Recherche appliquée
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- Diagnostic des maladies
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- Troubles urogénitaux
Etude biochimique, histologique et pharmacologique chez la souris modélisant des malformations corticales génétiques épileptogènes chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
32 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des femelles gestantes subissent une chirurgie pour modifier génétiquement le cerveau des embryons par électroporation in utero, et leur descendance développe des crises d'épilepsie, provoquées si besoin par injection d'un agent épileptogène, avec des traitements par injections, gavage ou injection intracérébrale. Le porteur décrit des crises pouvant être quotidiennes, des œdèmes cérébraux, de l'agressivité et des avortements, et prévoit la mise à mort dès l'atteinte de points limites ou dans les deux heures suivant l'injection épileptogène. Il affirme que la culture cellulaire ne reproduit ni les crises ni les interactions cellulaires et conclut au recours à des "organismes entiers".
Objectifs
L'épilepsie touche plus de 50 millions de personnes dans le monde. Les épilepsies focales sont parmi les plus fréquentes et sévères des épilepsies, et sont souvent liées à une malformation cérébrale, en particulier ce que l’on appelle les dysplasies focales corticales. Les dysplasies focales corticales sont caractérisées par une désorganisation locale du cortex cérébral et la présence de cellules neurales anormales et de taille anormalement grande. Ces anomalies du développement sont responsables d’épilepsies qui résistent aux traitements médicamenteux sont associées à des déficits cognitifs et des pathologies psychiatriques précoces. Les dysplasies focales corticales sont induites par plusieurs gènes d’une voie de signalisation particulière appelée mTOR (mechanistic target of rapamycin, cible de la rapamycine chez les mammifères). Ces anomalies du développement cérébral peuvent être dues à des mutations génétiques présentes uniquement dans une population neuronale restreinte et apparaissant précocement au cours du développement du cerveau. Il est nécessaire de mieux comprendre l’origine des crises épileptiques suite à ces mutations afin de pouvoir développer de nouveaux médicaments antiépileptiques, et potentiellement proposer une médecine personnalisée. Afin de modéliser ces épilepsies focales d’origine génétique, nous proposons d’induire ces mutations dans le cerveau au cours du développement en travaillant directement sur les embryons au niveau de l’utérus de souris en gestation. Cette technique dite « d’électroporation » permet d’induire l’expression de gènes mutés ou d’en inhiber d’autres dans une sous-population de neurones, mimant ainsi les mutations (c’est-à-dire présentes uniquement dans la partie du cerveau affectée par cette épilepsie). Ce travail de recherche permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des crises épileptiques en fonction des différents gènes mutés. Nous évaluerons, tout d’abord, ces nouveaux modèles génétiques de malformations cérébrales à l’origine des crises d’épilepsie d’un point de vue histologique et biochimique. Puis nous testerons différents traitements antiépileptiques innovants sur nos modèles par voie injectable, orale ou intracérébrale. Enfin, nous testerons l’effet de ces traitements sur des crises provoquées par l’injection d’un agent qui génère des crises d’épilepsie dans nos différents modèles si les crises n’arrivent pas spontanément.
Bénéfices attendus
Le projet de recherche permettra de créer de nouveaux modèles de malformation corticale épileptogène induite par des mutations génétiques. Ces pathologies sont rares, graves et orphelines. En effet, la majorité des patients atteints par ces mutations présente une épilepsie pharmaco-résistante qui nécessite donc le recours à une ou plusieurs chirurgies couteuses et invasives (tant sur le plan physique que psychologique) pour contrôler les crises. Il est donc urgent d’utiliser des modèles reproduisant la physiopathologie de ces maladies afin de : - tester des thérapies innovantes afin de permettre à court terme de diminuer voir d’abolir le recours à ces chirurgies mais également de proposer une thérapie aux patients présentant une forme non opérable. - découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter à la fois l’épilepsie mais également les comorbidités associées à ces pathologies (autisme, dépression, troubles de l’hyperactivité, …) - mieux comprendre le lien entre voie mTOR (mechanistic target of rapamycin, cible de la rapamycine chez les mammifères) et épilepsie afin d’ouvrir de nouvelles perspectives de recherches et de thérapies pouvant potentiellement être utilisées pour des patients atteints de différentes mutations.
Procédures
Chirurgie sous anesthésie et analgésie sur les mères gestantes afin d’induire des mutations dans le cerveau des embryons à travers la paroi utérine (électroporation in utero), afin de générer les groupes d’animaux génétiquement modifiés pour la suite de notre étude. Durée maximale 1h, une seule fois. Pour les souris électroporées (différents lots) : -Euthanasie sans traitement préalable (souris n’ayant pas de modification génétique ou simple observation clinique). -Traitement intrapéritonéal : injection intrapéritonéale de molécules thérapeutiques (1 injection de 30s tous les 2 jours pendant 2 semaines). -Traitement par voie orale (Gavage) : Administration par gavage de molécules thérapeutiques (1 gavage de 1 min tous les 2-3 jours pendant 3 semaines maximum). -Traitement par injection intracérébrale : injection unique sous anesthésie générale en analgésié, durée maximale 1h10. -Traitement et Pentylènetétrazole : injection intrapéritonéale de molécules thérapeutiques (1 injection de 30s tous les 2 jours pendant 2 semaines) OU Gavage de molécules thérapeutiques (1 gavage de 1 min tous les 2-3 jours pendant 3 semaines maximum) OU Injection intracérébrale (1 injection unique sous anesthésie et analgésie) PUIS Injection intrapéritonéale d’un agent épileptogène (1 injection de 30s).
Impact sur les animaux
1) Pour l’opération permettant d’induire des mutations dans le cerveau d’embryons d’une femelle gestante (électroporation in utero, procédure 1) : Isolement de la femelle préopératoire et jusqu’à la naissance des embryons. Risques de déficience respiratoire, cardiovasculaires et hypothermiques durant l’anesthésie. Possible douleur au niveau du site d’ouverture et utérin, inconfort général durant les heures suivant la chirurgie, perte d’embryon(s), mise-bas prématurée. Possible risque d’infection au niveau du site d’ouverture. 2) Pour les souris génétiquement modifiées issues de la procédure 1 : Le développement prédit de crise d’épilepsies avec potentiellement plusieurs crises par jour. Possible agressivité des souris envers leurs congénères pouvant entrainer stress et blessures. 3) Injection chronique intra-péritonéales : stress durant la manipulation des souris, perte de poids et possible douleur (œdème, hématome) dus à l’insertion répétée de l’aiguille sur le site d’injection. 4) Gavage oral : stress durant la manipulation des souris, perte de poids et possible douleur au niveau de l’œsophage due à l’insertion répétée de la sonde dans le système digestif. 5) Injection intracérébrale : Injection intracérébrale sous anesthésie. Risques de déficience respiratoire, cardiovasculaires et hypothermiques durant l’anesthésie. Possible douleur au niveau du site d’ouverture et inconfort général durant les heures suivant l’injection. Possible risque d’infection au niveau du site d’ouverture. Œdème cérébral dû à l’injection. 6) Injection de Pentylènetétrazole : stress durant la manipulation des souris, perte de poids, crises épileptiques et possible douleur sur le site d’injection.
Devenir
Femelles gestantes opérées afin d’induire des mutations cérébrales dans le cerveau des embryons : les femelles gestantes seront euthanasiées après le sevrage des souriceaux. Du fait de la chirurgie, elles ne peuvent être réutilisées pour des accouplements. Procédures exploratoire, traitements et injection de Pentylènetétrazole (agent inducteur de crises épileptiques) : les souris seront euthanasiées dès qu’un point limite sera atteint, ou dans les 2 heures suivant l’injection de Pentylènetétrazole ou en fin de procédure (âge maximum 1an). Nos analyses nécessitant le prélèvement du tissu cérébral, aucune souris ne peut être gardée en vie en fin de procédure.
Remplacement
Les résultats attendus de cette étude ne peuvent être obtenus par modélisation informatique car celle-ci nécessite des données expérimentales encore manquantes. De même, la culture cellulaire ne reproduit pas les interactions cellulaires, les voies de migration cellulaires, ni les crises d’épilepsie. La modélisation in vitro n’est donc pas indiquée dans notre type d’étude. De plus, nous ne pouvons éthiquement pas reproduire les modifications cérébrales nécessaires à notre étude chez des patients sains, ni tester nos traitements expérimentaux sur les patients atteints de ces troubles sans études précliniques préalables. Enfin l’utilisation d’organismes entiers, à la physiologie proche de l’humain et communément utilisé en étude préclinique nous permettra de tenir compte de la pharmacodynamie et de la pharmacocinétique de nos potentiels traitements. Nous pourrons ainsi rapporter les éventuels effets indésirables, la durée de traitement, la dose efficace et les effets attendus de nos traitements lors de nos discussions avec les cliniciens en charge des patients atteints de ces troubles avec lesquels nous travaillons étroitement.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences en testant préalablement la faisabilité des expériences, en combinant différents protocoles au cours d’une même expérience et en réalisant une exploitation maximale des données à l’aide de l’utilisation appropriée de tests statistiques. Le calcul du nombre d’animaux est fait suivant les recommandations internationales par calcul de puissance statistique afin d’obtenir des résultats fiables. Il nous faut donc au moins 10 souris par groupe traitement. Ce calcul de puissance sera ajusté selon les premiers résultats, car nous ne pouvons pas encore prédire les différences de moyennes entre nos groupes (soit 5760 souris). La première procédure comprend un groupe exploratoire (288 souris), pour lequel, nous avons prévu 3 souris par groupe afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, tout en obtenant des résultats fiables. Nous ne sélectionnerons que les souriceaux positifs aux mutations génétiques induites au stade embryonnaire. Dans la mesure du possible, nous utiliserons les souris contrôles (non mutées) comme contrôles de plusieurs modifications génétiques. Cependant, ne connaissant pas la physiopathologie de ces mutations induites, nous ne pouvons pas d’avance connaitre l'âge des souris utilisées dans les groupes de traitement. Nous ne pouvons donc pas être certains de la possibilité de ce double-emploi des contrôles. Nos calculs du nombre de souris se basent donc sur le scénario utilisant le nombre maximal de souris où aucun des pathologies induites par les 4 mutations prévues ne présenterait un décours concomitant à un autre et où chaque groupe aurait donc son propre groupe contrôle. Enfin, nous avons prévu un groupe exploratoire, nous permettant d’identifier le stade de traitement le plus adéquat afin de limiter les groupes d’études des différents traitements. Enfin nous commanderons nos souris gestantes à un stade permettant de vérifier l’état de gestation. Notre période d’acclimatation sera donc réduite (2 à 7 jours) mais la livraison à un stade de gestation plus précoce permettant le temps d’acclimatation recommandé engendrerait la livraison de femelles potentiellement non gestantes, inutilisables, à euthanasier. La souche que nous utilisons étant peu sensible au stress, nous préférons donc utiliser une période d’acclimatation courte afin de réduire le nombre d’animaux. Dans ces conditions, le taux de survie des mères à ce type de chirurgie est très proche de 100 pourcent.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des cages ventilées (maximum 6 par cage) avec accès à l’eau et à des croquettes à volonté, enrichies d’un nid de coton, et d’une maison en cas d’inconfort (animal isolé) ou pour les souris gestantes. Les souris injectées avec un convulsivant seront isolées pendant une période de 10 à 120min (selon durée des symptômes) dans une cage de grande dimension afin de limiter les risques de commotions ou de blessures lors des convulsions, après 30min de familiarisation à la cage. Le phénotype de nos lignées est encore inconnu. Les premiers lots de souris seront donc observés 3 fois par semaine du stade P10 (afin de limiter les risques de rejet de la mère par de trop nombreuses manipulation du nid) et jusqu’à 3 mois, puis quotidiennement après apparition de la première crise épileptique du lot. Les lots suivants seront surveillés quotidiennement au stade d’apparition des crises. Si une souris fait une crise de plus de 15 minutes ou présente une posture hypertonique post-crise, elle sera euthanasiée. De plus, lors des injections avec le convulsivant, si une souris fait plus de 15 crises, elle sera euthanasiée. Les souris feront donc l'objet d'une surveillance étroite par le personnel de soin animalier et de l’équipe de recherche. Le poids, l'apparence physique et des changements de comportement seront les facteurs pris en compte. En cas d’apparition d’un comportement d’agressivité envers les congénères, la cage sera enrichie (maisonnette, boule de papier, séparateurs) et ne sera changée que partiellement afin de conserver la hiérarchie de dominance au sein du groupe. En cas d’inefficacité de ces mesures, la souris agressive sera isolée dans une cage enrichie afin d’éviter le risque de blessure. Avant le début de la chirurgie, nous administrons une dose d’analgésique. En cas de souffrance post-chirurgicale, la souris recevra une nouvelle dose toutes les 24h, jusqu’à la mise-bas des souriceaux. Après cette mise-bas, nous surveillerons les signes de douleur de la femelle, et si les souriceaux sont bien nourris par observation de la présence de lait dans l’estomac à travers la peau. Dans les groupes de traitement et injection de convulsivant : les mouvements, le poids, le grimace-score, la respiration et les réflexes tels que le retrait de la patte seront observés attentivement jusqu’à euthanasie de fin de procédure (maximum 2h). S'ils révèlent une dégradation ou une souffrance de l'animal, celui-ci sera euthanasié plus précocement.
Choix des espèces
Notre choix a été motivé par des raisons scientifiques : (1) Nos études portent sur des modèles génétiques d'épilepsie nécessitant des modifications génétiques ciblées, possibles chez la souris (2) Les souches des souris que nous utiliserons ont été majoritairement utilisées pour modéliser les crises d’épilepsies. Elles ont donc été explorées de manière exhaustive de la molécule au comportement, permettant une solide base scientifique sur laquelle baser nos travaux. (3) Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. Les femelles gestantes seront utilisées à l’âge adulte (plus de 2 mois). Leurs embryons seront génétiquement modifiés au cours de la gestation. L’efficacité de notre méthode de modification génétique des souris utilisées par la suite est vérifiée visuellement par la présence ou non de tache fluorescente à l’aide d’une lampe. Pour le groupe exploratoire, les souris seront euthanasiées à 4 stades différents avant et après sevrage : -un stade postnatal précoce afin de caractériser le développement cérébral de nos modèles -un stade précoce à l’apparition des crises épileptiques -un stade tardif après l’apparition des crises -un stade supplémentaire selon les symptômes observés chez les premiers lots Pour les traitements, les souris seront utilisées après sevrage et au stade déterminé par le groupe exploratoire, jusqu’à l’âge d’un an maximum.
Effet neuro protecteur et neuro régénérateur de nouvelles biomolécules dans un modèle souris de glaucome
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
2670 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un pincement du nerf optique leur provoque une cécité d'un œil, suivi d'injections de biomolécules dans l'œil ou par voie intraveineuse, le porteur indiquant que le pincement et les injections oculaires causent une douleur. La mise à mort est justifiée par la récupération des rétines et des nerfs optiques, aucune souris ne pouvant selon le porteur être réutilisée, replacée ou adoptée. Il présente l'effet neuroprotecteur et régénérateur de ces molécules comme une piste pour éviter la cécité dans le glaucome, au conditionnel.
Objectifs
Le glaucome est une des principales causes de déficit visuel. Les neurones présents dans la rétine (RGC, Cellules Ganglionnaires Rétiniennes) transmettent les informations captées par les photorécepteurs sous forme de signal électrique par via leur fibre nerveuse (axone) qui parcourt le nerf optique (NO) jusqu’au cerveau. Dans le glaucome, ces axones et les RGC dégénèrent, provoquant une cécité irréversible. Un modèle robuste de cette pathologie est obtenu chez la souris par un pincement maitrisé du NO provoquant la dégénérescence des axones qui le composent. Nous souhaitons tester dans ce modèle les propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices de biomolécules « NV » Sur des cultures de neurones, les NV favorisent la survie des cellules, l’élongation des prolongements cellulaires qui permettent les connections entre neurones et leur repousse après lésion. Ces résultats suggèrent que les NV pourraient être utilisés pour protéger les RGC de la mort cellulaire (effet neuroprotecteur) dans le glaucome et favoriser la repousse de leurs axones dans le NO (effet neurorégénérateur). Nos études ont montré que l’injection intraoculaire de vecteurs AAV2 (virus adéno-associé 2) codant pour le peptide NV de première génération (AAV2-NV1) favorise la survie des RGC et la repousse de leur axone, efficacité renforcée en présence de CNTF (ciliary-derived neurotrophic factor), un facteur de croissance neuroprotecteur et neurorégénérateur (effet synergique d’AAV2-NV1 et AAV2-CNTF). De plus, ces travaux ont permis de montrer l’absence de toxicité ou d’effets secondaires lors de l’injection intraoculaire d’AAV2-NV1. Nous avons développé de nouvelles générations de NV, modifiées pour augmenter leur affinité pour leur cible et donc leur efficacité, et conjuguées à des CPM (Cell Penetrating Molecules) tels que les VHH (molécules dérivées de chaines lourdes d’immunoglobulines de lama capables de franchir les membranes cellulaires) ou des peptides étiquettes (ciblage préférentiel des neurones en fixant le récepteur de l’acétylcholine) afin d’augmenter leur stabilité et leur adressage aux neurones. Nous souhaitons tester ces nouvelles générations de NV dans le modèle souris de glaucome afin d’identifier la molécule ayant l’efficacité maximale avec une toxicité minimale pour ensuite développer ce candidat comme médicament pour le glaucome en l’amenant à l’essai clinique.
Bénéfices attendus
Les biomolécules NV développées dans notre laboratoire possèdent des propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices susceptibles d’apporter une réponse à de nombreuses pathologies dégénératives. Dans le glaucome, l’augmentation de la pression intraoculaire cause une dégénérescence des axones dans le nerf optique, une mort des cellules ganglionnaires rétiniennes et à terme la cécité. Dans le cadre de ce projet, l’administration de ces molécules a pour but d’induire la régénération des fibres axonales dans le nerf optique après lésion, ce qui aura pour bénéfice de reconnecter l’œil au cerveau et donc d’éviter la cécité causée par cette lésion. Leur effet neuroprotecteur devrait quant à lui permettre la survie des cellules ganglionnaires rétiniennes dans la rétine, dont les axones forment le nerf optique.
Procédures
Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur de nos biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes) et est réalisé sous anesthésie profonde et analgésie. L’injection intravitréenne de nos biomolécules NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes). L’injection intraveineuse de NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes).
Impact sur les animaux
Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur des biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Il est attendu que le pincement du nerf optique et l’injection des biomolécules NV dans l’œil causent une douleur chez la souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, toutes les procédures requièrent la récupération de tissus (rétines, nerfs optiques) destinés à être analysés en vue de démontrer l’effet thérapeutique de notre molécule NV.
Remplacement
Les biomolécules NV utilisées dans ce projet sont préalablement validées in vitro pour leur efficacité et leur absence de toxicité sur des cultures de cellules neuronales, des cellules épithéliales rétiniennes et des explants de rétines. Les cellules neuronales et épithéliales rétiniennes ne nécessitent pas l’utilisation d’animaux (lignées cellulaires). Les explants de rétine, réalisés à partir de rétines de souris, permettent de tester plusieurs constructions et concentrations de NV avec un nombre réduit de souris, ce qui permet par la suite de ne tester in vivo que les molécules NV efficaces in vitro. Les explants de rétine constituent un modèle in vitro très proche du modèle in vivo (même espèce, même tissu) et facilite l’extrapolation.
Réduction
Le nombre d’animaux requis pour établir l’efficacité des biomolécules dans ce modèle a été calculé par un test de puissance statistique à partir de nos résultats antérieurs. La mise à mort des animaux pour la récupération des yeux et des nerfs optiques étant nécessaire au projet, la réutilisation des animaux n’est pas envisageable. Les deux yeux des souris seront valorisés quand cela sera possible afin de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les techniques de chirurgie de l’œil nécessaires à la réalisation du projet ont été acquises auprès d’un laboratoire de référence. La maîtrise des bons gestes chirurgicaux limitera les risques d’altération de la lentille lors des injections intraoculaires et augmentera la probabilité de créer des lésions du nerf optique bien calibrées et donc exploitables. Les animaux recevront des antalgiques avant et après lésion ainsi qu’une anesthésie locale juste avant le pincement du nerf optique. Les gestes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane. La surveillance des animaux sera quotidienne durant les 3 jours suivant les pincements/injections, puis bihebdomadaire. Les animaux seront mis à mort en cas de dépassement des points limites fixés pour les différentes procédures. Après le réveil des animaux, les animaux sont remis dans leur cage et gardés pour une durée variable dépendante de la procédure (entre 1 heure et 44 jours pour la procédure la plus longue).
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris pour sa taille et son anatomie, particulièrement adaptées à la chirurgie ophtalmique. De plus, certains de nos tests seront réalisés avec des souris génétiquement modifiées existantes. Souris adultes âgées de 8 semaines. Les expériences sont réalisées à un stade où les rétines sont matures et dans lesquelles les neurones ont une capacité régénératrice minime afin de reproduire des conditions semblables à celles de la pathologie chez l’homme.
Ischémie reperfusion rénale sur souris uninephrectomisées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une microchirurgie de 45 minutes, avec ablation d'un rein puis clampage de l'artère et de la veine du rein restant pendant 30 minutes pour provoquer une ischémie, suivie de prélèvements sanguins et de traitements quotidiens pendant sept jours. Le porteur indique que la chirurgie peut entraîner des douleurs, une perte de poids et la mort sous anesthésie chez les animaux âgés, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Il affirme que la complexité physiologique ne peut être reproduite in vitro et présente ce modèle comme un moyen de réduire l'échec des candidats médicaments en clinique.
Objectifs
10% de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique (CKD). Cette condition pathologique caractérisée par de nombreuses atteintes tissulaires au niveau rénale conduisent à la perte de fonction de l’organe et des décès prématurés due à des problèmes cardiovasculaires. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie sont encore mal identifiés. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales chroniques. Malgré une intensification des efforts de recherche dans le développement de nouveaux médicaments, les industriels pharmaceutiques font face à un taux très important d’échec dans les phases de tests cliniques sur l’Homme. Une raison avancée à ces taux d’échec clinique élevés est une faible pertinence des modèles expérimentaux utilisés lors des phases précliniques. En effet, les modèles utilisés couramment ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un nouveau modèle expérimental de souris afin d'évaluer l'efficacité de médicaments ciblant les lésions rénales aïgues. Le modèle de souris développé dans ce projet permettra d'améliorer la prédiction d'efficacité de nouveaux candidats médicaments afin de limiter la progression des maladies rénales chez l'Homme.
Bénéfices attendus
La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi les tests précliniques d’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques.
Procédures
Chaque animal subira : - 1 seule procédure de microchirurgie d'une durée totale d'environ 45 min: Laparotomie, ablation du rein droit, puis clampage de l'artère et de la veine rénale du rein gauche pendant 30 minutes (ischémie). Déclampage puis suture de l'abdomen (muscle et peau). - prélèvements sanguin quotidien (sur 7 jours) de 20 à 100 ul de sang par légère incision au niveau de la queue ou via une ponction de la veine faciale (durèe environ 1 min par animal). - traitements quotidien par les candidats médicaments pendant 7 jours consécutifs (durèe inférieure à 1 min par animal).
Impact sur les animaux
Les animaux qui interviendront dans ce projet subiront des effets indésirables liés à la procédure de microchirurgie. Ces effets indésirables ont été classés par ordre décroissant de gravité et de probabilité : - Lésions du rein ayant subit la procédure d’ischémie reperfusion. La conséquence est une réduction significative de la fonction de ce rein après quelques semaines. - Douleurs liées à la microchirurgie, notamment à l’incision cutanée et musculaire pour l’accès au rein à clamper - Anesthésie profonde pouvant entraîner la mort chez les animaux âgés - Perte de poids après chirurgie - Lésions vasculaires au niveau du clamp pouvant entraîner une mauvaise reperfusion de l’organe
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort et disséqués afin de collecter le rein pour des analyses histologiques.
Remplacement
En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rongeurs), nous travaillons au développement de modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques aux candidats médicaments ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Les procédures chirurgicales et expérimentales seront basées sur les protocoles détaillés dans la littérature. Sur la phase de test de produits pharmaceutiques, un nombre de 13 souris par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène des interventions chirurgicale. Celui-ci est estimé à 30% de perte ou absence de réponse. De ce fait, avec 13 souris par groupe au départ, nous pourrions envisager un nombre de 9 souris par groupe en fin de procédure de traitement. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes traités par le solvant seul. Les données enregistrées seront analysées par des tests statistiques appropriés : - Pour des données uniques en fin d'expérimentation, il seront analysés par ANOVA 1-way ou par le test de Kruskal-Wallis (en fonction de l'analyse des variances). - Pour des données enregistrées en longitudinales, celles-ci seront analysées par ANOVA 2-way + Bonferonni’s post-test.
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l'inconfort aux animaux, un manipulateur expérimenté en microchirurgie sur rongeurs sera responsable de la procédure chirurgicale. De plus, les procédures de microchirurgies seront réalisées sous anesthésie générale (Kétamine 100mg/kg +Xylasine 10mg/kg) en IP. L’animal recevra aussi une dose d’analgésique Buprénorphine (1mg/Kg) pour réduire les douleurs au réveil. Un control quotidien avant, pendant et jusqu'au terme de l'experimentation sera effectué par les expérimentateurs afin de garantir la propreté des cages, des quantités suffisantes d'eau et de nourriture ainsi qu'un enrichissement adéquat dans les cages d'hébergement (igloo polycarbonates autoclavables et réutilisables + carton) . Pendant les périodes de traitement par les candidats médicaments, les expérimentateurs conduiront un suivi quotidien du poids corporel, de la comsommation d'eau et de nourriture ainsi que de l'état général des animaux. Ces observations seront enregistrées et analysées. Les animaux qui auront perdu plus de 20% de leur poids initial ou dont l'état général est dégradé (isolement, baisse d'activité, entretien de la fourrure, perte de poils, respiration anormale) sur 2 jours consécutifs seront retirés de l'expérimentation et mis à mort. A noter que les candidats médicaments qui seront testés pour leur efficacité auront déjà été évalués pour leur toxicité au préalable, et que le risque d'effets secondaires liés au traitement est minime. De plus, l'étude sera conduite par des personnels qualifiés et formés au respect des conditions du bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée par la communauté scientifique dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion. L’avantage de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure d’uninephrectomie + ischémie-reperfusion et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. De plus, grâce à leur système immunitaire spécifique, les souris ne présentent pas de risque d’infection post-opératoire. La procédure sera réalisée sur des animaux disponibles auprès d’élevages agrées (Charles River). Les animaux utilisés auront atteint l'age adulte, c'est à dire plus de 8 semaines
Mise en place d’un modèle de stress infantile chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
D'anciens reproducteurs mâles, retenus pour leur agressivité, infligent à des souris mères des défaites sociales de 10 minutes répétées sur six jours, afin d'exposer indirectement leurs souriceaux à l'agression physique de leur mère. 532 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, d'autres mères étant aspergées d'urine de mâle ou séparées de leurs petits 10 minutes par jour pendant six jours. Le porteur indique que la défaite sociale induira une "douleur physique" chez les mères et que la "douleur psychique" est "la base du modèle", puis exclut toute analgésie qui pourrait interférer avec l'étude. 160 souriceaux passent ensuite, à l'adolescence et à l'âge adulte, des tests de comportement social, d'anxiété, d'anhédonie et de résignation, sans que ces tests soient nommés. 270 souris restent en vie, 200 souriceaux et 40 femelles réaffectés à l'élevage si le comportement maternel n'est pas atteint, et 30 mâles agressifs gardés pour de futures défaites sociales, les 262 autres étant mises à mort.
Objectifs
Les expériences de vie précoce pendant l’enfance, qu’elles soient positives ou négatives, peuvent laisser des traces indélibiles sur le cerveau et le développement psychologique. En effet l’exposition précoce à des traumatismes psychosociaux, incluant entre autres la maltraitance infantile, est indiscutablement l’un des plus importants facteurs prédicteurs de pathologies psychiatriques à l’adolescence et à l’âge adulte, notamment de la dépression et du suicide. Différents modèles animaux chez la souris ont été mis en place pour étudier les conséquences du stress précoce sur le développement cérébral et psychologique, mais ces modèles se concentrent principalement sur des périodes tardives du développement (après le sevrage), et nos connaissances des effets à long terme sur le cerveau du stress infantile sont extremement limitées. Nos connaissances des mécanismes cellulaires participant à la formation et à la persistance des mémoires traumatiques précoces sont aussi très lacunaires. Afin d’étudier ces mécanismes, nous nous proposons ici de mettre en place et de tester la validité d’une procédure de stress indirect (l'expositition indirecte de souriceaux à l'agression physique de leur mère) basée sur l’experience sensorielle et la contagion émotionnelle, pouvant mimer chez la souris un traumatisme psychologique infantile avant le sevrage des animaux. Nous testerons finalement comment cette expérience peut precipiter la survenue de comportements de type anxieux et dépressifs à l’adolescence et l’age adulte.
Bénéfices attendus
Il n’existe actuellement aucun modèle animal permettant d’étudier les conséquences du trauma infantile sur le cerveau. Pour autant, l’adversité précoce est sans conteste le premier facteur de vulnérabilité pour les maladies psychiatriques telles que la dépression, les troubles anxieux, le syndrome de stress-posttraumatique, et pour le suicide. Outre la souffrance morale induite par ces pathologies, elles constituent un enjeu majeur de sante publique compte tenu du fardeau socio-économique engendré. Ces pathologies sont difficiles à prendre en charge, avec des traitements qui sont actuellement peu satisfaisants en termes de cout et d’efficacité. La mise en place d’un modèle pertinent de trauma psychosocial infantile permettrait dans ce cadre de mieux comprendre, d’un point de vue fondamental, comment le stress précoce affecte le cerveau et son développement. Cela permettrait également de disposer d’un outil pertinent pour étudier les mécanismes cellulaires mis en jeu dans la formation et la persistance des mémoires traumatiques précoces, et comment elles influent notre comportement. Si l’objectif à court terme de cette recherche fondamentale n’est pas la mise au point d’un outil thérapeutique visant à améliorer la prise en charge de populations cliniques victimes de trauma psychosocial pendant l’enfance, il est certain qu’une étape indispensable vers cet objectif est la compréhension des mécanismes neurobiologiques mis en jeu.
Procédures
- 8 mères ne subiront aucune manipulation (groupe contrôle) - 16 mères subiront une aspersion d'urine de mâle. - 16 mères subiront une séparation de leurs petits de 10 min pendant 6 jours. - 16 mères seront exposées à une défaite sociale durant 10 min et répétées sur 6 jours - 16 mères seront aspergées d'urine de mâle et isolées 10 min de leur petit, et cela, à un rythme d'une fois par jour sur 6 jours. - 60 mâles seront utilisés pour sélectionner des individus agressifs. - 40 souris sentinelles seront utilisées pour sélectionner des individus agressifs. - 360 petits seront pesés soit entre 3 et 8 jours postnatal soit entre 14 et 21 jours apres la naissance. - 160 petits seront utilisés dans des tests comportementaux, deux fois par test (une fois pendant l'adolescence, l'autre fois à l'age adulte). Ces tests sont effectués au cours de sessions uniques, allant de 3 à 10 minutes, et visent à mesurer les comportements sociaux, les conflits motivationnels et l'anxieté, l'anhédonie et la résignation des animaux.
Impact sur les animaux
Le modèle de défaite sociale (DS) induira de la douleur physique chez les mères sujettes directement au modèle. Il induira également de la douleur psychique, un état de stress aigu pendant la procédure mais aussi durable, en induisant possiblement un phénotype anxiodépressif chez les souris exposées au modèle. Cette douleur psychique est la base du modèle, l’objectif étant d’étudier comment ces changements comportementaux sont transmis aux souriceaux des mères exposées ou modifient leur comportement. L’exposition indirecte à la défaite sociale des souriceaux n’aura aucune incidence d’un point de vue physique, puisqu’elle n’est effectuée que sur les mères. Il est possible cependant que dans l’éventualité où la DS perturberait le comportement maternel, cela induise une détresse physiologique et sensorielle des souriceaux en diminuant la qualité des soins fondamentaux promulgués par leur mère. C’est pour cette raison qu'une attention particulière sera donnée au monitoring des souriceaux et du comportement maternel tout au long du protocole. Par ailleurs si notre hypothèse est validée, il est possible que le modèle induise chez les souriceaux une détresse psychique liée au stress, ce qui est notre objectif, afin d’étudier les substrats neurobiologiques et conséquences comportementales de ce stress. Etant donné que les tests de comportement sont basés sur des mesures quantitatives ou qualitatives d’exploration dans des dispositifs nouveaux et donc possiblement anxiogènes, il est possible que les tests utilisés puissent induire un stress léger chez les animaux. Ces tests sont cependant de courtes durées (10 minutes maximum), et ne sont pas basés sur des situations hautement aversives. Ces tests ne sont d’ailleurs pas connus pour induire de changements physiologiques ou comportementaux durables chez les animaux.
Devenir
Pour la validation du modèle, tous les animaux experimentaux (200 souriceaux et 40 femelles) seront réaffectés à notre élevage de souris (à condition que nos résultats ne montrent aucune atteinte au comportement maternel), afin de permettre la génération de nouveaux souriceaux. Les souris agressives utilisees pour la defaite sociale (nous estimons à la moitié le nombre de souris qui rempliront les critères d'agressivité, soient 30 souris) seront par ailleurs maintenues en vie pour de futures experiences de défaite sociale. Les souris sentinelles servant à selectionner les souris agressives, les souris non agressives, et toutes les souris utilisées pour etudier les effets du modèle sur le comportement seront mises à mort à la fin des expériences.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. La souris est par ailleurs un choix pertinent de par les homologies structurelles qui existent avec l’homme dans l’organisation des zones cérébrales impliquées dans la réponse au stress et les émotions.
Réduction
Nous souhaitons ici pouvoir évaluer une taille d’effet forte et être confiants dans les effets que nous observons, garantissant ainsi la fiabilité de nos conclusions et la reproductibilité future du modèle. Nos effectifs intègrent donc le fait de pouvoir comparer statistiquement les groupes expérimentaux pour les différentes variables comportementales (témoins, DS susceptibles : c’est-à-dire qui ont un comportement altéré à la suite du modèle de DS, DS résilients : qui ne présentent pas de modification comportementale à la suite du modèle). Basé sur la literature des effets comportementaux du stress et des changements neurobiologiques qui y sont associés, un dimorphisme sexuel est suspecté. C’est pourquoi nous utiliserons à la fois des males et des femelles en considerant ici le sexe comme une variable d’analyse. Seuls les mâles agressifs sélectionnés pourront être réutilisés pour la suite des expériences. Les effets du modèle sur le comportement des souriceaux sera testé à la fois à 22 jours et à l’âge adulte (63 jours) sur les mêmes souris, plutôt que d’utiliser des cohortes différentes pour ces différents temps de mesure, diminuant ainsi le nombre d’animaux utilisés. En l’absence d’effet délétère sur le comportement maternel et la survie des souriceaux, les animaux utilisés pour la validation du modèle pourront réintégrer l’élevage. Les tests statistiques seront adaptés à de petits effectifs expérimentaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimisées avec la mise à disposition de plusieurs supports pour la construction des nids (carton, coton, papier) et de bâtons de bois pour favoriser le comportement de ronger qui est important pour cette espèce (Raffinement hébergement). Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure seront réalisées avant les tests comportementaux. Les mères seront habituées à la manipulation au moins une semaine avant la naissance des petits. Les jeunes seront manipulés avec douceur et par des personnes habituées à manipuler des jeunes souriceaux. Nous incluons ici une procédure pilote en trois étapes pouvant chacune donner lieu à un arrêt total des expériences. La phase du projet étudiant l’impact de la DS indirecte sur les jeunes sera uniquement lancée si nous n’observons aucune surmortalité des petits par rapport aux mères contrôles au cours de cette procédure pilote (Raffinement des procédures). Des grilles d’évaluation de la douleur physique et de la qualité des soins maternels ont été créées pour définir précisément les points limites. Ce modèle visant à induire des atteintes psychiques, l’analgésie et le renforcement positif, ou tout traitement pouvant interférer avec l’étude ne peuvent être envisagés (réduction des douleurs physiques et psychiques associées aux procédures).
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris et la possibilité d’utiliser des animaux transgéniques permettant l’utilisation d’outils de neurosciences intégratives font de la souris le modèle animal le plus pertinent. Des souris OGM (phénotype non-dommageable) seront utilisées permettant d’induire l’expression permanente d’un rapporteur fluorescent dans les neurones activés pendant une fenêtre temporelle précise. Le choix de cette lignée est donc motivé par le fait que si notre modèle induit un phénotype robuste chez la descendance des souris exposées à la défaite sociale, elle nous permettra de visualiser les neurones activés pendant la défaite sociale, et d’étudier plus en avant la formation, la consolidation et le rappel de cette trace mnésique, ce qui est un objectif à long terme de ce projet. Les mâles agressifs seront d’anciens reproducteurs adultes, car c’est à cet âge que le comportement agressif est le plus marqué. Les souris femelles « sentinelles » seront âgées de 8 semaines (même âge que les mères qui seront utilisées pour la validation du modèle et la mesure de ses effets comportementaux). Mères expérimentales: jeunes adultes (8 semaines) ce qui est nécessaire pour la mise à la reproduction. Progéniture des mères expérimentales : de 3 jours après la naissance à l’âge adulte, car le modèle vise à induire un stress postnatal très précoce, pendant la période infantile. Les effets comportementaux du modèle seront testés après sevrage (à 21 jours) et à l’âge adulte (à 63 jours), puisque nous souhaitons connaitre les conséquences comportementales à long terme du modèle.
MISE EN PLACE D’UN MODELE VIVO D’ETUDE DE DEGRANULATION DES CELLULES MASTOCYTES AU NIVEAU LOCAL : PASSIVE CUTANEOUS ANAPHYLAXIS (PCA)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
2920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour prélèvement d'organes et une vingtaine réutilisées dans un autre projet. Chaque souris reçoit sous anesthésie deux injections intradermiques dans les oreilles, un anticorps IgE puis l'antigène, provoquant une inflammation de l'oreille, suivies d'administrations de candidats médicaments et de prélèvements sanguins répétés. Le porteur décrit ce modèle d'anaphylaxie cutanée passive comme un outil de "screening" de molécules pour les maladies auto-immunes et indique n'avoir pas relevé de signe de douleur au-delà de l'inflammation locale. Il affirme qu'un modèle substitutif in vitro n'a pas abouti et revendique le recours à l'"organisme" complet de la souris.
Objectifs
L’objectif de cette demande d’autorisation est de mettre en place un modèle d’anaphylaxie passive cutanée (PCA : Passive Cutaneous Anaphylaxis) permettant d’étudier rapidement l’impact de candidats médicament sur la dégranulation des cellules mastocytes in vivo, mécanisme impliqué dans certaines maladies auto immunes. Pour cela un anticorps au format IgE dirigé contre un antigène du non soi est injecté sous anesthésie générale dans le pavillon de l’oreille en intradermique pour sensibiliser la souris, puis quelques heures plus tard l’antigène (et un colorant physiologique et indolore pour la souris permettant de suivre la perméabilité vasculaire) est injecté provoquant dans les minutes qui suivent un gonflement de l’oreille et une coloration bleue de l’oreille (deux paramètres que nous suivrons) due à une activation des cellules mastocytes qui vont relarguer de nombreux granules comme l’histamine notamment. L’évaluation de candidats médicaments dans ce type de modèle vise à évaluer si le traitement par ces candidats permet de diminuer l’anaphylaxie (réaction allergique survenant rapidement après contact avec l’agent inducteur) observée au niveau cutané, mécanisme impliqué dans certaines maladies auto-immunes. Dans le processus de développement d’un candidat médicament, ce type d’étude se situe en aval des études in vitro et in silico. Il permet de sélectionner les candidats sur la base de leur capacité à diminuer l’activité du système immunitaire dans le domaine des maladies auto-immunes et également d’étudier la biodisponibilité de ces candidats (distribution de la molécule dans le corps durant les traitements). Les études incluses dans ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques (prélèvements sanguins pour notamment doser la présence des anticorps en cours d’étude et prélèvements d’organes terminaux pour valider l’expression des cibles thérapeutiques). Ces prélèvements sont adaptés en termes de volume/fréquence conformément aux standards éthiques et réalisés avec les méthodes les moins contraignantes possibles (ex : prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène)
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de pouvoir évaluer l’impact de nos candidats médicaments sur la dégranulation des mastocytes dans un modèle préclinique en amont de toute étude clinique.
Procédures
Selon la phase de développement du modèle et la procédure expérimentale associée mise en oeuvre : -chaque souris reçoit deux injections intradermiques (une dans chaque oreille) réalisées sous anesthésie générale (moins d'une minute) ; +/- 23h plus tard et selon la phase de la mise au point : administration du véhicule, composé de référence ou candidat médicament en per os, Intra veineuse, sous cutanée ou intra péritonéale sur souris vigile (moins de 30 secondes) ; suivi 1 heure plus tard d’une injection en intraveineuse en vigile (moins de 30 secondes) ; photographies de la coloration de l’oreille et mesures de l’épaisseur de l’oreille par pied à coulisse sur souris vigile (au maximum 4 mesures - moins d'une minute à chaque mesure) ; Durée totale des études de 48h heures maximum.Tout au long de l’étude chaque souris pourra se voir prélever un petit volume de sang par µsampling (prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène - moins de 30 secondes).
Impact sur les animaux
Inflammation locale de l’oreille de la souris durant de la durée de l’étude (1 heure à 24 heures) -Administration de composés candidats médicaments selon les voies classiques intra-péritonéale intra-veineuse sous-cutanée ou per os
Devenir
Les souris incluses dans la première phase de mise au point de ce modèle ne nécessitant pas de prélèvements de tissus pourront être réutilisées dans le cadre d’un autre projet. A l’issue de chaque procédure, les animaux seront sinon euthanasiés pour collecte des organes et tissus et analyses in vitro des échantillons (immohistochimie, etc).
Remplacement
La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. L’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est donc pas possible de modéliser complètement in vitro. Seules les molécules les plus abouties et les plus avancées dans leur développement sont administrées in vivo. Dans le cadre plus spécifique de ce projet, les tentatives de mise en place d’un modèle substitutif à ce modèle in vivo n’ont pour l’instant pas abouti et nous ne disposons pas d’un modèle de dégranulation in vitro suffisamment fiable et permettant le même niveau de prédictibilité que celui mené dans l’organisme de la souris avec toute sa complexité et l’intégralité des différents composants du système immunitaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera affiné au fur et à mesure de la mise en place de ce modèle. Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle très communément réalisé. Un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe pour les procédures 2 et 3 à l'aide d'un t test. De plus pour les premières phases chaque animal sera son propre contrôle, une seule des deux oreilles recevant l’agent inducteur et la seconde étant le contrôle.
Raffinement
L’administration de l’antigène par voie systémique va entrainer une inflammation locale du pavillon de l’oreille ayant reçu l’anticorps au forma IgE de cet antigène. Dans le cadre de cette DAP les doses utilisées du couple Anticorps/Antigène sont basées sur une analyse bibliographique et pour lesquels il n’a pas été relevé de souffrance ou de signes de douleur (si ce n’est l’inflammation locale de l’oreille qui est le paramètre étudié dans ce modèle) Des prélèvements de sang répétés en cinétique sont réalisés à différents temps afin de mesurer les paramètres biologiques d’intérêt et/ou le taux plasmatique du médicament. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique du « multisampling » à la veine latérale de la patte, méthode systématiquement privilégiée par rapport aux autres techniques usuelles car rapide, réalisable plusieurs fois sur un même individu, et respectant les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude Les administrations intradermiques dans chaque oreille sont réalisées sous anesthésie générale. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Ce suivi permettra d’identifier tout signe de souffrance et d’appliquer les mesures nécessaires au soulagement des souris en cas d’atteinte de points limites prédéfinis. Les souris seront hébergées en groupes sociaux et disposeront de matériel de nidification dans leur cage d’hébergement.
Choix des espèces
La souris présente certains traits caractéristiques similaires à l’Homme dans la biologie des réactions immuno-inflammatoires rendant ainsi pertinente son utilisation. De nombreux modèles ont montré un fort parallélisme dans les différents médiateurs mis en jeu lors des maladies auto-immunes (auto-anticorps, cellules du système immunitaire, cytokines, …). Par ailleurs l’utilisation de candidat médicament comme les anticorps nécessitent souvent l’utilisation de modèles murins dits humanisés, dans lesquels le gène cible a été remplacé par manipulation génétique par le gène cible humain sans incidence sur le phénotype. La protéine humaine exprimée pourra alors être détectée par le ou les anticorps candidats Idéalement, les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 8-9semaines, soit un poids corporel d’environ 18-20g. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments.
Évaluation de l’effet de constructions d’AAV exprimant un anticorps sur la fertilité des souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces femelles reçoivent une injection intramusculaire d'un vecteur AAV puis passent dix séances d'imagerie de bioluminescence et dix prises de sang sous anesthésie, pour mettre au point un médicament vétérinaire stérilisant présenté comme une alternative à la castration chirurgicale des chiens et chats. Le porteur inscrit le projet dans une démarche de "bien-être animal" et affirme que les souris remplacent chiens et chats aux étapes précoces, tout en prévoyant la mort des 750 souris utilisées. Il affirme qu'aucune méthode substitutive ne permet d'identifier une dose efficace et sûre.
Objectifs
Nous souhaitons réaliser des essais d’efficacité et d’innocuité chez la souris en vue de développer un médicament vétérinaire permettant une alternative à la castration chirurgicale des animaux de compagnie. L'enjeu de cette demande d’autorisation de projet s’inscrit dans un contexte de développement d’une solution alternative à une mutilation inutile et s’inscrit dans une démarche globale favorisant le bien-être animal. Outre le fait d’éviter la souffrance animale, la solution développée permettra de prévenir le recours à des euthanasies inutiles effectuées aujourd’hui sur des chiens et chats errants. Dans le respect de la règle des 3R : Afin de limiter au maximum le recours aux animaux durant ce projet, les premiers tests de sélection des candidats médicaments ont été/seront réalisés in vitro en laboratoire. Néanmoins, l'absence de méthodes substitutives à l'utilisation d'animaux permettant d’identifier aux mieux une dose efficace et sécurisée pour les animaux de compagnie font que des essais chez la souris sont justifiées. L’emploi de souris permet de remplacer l’emploi de chiens et de chats à des étapes précoces du développement. Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur réception à leurs morts : condition d'élevage des animaux adaptée, présence d'enrichissement dans les cages, visite quotidienne par du personnel qualifié. Une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée entre la réception des animaux et le début de la procédure. De plus lorsque cela est nécessaire les animaux seront anesthésiés et surveillés. De même, certains prélèvements pourront être effectués sur animal mort. Pour l'ensemble de la procédure, des critères d'arrêt par rapport à la souffrance strictes seront appliqués. Nous demandons pour réaliser l'ensemble de ces essais 750 animaux au total sur une période de 5 ans.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est de trouver une alternative à la castration chirurgicale qui est traumatisante pour les animaux.
Procédures
Injection intramusculaire : une fois pour un temps de 1 min Imagerie de bioluminescence : 10 fois pour un temps de 20 min avec 15 jours à 1 mois d'espacement. Prélévement de sang : 10 fois apour un temps de 1 min avec 15 jours à 1 mois d'espacement.
Impact sur les animaux
L'injection intra-musculaire d'AVV peut provoquer une inflammation en locale. La manipulation des souris et notamment l'imagerie réalisée nécessite des anesthésies gazeuses.
Devenir
Les animaux utilisés présentent un risque modèrés pour l'homme ou pour l'environement.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent pas encore être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiments biologiques mis en œuvre.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire par lot a été défini statistiquement. Il est ici de 15.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, de la douleur et/ou de l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront suivies quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter d’éventuels signes cliniques ou de mal-être. Les animaux sont hébergés dans le respect de la législation. Les conditions d’hébergements sont adaptées au statut sanitaire de ces animaux (cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. ). En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris femelles de 5 semaines (démarrant l’expérimentation à 7 semaines après 2 semaines d’acclimatation). De plus, les femelles sont plus aisément manipulables que les mâles et que nous pouvons nous limiter au genre femelle pour réduire le nombre d’animaux (dans le respect des 3R). Les hormones de reproduction étant similaires chez la souris et chez les animaux de compagnie, cette espèce est adaptée à notre étude. Les souris seront utilisées à l'âge de 7 semaines, âge pour lequel elles sont reconnues comme pubères et fertiles et dont on pourra confirmer l’induction d’une stérilisation biologique et après 2 semaines d’acclimatation.
Effet d’une exposition gestationnelle et pubertaire à des composants du cannabis chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes puis des jeunes reçoivent par voie orale des composants du cannabis pendant dix à trente-cinq jours, pour tester l'hypothèse d'un lien entre cette exposition et le cancer du testicule. Le porteur signale le stress de l'administration orale et un risque de fausse route pouvant conduire à euthanasier l'animal, et met à mort les souris pour prélever le sang et les testicules. Il indique disposer de lignées cellulaires et de cultures d'organes humains mais affirme qu'elles ne remplacent pas l'animal.
Objectifs
Le cancer du testicule constitue le cancer le plus fréquent chez l’homme entre 15 et 40 ans. L’étiologie de ce cancer est encore mal comprise. Les données épidémiologiques convergent pour indiquer que l’exposition à des facteurs environnementaux pendant certaines fenêtres de vulnérabilité, telles que le développement et la puberté, est impliquée dans la tumorisation des cellules germinales testiculaires. Récemment, la consommation de cannabis, substance illicite la plus consommée par les adolescents et les femmes en âge de procréer, a été corrélée au développement de tumeurs du testicule chez de jeunes consommateurs. Il a été établi que le développement de ce type de cancer affecte la fertilité. Dans ce contexte et sur la base de nos résultats préliminaires, nous postulons que les cannabinoïdes (CA), molécules contenues dans le cannabis, favorisent l'apparition du cancer du testicule en perturbant la maturation des cellules souches germinales. Le but de ce projet est donc d’évaluer si une exposition aux principes actifs du cannabis pendant la vie fœtale et/ou la puberté affecte la différenciation et la fonction testiculaire et pourrait ainsi favoriser le développement de tumeurs germinales.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettrait de mettre en exergue les conséquences d'un cumul d'exposition auxquelles les populations les plus vulnérables sont soumises, et ce en comparaisons avec une exposition uniquement gestationnelle ou uniquement pubertaire.
Procédures
Traitement par administration orale repetée (pendant 10 jours ou pendant 35 jours). Ce geste est rapide (10 à 20 secondes par animal).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont le stress induit par l'administration orale des souris gestantes pendant 10 jours ainsi que des souris prépubères pendant 35 jours. La possibilité de fausse route est également un risque induit par ce traitement. Bien que les doses utilisées ici sont des doses utilisées en thérapie humaine, nous ne pouvons exclure un effet néfaste des cannabinoïdes utilisés sur le développement pré- ou postnatale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les organes ainsi que les matrices biologiques à investiguer dans le cadre de notre étude. Il s'agit du sang, des testicules, de l'épidyme et du foie.
Remplacement
Alternativement aux modèles animaux, il existe des lignées de cellules cancéreuses testiculaires humaines. Nous utiliserons ces dernières afin de travailler sur les voies de signalisation spécificiques modulées en présence de CBD et/ou THC. Nous utilisons également des modèles de cultures organotypqiques de testicules adultes et foetaux humain pour investiguer la réponse de l'organe aux traitements. Ces modèles ne permettent pas d'obtenir la réponse de l'organisme, contrairement aux modèles animaux, et notamment de prendre en considération les interactions mère-foetus tout comme l'effet des traitements sur l'axe hypothalamo-hypophysaire, axe régulant la fonction reproductive. Ils restent complémentaires mais ne peuvent se substituer à l'utilisation d'animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental sera de 6 pour nous permettre de mener à bien des études statistiques et de prendre en compte la "réduction" de la règle des 3R.
Raffinement
Pour réduire au maximum le stress des animaux, les traitements seront administrés par voie orale par des personnes expérimentées en présence de musique qui, nous l'avons constaté, a pour effet de relaxer les animaux comme l'expérimentateur. Les animaux seront observé quelques minutes après le traitement pour vérifier l'absence de fausse-route. Si une fausse-route s'avérait constaté, l'animal serait euthanasié. Plusieurs paramètres du bien-être des animaux (mobilité, poids,activité de toilettage) sont particulièrement surveillés pendant la procédure et des points limites adaptés ont été définis.
Choix des espèces
Nous avons choisis la souris Swiss ici pour sa fertilité élevée et sa facilité d'élevage et de traitement. Les animaux seront utilisés du stade embyonnaire jusqu'à 8 mois.
Etude du rôle des enzymes (OGT, GFAT, PGM3 et OGA) impliquées dans la voie des hexosamines dans la pathogénèse du lupus systémique érythémateux (LSE)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
815 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, pour partie dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et pour partie dans des procédures de souffrance légère. Ces souris développent un lupus reproduisant la maladie humaine et subissent douze prélèvements sanguins, un par mois pendant un an, pour tester un inhibiteur ciblant des enzymes de la voie des hexosamines. Le porteur indique que la maladie auto-immune altère de façon modérée la fonction rénale et met à mort les animaux au motif d'un risque biologique. Il revendique un "besoin" crucial d'explorer le système immunitaire in vivo et affirme qu'aucune méthode alternative ne convient.
Objectifs
Le lupus systémique érythémateux (LES) est une maladie chronique rare qui se manifeste par des symptômes variables pouvant atteindre plusieurs organes (peau, articulations, reins, système nerveux central, séreuses…). La maladie survient dans 90% des cas chez la femme et débute le plus souvent à partir de la puberté. En France, la prévalence de la maladie est de 41 cas sur 100 000 et l’incidence de 3-4 nouveaux cas par an sur 100 000 habitants. Elle est caractérisée par des lésions parfois irréversibles ou mortelles. A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif. A l’heure actuelle, il existe un besoin crucial d’explorer le système immunitaire et plus exactement mieux comprendre les mécanismes moléculaires, cellulaires et environnementaux qui régissent la réponse immunitaire dans le contexte du LES dans le but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant améliorer la prise en charge des patients. Des données de publications in vitro récentes pointent une cible moléculaire qui pourrait être un acteur essentiel de la maladie. Pour étudier le rôle de cette cible dans la pathologie, un modèle de souris a été développé dans le laboratoire mimant le développement de cette pathologie. En parallèle, nous avons menés des études in vitro pour développer un inhibiteur de cette cible. Nous nous proposons donc maintenant de valider nos études in vitro par une étude in vivo avec cette inhibiteur sur notre modèle de souris mimant le développement du lupus
Bénéfices attendus
Ce projet permet la recherche de cible thérapeutique dans le contexte du lupus érythémateux (25000 cas/an)
Procédures
12 prélévement de sang (1 min de durée) à raison de 1 fois par mois sur 12 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux développe une maladie auto-immune qui altère de manière modérée la fonction rénale
Devenir
Les animaux de ce projet proviennet d'une animalerie de classe de risques A2 et seront euthanasiés car ils présentent un risque biologique.
Remplacement
Remplacer : Des méthodologies de culture cellulaire et de modélisation in vitro ont été mises en place afin de remplacer au possible l’utilisation d’animaux pour répondre à certaines questions spécifiques à ce projet. Cependant seul un modèle in vivo chez la souris récapitulant les éléments de la physiopathologie du lupus et regroupant les multiples acteurs de l’immunité innée/adaptative observés chez l'homme, permettra de vérifier l'hypothèse sur l’implication des enzymes OGT/GFAT/PGM3 et OGA sur le développement du LES.
Réduction
Réduire : Pour nos expériences, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et avoir le nombre de contrôles internes obligatoires, pour prouver l’efficacité des molécules thérapeutiques utilisées.
Raffinement
Raffinement : Afin de respecter la notion de raffinement, et éliminer ou réduire toute douleur, souffrance, angoisse, ou tout dommage durable, susceptible d’être infligé aux animaux, leur bien-être et leur souffrance seront pris en compte quotidiennement de leur naissance à leur mort et évalués par le personnel zootechnique expérimenté. Ainsi, pour chaque procédure impliquant une douleur supérieure à celle d'une piqûre, les animaux seront anesthésiés. De plus, chaque cage (type 2L avec 5 souris par cage) recevra du matériel pour nidifier dans le but de rétablir le répertoire comportemental des souris.
Choix des espèces
Il n’existe pas de méthodes alternatives à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments physiopathologiques observés chez l’homme, peut apporter une réponse quant aux rôles des deux enzymes OGT, GFAT, PGM3 et OGA dans le développement du phénotype lupique. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs ex vivo ou in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité et la diversité des différents facteurs pouvant intervenir dans la réponse immunitaire en action in vivo chez la souris. Les souris seront traitées soit à l’âge de 5 semaines (début de la pathologie avec apparition des auto-anticorps), soit à l’âge de 30 semaines (stade tardif de la pathologie avec apparition de l’auto-immunité systémique).
Le rat Goto Kakizaki un modèle d’étude du syndrome des ovaires polykystiques
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
312 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Ces rattes Goto-Kakizaki, présentées comme un modèle spontané du syndrome des ovaires polykystiques, subissent des frottis vaginaux, des injections d'un anticorps pendant la gestation et des prélèvements sanguins répétés, y compris des tests de tolérance au glucose, pour étudier le développement du syndrome et tester un traitement. Le porteur affirme n'attendre aucune souffrance des injections et met à mort tous les animaux pour analyser leurs tissus. Il affirme qu'aucun système in vitro ou in silico ne peut remplacer l'animal.
Objectifs
Le Syndrome des Ovaires polykystiques (SOPK) est la principale cause d’infertilité féminine et elle est associée à de nombreuses comorbidités telles que le diabète et les maladies cardiovasculaires. Les hommes apparentés aux femmes ayant ce syndrome présentent des taux d’androgènes élevés et des désordres métaboliques. Il s’agit de plus d’une maladie à fort caractère transmissible par les mères à leurs filles et fils, sans qu’aucun diagnostic puisse être établi précocément puisque l'origine de ce syndrome reste méconnu. Or nous avons mis en évidence récemment que les rattes Goto-Kakizaki, modèle de diabète de type 2 très connu, constituent le premier modèle rongeur spontané du syndrome des ovaires polykystiques. Notre projet est d'utiliser ce modèle de rattes GK afin de mieux comprendre l'éthiologie de ce syndrome en analysant le développement de ce syndrome dès le stade foetal. De plus, nous avons développé un anticorps bloquant les effets de l'hormone Anti-Müllérienne (AMH) qui est suspectée d'induire une hyperandrogénie et une anovulation chez les patientes présentant un syndrome des ovaires polykystiques. Nous proposons donc de traiter des rattes GK avec cet anticorps pendant la gestation pour comprendre le rôle de l'AMH dans le développement du phénotype et à l'âge adulte à des fins thérapeutiques pour normaliser les taux circulants d'androgènes et pour induire une ovulation.
Bénéfices attendus
Pouvoir analyser et comprendre les altérations developpementales chez la descendance de mères SOPK afin d'améliorer par la suite la possibilité de prise en charge des patientes SOPK au cours de la grossesse. Actuellement les patientes SOPK sont traitées de manière symptomatique : soit pour traiter leur infertilité, soit pour traiter l'hyperandrogénie, soit pour traiter les troubles du métabolisme en particulier le diabète. Le traitement que nous proposons de tester permettrait: - d'une part de corriger l'infertilité chez les 25% de patientes SOPK résistantes aux traitements actuels et d'éviter le risque d'hyperstimulation ovarienne induit par les traitements utilisés en PMA (procréation médicalement assistée) - d'autre part de corriger l'hyperandrogénie - d'autre part d'améliorer les anomalies métaboliques.
Procédures
Les animaux subiront des prélèvements de sang de 100 microlitres (environ 5 minutes par prélèvement). Pour l'ipGTT des prélèvements de sang de 30 microlitres (environ 1 minute par prélèvement) aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes sont réalisés. Pour l’ipITT, une goutte de sang (10 microlitres, moins d'une minute par prélèvement) sera prélevée pour lecture de la glycémie sur lecteur Accuchek aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes. Les 2 tests seront séparés d’au moins 3 jours pour permettre la récupération.
Impact sur les animaux
Pour le suivi du cycle ovarien par la méthode des frottis vaginaux ainsi que pour l'injection en sous cutanée, les femelles sont préalablement habituées à la contention par les expérimentateurs habilités. Pour les prélèvements sanguins qui seront nécessaires (100 microlitres/rat une fois par semaine sur 3 semaines pour les gestantes et les traitées et sur 5 semaines consécutives pour le lot étudié entre 4 et 8 semaines) le volume de sang prélevé à chaque prise de sang sera toujours en dessous du volume maximal autorisé (5% du volume sanguin total).
Devenir
Toutes les procédures conduiront à la mort des animaux afin d'effectuer les analyses histologiques de différents tissus.
Remplacement
Cette étude ne peut être réalisée que sur des animaux vivants et l'avantage du rat GK réside dans le fait que c'est un modèle de diabète de type 2 sans manipulation génétique et mimant certains aspects du syndrome SOPK humain. Ainsi sur le plan scientifique il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est réduit au minimum grace à l'utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux sont habitués à la manipulation de sorte à réduire le stress. Les prélèvements sanguins représentent moins de 5% du volume sanguin total et sont suffisamment espacés dans le temps pour ne pas induire une détresse chez l'animal. Les injections d'anticorps ne gènèrent pas de souffrance pour l'animal. Cependant, les animaux seront suivi toutes les 48h durant le traitement et si des signes de mal-être apparaissent tels que, prostration,poils hirsute et perte de poids, les animaux seront isolés et gardés en observation. Si la perte de poids est supérieure à 15% du poids de l'animal il sera eutahanasié.
Choix des espèces
Le rat GK est le seul model rongeur disponible developpant spontanémant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK). Le rat une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour permettre des mesures physiologiques pratiques. Les stades foetal (18,5 jpc), post natal(5 jours), pubertère et adulte ont été choisis puisque l'environnement maternel SOPK est fortement suspecté de contribuer au dévéloppement de ce phénotype qui apparait progressivement depuis le stade foetal.
Crises épileptiques induites par un stimulus externe
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2220
10 620 rongeurs, 8 400 souris et 2 220 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit un candidat médicament puis une stimulation électrique ou sonore déclenchant une crise d'épilepsie, certains après implantation d'une canule dans le cerveau sous anesthésie, pour tester des molécules antiépileptiques. Le porteur indique que la crise tonico-clonique provoquée peut aller jusqu'à l'arrêt respiratoire, les animaux étant tués juste après la convulsion ou en fin de test car les procédures ne permettent pas de les maintenir en vie dans de bonnes conditions. Il reconnaît des alternatives in vitro pour présélectionner les molécules mais affirme la nécessité du modèle animal pour l'étape finale.
Objectifs
L'objectif du projet consiste à évaluer de nouveaux candidats médicaments pour lutter contre les épilepsies généralisées ou partielles. A l'heure actuelle, il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients épileptiques. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité et l'espérance de vie des patients. Les crises généralisées correspondent à des décharges électriques anormales au niveau cérébral (les 2 hémisphères sont touchés), qui se traduisent par des convulsions tonico-cloniques. Les convulsions cloniques sont des secousses musculaires incontrôlées alors que les convulsions toniques correspondent à un raidissement et une contraction soudaine des muscles du corps et des membres inférieures et supérieurs accompagnés d'un arrêt respiratoire temporaire ou définitif. Des symptômes précurseurs sont parfois observés avant l'apparition d'une convulsion généralisée comme une hypersalivation ou une respiration bruyante. Les crises partielles sont liées à une décharge électrique anormale dans une région cérébrale spécifique. Les symptômes de la crise dépendent de la zone atteinte. Des fourmillements, picotements, sensation ou encore secousses musculaires incontrôlées au niveau d'un membre peuvent être observés chez l'Homme. Des mouvements de la tête ou des yeux ou encore des signes émotionnels (peur, rire..) peuvent également faire partie des symptômes. Le projet consiste en l'utilisation de tests basés sur l’induction de crises épileptiques par le moyen de stimulation électrique ou sonore permettant de tester l'innocuité et/ou l'efficacité de substances pharmacologiques en développement.
Bénéfices attendus
Les modèles de crises généralisées et partielles induits par une stimulation sont recommandés pour identifier et tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. A l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30% des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou les traitements sont inefficaces (résistance aux traitements). En plus du développement de nouveaux antiépileptiques, un des enjeux majeurs de la recherche sur l’épilepsie est de découvrir des traitements prophylactiques contre cette pathologie, c’est-à-dire des traitements ayant un effet antiépileptogène. Il n’en existe aucun à ce jour alors qu'il est possible d’identifier les personnes présentant un risque de développer une épilepsie.
Procédures
Pour chaque procédure décrite, les candidats médicaments seront administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. Si applicable, l'implantation d'un guide canule est réalisée sous anesthésie générale sur environ 60 minutes. Dans chacune des procédures décrites, le rongeur sera exposé à un stimulus, d'un durée maximale de 60 secondes chez la souris et de 3 secondes chez le rat. Des prélèvements sanguins peuvent également être envisagés avant le test (à minima 24 heures avant la stimulation, durée de l'ordre de la minute) pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les tests modélisant des crises induisent un stress physique chez les rongeurs, également retrouvé chez les patients lors de la survenue d'une crise épileptique (avec l'apparition de mouvements involontaires saccadés ou un raidissement des membres/du corps). Des symptômes annonciateurs peuvent être également observés chez l'homme comme la nervosité, l'irritabilité ou une hypersalivation. Chez l'animal, ce stress est principalement lié à la stimulation appliquée sur une très courte durée et qui conduit à l'apparition de symptômes convulsifs. La survenue de crises tonico-cloniques peut conduire à la mort des patients épileptiques et peut donc dans certains cas provoquer une certaine souffrance chez l'animal. Des points limites prédictifs limitent cet impact. Lorsque les animaux sont implantés avec un guide canule, ils sont mis en cage de réveil et maintenus isolés pendant environ 7 jours à partir de la chirurgie afin de protéger le guide canule de leurs congénères. Le prélèvement de sang au cours d'une expérience peut également conduire à un léger stress chez l'animal vigile.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés immédiatement après la stimulation si une convulsion tonique est observée ou à la fin du test en l'absence de convulsion tonique car ces procédures ne permettent pas le maintien en vie des animaux dans de bonnes conditions.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives in silico ou in vitro permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées dépendant de la nature des données : variables dichotomiques, données paramétriques ou non paramétriques. Il est possible de tester plusieurs composés et doses dans une même expérience. Ceci permet de limiter le nombre d'animaux contrôles et le nombre d'animaux testés avec une substance connue.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Une solution anesthésiante sera appliquée. Les animaux seront anesthésiés et/ou euthanasiés, immédiatement après l'apparition d'une convulsion tonique. Pour les études incluant une chirurgie pour administrer le composé par voie intracérébrale, une analgésie est assurée par l’administration d'un analgésique systémique et l'utilisation d'un analgésique local. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué pendant la chirurgie pour éviter le dessèchement de l'oeil.
Choix des espèces
Les modèles de convulsions induites par une stimulation externe sont largement décrits dans la littérature chez le rongeur (souris et rat). Les procédures décrites dans ce projet sont recommandées pour évaluer de nouveaux candidats médicaments (efficacité) et/ou l'innocuité d'un composé dans le cadre de l'épilepsie. Les rongeurs utilisés sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique .
Etude de l’impact durable d’un régime appauvri en fibres sur la symbiose hôte-microbiote chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules, elles subissent des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces, et un tiers reçoit dans l'eau un produit qui enflamme l'intestin pendant sept jours, provoquant selon le porteur une douleur intestinale croissante et des diarrhées avant la mise à mort. Le projet étudie la rupture de l'équilibre entre l'hôte et son microbiote induite par un régime pauvre en fibres. Le porteur affirme l'impossibilité de modéliser cette dynamique in vitro ou in silico.
Objectifs
Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies non transmissibles (maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. Ces maladies sont associées à des signaux déclencheurs provenant de notre environnement (microorganismes de l’intestin, alimentation) et se caractérisent par une inflammation locale de l’intestin. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Ces maladies de longue durée résultent de l’association combinée de plusieurs facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux dont la nutrition et l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein de cet organe. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des altérations de la composition du microbiote intestinal chez des patients atteints de maladies non transmissibles. Cette altération de la symbiose hôte-microbiote est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du système immunitaire de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies non transmissibles, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par la diminution du potentiel fonctionnel du microbiote intestinal et de son hôte. Notre projet consiste à évaluer la mise en place et le maintien à long terme d’une rupture de symbiose hôte-microbiote induite par un régime pauvre en fibres et à déterminer les conséquences de ce changement de régime alimentaire sur la symbiose lors d’un stress inflammatoire aigu. L’objectif final de nos travaux est de caractériser la rupture de symbiose et d’en évaluer les conséquences sur la santé dans un modèle animal afin d’identifier des leviers, à la fois côté hôte et côté microbiote, qui permettraient de retarder, prévenir et/ou traiter sa survenue, son installation et sa persistance chez l’individu.
Bénéfices attendus
Les maladies non-transmissibles, qui sont en constante augmentation, sont une préoccupation majeure de santé publique. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. De nombreux travaux témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal due à un régime alimentaire appauvri en fibres. Notre projet amènera à une meilleure compréhension des mécanismes de la rupture de la symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire appauvri en fibre s ; compréhension qui permettra d’identifier de nouvelles solutions de dépistage et de traitement.
Procédures
Tous les animaux seront hébergés en cage indivuduelle tout au long de l'expérimentation. Les deux tiers des animaux recevront un régime appauvri en fibres pendant une durée de 4 semaines. Tous les animaux recevront une solution par gavage au minimum 2 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de contention sera de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux auront au minimum 1 et au maximum 3 prises de sang. Le temps de collecte, contention comprise, sera de 30 secondes à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans la procédure. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. Un tiers des animaux recevra dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin pendant sept jours consécutifs en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition à un régime inflammatoire, ce qui pourra entrainer une perte de poids. Les prises de sang engendrent une douleur modérée de courte durée et un stress léger dû à la contention. De même, les gavages seront réalisés par un expérimentateur confirmé à l’aide d’une sonde gastrique et engendreront un stress léger dû à la contention de quelques minutes mais ne causeront pas de douleur. L’absorption du produit inflammatoire entraine une douleur intestinale croissante pendant les 7 jours de traitement occasionnant des diarrhées avant la mise à mort des animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de reproduire/modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.
Réduction
D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 120 animaux pour le groupe contrôle et 240 animaux pour les groupes expérimentaux sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement composé d'un abri en propylène rouge et d’un Mouse Swing et d'un abri en propylène rouge afin de répondre au mieux à leurs besoins comportementaux naturels et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les cages seront transparentes afin que les animaux gardent un contact visuel avec leurs congénères et n’auront pas de couvercles filtrants afin de maintenir le contact sonore et olfactif. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur le poids, l’apparence des animaux et leur comportement.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris qui sont largement utilisées pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes pauvres en fibres en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc une référence pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.
Etude des déficits plaquettaire et immunologique dans un modele de souris mutantes
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
194 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être transférées vivantes vers le laboratoire d'un collaborateur pour la suite de l'étude. Ces souris porteuses d'une mutation liée au syndrome de Hermansky-Pudlak subissent deux prélèvements sanguins à six et huit semaines, pour analyser leurs plaquettes et leur système immunitaire. Le porteur indique un risque de saignement prolongé chez ces animaux dont la mutation affecte la coagulation. Il affirme que la lignée cellulaire in vitro ne suffit pas et que le modèle souris reste "indispensable" à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
L’étude des maladies rares d’origine génétique permet aujourd’hui de décrire les gènes, des protéines et des mécanismes biologiques fondamentaux pour la compréhension du vivant et celle de maladie plus fréquente. Nous avons identifié chez des patients atteints du syndrome de Hermansky-Pudlak (SHP) qui est une maladie multisystémique caractérisé par un albinisme oculo-cutané et un terrain hémorragique. Une mutation d'un gène qui pourrait être à l’origine du déficit immunitaire global ainsi que d’anomalies sanguines principalement thrombopénie (déficit des plaquettes) avec des dysfonctionnements de la fonction plaquettaire. Notre projet et l’étude de la modification de ce gène impliqué dans la pathologie complexe observée chez les patients, grâce au modèle de souris portant la mutation de notre gène d'intêret. Plus précisément, nous souhaiterions étudier les paramètres hématologiques et particulièrement les plaquettes et leur physiologie. Pour cela des prélèvements de sang seront réalisés chez des souris contrôles et mutantes, afin d’être analysés. Au total 194 souris seront nécessaires pour valider notre question biologique et obtenir des résultats statistiquement valides.
Bénéfices attendus
L'objectif de notre projet et l'étude de systeme immunitaire et la fonction plaquettaire dans le cadre d'une maladie rare le syndrome de Hermansky-Pudlak , nous souhaiterons comprendre les mecanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène et son effet sur la thrombopenie (deficite plaquettaire)
Procédures
Les souris seront soumises à 2 prelevements sanguins (vigiles) à l'age de 6 et 8 semaines. Nous avons également un groupe de 7 mois.
Impact sur les animaux
Comme la mutation chez l’homme induit une dysfonction de la fonction plaquettaire et de la thrombopénie, un risque de saignement prolongé au moment de la prise de sang pourrait être observé sur notre modèle de souris mutantes.
Devenir
Tous les animaux seront transferés dans le laboratoire de notre collaborateur pour completer l'étude immunologique.
Remplacement
Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et est étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal (souris) reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystemique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en gardant s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Etant donné le manque de donnée concernant cette nouvelle lignée, l’analyse de puissance sera revue en fonction des données générées. En effet, en fonction du phénotype observé, on pourrait être amené à réduire le nombre d'animaux tout en cherchant à atteindre une puissance statistique de 80%. Un maximum de 194 souris sera nécessaire. Comme on s'attend à avoir le même phénotype chez les mâles et les femelles, nous utiliserons pour chaque série l'un des 2 sexes (selon la production), ce qui éviterait de dédoubler les effectifs.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation et son euthanasie. Les animaux seront observés toutes les semaines avec une grille de suivi du bien-être, en plus du suivi quotidien habituel. Afin d’éviter toute perte de sang excessive (hémorragie), le site de ponction sera comprimé avec un hémostatique local afin d’atteindre l’hémostase.
Choix des espèces
Le modèle souris est très pertinent et est necessaire pour étudier de la modification de notre gène d'intêret à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystemique ; de plus, le modèle de souris est très étudié et largement utlisé pour analyser la fonction plaquettaire. Les animaux seront étudiées à l'âge de 6 et 8 semaines à fin d'étudier les 2 stades avant l'age adulte et à l'age adulte. Nous avons également un groupe de souirs de 7 mois afin comparer l'effet de l’âge dans ce groupe.