Recherche appliquée
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Evaluation préclinique de composés dans un modèle murin d’hyperglobulinémie
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie inflammatoire humaine, elles reçoivent des composés jusqu'à deux fois par jour pendant douze semaines, avec cinq à neuf prélèvements sanguins au sinus rétro-orbital et des prélèvements urinaires. Le porteur indique que le phénotype dommageable, avec gonflement des ganglions et lésions tissulaires, s'installe vers vingt semaines, et que les composés testés peuvent induire un inconfort. Il affirme que le recours à un modèle animal est "indispensable" pour juger de l'efficacité d'un composé après une phase in vitro.
Objectifs
Chez l’homme, la maladie à IgG4 est une maladie fibro-inflammatoire systémique à médiation immunitaire. Elle se présente sous forme de dysfonctionnement d’organe ou de lésions avec infiltration lympho-plasmacytique dans un ou plusieurs organes (principalement entre autres dans les reins et les poumons) avec des symptômes relatifs à l’organe atteint. Elle peut entraîner une défaillance d’un ou plusieurs organes voire la mort si elle n’est pas traitée. Un taux élévé d’immunoglobulines caractérise également cette pathologie. L’objectif du projet est la découverte de médicament présentant des avantages thérapeutiques par rapport à l’offre médicamenteuse actuelle, capables de contrer l’augmentation des immunoglobulines permettant ainsi de diminuer la gravité des signes cliniques. Par extension, certaines maladies auto-immunes (i.e. Lupus érythémateux disséminé) pourraient également bénéficier de ces thérapies. Pour ce faire, le projet utilisera des souris homozygotes pour la mutation LATY136Fqui récapitule bon nombre des caractéristiques de la pathologie humaine.
Bénéfices attendus
Il n’y a actuellement pas de traitement spécifique de la maladie associée aux IgG4 mais les corticoïdes voire des immunosuppresseurs, permettent la régression des infiltrats inflammatoires et donc des symptômes de la maladie. L’objectif du projet est la découverte d’autres options thérapeutiques capables de contrer l’augmentation des immunoglobulines permettant ainsi de diminuer la gravité des signes cliniques. Par extension certaines maladies auto-immunes (i.e. SLE) pourraient également bénéficier de ces thérapies.
Procédures
1/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-veineuse ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour pendant un maximum de 12 semaines sous un volume de 5 à 10mL/kg en fonction de la voie d’administration 2/ en fonction de la durée de l’étude, 5 à 9 prélèvements sanguins à la veine sub-mandibulaire ou au sinus rétro-orbital (sous anesthésie à l’isoflurane et après application locale d’analgésique) 3/ lors des études longues, au maximum 9 prélèvements urinaires (dont un au moment du sacrifice) seront obtenus par mixtion spontanée (espacés d’une semaine) 3/ Au maximum 8 prélèvements urinaires pour les études longues
Impact sur les animaux
Les signes physiologiques des homozygotes apparaissent à partir de 4 semaines d’âge (adénomégalie, lésions tissulaires) et s’amplifient au cours du temps jusqu'à atteindre un phenotype dommageable aux alentour de 20 semaines. Les composés administrés peuvent induire un inconfort. La dose pourra alors être diminuée pour l'ensemble du groupe traité. L'arrêt temporaire ou définitif du traitement pour ce groupe peut être envisagé tout en continuant l'étude pour les autres groupes. Si ces mesures ne fonctionnent pas, une mise à mort anticipée sera envisagée (avis vétérinaire). Des prélèvements sanguins seront effectués : 5 à 9 en fonction de la durée de l’étude. Au maximum, 8 prélèvements urinaires par mixion spontanée seront effectués lors des études longues (espacés d’une semaine).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.
Remplacement
Après une phase de test d’évaluation d’efficacité in vitro permettant la sélection des meilleurs candidats, l’utilisation de modèles animaux mimant les pathologies humaines est indispensable pour juger de l’efficacité d’un nouveau composé
Réduction
Le modèle utilisé étant bien décrit dans la littérature, la mise au point sera ainsi limitée. Nous travaillerons sur des groupes homogènes au moment de leur inclusion dans l’étude, afin de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé et générer des résultats reproductibles. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (par exemple, maisons en carton, carrés de coton et feuilles de cellulose). Il sera toutefois adapté en cas de signes d’atteintes pulmonaires (élimination des sources de poussières), ou rénale (avec une litiére absorbante). La bonne connaissance de ce modèle décrit dans la littérature permettra de raffiner et d’anticiper le développement de la maladie chez l’animal et donc d’anticiper la mise à mort éthique selon des critères d’interruption prédéfinis. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse pouvant être infligées aux animaux, une surveillance journalière ainsi que des points limites précoces et spécifiques à ce modèle ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est la souris, notamment une souche portant la mutation LATY136F, caractérisée et décrite dans la littérature par plusieurs équipes. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point. Nous utiliserons des animaux entre 4 et 16 semaines d’âge suivant l’objectif de l’étude : effet des molécules sur les taux d’IgG1 et IgE ou caractérisation de l’impact de la diminution du taux d’immunoglobulines sur les atteintes tissulaires et fonctionnelles à long terme.
Capacité régénérative des cellules satellites après dénervation.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Opérées sous anesthésie pour une section définitive du nerf sciatique d'une patte arrière, 54 souris jeunes adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis mises à mort pour le prélèvement de leurs organes. L'équipe veut savoir si le stress oxydatif qui suit la dénervation altère la capacité de régénération des cellules souches du muscle. Le porteur juge les souris "peu invalidées par cette opération pour une vie en captivité", parce qu'elles sont "quadrupèdes et vivant à ras du sol", et estime l'étude "extrêmement rentable pour la société". Il présente la dénervation comme "définitive", puis prévoit de placer la nourriture à portée en raison de l'"absence temporaire de réactivité de la patte dénervée".
Objectifs
Le système nerveux contrôle de nombreuses fonctions dans l’organisme, l’une d’entre elles est la contraction musculaire. En effet, les motoneurones (i.e. neurones qui fonctionnent spécifiquement pour le mouvement) envoient un signal électrique, via leurs axones, qui se traduit en signal chimique au niveau de la jonction neuromusculaire. Ce signal induit la contraction musculaire. Une fibre musculaire est une cellule de forme cylindrique qui résulte, à l’état embryonnaire de l’organisme, de la fusion de nombreuses cellules pré-musculaires appelées myoblastes. La fibre musculaire est alors une cellule contenant de nombreux noyaux, chaque myoblaste ayant apporté son noyau. La fibre musculaire en elle-même ne se divise pas mais comprend sur sa périphérie quelques cellules souches pré-musculaires, dites cellules satellites, qui se divisent quand les fibres musculaires ont besoin d’être réparées ou de croître pour un gain de force. Quand les cellules satellites sont appelées à se diviser elles s’agrègent avec la fibre qui les portait, on parle dans ce cas d’accrétion. La fibre gagne ainsi de nouveaux noyaux avec pour conséquence un gain en molécules contractiles qui réparent la fibre en cas de blessure ou la rendent plus fortes si c’est pour répondre à des exercices intenses. Il a été décrit dans la littérature que suite à la dénervation, qui prive les muscles des signaux du nerf, les cellules musculaires subissent un fort dommage oxydatif. Nous avons récemment montré que le dommage oxydatif peut modifier, in vitro, les capacités régénératives des myoblastes, précurseur en différenciation des fibres musculaires. Les cellules satellites peuvent être isolées du muscle adulte et mises en culture dans des boîtes. Une fois en culture, leur statut biologique change et elles se mettent à proliférer en tant que myoblastes qui selon certaines conditions de culture peuvent fusionner et s’agréger pour donner des fibres musculaires immatures appelés myotubes. Ceci permet d’étudier plus facilement, que dans l’animale, leur biologie régénérative, sachant qu’avec un animal on obtient de nombreuses cellules permettant de faire de nombreux tests. Actuellement les conséquences du stress oxydatif lié à la dénervation sur les cellules satellites sont peu connues. Nos travaux sont destinés à comprendre si et comment l’activité régénérative des cellules satellites est altérée pendant le processus de dénervation.
Bénéfices attendus
Ce projet a deux volets qui ont un intérêt scientifique général : Tout d’abord nous allons évaluer comment le dommage oxydatif, qui suit une dénervation, va affecter les fibres musculaires et les cellules satellites. Nos résultats dans les cellules en culture nous laissent présager que ce dommage va impacter la capacité régénérative des cellules satellites et contribuer au processus d’atrophie musculaire post-dénervation. Une étude aussi complète de l’effet des dommages oxydatifs dans la problématique de la dénervation n’a jamais été effectuée. Quelques études montrent que le nombre de cellules satellites musculaires ne change pas après dénervation, néanmoins il n’y a aucune étude qui montre que leur capacité à fusionner ou à accomplir l’accrétion est la même. Cette investigation est d’autant plus importante car ses conclusions pourraient être applicables aux accidents de dénervation ou pincements des nerfs qui peuvent survenir chez l’humain. Il est important de connaitre les conséquences du dommage oxydatif induit par la dénervation pour pouvoir chercher des thérapies adaptées pour soulager la conséquente atrophie musculaire (détoxification des molécules oxydantes avec des traitements anti-oxydants, préconisations nutritionnelles). De plus, il est essentiel de vérifier si l’activité de régénération des cellules satellites est conservée après dénervation et comprendre comment la préserver pour limiter l’atrophie musculaire. Au vu des bénéfices attendus en termes scientifiques et médicaux et de l’impact limité sur les souris, nous estimons que cette étude sera extrêmement rentable pour la société.
Procédures
Chirurgie sous anesthésie chimique pour section du nerf. 54 souris seront traitées. La durée d'intervention par souris est d'environ 10 min.
Impact sur les animaux
La technique de dénervation définitive, par section du nerf sciatique présente l’avantage d’être une intervention chirurgicale modérément invasive si on l'a compare par exemple à une chirurgie abdominale. Les conséquences de la dénervation permettent une vie quasi-normale en captivité des animaux traités, la cage d’élevage comprenant de la litière adaptée ainsi qu’un enrichissement sous forme de petite cabane. La technique microchirurgicale de dénervation est effectuée avec le maximum de précautions pour limiter les douleurs post-opératoires des animaux (anesthésie générale et en local du nerf et administration d’antalgique en pré-opératoire et anti-inflammatoire en post-opératoire). La dénervation est effectuée sur l’une des pattes arrière de la souris et ne concerne pas tous les muscles, d’autres afférences nerveuses permettent à la souris de se relever ainsi que ses déplacements sans difficulté sur la litière de la cage. Il est par ailleurs à considérer que les souris étant quadrupèdes et vivant à ras du sol, elles sont par conséquent peu invalidées par cette opération pour une vie en captivité.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le recours à des souris est indispensable parce que la dénervation induit des modifications physiologiques sur l’ensemble du muscle qu’il est impossible de reproduire sur des cellules en culture. De plus, la mise en culture des cellules satellites modifie leur état de quiescence, ce qui peut modifier leur réponse au stress et aux dommages à l’ADN. En effet, la réparation de l’ADN n’est pas la même dans des cellules qui se divisent, des cellules qui ne se diviseront plus ou des cellules quiescentes qui ont toujours une possibilité de se diviser. Nous avons réalisé, en amont de ce projet, des tests préliminaires sur cellules en culture pour certaines mises au point de nos analyses (Immunofluorescence, colorations, traitement aux agents oxydants) permettant de ne recourir aux animaux que lorsque c’est absolument nécessaire.
Réduction
Dans la première phase du projet on prévoit un nombre minimum de 15 souris et un maximum de 18 souris : 5+1 par condition pour 3 temps post-dénervation. La robustesse de la procédure de dénervation et nos résultats préliminaires dans des myoblastes en culture nous ont amené à estimer que 5 souris par condition sera le juste nombre pour avoir des résultats statistiquement valables, une 6eme souris pourrait être utilisée si un problème de reproductibilité se présente. Dans la deuxième phase, on estime un nombre de 12 souris par temps post-dénervation les tests à réaliser demandant 6 souris pour la mesure de l’index de fusion qui correspond à la proportion de cellules comprenant deux noyaux sur l’ensemble de toutes les cellules et 6 souris pour le test d’accrétion qui mesure le nombre de cellules à plus de deux noyaux sur l’ensemble de toutes les cellules présentes. On estime que 5 souris par condition sera le juste nombre pour avoir des résultats statistiquement valables sur la base d’un test statistique dit non paramétrique de Wilcoxon, une 6eme souris pourrait être utilisée si un problème de reproductibilité se présente. Le nombre de souris utilisables dans cette phase sera donc compris entre 30 et 36. Par ailleurs des prélèvements effectués sur ces animaux (cœur, diaphragme, autres muscles, etc ...) seront également mis à profit pour des analyses nécessaires à d’autres projets au sein de notre équipe permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Grâce aux précautions prises pour l’anesthésie générale ainsi que les mesures médicamenteuses anti-douleur et anti-inflammatoires pratiquées en pré et post-opératoire, les souris traitées retrouvent très rapidement un comportement similaire à leurs congénères non traités. Les animaux sont ensuite surveillés quotidiennement pour détecter d’éventuels problèmes (apparence, comportement social, posture, perte de poids) et y remédier par des soins appropriés. Par ailleurs, pour faciliter l’alimentation des souris dénervées qui pourraient présenter une difficulté en raison de l’absence temporaire de réactivité de la patte dénervée, la nourriture sera placée de façon plus accessible dans la cage.
Choix des espèces
La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères. Nous avons choisi le stade jeune adulte de 8 semaines pour notre étude car la croissance musculaire est terminée et les cellules satellites ne se divisent plus dans les conditions d’élevage pratiquées.
Le métabolisme de l’oxygène obtenu par Imagerie à Résonance Magnétique (IRM) dans l’accident vasculaire cérébral (AVC) : Recherche d’un biomarqueur innovant des capacités de récupération post-AVC chez le Primate Non-Humain (PNH) EU (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une occlusion de l'artère cérébrale moyenne provoque chez les macaques une lésion du cerveau, avec perte des capacités motrices et cognitives, et un risque de mortalité estimé à 18 % d'après une étude antérieure. 12 macaques à longue queue adolescents vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour vérifier la sécurité d'une inclinaison du corps et de la tête de 15° vers l'arrière pendant l'occlusion. Avant l'AVC, ils passent quatre mois et demi d'entraînement à une tâche de prise alimentaire sous contrôle hydrique. Le porteur écrit qu'ils seront "toujours maintenus en hébergement par paire" même après l'AVC, et décrit ailleurs un "isolement et un confinement de l'animal durant quelques jours" après l'opération. Tous sont tués par injection létale 45 jours après l'intervention, pour des analyses du tissu cérébral qui doivent valider les mesures d'IRM.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est un déficit neurologique soudain, causé par un caillot dans une artère cérébrale (accident dit ischémique) ou une hémorragie cérébrale (accident dit hémorragique). Le traitement le plus récent de l’accident ischémique est la thrombectomie, qui vise à traiter le caillot responsable de l’occlusion par une action endovasculaire mécanique et ainsi restaurer l’apport sanguin de la région cérébrale irriguée. L’étendue de la pénombre ischémique, la partie du cerveau affectée par l’infarctus mais encore viable, est un indicateur important de l’issue de l’AVC. Sauver la pénombre est une priorité pour diminuer la mortalité et limiter les séquelles lourdes. Notre projet a pour principal objectif de vérifier la sécurité de la procédure qui consiste à incliner de 15° vers l’arrière le corps et la tête du sujet pendant l’occlusion, permettant ainsi d’augmenter l’apport sanguin vers le cerveau. Cette approche a déjà fait ses preuves chez le rongeur et son innocuité doit être validée chez le primate, pour rendre l’essai clinique possible. Cette approche d'inclinaison permettrait de sauver des patients dans la phase critique d’urgence qui risquent de décéder ou d’être lourdement handicapés. La mesure du métabolisme de l'oxygène (CMRO2 : Cerebral metabolic rate of oxygen) représente donc une mesure complémentaire reflétant l’atteinte ou la survie de cette zone de pénombre pour définir avec précision le tissu cérébral à risque lésionnel, et peut donc être un biomarqueur des déficits post-AVC. Après la phase aiguë, il pourrait également servir pour prédire la récupération de ces déficits à long terme. Cette mesure CMRO2 via l’IRM n’ayant jamais été validée à la phase aiguë, notre projet prévoit d’utiliser l’approche d'inclinaison afin d’en évaluer la valeur prédictive. Nos données rétrospectives sont utilisées pour développer un logiciel de post-traitement clinique de la CMRO2 avec Olea Medical. Son efficacité pour suivre un traitement comme l'inclinaison sera démontrée grâce aux nouvelles expériences. Des analyses corrélatives seront réalisées entre les mesures de déficits moteurs observés chez l'animal via une tâche de prise alimentaire nécessitant une dextérité motrice qui sera affecté par l’AVC et mettra en jeu des mécanismes d’adaptation comportementale que l’on pourra corréler avec nos marqueurs d’activité cérébrale dans les régions corticales et sous-corticales associés à l’intensité des déficits ou de la vitesse de récupération.
Bénéfices attendus
Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la reperfusion cérébrale dans les mécanismes de récupération fonctionnelle post-AVC. Grâce à l’étape d’habituation et d’entraînement des animaux à la réalisation de la tâche de prise alimentaire et à la manipulation pour le test de la motricité, le stress des animaux sera réduit, car ceux-ci participeront d’eux même à leur mise en chaise et seront habitués aux sorties quotidiennes. La restriction hydrique augmentera leur motivation pour réaliser la tâche. Notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant la procédure de l’HDT15°, un traitement non pharmacologique de première intention pour améliorer la reperfusion cérébrale et limiter les processus lésionnels, tout en favorisant la récupération fonctionnelle de nombreux patients atteints d’AVC. Nous pourrons ainsi avoir une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeux dans les phases précoces post-AVC, grâce aux nouveaux outils IRM pour mesurer la consommation d’oxygène cérébrale. En déterminant cette mesure de la CMRO2 au sein des structures cérébrales corticales et sous-corticales participant à la compensation fonctionnelle cela ouvrira certainement une meilleure prise en charge et un meilleur suivi thérapeutique des patients atteints d’AVC, avec une approche de plus en plus personnalisée. En combinant l’imagerie TEP avec l’IRM de diffusion à haute définition, nous allons avoir l’opportunité de caractériser les marqueurs d’inflammation sous-jacent aux processus lésionnels et de compensation et ainsi de mieux comprendre comment les zones cérébrales non-lésées peuvent compenser pour pallier la perte de fonction d’une région cérébrale ayant subi une lésion ischémique. L’IRM étant largement plus répandue et accessible en urgence que l’imagerie TEP, les marqueurs IRM pourront avoir un impact clinique très important. Afin d'être largement disponible pour une utilisation clinique dans les maladies cérébro-vasculaires, le pipeline de biomarqueurs IRM est implémenté dans une plateforme commerciale et sera optimisé pour une utilisation à la phase aiguë.
Procédures
Une légère anesthésie sera réalisée pour poser le collier des animaux (1 heure). L’apprentissage et la réalisation de la tâche alimentaire se fera sous un contrôle hydrique (4 mois et 15 jours). En fonction des performances de l'animal et de son apport hydrique venant des aliments obtenus dans la tâche, la quantité d'eau dans la bouteille sera ajusté pour donner un apport hydrique constant. Un apport nutritionnel complémentaire, composée de croquettes primates et légumes, sera dispensée dans la cage après chaque séance et sera pris en compte dans l’apport hydrique quotidien. Les jours de repos (week-end), les animaux auront un accès libre jusqu’au dimanche, où l’apport hydrique de référence pour chaque animal sera repris. Des imageries seront réalisées pour évaluer les lésions cérébrales et évaluer la valeur prédictive du CMRO2 ou de l’intensité du phénomène d’inflammation mesuré par IRM de diffusion ou l’imagerie (1/2 journée par imagerie). Des prélèvements de sang seront effectués sur tous les animaux, lors des étapes d’imagerie sous anesthésie. Ces prélèvements de sang seront plus nombreux lors de l’étape d’occlusion-reperfusion. Finalement un dernier prélèvement sanguin ainsi qu’un prélèvement de liquide céphalo rachidien (LCR) sera effectué avant l'euthanasie scientifique de l’animal. A la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés par injection intraveineuse létale d’un agent euthanasiant vétérinaire suite à une sédation à la kétamine, après prélèvement du LCR sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
La partie habituation/entraînement du projet peut induire un léger stress à l’animal au tout début de cette étape mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes. La partie du projet impliquant une intervention d’occlusion/reperfusion constitue une source potentielle de nuisances importantes. En effet l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, va provoquer des lésions cérébrales dans une zone localisée du cerveau. Ces lésions impliquent une perte des capacités motrices et cognitives de l’animal en post-opératoire, qui implique un isolement et un confinement de l’animal durant quelques jours, jusqu’à la récupération quasi-totale de sa motricité. Une étude précédente utilisant ce même modèle d’AVC chez le macaque a montré que la phase aigüe de l’AVC est la plus critique en termes d’effets indésirables sur les animaux (18% de risque de mortalité estimé). Une surveillance accrue des animaux sera donc réalisée lors de cette phase. Cette approche peut aussi induire des micro-accidents vasculaires par augmentation de la pression sanguine et de la rupture des vaisseaux cérébraux. C’est pour mesurer les risques de produire des effets indésirables découlant de ces potentiels accidents vasculaires induit par l’approche thérapeutique testée qu’il est essentiel de valider cette approche thérapeutique de reperfusion. Les parties de l’étude intégrant la phase d’entraînement et les examens d’imagerie sont considérées légères et modérés tandis que l’intervention d’occlusion/reperfusion qui présente des risques de déficits lésionnels étant classée en procédure plutôt sévère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure sévère pour tous les animaux.
Devenir
A l’issu de la procédure, 45 jours après l’intervention, les animaux seront euthanasiés. Cette sortie de la procédure par une euthanasie sur tous les animaux est principalement justifiée par le fait qu’elle nous sera indispensable, pour valider les mécanismes au niveau cellulaire, des outils d’imagerie développés dans ce projet. Seulement des approches histologiques au niveau cellulaire, sur du tissu cérébral post-mortem, peuvent nous permettre de valider ces outils IRM de la CMRO2 ainsi que des processus inflammatoires.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est nécessaire pour valider l’efficacité et l’innocuité d’un nouveau traitement de l’AVC ischémique. En effet, les alternatives non animales (in silico, in vitro ou ex vivo) ne permettent pas d’étudier la sécurité de l'angulation de la tête et du corps à 15° lors de l'occlusion, les interactions entre les déficits moteurs observés et les marqueurs cérébraux associés à l’intensité des déficits ou de la vitesse de récupération. Avant de tester cette procédure chez l’Homme, il est donc nécessaire de l’évaluer avec un modèle animal pertinent. Il est donc judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’Homme dans le cadre de l’AVC ischémique. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec des analyses comportementales. Ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Ainsi, les informations obtenues sur le PNH seront plus facilement transposables et applicable à l’humain qui subit une perte de fonction similaire découlant d’un AVC. Enfin, le macaque cynomolgus est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale.
Réduction
Le nombre d’animaux minimum permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations mesurées grâce à un calcul de puissance est de 8 animaux. Au total, nous prévoyons 12 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux pour réaliser des corrélations (n=8) chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2 à 4). En effet, en nous basant sur la précédente étude ayant utilisée ce modèle PNH d’AVC par occlusion de l’artère cérébrale moyenne, nous estimons à 18% le taux possible de mortalité suite à la procédure d’AVC. Si le nombre d’animaux atteignant un point limite s’avérait inférieur à notre prévision, dû probablement à l’effet bénéfique de l'angulation de la tête et du corps de 15° sur la reperfusion cérébrale, nous limiterons le nombre total d’animaux au nombre nous donnant une puissance statistique suffisante. Si nous réussissons à mener nos 8 premiers animaux à pouvoir faire toutes les étapes du protocole et que nous obtenons une puissance statistique suffisante, nous nous gardons la possibilité de réduire le nombre prévu de 12 à 8 animaux.
Raffinement
Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Par exemple, l’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’ischémie-reperfusion cérébrale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères, chaque sujet étant son propre contrôle. De plus, le fait que nos deux principales mesures d’imageries, l’IRM de la CMRO2 et la TEP, seront réalisées simultanément grâce à la caméra hybride, nous pourrons limiter le nombre d’examens par animaux dans cette étude. Dès leur arrivée et tout au long de l’étude, en dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés en groupes sociaux (4 ou 2), lorsque possible. Pour maximiser les effets bénéfiques de l’environnement, même durant les périodes post-AVC, les animaux seront toujours maintenus en hébergement par paire, pour limiter les effets délétères de l’isolement. Les animaux disposeront d’une quantité d’eau de boisson contrôlée et d’une quantité quotidienne d’aliment adaptée à leur poids.
Choix des espèces
L’organisation du système nerveux central est très différente selon les espèces, aussi bien au niveau macroscopique (taille des différentes structures) qu’au niveau moléculaire. Ce projet sera donc réalisé chez le macaque cynomolgus, du fait de sa proximité phylogénétique avec l’Homme et en particulier en raison des similitudes du cerveau et des comportements entre ces deux espèces. Les animaux utilisés seront adolescents car ce sont des animaux qui n’ont jamais été utilisés dans d’autres études.
Décryptage et ciblage des interactions cellules endothéliales/cellules immunitaires dans le but de limiter la toxicité digestive radio-induite à l’aide d’un modèle murin
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère. Une partie est irradiée à l'abdomen, une autre subit une chirurgie pour irradier directement l'intestin grêle, un modèle dont le porteur indique qu'il entraîne 50 % de mortalité, pour étudier les séquelles digestives de la radiothérapie pelvienne. Le porteur décrit la radiothérapie comme un traitement "incontournable" du cancer et souligne l'insuffisance des thérapies contre ses séquelles. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative au modèle animal pour reproduire l'interaction entre les tissus vasculaire, stromal, inflammatoire et épithélial.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au niveau du côlon et de l’intestin grêle qui sont responsables des séquelles tardives des irradiations de la zone pelvienne occasionnés par la radiothérapie.
Bénéfices attendus
La radiothérapie externe est l’un des traitements incontournables dans la prise en charge des cancers (60% des patients en bénéficient). L’objectif est la recherche d’un compromis entre le contrôle du volume de la tumeur et les dommages aux tissus sains, situés autour de la tumeur. En effet, l’irradiation des tissus sains de la zone pelvienne entraîne de nombreux effets toxiques au niveau de certains organes tels que le côlon, le rectum ou l’intestin grêle dits « organes radiosensibles » du fait d’une forte capacité d’auto-renouvèlement des cellules et aussi d’une forte sensibilité aux rayonnements ionisants. La toxicité radio-induite du tissu intestinal peut entrainer chez certains patients des séquelles à long terme, altérer fortement la qualité de vie du patient voire même dans les cas les plus sévères engager son pronostic vital. L’ensemble et la complexité des séquelles induites suite à une radiothérapie pelvienne ont amené à la définition d’une nouvelle maladie, la « Pelvic Radiation Disease » ou PRD. Le nombre de patients survivants au traitement d’un premier cancer et leur durée de vie augmentent grâce aux progrès de la médecine. L’augmentation de cette survie est associée à une augmentation du risque de complications. Une prise en charge globale du traitement du cancer intégrant le suivi des patients à long terme (> 20ans) est donc indispensable. De plus, réduire les risques de séquelles du traitement du cancer dans leur globalité et améliorer la qualité de vie des patients est un objectif du troisième plan cancer 2014-2019. À ce jour, la complexité physiopathologique de la PRD encore mal décrite, associée au contexte septique intestinal, limite l’efficacité des thérapies disponibles ainsi que la mise en place de nouvelles thérapies efficaces et pérennes. L’arsenal thérapeutique disponible pour le traitement des complications des radiothérapies est insuffisant. Ce projet, utilisant des techniques d’exploration innovantes (études scRNAseq, transcriptomique spatiale), permettra d’améliorer les connaissances sur l’effet des irradiations sur le tissu colique et intestinal et de déterminer des nouvelles voies de traitement ciblant des interactions cellules/cellules.
Procédures
Selon les modalités d’irradiation, les animaux seront anesthésiés pour être irradié localement au niveau de l’abdomen (durée max de 10 min) ou ils subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie afin d’irradier une partie de l’intestin grêle (durée max de 30 min).
Impact sur les animaux
Suite à l’irradiation locale du colon, les souris vont avoir une dépilation au niveau de l’abdomen (zone irradiée). A cette dose, les animaux ne perdent pas de poids. Les animaux sont observés tous les jours. Les animaux présentant une perte de poids trop importante seront euthanasiés. Dans le modèle d’irradiation localisée de l’intestin grêle après chirurgie, la douleur des animaux sera gérée par des injections d’anti-douleurs et un suivi très poussé. Ce modèle entraine un taux de mortalité de 50 % chez les animaux irradiés (pas de mortalité chez les animaux contrôles avec chirurgie seule.)
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.
Remplacement
Le développement des séquelles coliques et intestinales nécessite l’interaction entre différents compartiments tissulaires (vasculaire, stromal, inflammatoire et épithélial), conditions retrouvées chez le modèle animal intégré. A ce jour, il n’existe pas d’alternative au modèle animal pour étudier les processus physiopathologiques des séquelles des radiothérapies pelviennes
Réduction
Les modèles d’expérimentation pour l’étude tardive des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, cellulaires et moléculaires des groupes de 10 à 20 animaux sont nécessaires en fonction du modèle et des mesures réalisées. Des tests statistiques seront réalisés afin de comparer tous les groupes entre eux.
Raffinement
Différentes mesures spécifiques sont prises pour réduire au maximum l’impact sur le bien-être des animaux - Diminution de la dose d’irradiation à la dose nécessaire et suffisante pour obtenir les atteintes souhaitées. - Anesthésie pour les irradiations - Analgésie per et post-opératoire le cas échéant - Suivi du comportement et de leur aspect physique (aspect du poil, mobilité, prostration, pesée)
Choix des espèces
Les modèles d’irradiation chez la souris permettent de reproduire des lésions colorectales et intestinales similaires à celles que l’on peut observer chez des patients ayant des séquelles graves des radiothérapies pelviennes. De nombreux outils pour les études moléculaires sont disponibles chez la souris. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte sont utilisés (8-10 semaines). L’objectif est de modéliser les lésions chez l’animal, histologiquement proche de celles observée chez l’homme mais de faire une relation directe souris/homme. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte (8-10 semaines). L’objectif est de modéliser les lésions chez l’animal, histologiquement proche de celles observée chez l’homme mais de faire une relation directe souris/homme.
Evaluation de thérapies cancéreuses sur des modèles de tumeurs greffées en sous cutané
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 7000
45 000 souris et 5 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère, la plupart tués à l'issue et environ 2 000 réutilisés. Ce projet de prestation prévoit 10 000 animaux par an sur 200 études, avec greffe de tumeurs sous la peau et administration de composés par de multiples voies, dont certaines sous anesthésie et chirurgie. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer nécroses, cachexie et perte de poids, et que les animaux ayant subi peu d'actes sont réutilisés pour entraîner les équipes à de nouveaux gestes. Il affirme que les méthodes alternatives ne prédisent pas l'efficacité in vivo et reconnaît que les reconstructions d'organes en 3D restent "marginales" dans sa pratique.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible de la pathologie cancéreuse humaine afin de pouvoir évaluer de nouveaux médicaments pour traiter le cancer chez l’homme. Pour cela, nous étudierons de nouveaux médicaments dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme. Cela permettra d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Nous nous focaliserons sur des modèles de cancer en sous cutané, dans la graisse mammaire ou en intradermique. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possible afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Afin d’évaluer l’efficacité antitumorale et la tolérabilité de potentiels traitements anticancéreux, des tumeurs sous cutanées ou intradermiques ou dans la graisse mammaire seront induites par injection de suspension de cellules ou greffe de fragment (sous anesthésie générale avec analgésie,
Impact sur les animaux
- Trois types de greffes pourront être faites : Sous cutanée, intradermique et graisse mammaire sous anesthésie générale, et avec analgésie pour l’intradermique et fragment de tumeur en SC (incision chirurgicale de la peau). - L’évolution tumorale entrainera une distension de la peau qui peut engendrer une douleur légère ou une gêne dans la mobilité. - Il est possible que des nécroses apparaissent. La tumeur n’étant pas innervée, seules les plaies en surface peuvent engendrer une douleur. - La progression tumorale peut parfois entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. - Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés dans différents schémas d’administration, par voie topique, intradermique (avec analgésie), sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire (avec analgésie), orale, intrapéritonéale, intratumorale, les traitements pourront induire un stress léger. - Des effets secondaires des composés pourraient être observés, leur observation constituant le paramètre d’intérêt dans le cas des études de tolérance (procédure 3). - Si les animaux sont irradiés le délai d’acclimatation pourra être de 48h . - Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. - - Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.
Devenir
Les animaux seront en général mis à mort afin de prélever de grands quantités de sang ainsi que les organes et tumeurs pour analyse et évaluation de l’efficacité des traitements et / ou de leur toxicité éventuelle. Toutefois, les animaux ayant subi peu d’actes (sévérité modérée ou légère, animaux exclus de la randomisation etc) pourront être réutilisés pour former les équipes à de nouveaux gestes.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales. Des tests sont effectués dans la mesure du possible sur cultures cellulaires et sur prélèvements de tumeurs de patients.
Réduction
Les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le volume tumoral et/ou le poids). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité et/ou traité avec le véhicule, et un groupe avec tumeur traité avec le composé à tester. Dans la mesure du possible, le maximum de composés seront testés au cours de la même étude afin de ne pas démultiplier les animaux contrôles. Le nombre d’animaux implantés est déterminé sur la base de la prise et de l’évolution tumorale de chaque lignée tumorale grâce aux précédentes études. Il ne sera pas prévu plus de 10% d’animaux résidus non inclus dans un groupe après randomisation. Dans le cas des études d’efficacité, le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études (6 à 15 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Les comparaisons statistiques sont effectuées à l’aide du test ANOVA. Dans le cas des études de biodistribution tolérance sur animaux porteurs de tumeurs, dans la mesure du possible , le premier traitement des différents groupes sera décalé d’au minimum 24h, avec lancement initialement du groupe à la plus faible dose. Si 20% ou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure.. Le nombre minimum permettant de déterminer la MTD et la pharmacocinétique a été identifié : 3 à 5 animaux par groupe seront utilisés. Ce nombre pourra augmenter jusqu’à 10 en cas de variabilité du modèle. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine et recevront des soins (réhydratation, eau gélifiée et nourriture au fond des cages) adaptés à leur niveau de perte de poids. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Les actes douloureux (greffe de tumeur ou de cellules cancéreuses, chirurgies) seront réalisés sous anesthésie profonde avec analgésie forte. Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements de sang et d’urine) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible. Les administrations douloureuses seront réalisées avec analgésie. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction de pathologie cancéreuse et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. En cas de toxicité sur l’animal et afin de limiter la souffrance des animaux une procédure sous forme d’un arbre décisionnel validée par la SBEA sera suivi par l’équipe.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines minimum).
Effet de candidats médicament sur la sécrétion acide gastrique chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
2 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Ils reçoivent les composés à tester, puis subissent une chirurgie de ligature de l'estomac, une partie d'entre eux étant réveillés malgré la laparotomie et les sutures, avant d'être tués au plus tard trois heures après pour mesurer l'acidité gastrique. Le porteur reconnaît qu'il ne peut exclure une douleur liée à la chirurgie et que les composés peuvent provoquer des ulcères. Ces tests relèvent d'exigences réglementaires de pharmacologie de sécurité, et le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour un système intégré.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer les effets de candidats médicaments sur la sécrétion acide gastrique chez le rat afin 1) d’identifier et éventuellement prévenir l’apparition d’effets secondaires tels que des ulcérations ou 2) de déterminer d’éventuels effets anti-ulcérogènes.
Bénéfices attendus
Ces études font partie des requis en termes de pharmacologie de sécurité pour des candidats médicaments susceptibles de moduler la sécrétion acide gastrique ou de moduler les effets de molécules connues comme inductrices de la sécrétion acide gastrique (par exemple les anti-inflammatoires non-stéroïdiens). Elles sont requises pour une meilleure connaissance des effets secondaires potentiels de candidats médicaments et pour une information complète du clinicien et/ou du patient. Elles peuvent conduire à la mise en œuvre d'une surveillance de signaux d'alerte gastro-intestinale et/ou de mesures de protection gastrique. La procédure réalisée sur un animal anesthésié pendant toute la durée de l'expérimentation permettra de limiter la souffrance animal.
Procédures
Trois heures au maximum avant la chirurgie, les animaux vont recevoir les composés à tester. Les rats sont ensuite anesthésiés et une incision est réalisée pour permettre la ligature de la sortie de l’estomac (le pylore). Pendant toute la durée de la chirurgie (maximum 20 minutes), l'animal est placé sur tapis chauffant. Après avoir refermé la cavité abdominale, l'animal est remis soit dans sa cage, soit maintenu sous anesthésie pour le restant de l'expérience. Au maximum 3 heures après la chirurgie, l'animal est euthanasié et l’acidité (pH) et le volume du contenu de l’estomac sont mesurés. Un prélèvement sanguin pourra être effectué juste avant le prélèvement de l’estomac pour déterminer les taux de candidats médicaments.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue dans ce projet est celle liée à la chirurgie surtout lors de la procédure avec réveil de l’animal : même s’il y a administration d’un analgésique (buprénorphine), nous ne pouvons exclure à minima une gêne, voire une douleur résultant de la laparotomie, de la ligature du pylore et des sutures des couches musculaires et cutanés. Dans une moindre mesure, les autres nuisances attendues sont celles liées au stress de la mise à jeun, au stress de l’administration des candidats médicaments (contention, piqure…) et aux effets sur les sécrétions d’acide gastrique (possible apparition d’ulcères).
Devenir
Du fait du protocole (prélèvement de l'estomac), l'ensemble des animaux est mis à mort à l'issue chaque procédure.
Remplacement
A notre connaissance, il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro reportées dans la littérature qui permettent d'évaluer les effets de candidats médicaments sur la sécrétion acide gastrique dans un système intégré.
Réduction
Dans ce projet, le nombre d'animaux sera adapté à la puissance statistique requise pour pouvoir tirer des conclusions valides des résultats obtenus et ce en tenant compte des variabilités et dynamiques de la réponse physiologique suivie décrites dans la littérature et mesurées dans des essais antérieurs réalisés au laboratoire. Les volumes de sécrétion gastrique ainsi que l'acidité seront comparés en fonction des traitements. Le cas échéant, des prélèvements sanguins seront réalisés en parallèle pour obtenir des informations supplémentaires (par exemple des taux de candidats médicaments) sur ces mêmes animaux. Une prise en compte des données de pharmacocinétique dans le choix de doses et le(s) temps d'euthanasie post administration sera effectuée.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par l'usage de procédures rigoureuses, la formation du personnel, la détermination des points limites adaptés et au recours aux procédures d'euthanasie dès que nécessaire. Avant expérimentation, les animaux sont hébergés en groupe de 4 maximum dans une cage avec enrichissement (tunnel, balle, brique de bois à ronger, sizzle pad) dans une animalerie à température et hygrométrie contrôlées. La souffrance liée à la chirurgies sera limitée par l'administration d'antidouleurs. La procédure "pilote" a pour objet de raffiner l'expérimentation animale, en effet elle permettra de travailler sur un animal anesthésié toute la durée de la procédure et ainsi d'éviter les souffrances liées à la procédure classique.
Choix des espèces
A ce jour, le rat constitue un bon modèle pour une approche expérimentale in vivo des effets sur la sécrétion acide gastrique. La physiologie de l'estomac de cette espèce est largement documentée, d'un point de vue expérimentale l'estomac du rat est suffisamment grand pour le geste chirurgical et pour les mesures de volume et l'acidité des sécrétions. Des animaux adultes seront utilisés. Ce projet n'a pas pour objet d'étudier les effets sur la sécrétion acide gastrique à d'autres stades de développement.
Développement d’un vaccin vivant atténué contre la Peste Porcine Africaine
- Recherche appliquée
- Maladies animales
167 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont vaccinés avec une souche atténuée puis infectés par des souches virulentes de peste porcine africaine, avec de nombreux prélèvements sanguins. Le porteur indique que les animaux non vaccinés développeront une fièvre marquée et les symptômes de la maladie, et qu'ils seront mis à mort dès l'atteinte d'un point limite comme une perte de poids de 20 % ou une température trop élevée. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'évalue la réponse du porc à l'infection et qu'il est "indispensable" de recourir à cette espèce cible.
Objectifs
Nous travaillons sur une souche atténuée de virus de la Peste Porcine Africaine (PPA) à potentiel vaccinal. Cette souche a été produite initialement sur des cellules prélevées sur des porcs. Dans l'objectif d'un développement industriel de ce candidat vaccin, le laboratoire a adapté la souche à se multiplier sur lignée cellulaire ; et a ainsi obtenu la souche"atténuée-lignée". Au cours d’une étude sur porcs Exempts d’organisme pathogènes spécifiques (EOPS), la souche atténuée-lignée a montré une très bonne sécurité et efficacité vaccinale. Les résultats de laboratoire ont également montré que la souche atténuée-lignée contenait un mélange de 3 virus atténués légèrement différents entre-eux. L'objectif du présent projet est dans un premier temps de séparer ces 3 virus atténués (par des travaux de laboratoire) et d’évaluer leur sécurité et leur efficacité vaccinale chez nos porcs EOPS. Par la suite, une fois le meilleur virus atténué choisi et multiplié, la sécurité et l’efficacité de la souche vaccinale pure seront évaluées vis-à-vis d’une souche de terrain de virus de la PPA, ceci chez des porcs d’élevage. Il sera vérifié finalement la stabilité de cette souche atténuée-lignée au cours de passages répétés chez ces animaux.
Bénéfices attendus
La peste porcine africaine est une maladie virale qui se caractérise par des signes cliniques tels qu’une perte d’appétit rapide et un abattement des porcs en lien avec une forte fièvre, ainsi que des hémorragies cutanées, diarrhées, etc., qui vont induire une forte mortalité chez les porcs domestiques comme chez les sangliers. Pour le moment, il n’existe pas de vaccin commercialisé contre la PPA. De ce fait, la gestion des foyers de PPA repose chez les porcs domestiques sur des mesures de restriction de mouvement des animaux et des abattages massifs. Chez les sangliers sauvages, la gestion des foyers est complexe et repose sur la mise en place de clôtures et de piégeages. D’un point de vue sociétal, ces mesures de gestion sont de plus en plus critiquées et la disponibilité d’un vaccin pourrait offrir une solution plus acceptable. Si les résultats de notre projet sont conformes aux attendus en termes de sécurité et d’efficacité vaccinale, la souche atténuée-lignée pourrait être utilisée à terme comme vaccin, à la fois chez les porcs domestiques (après vaccination intramusculaire), mais aussi chez le sanglier (vaccination par des appâts comestibles).
Procédures
Selon les groupes, les animaux seront soumis à une vaccination par voie intramusculaire (IM) ou bien oronasale (ON) puis à un challenge viral par voie IM ou ON. Les vaccinations / challenges par voie IM ou ON sont des actes rapides qui prennent moins d’une minute. Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins (selon les groupes de 2 à 13 prises de sang d’une durée d’1 à 2 miniutes chacune) répartis tout au long du suivi des animaux.
Impact sur les animaux
Suite à l’inoculation de la souche atténuée-lignée (par voie IM ou ON), les porcs pourraient présenter un court épisode de fièvre pendant lequel leur consommation alimentaire et leur croissance pourraient être diminuées. Chez les animaux non vaccinés, le challenge avec les souches virulentes de virus de la PPA devrait conduire à une fièvre marquée et des symptômes caractéristiques de la PPA. Pour éviter que les animaux souffrent ils seront mis à mort dès l’atteinte d’un des points limite.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Des prélèvements de tissus (pour recherche virologique) sont prévus à la fin de chaque procédure, la mise à mort des animaux est donc indispensable.
Remplacement
Aucune méthode in vitro d’évaluation directe de la réponse du porc à l’infection ou à la vaccination par le virus de la PPA n’est disponible
Réduction
Généralement, les lots de porcs vaccinés et les lots témoins seront constitués chacun de 6 animaux et les contrôles positifs (lots non-vaccinés et challengés) de 3 porcs. Si nécessité de mettre en évidence des différences plus fines entre les conditions expérimentales, l’effectif des groupes sera alors porté à 8 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux a été déterminé de façon à pouvoir comparer statistiquement les résultats
Raffinement
Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets. Après chaque prélèvement (réalisé sans anesthésie car non douloureux), une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants (score clinique >15/40, non réponse à des stimuli tactiles et visuels, perte de poids ≥ 20% sur une semaine, température supérieure à 41,8°C pendant plus de 48 h ou inférieure à 36°C pendant plus de 24 h), les animaux seront mis à mort par anesthésie profonde suivie d'une saignée.
Choix des espèces
Etant donné que seuls les porcins sont sensibles à l’infection par le virus de la PPA, il est indispensable d’avoir recours aux porcs pour cette étude (=espèce cible). Sur le terrain les porcs sont généralement vaccinés au moment du sevrage. Nous nous mettrons ici dans des conditions similaires en vaccinant les animaux à 4 semaines d’âge.
Etudes sur des modèles murins de cancer, d’une nouvelle stratégie de vaccination anti-tumorale utilisant des nanoparticules dérivées de virus de plantes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
3 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections d'une nanoparticule dérivée d'un virus de plante puis des cellules tumorales, avec jusqu'à six anesthésies et cinq prélèvements sanguins, pour développer des tumeurs cutanées ou des métastases pulmonaires. Le porteur indique que la croissance des métastases peut provoquer des difficultés respiratoires et la mort par congestion pulmonaire, et que les tumeurs cutanées peuvent nécroser, s'ulcérer et saigner. Il conclut qu'aucun autre système que l'animal ne reproduit la complexité des interactions entre système immunitaire et tumeur, jugeant le recours à un "organisme animal" nécessaire.
Objectifs
Les thérapies antitumorales qui existent aujourd’hui (chimiothérapie, immunothérapies…) permettent certes d’éradiquer certaines tumeurs mais d’autres restent résistantes. C’est pourquoi la recherche de nouvelles thérapies, à utiliser seules ou en combinaison avec celles déjà existantes, se poursuit. Dans l’organisme, il existe des cellules immunitaires qui, tels des chefs d’orchestre, sont capables après reconnaissance d’un fragment de tumeur, d’induire une réaction immunitaire qui détruit les cellules tumorales sans affecter les autres cellules. Afin de déclencher, chez le patient, une réaction immunitaire spécifique et efficace, des composés thérapeutiques innovants qui adressent une fraction de tumeur à ces cellules immunitaires d’intérêt sont développés. Les nanoparticules sont des objets de petite taille (10-100 nm) et de composition variable (protéines, lipides…) qui peuvent pendant ou après leur synthèse être modifiés pour enfermer ou exposer différentes molécules d’intérêt (par exemple une molécule de ciblage et un agent thérapeutique). Elles suscitent donc un grand intérêt pour ce genre d’applications. Ce projet vise à étudier le potentiel antitumoral d’une nouvelle particule thérapeutique dérivée d’un virus de plantes que nous avons produite. Celle-ci est non-toxique et particulièrement innovante car très adaptable, en effet, le fragment tumoral qu’elle renferme peut être facilement changé afin de déclencher une réponse très spécifique de la tumeur à détruire. Dans ce projet, nous souhaitons étudier chez la souris si cette nanoparticule est capable d’empêcher l’émergence de nouvelles tumeurs et/ou de réduire la taille de tumeurs installées. Nous étudierons l’effets des nanoparticules sur des métastases pulmonaires et sur deux tumeurs cutanées de types différents. Ainsi, nous souhaitons étudier si cette nanoparticule peut avoir des applications en thérapie anti-cancéreuse pour de multiples cancers.
Bénéfices attendus
La nouvelle nanoparticule utilisée dans cette étude pour de la vaccination anti-tumorale constitue une innovation intéressante qui pourrait enrichir les stratégies existantes pour lutter contre le cancer. En effet, si aujourd’hui les nouvelles immunothérapies ont certes permis d’améliorer la rémission de certains patients, d’autres demeurent résistants à ces composés. Pour ceux-ci, utiliser des nanoparticules innovantes seules ou en combinaison avec d’autres composés thérapeutiques déjà existants pourrait constituer une alternative thérapeutique. Par ailleurs, la nanoparticule utilisée dans cette étude peut-être facilement modifiée pour s’adapter au mieux à différentes pathologie tumorales, ce qui est un atout certain. A terme, des particules intégrant un (ou plusieurs) autre(s) fragment(s) tumoral(aux) d’intérêt pourraient être développées. Après des études précliniques et cliniques, elles pourraient, chez l’Homme, compléter les traitements existants pour lutter contre le cancer.
Procédures
Au cours de l’expérimentation, les animaux seront soumis à plusieurs gestes techniques. En effet, ils recevront une ou trois injections de nanoparticules espacées de 5 jours par voie intradermique dans l’oreille ou par voie sous-cutanée dans le flanc. 3 à 8 jours après ou avant ces injections, selon la procédure, les animaux recevront par ailleurs une injection de cellules tumorales soit par voie intraveineuses (modèle métastases) soit par voie sous-cutanée dans le flanc (modèle tumeur solide). Par ailleurs, au cours de la procédure jusqu’à 5 prélèvements sanguins seront effectués. Ils seront d’un volume adapté à leur fréquence pour laisser le temps à l’organisme de l’animal de régénérer tout son volume sanguin avant le prélèvement suivant. Ces trois types d’intervention seront tous réalisés sous anesthésie générale gazeuse (complétée avec un anesthésiant local pour les injections intraveineuses). Les animaux subiront au total au plus 6 anesthésies générales espacées d’au moins 3 jours. Chaque anesthésie durera environ 10-15 minutes.
Impact sur les animaux
Les impacts cliniques prévus sur les animaux inclus dans cette étude sont décrits ci-dessous. Les injections de nanoparticules peuvent localement au niveau du site d’injection (oreille ou flanc) provoquer un une réaction inflammatoire locale courte et de faible amplitude qui pourrait causer une souffrance limitée (démangeaisons, rougeur cutanée, croûte) pour l’animal pendant au plus 2 jours. Dans de très rares cas, une infection pourrait survenir au niveau du site d’injection. La non-toxicité des nanoparticules a été vérifiée en amont ainsi, en elles mêmes, les nanoparticules injectées ne seront pas sources d’effets indésirables elles pourraient en revanche avoir un effet bénéfique sur la croissance tumorale et donc réduire les nuisances associées. Les injections de cellules tumorales (flanc ou voie intraveineuse peuvent être sources d’inconfort/gêne locale. Dans le modèle des métastases, la croissance des foyers métastatiques sur les poumons des souris peut provoquer des difficultés respiratoires et conduire à terme à la mort de l’animal par congestion pulmonaire. Dans les modèles cutanés de tumeurs solides la croissance tumorale peut être source de douleur. Si la tumeur atteint une taille trop élevée, elle peut nécroser en son centre, ulcérer et/ou saigner. En outre, en plus des répercussions liées à la localisation des cellules tumorales, des nuisances systémiques peuvent apparaître : le comportement et les capacités locomotrices des animaux peuvent être affectés. Les prélèvements sanguins répétés (au plus 5) seront suffisamment espacés et d’un volume adapté pour laisser au temps à l’organisme de l’animal de regénérer son volume sanguin entre deux prélèvements. Ainsi les animaux ne devraient que très légèrement être affaiblis par la réduction transitoire de leur volume sanguin. Après le prélèvement, au niveau du point de prélèvement du sang, une croûte pourrait se former et démanger l’animal, cette dernière devrait se résorber rapidement. Enfin toutes les manipulations répétées des animaux préalables aux injections et aux prélèvements sanguins peuvent être sources de stress. Pour limiter le stress et la douleur occasionnés par les injections et les prélèvements sanguins, les animaux seront placés sous anesthésie générale gazeuse parfois complétée avec une anesthésie locale au niveau du site d’injection. Les animaux seront toujours manipulés par du personnel compétent, habitué et sensibilisé au bien-être animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en vue de récupérer différents organes. Leur analyse permettra de conclure quant aux effets de la vaccination avec des nanoparticules sur la croissance des tumeurs.
Remplacement
Lors d’études préliminaires in vitro nous avons confirmé la non-toxicité des nanoparticules et avons obtenu des résultats très encourageants qui démontrent que les nanoparticules étudiées ici sont capable d’adresser spécifiquement une molécule bioactive aux cellules ciblées capables ensuite in vitro d’être fonctionnelles. Nous avons également, chez des animaux non porteurs de tumeurs, montré in vivo que les nanoparticules sont capables d’activer le système immunitaire. Ici nous souhaitons étudier son potentiel effet anti-tumoral à empêcher la croissance tumorale voire à conduire à son éradication complète. Si la nanoparticule a un effet celui-ci sera la conséquence d’une activation de différentes mécanismes complexes du système immunitaire conduisant à la mise en place d’une réponse immunitaire spécifique de la tumeur et à la suppression spécifique des cellules tumorales. ll n’existe actuellement pas d’autre système que le modèle animal pour reproduire fidèlement la complexité des interactions entre cellules immunitaires et cellules tumorales. Ainsi le recours à un organisme animal est nécessaire.
Réduction
Nos premières études in vivo (décrites dans une autre demande APAFIS déjà autorisée) indiquent que l’injection dans les oreilles des particules induit chez la souris la mise en place d’une réponse immunitaire efficace. Nous n’avons pas encore étudié l’injection dans le flanc (études également autorisées dans une précédente demande) si celle-ci s’avère inefficace, nous nous limiterons, à l’étude de l’effet antitumoral des particules par la seule voie intradermique (oreille), réduisant alors le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de souris utilisées dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Il est prévu de réaliser chaque expérimentation 4 fois afin de s’assurer que les effets observés soient constants et reproductibles d’une expérimentation à l’autre. Pour chaque condition testée, 3 animaux seront inclus par expérimentations pour atteindre au plus 12 souris par groupe. Si dès la troisième répétition d’expérience (effectif de 9 animaux) des effets sont mis en évidence par les tests statistiques alors nous ne réaliserons pas la quatrième répétition, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés. Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adéquats qui permettront de mettre en évidence des éventuels bénéfices du traitement avec la nanoparticule sur la mise en place des tumeurs chez les souris.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes dans des cages enrichies avec l’ajout de nids et de bâtons à ronger. Les animaux seront surveillés et manipulés par des personnes compétentes et formées au bien-être animal. Quotidiennement, leur état général sera surveillé visuellement afin de déterminer l’éventuelle présence de signes de stress ou de souffrance (attitude prostrée, dos voûté, démarche anormale, …). Après l’injection des cellules tumorales, 3 fois par semaine, les animaux seront pesés et la taille des tumeurs cutanées sera mesurée. Par ailleurs, le nombre de cellules tumorales injectées a été choisi en accord avec les données de la littérature comme permettant l’induction de tumeurs dont la temporalité de croissance est bien connue ce qui nous a permis de définir des points limites ou une fin de protocole en amont d’une souffrance animale trop élevée. En cas d’atteinte d’un des points limites l’arrêt anticipé de l’expérimentation sera alors décidé. Les injections (intradermiques, intraveineuses, sous-cutanées) et les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Par ailleurs, dans le cas des injections par voie intraveineuse l’anesthésie générale sera complétée d’une anesthésie locale au niveau du site d’injection.
Choix des espèces
Les souris (Mus musculus) sont des mammifères dont le système immunitaire est très proche du système immunitaire humain tant du point de vue des caractéristiques des cellules immunitaires que des mécanismes globaux. En particulier, la type de cellules que nous souhaitons cibler avec notre nanoparticule dans cette étude est décrite avec des caractéristiques proches chez l’homme et chez la souris. Ainsi, pour nos études précliniques, la souris est un modèle de choix. Il existe des procédures bien décrites dans la littérature qui permettent de mettre en place chez la souris des modèles de métastases ou de tumeurs solides afin d’étudier une nouvelle particule thérapeutique et de suivre ses éventuels effets bénéfiques sur les tumeurs. Nous utiliserons des souris femelles adultes jeunes (2 à 3 mois) qui possèdent un système immunitaire mature et fonctionnel.
Comprendre et cibler l’épitranscriptome de l’îlot pancréatique pour restaurer la sécrétion d’insuline dans le diabète de type 2.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Elles subissent des injections intrapéritonéales de glucose et d'insuline, des gavages, un séjour en cage métabolique et des injections répétées de deux inhibiteurs, le brequinar et le bisantrène, pour étudier une enzyme liée à la sécrétion d'insuline dans le diabète de type 2. Le porteur indique que ces molécules sont cytotoxiques in vitro et qu'elles ont provoqué chez l'humain des effets toxiques sur le sang et le foie, les souris étant surveillées et euthanasiées si elles perdent 20 % de leur poids. Il conclut que les lignées cellulaires ne permettent pas d'étudier la communication entre organes, ce qui justifierait le modèle in vivo.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer, in vivo, le rôle de la déméthylase FTO dans la fonction et l’identité des cellules bêta au sein des îlots pancréatiques mais égalment dans d'autres organes métaboliques. Pour cela nous injecterons dans différents modèles de souris des inhibiteurs pharmacologiques de cette enzyme, le bisantrene et le brequinar puis nous étudierons leurs différents effets au niveau transcriptionnel et métabolique. Des modèles génétiques d'invalidation du gène codant l'enzyme seront également utilisés pour les différents tissus (cellules bêta et alpha pancréatiques, foie, tissus adipeux)
Bénéfices attendus
Des données préliminaires réalisées au sein du laboratoire sur des lignées cellulaires bêta pancréatiques montrent que l’inhibition de la déméthylase FTO (par siRNA ou inhibiteurs pharmacologiques) améliore l’expression des gènes de l’identité et de la fonction de la cellule bêta pancréatique, associé à une augmentation de la sécrétion d’insuline. Ainsi les résultats obtenus au cours du projet pourraient nous permettre d’identifier in vivo de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de conserver la masse des cellules bêta pancréatiques et/ou d'améliorer la sécrétion d’insuline au cours du diabète de type 2.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - une prise de poids régulière 2 fois par semaines au maximum. - suivi en cage métabolique (durée 1 semaine) - des injections intrapéritonéales de glucose, pyruvate ou insuline (6 fois pour chaque individu, en cours et fin de protocoles, chaque expérimentations étant espacées d'une semaine minimum, durée 4 heures) - des gavages de glucose (3 fois pour chaque individu, en cours et fin de protocoles, durée 4 heures) - des injections intrapéritonéales de molécule pharmacologiques (1 fois par jour pour chaque individu, pendant 5 à 20 jours, durée 1 heures), avec changement de site d'injection entre chaque injection
Impact sur les animaux
Les différents protocole pourront engendrer un stress chez les animaux suite aux diverses manipulations ainsi que des douleurs légères. Seuls l'effet du brequinar et du bisantrene, encore peu connu chez la souris, est susceptible d'induire des douleurs modérée chez les animaux et/ou des variations de comportements. Toutefois des études in vitro montrent que ces inhibiteurs peuvent être cytotoxiques. Chez l’Homme des essais cliniques pour le traitement de la leucémie ont également montré des effets hématotoxiques et hépatoxiques temporaires. Pour pallier à toutes ces nuisances, les animaux seront manipulés dans des pièces dédiées et calmes, avec une surveillance quotidienne pour détecter le moindre signe de souffrance (blessure, posture ou comportements anormaux, perte de poids importante, etc).
Devenir
Les animaux utilisés étant génétiquement modifiés, aucun des animaux utilisés en fin de protocoles sera maintenu en vie. Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude.
Remplacement
Des expérimentations in vitro, réalisées sur des lignées cellulaires de cellules bêta pancréatiques murines, montrent des résultats très encourageants quand au rôle de la déméthylase FTO et de ses inhibiteurs dans la régulation de l'homéostasie du glucose. Toutefois les modèles de lignées cellulaires sont limités et ne permettent pas d'étudier la communication inter-organe qui peut avoir lieu au cours de la régulation de l'homéostasie du glucose et du diabète de type 2. Ainsi l'utilisation de modèles in vivo, par l'utilisation de souris génétiquement modifiées, et/ou soumises à un régime riche en graisse, permet de reproduire les conditions physiologiques et physiopathologiques afin de mieux comprendre le rôle de la déméthylase FTO dans le développement du diabète de type 2 ou d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Pour définir statistiquement le nombre d'animaux nécessaires, nous avons utilisé une méthode statistique pour réduire au minimum le nombre d'animaux, permettant ainsi de déterminer le nombre exact d'animaux par expérimentation en fonction des paramètres recherchés.
Raffinement
Un suivi quotidien et une observation des animaux sont réalisés par les membres de l'équipe de l'animalerie dans laquelle les animaux sont hébergés. Les membres de l'équipe travaillant sur ce projet suivent également les animaux afin de garantir leur bien-être et minimiser au maximum leurs éventuelles souffrances. L'état général des animaux est évalué tous les jours par des observations quotidennes et pesées hebdomadaires. L’état général des animaux sera évalué par les utilisateurs ainsi le personnel animalier. Les points limites déterminés pour nos protocoles sont : le dos vouté, le poil hérissé, une perte de poids de 20% et la prostration ou l’absence de réaction des animaux. Dans ce cas l’animal sera enregistré au SBEA. Un traitement visant à soulager l’animal pourra être mis en place, le cas échant sans amélioration, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris reste le meilleur modèle permettant d’étudier l’importance d’un gène dans le développement de maladies et d’identifier de nouveaux traitements potentiels. Pour ce projet, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement déficientes pour le récepteur de la leptine (souris Db/Db), qui reproduisent la physiopathologie du diabète de type 2 ainsi que les souris contrôles correspondantes. Des souris C57Bl6J soumises à un régime standard ou riche en graisse seront également utilisées dans ce même but. Des souris invalidées dans les cellules alpha ou bêta pancréatiques et dans d'autres tissus pour le gène codant la déméthylase FTO pourront également être utilisées au cours du projet afin de mieux comprendre le rôle de Fto dans les différents organes métaboliques (MipCre Fto-Flox, RipCre Fto-Flox ; GcgCre Fto-Flox ; AdipoQCre Fto-Flox ; AlbCre Fto-Flox). Ces modèles de souris seront associés aux souris contrôles respectives. Les souris C57Bl6/J ou invalidées pour FTO seront utilisées à partir de 5 semaines de développement afin de mettre en place un régime alimentaire riche en graisse de 12 à 24 semaines et induire un phénotype diabétique. Des souris Db/Db de 8 et 16 semaines seront également utilisés pour les injections d'inhibiteurs de FTO (bisantrene ou brequinar). Les souris de 8 semaines permettront d'étudier les effets de l'inhibition de FTO dans des cellules bêta fonctionnelles. Les souris de 16 semaines permettront également d'étudier les effets de l'inhibition de FTO mais dans des cellules bêta ayant une fonction altérée.
Evaluation de l’efficacité de nouveaux promoteurs muscle-spécifiques chez le rat sain et chez le rat DMDmdx, modèle animal de la Dystrophie Musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
82 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats porteurs de la mutation de la myopathie de Duchenne et des rats sains reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur de thérapie génique, puis des prélèvements sanguins mensuels et un prélèvement terminal, pour tester de nouveaux promoteurs censés cibler le traitement sur les muscles. Le porteur justifie le choix du rat en écartant la souris, au phénotype jugé trop peu marqué, et le chien, jugé trop lourd à manipuler. Les bénéfices annoncés pour les patients, des doses plus faibles et moins de toxicité, sont renvoyés au conditionnel.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique liée au chromosome X affectant environ 1 garçon sur 5000 à la naissance. Elle est due à des mutations dans le gène DMD qui code pour une protéine appelée Dystrophine. La Dystrophine est essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité de l'ensemble des muscles de l'organisme (y compris le coeur). L’absence de Dystrophine dans les muscles provoque leur dégénérescence progressive, une faiblesse musculaire, la perte de la marche avant 15 ans, l’apparition de déficiences respiratoire et cardiaque, et, finalement une mort prématurée. Aucun traitement n’est disponible à ce jour pour la DMD. La thérapie génique, qui vise à corriger ou remplacer le gène DMD est aujourd’hui une approche prometteuse pour le traitement de cette maladie. Pour réaliser un transfert de gène efficace, il est possibile d'utiliser des vecteurs viraux dérivés des Virus Adéno-Associés (AAV) produits en laboratoire dans des systèmes cellulaires. Ils assurent un transfert de gène thérapeutique sûr et efficace dans différents tissus/organes (oeil, muscle, foie ou cerveau). Les AAV sont des produits thérapeutiques performants mais des essais précliniques et cliniques ont montré des limites à leur utilisation, avec notamment la nécessité d'utiliser de fortes doses, et un transfert de gène dans certains tissus non ciblés (tissus non musculaires), avec un risque de toxicité associé. Une approche pour contrer cet effet secondaire indésirable des vecteurs AAV repose sur l'utilisation, dans ces vecteurs AAV de séquences d'ADN particulières (appelées promoteurs "tissus-spécifiques"), qui vont permettre de restreindre le traitement uniquement dans les tissus ciblés dans la pathologie à traiter, soit, dans le cadre de la Dystrophie Musculaire de Duchenne, dans les muscles squelettiques et le coeur. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité et la spécificité de nouveaux promoteurs "muscle-spécifiques" portés au sein de vecteurs AAV. Cette évaluation se fera chez le rat DMDmdx, modèle animal pertinent de la DMD, mais également chez le rat sain, afin d'évaluer les potentielles différences d'activité de ces promoteurs entre un tissu pathologique et un tissu sain.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra d'identifier un (ou plusieurs) promoteurs "muscle-spécifiques" et de rendre les traitements utilisant les vecteurs de thérapie génique de type AAV beaucoup plus sécuritaires et plus efficaces: plus sécuritaires via le ciblage du traitement uniquement dans des tissus ciblés (ici les muscles), et plus efficaces car permettant d'obtenir un effet théraputique à une plus faible dose de vecteur AAV que celles actuellement utilisées. Une réduction des doses à injecter permettra de réduire la toxicité associée à l'injection de ces fortes doses, et de réduire le coût du traitement. L'identification de tels promoteurs "muscle-spécifiques" aura une application directe pour le traitement des patients atteints de DMD à l'aide de vecteurs AAV. De plus, si ces promoteurs montrent la même efficacité dans les muscles sains et dans les muscles dystrophiques, il pourra alors être envisagé de les utiliser dans des vecteurs AAV thérapeutiques visant à traiter d'autres types de maladies musculaires.
Procédures
(i) Injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale: geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: maximum 10min. (ii) Prélèvements sanguins au niveau d'une veine jugulaire le jour de l'injection, puis une fois par mois jusqu'à la mise à mort de l'animal (2 prélèvements pour les animaux suivis 2 mois post-injection, et 4 prélèvements pour les animaux suivis 4 mois post-injection). Prélèvements effectués sous anesthésie, pour un volume correspondant à 7.5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal. Durée de l'intervention: maximum 10min. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.
Impact sur les animaux
(i) L'injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale se fera sous anesthésie et ne provoquera donc pas de stress ou de douleur aux animaux. Les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur viral chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) Prélèvements sanguins mensuels au niveau d'une veine jugulaire: les animaux pourraient être stressés par les anesthésies, mais celles-ci seront espacées d'au moins 4 semaines, et les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.
Devenir
A l'issue de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses moléculaires et immunohistologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: muscle squelettique, coeur, foie et autres tissus majeurs). Ce projet, qui vise à évaluer l'efficacité et la spécificité d'éléments géniques régulateurs, à la fois dans un contexte malade (DMD) et un contexte sain, et dans plusieurs tissus différents, ne peut donc être réalisée in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets sur le modèle de rats DMDmdx, lors desquels des résultats d'analyses moléculaires et immunohistologiques cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de cette taille. Pour les rats DMDmdx, nous nous laissons la possibilité d'inclure un animal supplémentaire par groupe (avec un maximum de 10 animaux DMDmdx supplémentaires sur l'ensemble de l'étude), en cas de sacrifice prématuré d'un animal du fait de l'évolution de la maladie chez ces animaux avec phénotype dommageable.
Raffinement
Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (mise à disposition de tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois), un hébergement à deux animaux (par groupe expérimentaux), accès à l’eau et à l’alimentation à volonté. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).
Choix des espèces
Il existe un modèle de rat possèdant un défaut génétique dans le gène codant pour la protéine Dystrophine, le rat DMDmdx. Dans ce modèle animal de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD), l’expression de la dystrophine est nulle et le phénotype sévère. Les modèles animaux atteints de cette maladie les plus classiquement utilisés : souris déficientes en dystrophine (souris mdx) et chien Golden Retriver déficient en dystrophine (chien GRMD), présentent des limites pour les projets pré-cliniques : -La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires avec un phénotype peu marqué. -Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles des patients atteints de la Dystrophie Musculaire de Duchenne et un phénotype sévère, mais reste un modèle "gros animal" lourd à manipuler. Le rat DMDmdx est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Afin de comparer les résultats obtenus dans un contexte sain et un contexte dystrophique, des rats sains de type Sprague Dawley (même fond génétique que les rats DMDmdx) seront utilisés. Les animaux seront injectés à l'âge de 1 mois au niveau de la veine caudale. C'est un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles", et mimant donc le stade auquel des patients DMD pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants ou jeunes adolescents, pré-pubères). Les animaux injectés seront ensuite suivis sur une durée de soit 2 mois, soit 4 mois après injection pour documenter l’efficacité du traitement à 2 temps différents. Ce planning nous garantira de pouvoir effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre un âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère. En effet, cette myopathie est associée à une dégradation progressive de l’état général de l’animal. Cette dégradation devient sévère (troubles locomoteurs, douleurs à la manipulation) pour la plupart des animaux au delà de 8-9 mois.
Evaluation préclinique de produits de santé pour la neurologie
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Lapins : 300
Chiens : 100
Cochons : 100
Chèvres : 100
Moutons : 200
900 animaux non-humains, dont 300 lapins, 200 moutons, 100 chèvres, 100 cochons, 100 chiens et 100 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Chaque individu subit une chirurgie d'implantation d'un dispositif médical de une à deux heures, parfois suivie d'une seconde chirurgie de retrait, avec prélèvements sanguins, imagerie et enregistrements cérébraux pouvant durer jusqu'à quatre heures pendant lesquels l'animal peut être isolé. Le porteur décrit une activité de prestation menée pour un donneur d'ordre et indique que les tissus entourant l'implant sont prélevés après mise à mort pour analyse. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative et que la réglementation impose le recours aux animaux avant les essais cliniques.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en neurologie (exemple : électrode cérébrale pour la stimulation ou l'enregistrement de signaux cérébraux, implant pour soulager les douleurs de la colonne vertébrale, les hernies discales, implant pour la réparation des os du crane...). Ces produits, destinés à être mis en contact avec le corps humain et particulièrement avec le système nerveux (cerveau, moelle épinière) doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur sécurité et efficacité lors de l'utilisation clinique. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, ainsi que de la sensibilité et fragilité du système nerveux, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet, avant de pouvoir passer aux tests chez l'humain. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux de données de performance et de tolérance des produits de santé en neurologie. Ainsi, il est possible d'analyser ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une mise sur le marché. Pour chacune des procédures, qui décrivent différents modèles animaux permettant d'évaluer les dispositifs médicaux en fonction de leur indications cliniques (par exemple : électrode implantée dans le cerveau, système de stabilisation de la colonne vertébrale ...), les bénéfices susceptibles sont principalement de faire avancer les connaissances sur la réaction de l'organisme après mise en contact avec le dispositif médical mais aussi sur son efficacité. Cela permet d'obtenir des données sur la sécurité du produit (exemple : il n'induit pas de réaction inflammatoire anormale), et des données sur la performance du produit (exemple : le produit a engendré une stabilisation de la colonne vertébrale, évaluée par le biais de la fusion de 2 vertèbres entre elles). Ainsi si les différents produits obtiennent des résultats satisfaisants à ce stade, ils pourront ensuite passer à l'étape suivante des tests cliniques, chez l'homme, avant d'être proposés à l'ensemble de la population, après validation des instances réglementaires.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 1h et 2h). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), analgésie et antibiothérapie. Certains animaux peuvent être soumis à une intervention chirurgicale supplémentaire si le but de l'étude est aussi d'évaluer la cicatrisation après retrait du dispositif de son site d'implantation (cette intervention chirurgicale peut durer entre 1h et 2h). Cette intervention aura lieu dans les mêmes conditions que celles précédemment citées. Des prélèvements sanguins peuvent etre réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres type d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude (plusieurs années possibles), 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude). De même, des enregistrements cérébraux suite aux stimulations électriques des électrodes implantées (procédures 3 ou 6 par exemple) pourront être réalisées en cours d'étude. Ces enregistrements sont non douloureux et peuvent etre réalisés chaque jour de la semaine (5x/semaine), pendant quelques minutes à 4 heures maximum par session, ou bien durant la nuit (12 heures maximum). Lors de ces enregistrements, l'animal pourra être isolé.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, une douleur et stress liés à la chirurgie, une perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours, un risque infectieux à la chirurgie, un hématome sur le site opératoire, pouvant entrainer, selon la localisation : déficit sensitif et/ou moteur des membres postérieurs (troubles de la locomotion), trouble de la commande vésicale ou anale (incontinence), signes neurologiques (port de tête anormal, tremblements corporels, convulsions).
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des vertèbres pour évaluer la fusion dans le cadre de la procédure de stabilisation de la colonne vertébrale). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d'évaluer la sécurité et la performance des dispositifs médicaux utilisés en neurologie, en raison des interactions complexes s'établissant entre le tissus ciblé (exemple : cerveau, moelle épinière) et le dispositif lui-même. De plus, l’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation que doivent suivre les tests précliniques sur les dispositifs médicaux, avant de pouvoir lancer les tests cliniques.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Le dispositif à tester est le dispositif final, celui qu'il est prévu d'implanter chez l'homme ensuite. Il ne s'agit pas d'un produit en cours de développement, pouvant subir encore beaucoup de modifications de sa composition ou de sa forme. Cela implique donc que l'utilisation des animaux n'a lieu qu'en dernier lieu et assure qu'il n'y aura pas d'animaux utilisés inutilement sur un dispositif qui ne serait pas finalisé. Avant de lancer une étude réglementaire à grande échelle sur un dispositif médical, il est aussi possible de lancer des études pilotes qui permettront, sur un faible nombre d'animaux, de comparer plusieurs produits entre eux afin de sélectionner le produit pour l'étude à grande échelle. De plus, l’interprétation des résultats nécessite toujours de comparer ceux obtenus chez des animaux qui reçoivent le produit à évaluer avec ceux obtenus d’animaux qui reçoivent un produit « contrôle », dont l’effet attendu est déjà connu. Pour réduire encore le nombre d’animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "controle", pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Le nombre d'animaux à inclure en étude est imposé par les normes en vigueur (exemple : minimum 10 sites d'implantation sur un minimum de 3 animaux par groupe et par délai d'analyse, et pour les produits au contact du cerveau : minimum 8 animaux par groupe et par délai d'analyse).
Raffinement
Le stress des animaux est limité par la mise en place d'une période d’acclimatation à leur arrivée dans l'établissement utilisateur, pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable. Ensuite, pour les procédures le nécessitant, une période d’habituation et d'entrainement aux actes spécifiques (contention, palpation, isolement, mise en place d'éléments pour les sessions d'enregistrement cérébraux…) est réalisée pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (jouets, plateforme de repos, augmentation de la quantité de litière…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires par exemple pour certaines espèces). Afin de limiter au maximum la douleur des animaux, les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie chimique et gazeuse, et analgésie (à base de morphiniques). En cas de signes de douleur et signes cliniques, le traitement adapté sera mis en place. Les animaux sont suivis de façon quotidienne, 7 jours sur 7 sur la base des critères suivants : apparence et état général, consommation alimentaire et hydrique et transit, attitude, comportements, signes cliniques. Si des points limites sont atteints pour plusieurs de ces critères, relevant d'un inconfort ou souffrance importants, et si le traitement mis en place n'a pas d'effet, l'animal est alors euthanasié. En phase post-opératoire, le suivi est renforcé et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance ou réfection des pansements s'il y a lieu, désinfection des sites chirurgicaux…). En cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, l’équipe vétérinaire assure l’examen clinique et le suivi de l’animal, afin de mettre en place une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. Le risque infectieux est controlé par l'administration d'antibiotique en phase per-opératoire.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. Les produits de petite taille/miniaturisé seront testés préférentiellement chez le rat ou le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le chien, les ovins/caprins ou les porcs/miniporcs. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie). Le choix entre les grands modèles repose aussi sur les similarités avec l’Homme: -Développement du cerveau, myélinisation, biochimie, surface du cerveau et proportion de matière blanche similaire chez le porc. -Caractéristique anatomique de la moelle épinière, vertèbres cervicales similaires et modèle reconnu pour la recherche sur la colonne vertébrale chez les ovins -Colonne vertébrale uniforme et régulière simplifiant les procédures chirurgicales, taille du canal vertébral, structure et biomécanique de la colonne lombaire et thoracique similaires. Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1. Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2. Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière, le stade de développement est pertinemment sélectionné. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3. Cas particulier des porcs domestiques Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où le choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance est la plus appropriée dans ce projet.
Validation de marqueurs moléculaires pour le suivi des brûlures radiologiques dans un modèle d’irradiation localisée chez le rat SD
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Ils reçoivent une irradiation localisée du membre inférieur sous anesthésie, puis subissent des prises de sang, des scanners et des évaluations de la peau répétés jusqu'à vingt fois, ainsi que des nuits en cage à métabolisme, pour valider des marqueurs de brûlures radiologiques. Le porteur indique que la lésion atteint son pic vers trois semaines, avec dépilation, rougeur et œdème, et un léger ralentissement de la prise de poids. Il affirme être "dans l'obligation" d'utiliser un modèle animal vivant pour identifier ces marqueurs.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans la continuité d’un projet déjà mené au sein de notre laboratoire, ayant permis d’identifier, dans un modèle préclinique chez la souris, des indicateurs biologiques moléculaires (biomarqueurs), à valeur prédictive de la survenue d’une brûlure radiologique, et pronostique du degré de sévérité encouru, lors de situations d’exposition accidentelle à de fortes doses de rayonnements ionisants. Le présent projet vise à confirmer le pouvoir informatif des marqueurs moléculaires ainsi identifiés dans un autre modèle préclinique de lésion localisée radio-induite chez le rat, et leur association avec l’évolution de la lésion et le processus cicatriciel.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de confirmer la robustesse des biomarqueurs moléculaires prédictifs, identifiés précédemment chez la souris, dans un second modèle préclinique de lésion localisée radio-induite établi chez le rat, en vue d’un transfert vers une application chez l’homme, permettant d’identifier rapidement les individus susceptibles de développer de telles lésions après un accident d’irradiation, ou pour le suivi médical des patients traités par radiothérapie.
Procédures
Irradiation localisée sous anesthésie gazeuse : une fois (durée de 6 à 25 min) Passages en cage à métabolisme durant la nuit (18 heures maximum): 8 fois ou 18 fois selon les groupes. Prélèvements de sang par ponction de la veine caudale sous anesthésie gazeuse (env. 5 min) : 7 fois ou 17 fois selon les groupes. Imagerie scanner sous anesthésie gazeuse (env. 5 min) : 5 ou 10 fois selon les groupes Evaluation peau sous anesthésie gazeuse (env. 10 min) : 10 ou 20 fois selon les groupes
Impact sur les animaux
L’irradiation à forte dose du membre inférieur conduit à une lésion radio-induite dont le pic de sévérité est atteint vers 3 semaines post-irradiation, suivi d’une phase de cicatrisation. Un léger ralentissement dans la prise de poids a été observé pour la dose la plus forte chez la souris, sans conséquence notable sur le comportement des animaux. En outre, les passages en cage à métabolisme individuelle pendant la nuit afin de collecter les urines peuvent être source de stress et d’inconfort pour les animaux.
Devenir
Afin de réaliser les différents prélèvements pour les analyses des tissus, l’euthanasie de tous les animaux sera indispensable.
Remplacement
Dans le but d’identifier de nouveaux indicateurs biologiques dans les fluides corporels associés à l’apparition, l’évolution et la réparation des lésions radio-induites de différents grades de sévérité, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle animal vivant.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet, une étude statistique a été menée. Le nombre minimum d’animaux pour obtenir une puissance statistique suffisante est de 15 par groupe. Cet effectif nous fournira des résultats statistiquement robustes.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées à la procédure réalisée afin de limiter au minimum les impacts sur les animaux. Selon les retours d’expérience avec ce modèle, il n’est pas attendu de douleur pendant l’irradiation. Suite à l’irradiation, une dépilation, ainsi qu’une rougeur avec ou sans œdème peuvent être observées. Il n’est pas attendu d’impact important sur l’état général des animaux. Les animaux sont observés tous les jours. Si un des indicateurs du bien-être n’était plus respecté, l’euthanasie pourrait s’avérer nécessaire. Si hématome/lésion caudale observé en lien avec les prélèvements sanguins répétés, les prélèvements seront stoppés. De même, il n’est pas attendu de douleur pendant les imageries. Le temps en cages métaboliques a été limité autant que possible afin de limiter l’impact sur le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le rat est un modèle expérimental de référence pour les études précliniques. Les animaux utilisés dans cette étude seront âgés de 3 mois (stade adulte, mâle et femelle) car ils ne présentent pas de sensibilités ou de spécificités particulières. Ils permettront de renforcer la robustesse des signatures moléculaires obtenues précédemment chez la souris.