ponte, mais surtout une reproduction par insémination artificielle qui permet de limiter la consanguinité en contrôlant les couples reproducteurs et de connaître le pedigree de la descendance à chaque génération. Aujourd’hui, nous cherchons à concevoir un élevage sans cage, plus en lien avec les demandes sociétales de bien-être animal. Si la reproduction au sol ouvre la possibilité d’exprimer des comportements naturels positifs (activité, bain de poussière,…), l’effet global sur le bien-être des animaux doit être mieux évalué. Des interactions sociales agressives entre adultes au sol peuvent s’accompagner d’une baisse du bien-être du troupeau, avec l’apparition de picage, de comportements violents voire de cannibalisme. D’autre part, ce mode d’élevage des reproducteurs pourrait avoir un effet sur la fertilité et la fécondité des mâles comme des femelles. Le but du projet est d’estimer la faisabilité et les conséquences d’une reproduction au sol sur le comportement et les performances des reproducteurs en utilisant deux lignées génétiques de poulets de chair, variant sur la vitesse de croissance et les caractéristiques métaboliques. Ce projet évaluera comment une reproduction au sol impacte le bien-être et la fertilité des animaux reproducteurs, et si cet impact varie entre lignées aux caractéristiques bien distinctes. Le projet implique des prises de sang sur les animaux pour évaluer le taux d’hormones indicatrices de comportements aggressifs et du niveau de stress des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet servira de socle à un renouvellement de nos pratiques pour accompagner la transition vers un mode alternatif d’élevage en sélection. A court terme, il permettra l’évaluation des pratiques prenant en compte : les effets positifs ou négatifs d’un élevage au sol sur le bien-être et les performances de reproduction des animaux. Il sera également important d’évaluer l’impact de la reproduction au sol sur le travail des animaliers. Au niveau scientifique, ce projet permettra une meilleure connaissance des interactions entre environnement d’élevage (cage vs sol) et génétique (croissance lente vs rapide) sur les performances de reproduction et le comportement des animaux.
Procédures
Chacun des 320 animaux, d’élevage en cage ou d’expérimentation au sol, seront soumis à 3 prélèvements sanguins maximum à l’âge adulte, séparés d’au moins 3 semaines entre eux. La technique de prélèvement de sang au sinus occipital ne dure que quelques secondes (15s environ).
Impact sur les animaux
320 animaux d’élevage en cage ou d’expérimentation au sol, seront soumis à 3 prélèvements sanguins à l’âge adulte. Les prélèvements sanguins à l’âge adulte entrainent un risque de douleur légère de courte durée, un léger risque d’hématome et un potentiel stress de contention.
Devenir
Tous les animaux n’ayant subi qu’une porcedure légère seront disponibles à la vente (animaux vivants).
Remplacement
Pour évaluer les possibilités de reproduction au sol des poulets de chair et connaître leur impact sur le bien-être, le modèle le plus adapté est le poulet de chair lui-même.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires pour ce projet a été évalué d'après des publications scientifiques de simulation de précision de l'estimation des paramètres physiologiques et génétiques estimés dans ce projet. Les effectifs les plus faibles sont pour les mâles. De nombreux caractères seront testés, dont plusieurs ont déjà montré des différences significatives à moins de 20 individus. D’autre part, des prélèvements multiples, permettront de renforcer la puissance des effets observés entre traitements en utilisant moins d’animaux. Les femelles seront, elles, au nombre de 60 par traitement. Un sexe ratio de 1 mâle pour 3 femelles est le standard utilisé en reproduction en cage. Les animaux au sol permettront de tester trois traitements différents : au sol en sexes séparés (sans reproduction), au sol en reproduction libre, et au sol avec reproduction contrôlée (où un mâle est placé avec trois femelles choisies par l’expérimentateur), pour réduire le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Le calme et une contention soignée pendant la prise de sang seront mis en oeuvre. Par ailleurs, les animaux voués à l’expérimentation de la reproduction au sol seront élevés sur copeaux, en groupe, et auront accès à l’aliment selon les schémas de rationnement. Un panel d’enrichissements du milieu sera disponible : perchoirs, cachettes, nids, et distribution de nourriture aléatoire dans la litière. En plus des bienfaits habituels des enrichissements, ces derniers seront cruciaux pour limiter l’agressivité entre les animaux, que ce soit les comportements harceleurs des mâles envers les femelles (cachettes), l’agressivité entre mâles, ou la compétition pour la nourriture (distribution dans la litière favorisant le grattage). Tous les animaux seront visités quotidiennement pendant 15 à 20 minutes. Si un animal est blessé ou malade (emplumement, picage) ou s’il est en souffrance (prostration permanente), il sera isolé en infirmerie jusqu’à récupération complete.
Choix des espèces
L’objectif étant l’etude de la reproduction au sol des poulets de chair, le modèle le plus adapté est le poulet de chair lui-même. Toutes les procédures seront realisées sur des animaux adultes, pour phénotyper des reproducteurs.
Nouvelles stratégies thérapeutiques dans L’accident vasculaire cérébral chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 d'entre elles étant maintenues sous anesthésie sans réveil pour une imagerie de six heures. Chaque animal subit une occlusion d'une artère cérébrale pour provoquer un accident vasculaire cérébral, souvent doublée d'une hyperglycémie induite par injection de glucose, avec administration d'agents thérapeutiques et prélèvements sanguins. Le porteur indique que l'ischémie cérébrale provoque une douleur et une perte de mobilité, et prévoit la mise à mort pour prélever les tissus cérébraux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de l'efficacité d'un traitement à la phase aiguë d'un AVC associé à une hyperglycémie.
Objectifs
En France, l’accident vasculaire cérébral reste une cause majeure de handicap, de troubles cognitifs et de mortalité. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament permettant de dissoudre le caillot de sang responsable de l’accident vasculaire cérébral, soit un dispositif médical permettant de le retirer chirurgicalement. Ces 2 traitements présentent des limites qui font que seule une minorité de patients peut en bénéficier. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements qui permettraient de traiter un plus grand nombre de patients. Par ailleurs, l’une des principales complications des accidents vasculaires cérébraux et de leurs traitements actuels est la survenue d’une hémorragie cérébrale qui peut aggraver le pronostic des patients. Pour cette raison, lors de l’évaluation de nouveaux traitements des accidents vasculaires cérébraux, il est donc important de s’assurer qu’ils n’entrainent pas de risque hémorragique. Les objectifs de ce projet sont donc d’évaluer l’efficacité mais aussi la sûreté de nouveaux agents thérapeutiques visant à protéger le cerveau au cours des accidents vasculaires cérébraux.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet donnera des résultats concernant l'efficacité thérapeutique et la sûreté de différents candidats médicaments pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux. Il permettra ainsi d’envisager une meilleure prise en charge des patients atteints d’un accident vasculaire cérébral et ainsi une amélioration de la fonction neurologique et de l’état de santé chez ces patients.
Procédures
Pour cette étude, nous utiliserons un modèle d’accident vasculaire cérébral induit par une occlusion transitoire, réalisée sous anesthésie et analgésie, d’une artère cérébrale moyenne chez la souris. La procédure chirurgicale dure environ 20 minutes. Ce modèle sera combiné à une injection de glucose par voie intrapéritonéale pour provoquer une hyperglycémie aiguë 20 min avant le début de la procédure chirurgicale. Les différents agents thérapeutiques testés seront administrés 30 min après l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne. La durée d’injection chez la souris est d’environ 10 secondes. Au total, 1390 souris seront utilisées. 1270 souris dont 1040 seront soumises à une occlusion de l’artère cérébrale pendant une heure avec ou sans hyperglycémie aiguë et 230 souris contrôles sans occlusion de l’artère cérébrale subiront différents examens (dosages biologiques et suivi neurologique) visant à déterminer la sévérité de l’accident vasculaire cérébral. 120 souris subiront également un accident vasculaire cérébral pour étudier les différents acteurs cellulaires impliqués dans la formation du caillot sanguin par imagerie intravitale (au maximum 6 heures). Sur la totalité des souris, des prélèvements sanguins seront réalisés à différents temps (jour 7 avant la chirurgie, 6 heures et 24 heures après l’accident vasculaire cérébral). La durée maximale pour effectuer les prélèvements chez la souris est d’environ de 2 minutes. Toute procédure invasive sera faite sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront mis à mort en fin d'étude et les tissus seront prélevés et stockés pour les analyses biologiques.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lié aux injections de différents agents thérapeutiques et anesthésiques ainsi qu’aux prélèvements sanguins effectués avant et après ischémie cérébrale. L’induction de l’ischémie cérébrale provoque aussi une douleur chez l’animal et un comportement anormal (perte de mobilité). L’hyperglycémie aiguë peut également entraîner une déshydratation chez l’animal.
Devenir
Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques.
Remplacement
Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de l’efficacité d’un traitement thérapeutique à la phase aiguë d’un accident vasculaire cérébral associé à une hyperglycémie. L'effet biologique des molécules utilisées sur leur cible a été démontré in vitro. La démonstration de leur effet bénéfique thérapeutique avant transposition chez l'homme ne peut se faire que dans un modèle animal proche de la physiopathologie humaine. Les modèles murins d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'occlusion de l’artère cérébrale chez l'homme.
Réduction
Les modèles d’accident vasculaire cérébral développés chez la souris, sont parfaitement connus et maîtrisés par les expérimentateurs. Les groupes ont été conçus de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste de manière à avoir une puissance suffisante pour l’analyse statistique pour toutes les évaluations réalisées dans les différents groupes au cours du temps. Ces calculs ont été possibles grâce aux résultats antérieurs obtenus avec ces modèles animaux.
Raffinement
Le soin et le suivi des animaux seront faits par des personnes compétentes et expérimentés, journalière par l’animalier et bi-hebdomadaire par l’expérimentateur. La douleur sera évaluée par la mise en place de points limites bien définis à l’aide d’une grille de score. le déficit neurologique sera également évalué à l’aide d’une grille de score bien définis.
Choix des espèces
L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés
Imagerie de la neuroinflammation par ultrasons, chez la souris nouveau-né et la jeune souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souriceaux reçoivent une injection de molécule pro-inflammatoire dans le péritoine ou directement dans le cerveau à cinq puis trente jours de vie, avec ouverture de la boîte crânienne par craniotomie et imagerie par ultrasons sous anesthésie. Le porteur décrit un retard de croissance, des troubles comportementaux et moteurs, et un risque de mort par surdosage anesthésique, la mise à mort étant justifiée par les injections et la craniotomie subies. Il présente ce modèle comme applicable à terme au nouveau-né prématuré humain et affirme que ces caractéristiques du cerveau en activité sont impossibles à reproduire hors de l'organisme.
Objectifs
La neuroinflammation est une réaction inflammatoire (réaction de l'organisme aux lésions et infections) qui se produit dans le cerveau. Lorsqu’elle survient peu avant ou après la naissance, la neuroinflammation peut impacter des phases critiques du développement du système nerveux central et avoir des conséquences à long terme sur la santé de l’individu (handicaps moteurs, troubles comportementaux, déficits cognitifs…). Cette étude vise à mieux comprendre l’impact de l’inflammation sur le développement cérébral. Nous nous intéressons ici à trois caractéristiques du cerveau : la connectivité entre différentes régions cérébrales lorsqu'elles sont activées, l’architecture vasculaire et la rigidité. La connectivité analyse l’activation simultanée de plusieurs aires cérébrales structurellement différentes. La neuroinflammation engendre des défaillances de cette connectivité fonctionnelle. L’inflammation modifie également les vaisseaux sanguins de la zone touchée, puisqu’elle se traduit par un afflux important de sang à cet endroit. L’architecture vasculaire à l’échelle des microvaisseaux fera l’objet d’une partie de cette étude. Enfin, la neuroinflammation, de par ses conséquences au niveau vasculaire notamment, pourrait modifier la rigidité du cerveau, et nous chercherons à quantifier cette modification. Les ultrasons biomédicaux, utilisés à des fins d’imagerie diagnostique, sont un moyen parfaitement adapté à l’étude de ces trois caractéristiques. L’essor considérable qu’ils ont connu au cours des dernières années a permis d’augmenter le niveau de détail des images, spatialement et temporellement, et leur sensibilité. Dans notre étude, trois techniques d’imagerie ultrasonore seront utilisées : les ultrasons fonctionnels pour étudier la connectivité fonctionnelle, l’imagerie superrésolution pour cartographier l’architecture cérébrale à l’échelle des microvaisseaux, et l’élastographie pour mesurer la rigidité du cerveau inflammé.
Bénéfices attendus
Ce projet contribue à enrichir les recherches faites sur la neuroinflammation chez le souriceau, en utilisant une méthode jusque-là peu utilisée pour étudier ce sujet : l’imagerie par ultrasons. En particulier, l’étude de l’impact possible de l’inflammation sur la rigidité du cerveau constitue la principale avancée de ce projet. A plus long terme, les données collectées serviront à la recherche sur le nouveau-né humain prématuré. La neuroinflammation est en effet une conséquence de la prématurité des enfants, dans 20 à 40% des cas. Elle est à l’origine de la plupart des lésions dans le cerveau du nourrisson, regroupées sous le terme d’encéphalopathie du prématuré. Mieux comprendre les modifications de vascularisation, de connectivité et de rigidité induites par la neuroinflammation contribuera à élargir les outils pronostiques de la prématurité, afin de pouvoir mettre en place des interventions plus précoces et ouvrir la voie à de nouveaux traitements.
Procédures
- Les animaux recevront une injection (à travers le péritoine, sans anesthésie, 1 min ; ou directement dans le cerveau, avec anesthésie, environ 30 min) d’une molécule pro-inflammatoire, à deux stades de croissance différents (5 jours et 30 jours après la naissance). - Les animaux au 30ème jour après la naissance nécessitent une opération chirurgicale d'ouverture de la boîte crânienne, au cours de laquelle ils seront placés sous anesthésie générale (environ 1h). - Toutes les mesures d’imagerie ultrasonore (imagerie fonctionnelle, élastographie, imagerie superrésolution) sont réalisées sous anesthésie générale (durée variable en fonction des mesures à effectuer : entre 15 min et 1h30). - L'imagerie superrésolution nécessite en plus l'injection de microbulles dans la circulation sanguine, réalisée sous anesthésie, à l'aide d'une seringue très fine, adaptée à la taille de l'animal (environ 2 min).
Impact sur les animaux
- L’administration intra-péritonéale (i.e., dans le péritoine) ou intra-cérébroventriculaire (i.e., directement dans le cerveau) peut créer une infection locale dans la zone d’injection. - L’injection de molécule inflammatoire engendre un retard de croissance chez les animaux concernés, qui se traduit morphologiquement par une taille et un poids inférieurs à la normale. De plus, les animaux injectés sont susceptibles de développer des troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible…) et moteurs. - Une dose mal estimée d’anesthésie au cours des acquisitions en imagerie peut engendrer le réveil des animaux si trop faible, ou leur mort si overdose, ce qui justifie une étape préalable d'ajustement des doses. - La manipulation des animaux au cours des injections, ainsi que l’injection elle-même, sont sources de stress pour les animaux.
Devenir
Pour toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés. Ils auront en effet reçu des injections et/ou subi une craniotomie donc ne pourront pas être maintenus en vie.
Remplacement
Notre étude s’intéresse à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel, qu’il est par conséquent impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques).
Réduction
Au total, notre projet nécessitera au maximum 1140 animaux. Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique.
Raffinement
- Des grilles de scoring en fonction de l’âge des animaux seront proposées pour s’assurer du bien être des animaux et déterminer les points limites. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités et le tonus des animaux. Suite à l’inflammation, on surveillera régulièrement la prise de poids et l’apparition éventuelle de troubles comportementaux (isolement, agressivité) : la molécule inflammatoire sera injectée le matin, puis les animaux seront surveillés 1h, 6h, 10h, 22h et 24h après l’injection (deux personnes se relaieront pour la surveillance). Si l’un de ces points limites est atteint, et/ou à la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés. - Les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. - Pendant les chirurgies nécessaires pour la mise en place des appareils d’imagerie, les animaux seront anesthésiés et surveillés : si l’animal présente une difficulté respiratoire, une variation importante de sa fréquence cardiaque ou une hypothermie importante, la procédure de chirurgie sera interrompue et l’animal euthanasié. - Au cours des acquisitions en imagerie, sous anesthésie générale, les constantes physiologiques suivantes seront mesurées en continu : fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, température.
Choix des espèces
Dans le cas de l’étude de la neuroinflammation, la littérature montre que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; il pourra donc, à plus long terme, être appliqué au cas du nouveau-né humain. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de la neuroinflammation sur certaines caractéristiques du cerveau, à différents stades de croissance : les animaux seront utilisés au cours du développement, à un stade encore immature du cerveau (5 jours après la naissance), et à plus long terme, lorsque le cerveau a atteint sa maturité (30 jours après la naissance).
Etude de l’effet de faibles doses de rayonnements ionisants externes de type gamma et d’un régime riche en lipides sur la microvascularisation cérébrale et cardiaque chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies animales
736 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est irradié aux rayons gamma sur le corps entier pendant une contention d'un quart d'heure, une partie recevant un régime riche en lipides, avec des échographies sous anesthésie et un prélèvement d'organes terminal. Le porteur affirme que l'irradiation à faible dose n'entraîne ni douleur ni brûlure et se limite à un stress de contention. Il présente l'étude comme une contribution aux normes de radioprotection, en complément d'études épidémiologiques jugées insuffisantes.
Objectifs
L’objectif de notre étude est d’identifier la réponse de la microvascularisation cardiaque et cérébrale à une exposition aigüe à des doses faibles à modérées de RI, associée ou non à un facteur de risque tel qu’un régime riche en graisse. Pour cela, l’évaluation de potentielles conséquences sur les troubles moléculaires, physiopathologiques, phénotypiques et fonctionnels cardiaque et cérébral sera réalisée. L’objectif de ce projet sera d’évaluer cette hypothèse par un modèle expérimental d’exposition externe unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur le les vaisseaux du cœur et du cerveau seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances sur les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur la microvascularisation (cardiaque et cérébrale), afin de participer à la détermination des normes en radioprotection pour des institutions du domaine de la radioprotection.
Procédures
Pour les animaux exposés aux rayonnements gamma, l’irradiation durera maximum 10 minutes. Ainsi la durée de contention des souris en boîte d’irradiation sera maximum de 15 (10 min d’irradiation + 5 minutes de préparation). Certains lots recevront un régime alimentaire riche en lipides pendant toute la durée de l’étude. Pour tous les animaux, les échographies sont non invasives et effectuées sous anesthésie. L’ensemble des prélèvements sera réalisé en terminal.
Impact sur les animaux
L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de brulure aux animaux, seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque a été observée à long terme. Néanmoins un stress des animaux est possible lors de la mise en boite d’irradiation même s’il y a habituation au tube à contention. L’ajout d’un régime riche en graisse n’impact pas le bien-être des animaux. Cela peut pour les temps longs les faire prendre du poids.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.
Remplacement
Pour mimer l’exposition corps entier de résidents vivants en zone contaminée ou les travailleurs (après un accident nucléaire par exemple celui de Tchernobyl ou Fukushima), il est nécessaire d’avoir recours à une exposition externe à des doses faibles de rayonnements ionisants gamma (imitant les rayonnements ionisants du CS137) sur un modèle intégré (microvascularisation cardiaque et cérébrale). De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique, il est de plus très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.
Réduction
Au total, 736 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 20 à 26 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. Il n’y aura pas 20% de mortalité mais la puissance statistique sera supérieure à celle attendue avec 20 souris. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe, mais en cas de bagarres, les animaux pourront être isolés. Les souris seront suivies quotidiennement. Elles seront pesées régulièrement une fois par mois. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement par application de Vétédine, crème antibiotique ou par administration d’antibiotique.
Choix des espèces
Ce projet vise à déterminer un seuil dose pour lequel on observe le développement de pathologies microvasculaire (raréfaction au niveau cardiaque ou cérébrale) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature. Des souris C57BL/6 males seront utilisées pour notre projet afin de pallier les effets cardioprotecteurs des hormones comme les œstrogènes. Néanmoins lorsque nous aurons des résultats sur les mâles et si ceux-ci sont significatifs, nous pourront prévoir la réalisation de ces mêmes expériences sur des souris femelles.
Étude du rôle global de PDL1 et de MCT4 dans la métastase osseuse de cancer pulmonaire. Effets immunitaires et non immunitaires.
- Recherche appliquée
- Cancers
402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de cellules cancéreuses dans le tibia, suivie d'un suivi radiographique hebdomadaire pendant douze semaines et de traitements par voie intraveineuse ou orale. Le porteur indique un développement tumoral attendu, une douleur se manifestant par une boiterie, et une sortie de l'étude avant que le volume tumoral ne dépasse 10 % du poids de l'animal. Il affirme que l'environnement tumoral est impossible à recréer in vitro et conclut au caractère "indispensable" du modèle murin pour étudier les protéines PDL1 et MCT4.
Objectifs
Le cancer pulmonaire est une cause fréquente de mortalité chez l’homme. 40 % des patients vont présenter des métastases osseuses qui assombrissent leur pronostic. Lorsque le cancer est métastatique, il est incurable et diminue drastiquement la survie des patients. Les cellules cancéreuses sont caractérisées par l’expression différentes de nombreuses protéines impliquées dans le fonctionnement cellulaire ce qui permet aux cellules cancéreuses de se multiplier anormalement. Parmi les protéines augmentant l’agressivité du cancer, MCT4 et PD-L1 jouent un rôle important dans plusieurs cancers dont le cancer pulmonaire. En revanche, il n’y a pas de données chez les patients porteurs de métastases osseuses. MCT 4 est la principale protéine qui exporte l’acide lactique des cellules tumorales dans leur environnement. Dans l’os, ce lactate soutient le développement des métastases osseuses en stimulant la lyse osseuse (principale caractéristique des patients souffrants de métastases osseuses d’origine pulmonaire) et en favorisant une immunité pro-tumorale. L’inhibition pharmacologique de MCT4 sur des modèles murins montre une diminution du développement tumoral de plusieurs cancers. Néanmoins, dans les métastases osseuses, cette approche n’a jamais été essayée alors qu’elle s’avère prometteuse. PDL1 est une protéine impliquée dans l’inactivation des cellules immunitaires anti tumorales (lymphocytes T CD8+). Son rôle est documenté dans les cancers pulmonaires et les métastases des tissus mous mais inconnu au sein de la métastase osseuse des cancers pulmonaires. Les immunothérapies PD-1/PD-L1 sont une avancée majeure dans le pulmonaire métastatique. Dans les métastases osseuses l’efficacité de ces traitements n’est pas connue. Aussi, nous souhaitons étudier le rôle de ces protéines dans la métastase osseuse en réalisant des injections intra tibiales de cellules cancéreuses qui expriment en forte quantité ou sans expression de ces protéines. Nous étudierons également des traitements inhibant ces protéines et observerons l’effet sur les métastases osseuse.
Bénéfices attendus
Le bénéfice est de comprendre le rôle de PDL1 et MCT4 dans la métastase osseuse ainsi que déterminer si l’utilisation de traitement ciblant pharmacologiquement ces protéines présente un intérêt thérapeutique dans un modèle de recherche pré-clinique.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des prélèvements vigiles ni de procédures chirurgicales. Les animaux seront anesthésiés une fois lors de l’injection des cellules cancéreuses dans le tibia (5 min) puis une fois par semaine pour le suivi radiographique (5 min) des lésions osseuses pour une durée maximale de 12 semaines. Les animaux traités par voie intra veineuse auront 9 injections de traitement ou de contrôle au total sur 3 semaines (1 min). Les animaux traités par voie orale auront une prise quotidienne de traitement pendant 3 semaines (15min).
Impact sur les animaux
Les modèles expérimentaux de cancérologie sont des modèles dommageables et il est attendu un développement de cancer chez les animaux. La douleur peut survenir et se manifester par une boiterie chez les souris. Aussi, nous utiliserons un protocole strict de suivi des animaux en utilisant des échelles de points limites. Ces points limites sont les situations prédéfinies à ne pas atteindre pour respecter le bien-être animal. Les animaux seront sortis de la procédure avant atteinte des points limites expérimentaux et les pilotes expérimentaux permettrons de suivre le délais d’apparition de ces situations sur un petit nombre d’animaux avant utilisation d’un plus grand nombre. Les injections de traitement répétées peuvent conduire à un inconfort momentané et des blessures chez les animaux et pour y remédier, nous procèderons à des injections à différents endroits.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole. A la fin de la procédure, les tumeurs osseuses, ainsi que les organes des souris qui sont le siège de métastases (généralement poumons, os, foie) seront prélevés pour peser les tumeurs. Les tumeurs et les organes métastatiques seront ensuite fixés et inclus en paraffine afin de réaliser des études histologiques.
Remplacement
Remplacement : Bien que l’étude in vitro permette la compréhension de nombreux processus du cancer, cela ne prend pas en compte l’environnement tumoral, dont l’impact est majeur. L’étude d’une tumeur in vivo permet la considération des cellules tumorales, immunitaire, osseuses, fibroblastiques (autres cellules de l’environnement tumoral) ainsi que la vascularisation de l’hôte, leur interactions et fonctionnement ensemble. Un tel modèle est impossible à recréer in vitro, ainsi, l’utilisation d’un modèle murin est indispensable à notre étude. Tous les organes des animaux seront prélevés à la fin de la procédure.
Réduction
Réduction: Nous avons utilisé une approche statistique et consulté la littérature pour déterminer la taille des groupes d’animaux nécessaire à la réalisation à chaque protocole de l’étude. Pour chaque groupe, nous allons réaliser une analyse du tissu osseux qui nécessite 10 animaux, une analyse de l’expression des gènes qui nécessite 4 animaux et une analyse des populations cellulaires qui nécessite 4 animaux soit 18 animaux.
Raffinement
Raffinement : Les souris cohabiteront par groupe de 3, dans des cages à couvercles filtrants de 424 cm² avec un milieu enrichi (objets partagés par les animaux, frisottis, épaisseur de litière importante, copeaux doux) et aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. Afin de réduire le stress des animaux, une période d’acclimatation de deux semaines sera observée à la suite de leur réception. La litière sera changée de moitié toutes les semaines pour réduire le stress des animaux. Pendant cette période les animaux seront uniquement manipulés afin de les habituer au contact de l’utilisateur et réduire leur stress, nous les familiariserons à boire à la pipette afin de pouvoir leur administrer le traitement anti MCT4 de cette manière plutôt que de réaliser un gavage afin de limiter leur stress. Lors de l’injection des cellules tumorales, les cellules seront stériles, vérifiées sans champignons et sans bactéries, les souris seront anesthésiées et la température des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de coussins chauffants. L’état de bien-être des souris sera évalué quotidiennement en évaluant la qualité de la fourrure de l’animal, un isolement ou manque de dynamisme. En cas de douleur les animaux seront traités avec de la rimadyl (carprophène) associée à la buprénorphine (à la posologie adaptée et par voie sous cutanée). Les soins et traitements des animaux seront réalisés par le personnel compétent de l’animalerie définis avec le vétérinaire désigné. L’identification d’un point limite (perte de poids, respiration pénible, réticence à se déplacer, volume tumorale supérieur à 10% de du poids de l’animal) entraînera la sortie de l’animal de l’étude et sa mise à mort. Lors des injections de traitements anti-PDL1, nous privilégierons l’injection intra veineuse (différents sites d’injection caudale, jugulaire et saphène) aux injections intra péritonéales afin de limiter l’inflammation du péritoine. Tous les organes des animaux seront prélevés à la fin de la procédure.
Choix des espèces
Les souris C57/Bl6 et C57/Bl6 nude sont couramment utilisées en recherche cancérologique. Les souris nude présentent une déficience en lymphocytes T. Le phénotype dommageable est dû à la mutation génétique qui prévient le rejet des cellules tumorales humaines par la souris. Dans le contexte de notre étude, les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 6 semaines. A cet âge, l’ensemble des fonctions sont matures.