Recherche appliquée

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte, éveillées, des cellules tumorales puis quatre administrations d'un traitement directement dans la tumeur, avant prélèvement d'une quinzaine d'organes pour étudier la toxicité et le cheminement d'une thérapie anticancéreuse. Le porteur attend une gêne au déplacement liée à la tumeur et une perte de poids pouvant approcher vingt pour cent, et situe les bénéfices pour les patients à moyen terme et au conditionnel. Sur le remplacement, il indique recourir à des organoïdes et des modèles bio-imprimés, mais conclut que la toxicité ne peut être évaluée que dans un "organisme complet".

Objectifs

Les cellules dendritiques sont des cellules spécialisées dans la reconnaissance de tout ce qui n'appartient pas à notre organisme : le non-soi et sont capables de le présenter aux cellules du système immunitaire pour l'éliminer. Le porteur de projet a identifié une stratégie capable de transformer des cellules cancéreuses en ces cellules dendritiques. Elles sont alors capables de prévenir le système immunitaire, ce qui provoque une réponse immunitaire contre la tumeur dans le but de l'éliminer. De part cette capacité à réveiller et armer le système immunitaire contre une tumeur, ces cellules représentent un outil thérapeutique prometteur dans le traitement du cancer. Le but ici est de caractériser la toxicité de cette thérapie et de connaître son cheminement dans l'organisme une fois celui-ci injecté : les tissus ou organes par lesquelles il va passer avant d'être éliminé, tout cela chez la souris saines et chez la souris atteinte de cancer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de développer et de caractériser en phase préclinique une approche thérapeutique anticancéreuse très innovante, sur un large panel d’indications oncologiques. Cette approche thérapeutique permettra au mieux de guérir les patients atteints de cancer, sinon de ralentir la progression tumorale. La thérapie étudiée devra encore passer par une phase préclinique règlementaire avant une première administration chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis vigiles, une fois à une injection de cellules tumorales puis une à deux semaines après, selon le temps de pousse des tumeurs, à quatre injections de traitement à deux jours d'intervalle. Les groupes sains sans injection de cellules tumorales débutent le traitement en même temps que les groupes avec tumeurs. L'administration du traitement se fera en intratumoral pour les groupes avec tumeur et en sous-cutanée pour ceux sans tumeur. Les injections durent pour chaque souris quelques secondes.

Impact sur les animaux

1/Nuisances attendues : -Injection sous-cutanée de cellules : douleur à la piqûre et à l’injection ; durée de quelques secondes - Croissance d’une tumeur sur le flanc : gêne cutanée, gêne au déplacement ; durée maximum 25 jours. -injections en sous cutané ou en intratumoral : douleur de la piqûre ; 5 secondes. 2/Nuisances potentielles : -perte de poids de moins de 20% du poids maximal : 4 jours maximum -inflammation de la surface de la tumeur : douleur cutanée, démangeaisons ; maximum 48h - réaction au traitement : irritation, rougeur

Devenir

A différents temps au cours des études : 24 heures et 7 jours après la dernière injection de traitement pour les animaux avec tumeur et 24 heures, 7 jours et 30 jours après pour les animaux sans tumeur, 6 individus par groupes seront prélevés en terminal. A l'issu du dernier temps de prélèvement, ce sera la fin des études, tous les animaux auront été mis à mort. Lorsque les souris seront mises à mort, les organes et échantillons suivants seront prélevés : sang, urine, tumeur, foie, rate, poumons, reins, cerveau, cœur, gonades, glandes surrénales, moelle osseuse, moelle épinière, thymus et nœud lymphatique, pour de la quantification biochimique dans l'étude de biodistribution et pour de la quantification histologique pour l'étude de toxicologie.

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Certaines caractéristiques individuelles seront étudiées in vitro/ex vivo (modèles organoïdes, modèles bio-imprimés), la toxicité et la biodisponibilité ne peuvent être pleinement évalués que dans un organisme complet.

Réduction

Pour le modèle de cancer de la vessie, les études de toxicologie et de biodistribution seront faites sur le nombre minimal de souris nécessaires permettant de conclure de façon fiable statistiquement avec le test statistique approprié, à savoir 12 ou 18 souris par groupe thérapeutique, pour un total de 16 groupes. Parmi ces 16 groupes thérapeutiques, 8 seront testés sur un modèle tumoral très bien connu et représentatif d’un cancer à fort besoin thérapeutique et 8 autres sur des souris saines sans tumeur pour s'affranchir d'un effet induit par la tumeur. Dans notre expérience, les effectifs de 12 ou 18 souris par groupe permettent de caractériser avec les tests statistiques adéquats des différences significatives. Le modèle tumoral utilisé a été préalablement testé in vitro pour sa bonne réponse à la thérapie étudiée. Pour chaque groupe thérapeutique, différents organes et échantillons seront analysés post-mortem sur 6 souris indépendantes à deux ou trois temps différents pour connaître les effets et le cheminement du porduit au cours du temps : le site d’injection, foie, rate, poumons, reins, cerveau, cœur, gonades, glande surrénale, moelle épinière, nœud lymphatique, thymus, moelle osseuse, sang et urine).

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Des prélèvements en point final (tumeurs, organes et échantillons) seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et d’un modèle tumoral de souris. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs de souris représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Par rapport aux rats, la souris permet également d’utiliser moins de composés pour obtenir une dose/poids. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras puis hébergées seules à thermoneutralité, elles reçoivent chaque jour pendant plus de six semaines un composé par gavage ou injection, avec pesées, prélèvements sanguins et test de tolérance à l'insuline, pour un laboratoire pharmaceutique client. Le porteur décrit l'isolement et les administrations quotidiennes comme des nuisances et affirme que le choix du modèle a été "validé avec le client". L'objectif déclaré est commercial, constituer un dossier d'autorisation puis mettre sur le marché un médicament contre l'obésité.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré qu'une série de composés en développement induit une perte de poids corporel associée à une diminution de la prise alimentaire chez des souris obèses. L'objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l'impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris rendues obèses par un régime hyperlipidique (60% de l'énergie issue des graisses) pendant 10 semaines avant réception. Les traitements seront administrés par voie orale ou sous-cutanée pendant 5 semaines, pendant lesquelles les animaux seront soumis au même régime enrichi en graisses. Au cours du traitement, les paramètres suivants seront mesurés : poids corporel et prise alimentaire, composition corporelle, glycémie à jeun, tolérance à l'insuline. Par ailleurs, afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°C).

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de sécuriser le développement des composé tests, notamment dans le but de prioriser ceux ayant les effets les plus marqués. Ainsi, ls données obtenues permettront de constituer un dossier de demande d'autorisation pour la réalisation d'études cliniques. A terme, cela permettrait à la société cliente d'obtenir une AMM et de commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1) un état d'obésité induit par l'aliment enrichi en graisses (Régime fournis pendant 12 semaines avant réception des animaux et 7 semaines après réception) - 2) un hébergement individuel sur toute la longueur de l'étude (Durée: 7 semaines après réception) - 3) une administration orale ou sous-cutanée quotidienne du traitement test, du véhicule ou du composé de référence à partir de D-11 et jusqu'à D35 (46 jours; durée de l'acte : environ 1-2 minutes) - 4) une pesée quotidienne de D-18 à D-1 (durée de l'acte : environ 1-2 minutes) - 5) une mise à jeun de 4h + un prélèvement sanguin à la queue à D-6 (durée de l'acte : environ 5 minutes)- 6) des mesures de prise alimentaire et de poids corporel trois fois par semaine à partir de D1 (soit un total de 15 mesures; durée de l'acte : environ 2-3 minutes) - 7) deux analyses de leur composition corporelle à D-6 et D29 (Durée de l'acte < 2 minutes) -8) un test oral de tolérance à l'insuline (ITT) à D29 [(Mise à jeun pendant 6h, Prélèvements sanguins (1 goutte) 0, 15, 30, 60 et 120min après administration du glucose; Durée de l'acte : 2,5 heures) . - 9) Une anesthésie générale et euthanasie à D35 (Durée de l'acte: environ 5 minutes) .

Impact sur les animaux

La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire et les mesures en cages métaboliques prévues en cours d'étude imposent un hébergement individuel des animaux imposent un hébergement individuel des animaux constituant une nuisance. Afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°). Les animaux seront pesés régulièrement afin d'administrer le bon volume de véhicule ou de traitement. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance. D'autre part, des prélèvements sanguins pour mesure de glycémie, un test de tolérance à l'insuline (avec une mise à jeun de 6h), et deux analyses de la composition corporelle par RMN sont prévus et pourront être source de stress ou de nuisance pour les animaux. Enfin, les gavages oraux et les administration sous-cutanées quotidiens à partir de D-11 et jusqu'à D35 (soit 46 jours) sont une source de nuisance. Il est à noter que les administrations (orales ou sous-cutanées) d'habituation effectuées entre D-11 et D1 s'avèrent nécessaires car sans cette précaution, ces procédures induiraient des modification du prise alimentaire et de poids corporel au début du traitement et seraient et donc seraient à même de fausser les résultats de l’étude.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements terminaux post mortem sont nécessaires pour une étude complète des effets des composés test.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt compte tenu des paramètres mesurés dans la présente étude mais également de l'hétérogénéité connue du modèle obèse. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), test de tolérance à l'insuline (glycémie et aire sous la courbe), glycémie à jeun, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas), HbA1c, triglycérides et le poids du tissu adipeux inguinal gauche et droit.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisement l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Par ailleurs, nous avons remarqué que la litière en cellulose permet non seulement une bonne absorbance mais également un enrichissement (nidification). Pour chaque prélèvement sanguin, de la lidocaïne en gel sera appliquée à l'extrémité de la queue 30 minutes avant prélèvement afin de prévenir la douleur pouvant résulter de ce geste. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. En cas de signe de souffrance de l'animal, un analgésique (buprénorphine) sera administré. Si aucune amélioration n'est constatée passé un certain délai, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (16 semaines à réception). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

4 200 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras puis exposées à des cocktails de perturbateurs endocriniens entre le cinquième et le onzième jour après la fécondation, elles servent à étudier la progression des maladies du foie gras, avec une atteinte hépatique et une nage altérée attendues. Le porteur présente la larve comme un modèle "alternatif" au rongeur qui limite l'usage de mammifères, tout en qualifiant l'expérimentation animale d'"indispensable". Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit les interactions entre organes nécessaires à l'étude.

Objectifs

Les maladies du foie gras sont devenues une priorité de santé publique car elles touchent plus de 20 % de la population générale et surtout les personnes obèses (>70% de personnes atteintes). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite, propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. L’exposition aux perturbateurs endocriniens, seuls ou en mélange, notamment via l’alimentation, est reconnue comme un facteur pouvant participer au développement de ces maladies. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact de ces molécules sur la santé et en particulier sur les maladies du foie gras. Etant donné la nature complexe de ces maladies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est nécessaire d’avoir une approche utilisant des organismes entiers et donc uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Le premier objectif de ce projet est donc de poursuivre l’évaluation de la larve de poisson-zèbre comme modèle alternatif aux modèles rongeurs pour l’étude des effets cocktail des perturbateurs endocriniens sur les maladies du foie gras. En outre, l’un des mécanismes suspectés fait intervenir les vésicules extracellulaires comme un moyen de communication important entre les organes participant à la progression de ces maladies du foie. Ces vésicules représentent également de potentiels biomarqueurs d’exposition et/ou de progression de la maladie dans la mesure où elles sont facilement accessibles par prélèvement sanguin. Ainsi, un second objectif de ce projet est de caractériser la production des vésicules extracellulaires issues du foie suite à l’exposition à un cocktail de perturbateurs endocriniens.

Bénéfices attendus

Cette phase d'expérimentation in vivo devrait permettre de confirmer le potentiel de ce modèle de larve de poisson-zèbre en alternative au modèle murin classiquement utilisé. En parallèle, des travaux seront d’ailleurs conduits sur un modèle murin pour compléter ce projet (ces travaux sont intégrés à une autre saisine). En outre, ce projet permettra de vérifier nos hypothèses sur les vésicules extracellulaires et, en cas de confirmation, ouvriront la voie à des études plus avancées sur le rôle de ces vésicules dans les maladies du foie gras ou à leurs utilisations en tant que potentiels biomarqueurs.

Procédures

Alimentation avec un régime enrichi en graisse de 4 à 10 jours post-fertilisation des oeufs. Exposition à des cocktails de perturbateurs endocriniens (de 7 à 11 jours post-fertilisation des oeufs)

Impact sur les animaux

L'objectif de ce projet est d'étudier l'apparition et la progression de pathologies hépatiques. On s'attend donc à un impact sur la santé des poissons, cependant celui-ci devrait rester modéré et se traduire éventuellement par des modifications légères du comportement (nage altérée).

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques pour réaliser les expériences envisagées et garantir au maximum l'obtention de résultats significatifs.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à l’atteinte des objectifs du projet (3R : Remplacement), l’utilisation du modèle poisson-zèbre reste toutefois une alternative au modèle rongeur dans le contexte de l’étude du rôle des vésicules extracellulaires dans les effets délétères des NAFLD.Plus précisément, l’un des objectifs de ce projet est de déterminer si les vésicules extracellulaires produites par le foie peuvent servir de biomarqueurs d’exposition et/ou d’atteintes hépatiques dans le contexte d’exposition à des polluants environnementaux. Pour cela, il est nécessaire de reconnaitre spécifiquement les vésicules issues du foie au sein de toutes les vésicules produites par l’organisme et d’identifier les changements qualitatifs ou quantitatifs de cette population de vésicules qui pourraient corréler avec les niveaux d’exposition aux polluants ou avec les atteintes du foie. Ainsi, seule l’expérimentation sur un modèle in vivo peut permettre d’évaluer de manière intégrative la production de vésicules et le développement de ces maladies du foie (maladies qui dépendent en partie de la communication entre différents organes). A l’heure actuelle, il n’existe pas d’alternatives (in vitro, in silico ou ex vivo) permettant de reproduire l’ensemble des interactions entre organes liées à ces maladies du foie ni la grande variété de vésicules retrouvées dans un organisme entier.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Ainsi, nous avons prévu de réaliser des tests de comparaison de moyennes ANOVA avec un seuil de significativité à 5% (p

Raffinement

Les études seront conduites dans le respect des normes les plus strictes en matière de soins des animaux et d’évaluation de la souffrance animale. Les animaux seront maintenus dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux. Tout le personnel impliqué dans le travail des animaux a suivi une formation conformément aux réglementations institutionnelles et aux lois nationales relatives à la protection des droits des animaux. En outre, les animaux seront attentivement suivis et l’atteinte éventuelle des points limites évalués selon des critères adaptés, gradés et précis entrainera l’arrêt des expérimentations.

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’impact des perturbateurs endocriniens en mélange sur l’apparition et la progression des maladies du foie gras. Le modèle de poisson- zèbre se positionne comme un modèle d’étude intermédiaire entre les modèles in vitro et les modèles murins et limite ainsi l’utilisation de ces modèles mammifères. L’objectif de ce projet est en partie de renforcer cette notion en particulier pour l’étude des perturbateurs endocriniens et des vésicules extracellulaires. Le modèle zebrafish possède, en effet, de nombreux atouts : une grande similitude avec l’Homme notamment concernant le foie et les maladies du foie gras (types cellulaires et métabolisme); une grande sensibilité dans la réponse aux agents hépatotoxiques et aux perturbateurs endocriniens ainsi que des avantages méthodologiques (transparence des larves permettant l’observation directe d’organes internes). Les animaux seront utilisés, après éclosion, au stade larvaire entre 5 et 11 jours post-fertilisation. En effet, à partir du 4ème jour, les larves présentent un foie fonctionnel et sont capables de se nourrir de l’alimentation apportée : 2 éléments essentiels à ce projet. D’autre part, de nombreuses études ont montré qu’à cet âge, les larves de poisson-zèbre pouvaient être utilisées comme modèle pour tester la toxicité d’agents chimiques au niveau du foie ou étudier le développement des maladies du foie gras (induite par l’alimentation notamment).

2 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale répétée, ils reçoivent quatre administrations intraveineuses d'un ARN interférent et subissent cinq prélèvements de sang, cinq ponctions de liquide céphalorachidien et cinq électromyogrammes, pour évaluer la tolérance d'un candidat-médicament contre la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Le porteur indique que les ponctions peuvent provoquer maux de tête, vomissements et signes neurologiques, et que les deux animaux sont euthanasiés pour analyses histologiques et de biodistribution. Il présente le recours au primate comme une exigence réglementaire de l'ANSM, une seconde espèce non rongeur étant "requise" après les études menées chez la souris.

Objectifs

Les maladies de Charcot-Marie-Tooth (CMT) sont un groupe de maladie des nerfs périphériques héréditaires consécutives à des mutations dans un large panel de gènes et conduisant à une atteinte majeures de la myéline (gaine isolante) des nerfs périphériques . Il n’existe actuellement pas de traitement pour ces pathologies. L’objectif ici est d’évaluer la faisabilité, l’efficacité et la tolérance d’une administration intraveineuse de petits ARN interférent siARN (cible confidentiel) pathologiques à doses croissantes chez le Primate non humain (PNH), qui en se liant à l’ARN chez l’hôte empêchent la production de la protéine et ainsi empêche la maladie. Le bien-être animal sera surveillé tout au long du projet avec mise en place de critères précis d’interruption.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d'obtenir toutes les données préclinique permettant ensuite de proposer un essai clinique chez l’Homme pour un nouveau traitement très peu invasif par de petites molécules d'ARN interférents administrée en intraveineux. Pour rappel, il n'existe à l’heure actuelle aucun traitement

Procédures

Dans ce projet, tous les gestes techniques sont réalisés sous anesthésie générale et analgésie , et une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) et Electromyogramme (EMG) selon les temps d’intérêt de l'étude). - 4 administration intraveineuse (durée 10min) - 5 prélevements de sang et 5 prélèvements de LCR durée 30min - 5 EMG durée 10min

Impact sur les animaux

Les animaux sont soumis à plusieurs prélèvements de sang et de Liquide céphalo rachidien (LCR) avec un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques) et la formations possibles d’hématomes. Mais aussi plusieurs Electromyogramme (EMG) avec un risque de douleurs musculaires passagères et enfin un risque anesthésique (hypothermie, sécheresse oculaire, anomalies cardio-respiratoire.

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour permettre les études histologiques et de biodistribution afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de l’approche.

Remplacement

Toutes les études sur des cellules en dehors dès organismes vivants (in vitro) possibles pour valider la cible thérapeutique ont été effectuées en amont de ce projet afin de valider l’utilisation de siARN comme cible thérapeutique dans la maladie de Charcot Marie Tooth. De plus la stratégie thérapeutique a été démontrée dans 2 modèles rongeurs de la pathologie. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude d’efficacité, de toxicité, etc sur un modèle non rongeur, le plus pertinent pour reproduire le modèle est le primate car le siARN cible la protéine humaine qui est quasi identique à celle du primate. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation pour la réalisation d’étude clinique (chez l’homme).

Réduction

Il y a 2 animaux sur ce projet, correspondant au minimum requis pour une étude statistique permettant de repondre à l'objectif du projet qui est la validation de l’efficacité de l’approche et à l’évaluation de la toxicité. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie, l'utilisation d’un analgésique pour les ponctions lombaires et les injections virales, pour éviter tout inconfort. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Si un animal ne présente pas d'amélioration suite à une prise en charge vétérinaire, il sera euthanasié (avec avis vétérinaire). Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, elles sont réalisées par du personnel formé et expérimenté́. Enfin, le nombre d'anesthésies est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandations en termes de Bien-être animal), ponction lombaire) au sein de la même anesthésie générale

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle souris de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie testée. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du singe en particulier le cerveau, se rapprochent de ceux de l’Humain en terme de structure anatomique et connectivité fonctionnelle mais aussi le système nerveux périphérique. L’administration d’une telle thérapeutique dans un individu proche de l’humain permet de définir au mieux les paramètres (dose, diffusion) et d’étudier l’efficacité et la tolérance de l’approche. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (2-6 ans) (2 à 10 Kg) ayant un système nerveux complètement développé et myélinisé.

Des injections de protéines avec adjuvant de Freund, complet la première fois puis incomplet, précèdent une exsanguination par ponction intracardiaque sous anesthésie pour les souris immunisées : 600 souris âgées de 6 semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet doit produire des anticorps polyclonaux contre des protéines de Plasmodium, le parasite du paludisme, et cribler des candidats vaccins à ARNm injectés dans le muscle. Le porteur prévient que les souris "peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d'angoisse". Celles dont le titre d'anticorps suffit sont mises à mort pour leur sérum, et les autres doivent l'être à la fin de chaque procédure, même si le porteur ajoute qu'elles "peuvent être réutilisées dans d'autre projets dans la mesure du possible".

Objectifs

Le paludisme est un problème de santé publique, majeur qui sévit dans plus de 100 pays et fait plus de 627 000 morts par an surtout chez les jeunes enfants. Chez les femmes enceintes, l’infection par Plasmodium peut causer leur mort et celle de leur enfant ainsi qu’un poids de naissance inférieur à la normale entraînant une mortalité très fréquente après la naissance. Depuis 2021, un vaccin est disponible sur le marché. La prise d’antipaludiques et l’utilisation de moustiquaires imprégnées augmentent la résistance du parasite aux antipaludiques. La maladie est causée par le parasite du genre Plasmodium, un protozoaire appartenant au phylum des Apicomplexes. Parmi les 5 espèces qui infectent l’Homme, deux sont les plus répandues : Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Le cycle de vie du parasite, entre un hôte mammifère et un moustique du genre Anopheles, est complexe. La partie la mieux connue de ce cycle est la phase érythrocytaire se déroulant chez le mammifère, durant laquelle les parasites se multiplient dans les érythrocytes de l’hôte. Notre laboratoire étudie les mécanismes d’invasion des globules rouges humains par Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Nous nous intéressons, en particulier, au stade sanguin du cycle du parasite. Nous étudions les mécanismes mis en jeu par le parasite pour s’attacher au globule rouge, y pénétrer et s’y développer. Cette phase érythrocytaire pour P. falciparum et P. knowlesi, peut être reproduite in vitro dans des systèmes de culture de globules rouges humains. Nous avons identifié plusieurs protéines d’intérêt exprimées par le parasite lors de son cycle de vie dans le globule rouge. Afin de les étudier, nous allons produire, chez la souris, des anticorps polyclonaux (AcP) dirigés contre ces protéines. Ces anticorps nous permettrons d’inhiber ces protéines à la surface du merozoïte (forme du parasite permettant d’infecter un nouveau globule rouge) ainsi que de déterminer la réponse immunitaire des candidats vaccins.

Bénéfices attendus

Notre compréhension du paludisme est limitée par des outils de recherche tels que les anticorps. Il existe en effet peu d’anticorps spécifiques contre les différentes espèces de Plasmodium disponibles. Ce projet a pour but de produire un outil qui sera indispensable dans la lutte contre cette maladie. Les anticorps sont essentiels pour faire progresser notre connaissance sur le fonctionnement du parasite. Nous pouvons étudier l’expression de ces molécules dans les différents stades du parasite en utilisant les techniques suivantes : ELISA, Western Blot, l’inhibition de la croissance parasitaire, les procédures d’immunoprécipitation, l’immunofluoromicroscopie. Avec des anticorps spécifiques nous sommes en mesure de mieux comprendre l’implication des protéines responsables de l’invasion chez P. falciparum, P. vivax et P. knowlesi. De plus, les infections de souris par des candidats vaccins permettront un criblage des préparations vaccinales.

Procédures

1) Une prise de sang (une minute). 2) Une injection (une minute). 3) L'exsanguination par ponction intra-cardiaque (5 minutes) à la fin de l’expérience, préalablement anesthésiées par injection par voie intrapéritonéale (une minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont liés à l’injection des protéines avec adjuvant et des candidats vaccins. Dans des très rares cas les souris peuvent mal supporter les protéines recombinantes et les candidats vaccins à ARNm. Elles peuvent montrer une réaction inflammatoire. Les souris recevront les protéines recombinantes en présence d’adjuvant Complet de Freund (CFA) pour la première injection et l'adjuvant Incomplète de Freund (IFA) pour les autres injections. L’utilisation de l’adjuvant CFA par voie sous-cutanée peut induire des effets indésirables. Les injections des candidats vaccins à ARNm se feront par la voie intra-musculaire sans adjuvant. Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse.

Devenir

Toutes les souris ayant un titre d’anticorps satisfaisant seront mises à mort afin d’obtenir une quantité de sérum suffisant pour l’études des protéines d’invasion ou déterminer les candidats vaccins permettant la meilleure immunisation possible contre P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi. Toutes les souris n’ayant de titre d’anticorps satisfaisant lors de prélèvements intermédiaires seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car elles ont reçu au moins une injection de protéines recombinantes ou une dose de candidats vaccins à ARNm. Elles ne peuvent donc pas être réutilisés dans notre projet. Cependant, elles peuvent être réutilisées dans d’autre projets dans la mesure du possible.

Remplacement

L’alternative possible à l’emploi de sérums serait d’employer les sérums prélevés chez des personnes vivant en zone d’endémie, porteuses d’anticorps contre les antigènes d’intérêt et d’immuno-purifier les immunoglobulines spécifiques par affinité sur les antigènes recombinants. Les expériences d’autre groupes de recherche ont montré que les anticorps ainsi obtenus sont de faible affinité pour des protéines spécifiques, avec un titre très faible et ne fonctionnent pas pour les protéines intracellulaires qui ne sont pas exposée à la réponse immunitaire de l'hôte. Il existe aujourd'hui des alternatives non animales pour produire les anticorps telles que les anticorps recombinants et les aptamères (courts fragments d'ADN ou d'ARN qui peuvent se lier à des cibles telles que des protéines). Cependant, une bibliothèque de gènes d'anticorps de Plasmodium n'a pas encore été constituée, ce qui rend cette technique hors de portée pour le moment. Le recours à l’animal est nécessaire car ces anticorps ne peuvent être obtenus qu’après immunisation d’une espèce animale. Cependant, pour chaque protéine identifiée avec certitude dans l’invasion du globule rouge par P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi, nous ferons des hybridomes permettant d’obtenir des anticorps monoclonaux. Ce qui nous permettra de bénéficier d’une banque d’anticorps pour l’étude des mécanismes d’invasion du globule rouge par les Plasmodium.

Réduction

Le nombre de souris pour chaque expérimentation a été calculé au plus juste pour permettre un nombre minimum des animaux. Cette estimation a été réalisée en concertation avec un biostatisticien. Ainsi, nous avons choisi des groupes de 5 souris dont les sérums seront poolés afin d’avoir une quantité de sérums suffisante pour une étude approfondie et répétée.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse de nos souris, nous mettrons en œuvre un enrichissement de l’environnement avec par exemple des abris et des bâtons de coton pour la nidification. Si les souris montrent des signes de détresse ou de souffrance pendant les prélèvements nous pouvons utiliser une anesthésie gazeuse sous isoflurane. Une surveillance accrue pendant 3 jours suivant les injections et puis 2 fois par semaine entre les injections et les prélèvements ainsi que des soins post manipulation (injections et prélèvements) seront pratiqués.

Choix des espèces

Nous avons choisi de produire nos anticorps chez la souris car nous savons par des expériences antérieures que les protéines recombinantes de Plasmodium sont très immunogènes chez la souris. De plus il est indispensable de tester des candidats vaccins sur des souris avant de continuer leur développement. Les souris utilisées pour les immunisations seront âgées de 6 semaines, âge auquel on obtient une bonne réponse immune et une préhension correcte pour l’immunisation et le prélèvement sanguin.

90 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés avec des virus porcins vivants par voie nasale, trachéale, intramusculaire ou intradermique, sans anesthésie, puis subissent des ponctions sanguines hebdomadaires et d'éventuels rappels d'immunisation, avant d'être mis à mort trois à quatorze semaines plus tard pour prélever la totalité de leur sang. L'objectif est de produire des sérums de référence servant à détecter ces virus dans les élevages, le porteur invoquant leur caractère "indispensable" et une corpulence permettant de récupérer au moins deux litres de sang par animal. Sur le remplacement, il affirme en une phrase que ces sérums ne peuvent "pas être produits in vitro".

Objectifs

Afin de pouvoir assurer le diagnostic des maladies virales des porcs et des sangliers, il est nécessaire pour notre laboratoire de disposer d’outils de caractérisation des pathogènes recherchés. Plusieurs pathogènes font en effet l’objet d’une surveillance en élevage de suidés ou chez les sangliers sauvages. Les Laboratoires nationaux de référence ou Laboratoires experts ont pour mission de proposer des méthodes de détection virologique et sérologique fiables pour leurs activités de surveillance et de recherche. Un sérum contenant des anticorps dirigés contre un agent pathogène spécifique est indispensable pour détecter et caractériser ce pathogène dans divers échantillons biologiques ou pour servir de contrôle positif pour valider des tests. L’objectif du projet expérimental est de produire des sérums dits post-infectieux (SPI) ou hyperimmuns (SHI) vis à vis de souches de virus porcins. Pour cela, le virus sera inoculé à des porcs indemnes de ce pathogène particulier, en une fois ou à plusieurs reprises (1 ou 2 à 3 rappels d’immunisation). Dans le cas de virus très virulents pour le porc, les animaux pourront être préalablement vaccinés afin d’être protégés de l’infection, ou le virus pourra être inactivé. Ces porcs seront suivis sur le plan clinique et mis à mort 3 à 14 semaines plus tard pour récolter un volume important de sang nécessaire à l’obtention d’une quantité suffisante de réactifs de référence.

Bénéfices attendus

Le modèle porc nous permet de récupérer de grandes quantités de sérums avec un minimum d’animaux afin de disposer de matériaux de référence spécifiques à la maladie virale étudiée et à l’espèce animale concernée.

Procédures

Tous les actes prévus sur les animaux se feront sur animaux vigiles. Aucune anesthésie n’est prévue dans ce projet lors des différentes interventions du fait de leur rapidité (moins d’une minute) et de leur caractère peu invasif. Les inoculations et les ponctions sanguines seront effectués le plus rapidement possible. Dans la procédure 1, les 2 à 3 porcs de chaque lot seront inoculés avec du virus par la voie la plus appropriée (ex : intranasale, oronasale, intratrachéale, intramusculaire ou intradermique) et une ponction sanguine sera réalisée de façon hebdomadaire pendant les 3 semaines de l’étude expérimentale. Concernant la procédure 2, les 2 à 3 porcs de chaque lot seront inoculés avec du virus par la voie la plus appropriée (ex : intranasale, oronasale, intra-trachéale, intramusculaire ou intradermique) et 1 autre injection du virus sera réalisée 3 semaines après la première inoculation. Un second rappel d’immunisation pourra être programmé 2 semaines plus tard. Une ponction sanguine sera réalisée de façon hebdomadaire tout au long du projet. Il est possible de collecter 15 tubes de sang juste avant le 1er rappel d’immunisation pour obtenir un SPI en faible volume. Enfin, le protocole suivi dans la procédure 3 sera le même que dans la procédure 2 mais les animaux auront été préalablement vaccinés à 1 ou 2 reprises par la voie appropriée avant d’être inoculés avec du virus.

Impact sur les animaux

La vaccination et les inoculations des virus vivants par voie oro/nasale, intratrachéale, intramusculaire ou intradermique peuvent entrainer une hyperthermie transitoire (quelques jours). Les virus considérés plus pathogènes seront inactivés ou inoculés à des animaux préalablement vaccinés contre le virus en question. Pour les rappels d’immunisation par voie intramusculaire en présence d’adjuvant, un seul point d’injection est réalisé pour limiter les actes invasifs. L’adjuvant utilisé est également reconnu pour son innocuité. Aucune symptomatologie sévère n’est attendue lors de ces procédures.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour pouvoir collecter le volume sanguin total et récupérer le sérum riche en anticorps.

Remplacement

Production de réactifs sérologiques (sérums) de référence ne pouvant pas être produits in vitro.

Réduction

Chaque production de SPI/SHI vis-à-vis d’un virus implique 2 à 3 porcs de 4 à 12 semaines d’âge. Les réponses immunitaires pouvant légèrement varier d’un individu à l’autre, il est d’usage d’inoculer à minima 2 porcs pour chacun des virus de référence vis-à-vis desquels il est prévu de produire des SPI et/ou SHI. A raison de 3 porcs par virus inoculé et se basant sur une estimation d’un besoin annuel de deux nouveaux sérums vis-à-vis de trois virus représentatifs des maladies virales porcines pouvant infecter les porcs ou les sangliers en France et selon l’historique de production de ce type de réactif sur 17 années (2005-2022), 90 porcs devraient être utilisés sur les 5 années de validité du projet.

Raffinement

Les animaux seront logés dans des parcs par groupe de 2 ou 3. Ils auront accès à de l'eau à discrétion et ils seront alimentés à volonté. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et une plaque de couchage. Enfin, les porcs auront à leur disposition des matériaux manipulables (mordilles, boules en matière plastique, tourniquets et tubes à relever et à abaisser) qui seront renouvelés au cours de l’expérimentation. Un soin sera apporté au suivi clinique de chaque animal au quotidien. L’examen clinique comprendra une observation "visuelle" de l'état de santé général des animaux et un relevé de la température rectale de tous les porcs. De plus, l’évolution pondérale sera suivie par des pesées individuelles hebdomadaires, à partir de l'installation des animaux dans les animaleries jusqu’à l’autopsie. La consommation alimentaire au niveau de la case sera également connue chaque semaine. Si une altération de l’état de santé était notée, les animaux concernés seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites décrits dans les procédures expérimentales (partie 4). Si un ou plusieurs rappels d’immunisation sont réalisés et que le virus est administré par voie intramusculaire en présence d’adjuvant, ce dernier sera choisi pour son innocuité. Pour limiter les actes, le suivi sérologique sera réalisé à partir de ponctions sanguines effectuées à une fréquence hebdomadaire, jusqu’à la fin de l’essai, cette cinétique étant suffisante pour évaluer le plateau de la production en anticorps.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible des virus porcins et est donc l’espèce choisie pour la récolte de sérums contenant les anticorps d’intérêt. Les animaux sont sevrés à 3 ou 4 semaines d’âge. Ils auront au minimum 4 semaines d’âge au moment de la première inoculation et au maximum 15 semaines lors du dernier rappel d’immunisation. A 4 semaines, le porc présente d’un point de vue physiologique un système immunitaire quasi-mature. A la fin de l’essai, sa corpulence permet de récupérer au moins 2 L de sang.

64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticorps, par voie intraveineuse sous anesthésie ou trois injections intrapéritonéales par semaine pendant un mois, avec des prélèvements sanguins rétro-orbitaux hebdomadaires sous anesthésie jusqu'à cent jours, pour mesurer la durée d'action d'une immunothérapie anti-CD45RC avant un essai clinique. Le porteur indique que la biosécurité de l'anticorps a déjà été démontrée et qu'aucun effet indésirable n'a été observé, et précise que tous les rats sont euthanasiés pour analyser le sang, la rate, les ganglions et la moelle osseuse. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'ensemble des systèmes biologiques humains et conclut que le rat reste le "meilleur modèle".

Objectifs

L'immunothérapie ciblée constitue un espoir majeur dans le traitement de nombreuses pathologies dont les maladies inflammatoires, les maladies auto-immunes ou encore le rejet de greffe. Contrairement aux médicament immunosuppresseurs couramment utilisés, la thérapie par injection d'anticorps permet d'induire des effets immunomodulateurs spécifiques en agissant uniquement sur les populations cellulaires d'intérêt. Depuis plusieurs années, notre équipe de recherche a démontré l'efficacité de l'immunothérapie par injection d'anticorps dans le contrôle de l'inflammation dans des modèles de transplantation, de maladie du greffon contre l'hôte et de maladie auto-immune. Une nouvelle société pharmaceutique développe actuellement plusieurs versions de cet anticorps. Les résultats obtenus suite à la collaboration entre cette société et notre laboratoire de recherche permettent aujourd'hui d'envisager un essai clinique de phase I courant 2024. L'objectif de ce projet est donc d'étudier la pharmacodynamique (la durée de l'effet thérapeutique) de l'anticorps in vivo chez le rat en prévision de cet essai clinique.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est de définir à la fois la durée de l'effet d'une injection d'anticorps, et la durée de l'effet d'un cycle de traitment par injection répétées d'anticorps. Ces résultats ont pour objectif final d'orienter le protocole de traitement pour l'essai clinique chez l'Homme.

Procédures

Les animaux auront soit une seule injection d'anticorps en intraveineuse (sous anesthésie) soit un mois de traitement avec 3 injections intrapéritonéales par semaine. Dans les deux cas, un petit volume de sang sera prélevé en rétro-orbital sous anesthésie toutes les semaines à partir de la dernière injection et jusqu'à réapparition des cellules (maximum 100 jours après la dernière injection d'anticorps) pour controler l'efficacité à long terme du traitement.

Impact sur les animaux

La biosécurité de l'anticorps, selon la dose et les protocoles utilisés dans cette étude, a déjà été démontré. Aucune nuisance ou effet indésirable n'a été observé. Les injections intraveineuses ou intrapéritonéales ainsi que les prélèvements sanguins peuvent engendrer une douleur légère de courte durée.

Devenir

L'euthanasie au terme de la procédure ou à l'atteinte du point limite est nécessaire pour permettre l'analyse en parallèle des cellules présentes dans le sang et dans les tissus tels que la rate, les ganglions et la moelle osseuse.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'étude pré-clinique réalisée chez l'animal lorsqu'aucun modèle expérimental in vitro ne permet de le remplacer. Aujourd'hui il n'existe pas de modèle in vitro qui permette de reproduire l'ensemble des systèmes biologiques présents chez l'homme. Ainsi, l'injection d'anticorps chez le rat (anticorps démontré comme étant un bon susbtitut de l'anticorps humain) est le meilleur modèle pour étudier la durée de l'effet du traitement en prévision d'un essai clinique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été détermineé de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur l'efficacité ou non du traitement.

Raffinement

Avant même le début de la procédure les animaux seront entrainés à la contention de manière à ce que les injections de traitement puissent se dérouler sans créer de stress supplémentaire chez l'animal. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les symptômes seront évalués selon une grille critériée deux fois par semaine par les personnes responsables de la procédure. Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (rouleau en carton, batônnet de bois,...).

Choix des espèces

Nous avons déjà démontré l'intérêt des modèles de rats pour étudier les pathologies humaines et notamment pour étudier l'implication de certaines cellules dans leur développement. Ainsi, en plus d'avoir mis en évidence la pertinence de l'utilisation des modèles de rats, nous avons prouver que l'injection de notre anticorps n'induit pas d'effets indésirables ou nuisibles chez le rat adulte.