Recherche appliquée

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par une alimentation à 60 % de lipides, elles reçoivent chaque jour pendant douze semaines un composé par voie orale, avec prélèvements sanguins après jeûne et hébergement individuel, pour le compte d'un laboratoire client préparant un médicament contre l'obésité. Le porteur indique que la perte de poids peut devenir une nuisance si elle est trop rapide, et prévoit une mise à mort pour prélever les organes. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier ces régulations métaboliques.

Objectifs

L'obésité dans le monde a plus que triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 1 milliard de personnes obèses aujourd'hui, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Dans ce contexte, notre client souhaite évaluer l'effet des nouveaux composés sur les symptômes liés à l'obésité chez les souris obèses (induites par une alimentation enrichie en graisses). Notre entreprise mènera, pour le compte de notre client, une étude in vivo visant à évaluer les effets des composés clients sur la prise alimentaire, le poids corporel et le métabolisme du glucose chez la souris obèse. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ces composés induisent une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ces composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris soumises à une alimentation enrichie en graisses (HFD; 60% de l'énergie fournie par les lipides). A termes, ces données seront incluses dans un dossier de demande d'autorisation d'essais cliniques dans le but d'obtenir une autorisation sur le marché d'une nouvelle classe de médicaments visant à traiter les troubles métaboliques.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier de demande de premier essais cliniques chez l'humain dans le but d'obtenir une autorisation de mise sur le marché d'un composé thérapeutique luttant contre l'obésité et les troubles métaboliques associés.

Procédures

Les animaux seront pesés régulièrement et leur prise alimentaire mesurée. Ces mesures durent environ 2-3 minutes. Des prélèvements sanguins sont prévus après 4 heures de mise à jeun. Les prélèvements en eux même durent environ 3 minutes. Des mesures de composition corporelle non-invasives seront réalisées. Ces mesures sont rapides (

Impact sur les animaux

La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance si celle-ci s'avère trop rapide. D'autre part, des prélèvements sanguins avec mise à jeun préalable de 4h, les administrations quotidiennes per os pendant 12 semaines, les mesures de composition corporelles et le test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 8h préalable) peuvent être source de nuisance pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu de l'étude afin de collecter des organes d'intérêt. Des analyses biochimiques seront réalisées a posteriori sur ces derniers.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la régulation glycémique dans les cas de troubles métaboliques. En effet, les paramètres physiologiques impactés impliquent une communication hormonale et nerveuse entre différents organes qui produit des effets au niveau de l'ensemble des cellules de l'organisme et il n'existe pas à l'heure actuelle de modèle non animal capable de reproduire ou de prédire l'impact d'un composé sur ces phénomènes de régulation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), composition corporelle (mesures de la masse de tissu gras, de la masse de tissu maigre et de la masse de fuides non liés), test de tolérance au glucose (glycémie, insulinémie et aires sous la courbe), glycémie à jeun, insulinémie, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas) et les poids des différents organes. Dans le cadre des groupes expérimentaux obèses, le nombre d'animaux a été fixé à 12/groupe en prenan également en compte l'hétérogénéité du modèle, certains animaux présentant naturellement une résistance à l'induction de l'obésité. Concernant le groupe témoin du modèle d'obésité (Groupe 1, nourri avec la nourriture sandard et traité au véhicule), nous avons réduit le nombre à 10 animaux.

Raffinement

Le modèle animal utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles mais conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos et de matériels de nidification. Concernant les prélèvements sanguins, un anesthésique local sera appliquée sur la queue des souris 30 minutes avant. Avant les mesures de composition corporelle, les animaux seront préalablement habitués au système. Pour les mesures de glycémie, la mise à jeun préalable sera limitée à 4h afin de limiter l'inconfort. Concernant les traitements, ceux ci seront réalisés par des expérimentateurs rodés à geste expérimental en utilisant des canules souples pourvues d'embouts en silicone. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge de jeune adulte adulte au début des traitements (7 semaines d'âge). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une ataxie cérébelleuse humaine, elles subissent un génotypage puis des tests comportementaux répétés, dont un passage dans un bassin de nage à 27 degrés, pour évaluer un composé pharmacologique avant et après l'apparition des symptômes. Le porteur indique une fatigue musculaire de courte durée et un stress liés aux tests, et suit les animaux sur plusieurs mois avant une mise à mort pour prélèvement de tissus. Il affirme que sa lignée avec délétion du gène est le "seul" modèle animal reproduisant la maladie.

Objectifs

Ce projet vise à étudier une ataxie cérébelleuse d’origine génétique qui se manifeste chez les patients par une ataxie cérébelleuse avec une évolution lente et progressive pouvant être associée à une intolérance à l’exercice, un retard mental faible à modéré, des crises d’épilepsie et des pseudo-épisodes vasculaires cérébraux. Le laboratoire a developpé un modèle de souris avec délétion totale du gène qui reproduit la pathologie humaine. Ainsi, l’objectif de ce projet est de tester sur ce modèle l’efficacité d’un composé pharmacologique dans deux approches pré- et post-symptomatiques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de mettre en place des essais pré-cliniques qui, s’ils s’avèrent concluants, déboucheront sur un transfert de ces essais vers la clinique dans le but de traiter les patients atteints de cette ataxie dégénérative.

Procédures

Ce projet comprend : - Une étape d’identification et génotypage des animaux qui aura lieu une fois entre l’âge de 2 et 3 semaines. - Une étape incluant des tests comportementaux sera réalisée sur les animaux vigiles. La durée de ces tests est comprise entre 30 secondes et 5 minutes.

Impact sur les animaux

Procédure avec degré de gravité modérée : Les animaux peuvent avoir une fatigue musculaire de courte période, seront mouillées après passage dans un bassin de nage à 27°C. Pourront avoir un stress lié aux tests comportementaux.

Devenir

Dans ce projet, les animaux qui seront etudiés à différents âges seront replacés dans leur cage entre chaque série de tests afin d’assurer l’étude longitudinale sur un même lot d’animaux. A la toute fin des études, les animaux seront mis à mort pour prelevement de tissus.

Remplacement

En parallèle de la création d’un modèle animal de la maladie, les alternatives non-animales (in vitro) ont été utilisées en première intention par notre équipe pour étudier les mécanismes pathologiques. Nous venons de démontrer l’efficacité du traitement proposé dans ce projet à l’aide d’une autre approche in vitro. Ces approches ne peuvent remplacer l’utilisation d’animaux et l’appréciation globale du bénéfice du traitement chez le modèle animal de la maladie car ce n'est que le reflet d'un seul type cellulaire, or la maladie impacte plusieurs organes (cervelet, muscles). La création du modèle animal et son étude in vivo permettra de définir les conditions optimales de transfert du traitement chez le malade. La souris avec délétion du gène que nous avons développé est le seul modèle animal reproduisant la maladie et permettant d’apprécier l’efficacité de traitements pharmacologiques.

Réduction

Toutes les procédures sont conçues pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, tout en tenant compte du nombre minimum nécessaire pour appliquer les tests statistiques adaptés. Les travaux de notre équipe et les données préliminaires nous permettent d’estimer le nombre de souris pour avoir une valeur statistique suffisante (10 souris par condition pour les différentes analyses). Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, autant que possible, nous effectuerons une étude sur un même lot d’animaux à différents âges et les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les différentes analyses.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans les conditions standard d’hébergement et l’environnement sera enrichi (igloo polycarbonate, rouleau de cellulose,...). Tout au long des procédures, un suivi régulier des animaux sera réalisé (une à deux fois par semaine). Il nous permettra de s’assurer du bon vieillissement des animaux au fil des mois. Ce suivi est basé sur la mise en place de points limites et méthodes de prise en charge d’éventuel stress et douleur spécifiques à notre projet. Certains prélèvements impliquent une mise à mort sous anesthésie générale et une fixation des tissus.

Choix des espèces

Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. Les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris génétiquement modifiée est liée à l'absence de modèle mammifère naturel correspondant à la maladie humaine. Par ailleurs, nos données de l’étude du modèle murin avec délétion totale du gène montrent que ce modèle reproduit les caractéristiques pathologiques necessaires pour tester des solutions thérapeutiques. Les souris étudiées dans le cadre d’une administration pré-symtomatique de l’agent pharmacologique seront étudiées de l’âge de 1 mois à l’âge de 6 mois. Les souris étudiées dans le cadre d’une administration post-symtomatique de l’agent pharmacologique seront étudiées de l’âge de 4 mois à l’âge de 14 mois.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans l'œil ou dans le cœur d'un vecteur viral, puis subissent jusqu'à six examens de la vue sous anesthésie répétée, dont fond d'œil, tests optocinétiques, tomographie et électrorétinogrammes, pour tester des thérapies géniques contre des dégénérescences de la rétine. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer des décollements de rétine et des hémorragies oculaires, et que les anesthésies répétées exposent à l'hypothermie. Il affirme que l'étude du système visuel ne peut se faire que chez l'animal, faute de méthode de modélisation.

Objectifs

La perte de la vue représente un handicap majeur pour les personnes qui en sont atteintes. Afin que ces personnes puissent rester complètement autonomes, il apparaît essentiel de trouver des thérapeutiques efficaces pour ralentir l’évolution d’une perte visuelle ou de la restaurer chez les personnes l’ayant perdue. Notre objectif est de combattre les maladies dégénératives de la rétine en utilisant des thérapies géniques vectorisées par des virus adéno-associés (virus non pathogènes, non immunogènes et qui permettent un transfert efficace de gène dans les cellules). L’efficacité des différentes thérapies testées sera évaluée sur la structure anatomique de la rétine par tomographie à cohérence optique, sur l’acuité visuelle des animaux par des tests optocinétiques et sur la fonction rétinienne par des électrorétinogrammes, à différents points dans le temps, dans différents modèles de souris de dégénérescence rétinienne.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre en avant la preuve de concept d’efficacité d’une ou plusieurs thérapies géniques dans des modèles de souris de rétinite pigmentaire. Le bénéfice attendu est à terme d’amener en clinique cette/ces thérapies géniques pour des maladies dégénératives de la rétine.

Procédures

- Injection intraoculaire : les animaux recevront une injection intraoculaire (une seule par œil) de la thérapeutique à évaluer. L’injection est rapide (5 à 10 minutes) et sera réalisée sous anesthésie générale. Les souris ne passeront qu’une seule fois par cette étape expérimentale. Les souris qui recevront une injection intraoculaire de la thérapeutique à tester ne recevront pas d’injection intracardiaque. - Injection intracardiaque : les animaux recevront une injection intracardiaque de la thérapeutique à évaluer. L’injection est très rapide (30 secondes) et sera réalisée sous anesthésie locale. Les souris ne passeront qu’une seule fois par cette étape expérimentale. Les souris qui recevront une injection intracardiaque de la thérapeutique à tester ne recevront pas d’injection intraoculaire. - Fond d’œil : suite à l’injection de la thérapeutique, le fond d’œil des animaux sera visualisé pour contrôler la qualité de l’injection réalisée. La procédure est rapide (5 minutes) et sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé 1 à 3 fois selon les conditions expérimentales. - Test optocinétique : ce test permet d’estimer la fonction visuelle in vivo. L’acquisition d’images dure environ 10 minutes par animal et sera réalisée sur animal vigile. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 6 fois par animal entre l’âge de 35 à 150 jours. - Tomographie à cohérence optique : ce test permet de visualiser la structure anatomique de la rétine (différentes couches de cellules). L’acquisition d’images dure environ 5-10 minutes par animal et sera réalisée sous anesthésie gazeuse Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 6 fois par animal entre l’âge de 35 à 150 jours. - Electrorétinogramme : ce test permet d’évaluer la fonction de la rétine (capacité des cellules de la rétine à répondre à un stimulus lumineux). L’analyse dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée sous anesthésie générale. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 6 fois par animal entre l’âge de 35 à 150 jours. - Euthanasie par des méthodes réglementaires en vue de prélèvements : en fin de procédure expérimentale, les souris seront euthanasiées pour collecter des échantillons pour des analyses microscopiques des tissus et des analyses biochimiques ultérieures.

Impact sur les animaux

Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Les injections intrapéritonéales, sous-cutanées et intracardiaques peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. La majorité des gestes expérimentaux auxquels seront soumises les souris seront réalisés sous anesthésie induisant une répétition des anesthésies. L’anesthésie peut provoquer une hypothermie chez la souris qui est la première complication et cause de mortalité lors d’anesthésie de rongeurs. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme) et lors des tests confinés d’optocinétiques.

Devenir

Tous les animaux de l’étude (1440) seront euthanasiés à la fin des procédures afin de collecter des échantillons pour des analyses histologiques et biochimiques post-mortem

Remplacement

Nous étudions dans ce projet le fonctionnement du système visuel après un traitement thérapeutique à plusieurs niveaux. Ceci ne peut être étudié que chez l’animal puisque le fonctionnement du système visuel doit être intact. Il n'existe pas de méthodes alternatives par modélisation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés (1440 souris) sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Les tests statistiques réalisés seront adaptés aux échantillons de petite taille afin de limiter le nombre d’animaux par groupe (12 souris par groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe est basé sur des études antérieures du laboratoire utilisant des techniques similaires. Plusieurs tissus seront prélevés sur toutes les souris utilisées dans ce projet afin de collecter un maximum d’échantillons et d’éviter de relancer des expérimentations additionnelles.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les utilisateurs et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation. - Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (tunnel en carton, coton), alimentation et abreuvement à volonté. - Une anesthésie courte gazeuse, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale gazeuse pour les procédures courtes (injection intraoculaire, imagerie), et d’une anesthésie générale par injection d'anesthésiants pour les procédures plus longues (électrorétinogrammes). Une anesthésie locale de la cornée sera réalisée pour les injections intraoculaires et les électrorétinogrammes. Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant les procédures. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. - Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intraoculaires/intracardiaques/intrapéritonéales (dans la cavité abdominale)/sous-cutanées. - Application d'une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne en post-injection intraoculaire et à la fin des électrorétinogrammes. - Un temps de repos minimal de 24h sera réalisé entre une anesthésie gazeuse et une anesthésiepar injection d'anesthésiants et de 7 jours entre deux anesthésies par injection d'anesthésiants. - Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (tunnel en carton et coton), ainsi que nourriture et eau à volonté. - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. - Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée sur des modèles de souris car il existe différents modèles génétiques de rétinopathie proches du phénotype humain. Nous utiliserons plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées ayant des mutations différentes et une vitesse de dégénérescence rétinienne différente, pour modéliser la variabilité observée chez les patients. L’âge auquel les animaux entreront dans la procédure dépendra du phénotype et de la stratégie utilisée (selon si nous voulons injecter avant ou après que la dégénérescence rétinienne ait commencée). Les souris seront donc injectées soit au stade « nouveau-né » (entre 2 et 4 jours de vie, avant le développement définitif de la barrière hémato-rétinienne), soit à l’âge de 15 jours (avant que la dégénérescence des photorécepteurs ne soit trop avancée), soit à l’âge de 5 ou 8 semaines (lorsque la dégénérescence des photorécepteurs est quasiment complète).

322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime appauvri en fibres et pro-inflammatoire, des gavages répétés et des prises de sang, et 40 % d'entre elles absorbent un produit induisant une inflammation intestinale pendant sept jours, cinq fois de suite. Le porteur indique attendre une perte de poids de 5 à 10 % et des diarrhées durant les phases inflammatoires, et héberge les souris seules pour éviter la coprophagie. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de modéliser in vitro la rupture de la symbiose entre l'hôte et son microbiote.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles, dont maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète…, ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à notre environnement (microbiote, régime alimentaire). Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins des êtres vivants. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres au sein du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Récemment il a été montré que ce déséquilibre résulte d’une altération de la symbiose hôte-microbiote, elle-même caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Nos travaux suggèrent que ce déséquilibre résulte d’une rupture du dialogue microbiote-hôte due à des signaux inducteurs inflammatoires. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies chroniques, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par une diminution qualitative du microbiote. L’objectif de notre projet est d’étudier la mise en place d’une rupture de symbiose microbiote-hôte occasionnée par un stress inflammatoire chronique chez l’animal et d’évaluer les conséquences de cette rupture sur le vieillissement des animaux et leur descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’humain et permettront d’identifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques inflammatoires intestinales.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. Dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales, une perturbation du microbiote intestinal est souvent associée à une dérégulation de l’état de santé chez l’humain. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance de cette perturbation conduit souvent à une succession de phases aigües de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et inducteur d’inflammation susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Tous les animaux adultes recevront une solution par gavage au minimum 4 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de gavage contention comprise est de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue de 40 µL. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 1 et au maximum 2 prises de sang à la joue de 200 µL. Le temps de collecte contention comprise est de 30 seconde à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux adultes seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans les procédures. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. 40% des animaux adultes recevrons dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin durant sept jours consécutifs répéter 5 fois avec une semaine de récupération entre chaque prise.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle, entrainant un stress modéré, afin d’éviter des contaminations croisées de microbiote par coprophagie. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise de poids et soient sujets à des diarrhées pendant les phases inflammatoires aigues. Des prises de sang engendrant un léger stress de très courte durée seront réalisées et les animaux seront également gavés oralement avec des solutions permettant d’évaluer respectivement le temps de transit et la perméabilité intestinale. Ces protocoles constitueront un stress modéré notamment dû à la contention. Des signes de douleurs intestinales (diarrhée) sont attendus pendant les phases inflammatoires.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte. En effet, comprendre et caractériser l'évolution de la symbiose microbiote-hôte nécessite la mise en place d'intéractions bidirectionnelles complexes entre l'hôte et son microbiote. Ces intéractions sont difficilement controlables et pertinentes dans des modèles in vitro actuel de type microbiote/organoïde, notamment sur des temps longs tels que ceux décrient dans notre projet, ou nous ciblons particulièrement les périodes post stress et plus particulièrement la résilience ou non de la symbiose.

Réduction

D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 134 animaux pour le groupe contrôle et 188 animaux pour le groupe expérimental sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux, leur comportement et leur prise de poids.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies inflammatoires chroniques intestinales en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

7 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois adjuvés, et subissent des prélèvements sanguins répétés jusqu'à quatre par jour, pour environ cinquante études d'immunisation par an. Le prélèvement final, mortel, récupère un volume important de sang. Le porteur affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas et indique avoir réduit d'environ 20 % le nombre d'animaux par rapport au projet précédent.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques). Réalisation d’environ 50 études par an d’immunisation avec une moyenne de 30 animaux par étude.

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 0.5 mL / site (4 sites maximum) pour la voie sous-cutanée, 0.05mL/site (2 sites maximum) pour la voie intra-musculaire, 0.2mL pour la voie intraveineuse, 1mL pour la voie intra péritonéale. Une injection de dose solide est également possible (diamètre de la seringue maximal 1.4mm). - Temps minimum entre deux injections : 1 semaine sur des sites différents (sauf intraveineuse : 1 jour), à condition qu’aucune réaction anormale n’ait été observée sur l’animal. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique. Concernant les prélèvements (durée maximum 5 minutes), les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements par jour). Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : Douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), Douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, La contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Lors du prélevement final un volume significatif de sang est récupéré.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

A travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Avec l’expérience acquise, le nombre d’animaux prévu dans ce projet est diminué de l’ordre de 20% par rapport au projet précédant. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux, avec différents enrichissements dans leurs cages (e.g. tunnel, nidification…) . Elles sont observées chaque jour par du personnel formé et compétent et des points limites sont mis en place. Les techniciens animaliers sont encouragés à favoriser la manipulation sans stress des animaux (contention avec la technique de la cuillère ou utilisation de tunnels). Des signes cliniques spécifiques aux protocoles d’immunisation sont reconnus et appliqués comme points limites intermédiaires - entraînant une surveillance accrue avec mise en place de raffinements et traitements – et points limites terminaux - entraînant la mise à mort immédiate de l’animal. Avant les injections intra-veineuses les souris sont positionnées dans une enceinte chauffante à 38°C pendant 10 minutes pour faciliter l’injection intra-veineuse. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisés que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique Également après prélèvement intermédiaire de sang supérieur à 250μL, une injection est effectuée en sous cutané pour réhydrater l’animal (minimum 40ml/kg). Un anesthésiant local est appliqué en amont de l’injection d’une dose solide (15/30 minutes avant l’injection).

Choix des espèces

La souris est une espèce adaptée pour les études d’immunisation étant donné la qualité du sérum produit et elle répond donc aux demandes des scientifiques. L’âge minimal des souris à J0 est de 8 semaines. A cet age, les souris ont un système immunitaire permettant la réalisation des études de type immunisation.

2 000 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois adjuvés, et subissent des prélèvements sanguins répétés jusqu'à quatre par jour, dans le cadre d'études d'immunisation destinées à produire des tests de diagnostic et des médicaments biologiques. Le prélèvement final, mortel, récupère un volume important de sang. Le porteur reconnaît que la production d'anticorps in vitro existe mais affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas, notamment pour la qualité du sérum.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques). Réalisation d’environ 40 études par an d’immunisation avec une moyenne de 10 animaux par étude.

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 10mL / kg (4 sites maximum) pour la voie sous-cutanée, 0.5mL/site (2 sites maximum) pour la voie intra-musculaire. Une injection de dose solide est également possible (diamètre de la seringue maximal 1.4mm). Temps minimum entre deux injections : 1 jour, sur des sites différents à condition qu’aucune réaction anormale n’ait été observée sur l’animal. A noter qu’en routine, le temps entre deux injections est supérieur à 1 semaine La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique. Concernant les prélèvements (durée maximale de 5 minutes), les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements par jour). Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : Douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), Douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, La contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Lors du prélevement final un volume significatif de sang est récupéré.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

A travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les cobayes sont hébergés en groupes sociaux, avec différents enrichissements dans leurs cages (e.g. tunnel, mousqueton…) . Ils sont observés chaque jour par du personnel formé et compétent et des points limites sont mis en place. Des signes cliniques spécifiques aux protocoles d’immunisation sont reconnus et appliqués comme points limites intermédiaires - entraînant une surveillance accrue avec mise en place de raffinements et traitements – et points limites terminaux - entraînant la mise à mort immédiate de l’animal. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. En cas d’hémorragie inattendue lors d’un prélèvement sanguin, une réhydration via injection sous cutanée est effectuée (minimum 10ml/kg). Un anesthésiant local est appliqué en amont de l’injection d’une dose solide (15/30 minutes avant l’injection).

Choix des espèces

Le cobaye est une espèce adaptée pour les études d’immunisation étant donné la qualité du sérum produit et il répond donc aux demandes des scientifiques. Le poids minimal à J0 est de 250 grammes. A cet âge, les cobayes ont un système immunitaire mature permettant la réalisation des études de type immunisation.