Recherche appliquée

6 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéficientes et castrées chirurgicalement, elles reçoivent la greffe d'un fragment de tumeur humaine puis jusqu'à trois administrations quotidiennes, pour tester des traitements contre des cancers hormono-résistants du sein, de l'ovaire et de la prostate. Le porteur présente ces xénogreffes issues de patients comme "les seuls" modèles reconstituant la complexité des tumeurs humaines et affirme que ce travail sur animal "ne peut être remplacé". L'efficacité clinique des molécules testées reste hypothétique, l'objectif immédiat étant de les sélectionner avant un éventuel passage chez l'humain.

Objectifs

Le cancer représente la deuxième cause de mortalité dans les pays développés et de nombreux cancers sont connues pour être favorisé par certaines hormones, il s’agit principalement des cancers du sein et des ovaires chez la femme et de la prostate chez l’homme. Ces tumeurs hormonodépendantes, qui présentent des récepteurs hormonaux peuvent être traitées par hormonothérapie, cependant, ce traitement hormonal n'a qu'un effet transitoire, d'une durée variable, et bloque la prolifération du cancer sans le guérir. En dépit de l’amélioration constante de la prise en charge de ces patients, de nombreux progrès restent à faire et de nombreux travaux sont actuellement menés afin de mettre sur le marché de nouveaux traitements thérapeutiques anti-tumoraux visant ces tumeurs hormono-résistantes.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de déterminer in vivo sur des animaux castrés porteurs de tumeurs hormonorésistantes, les propriétés anti-tumorales de traitements innovants (petite molécule et/ou biothérapie) afin d’identifier ceux potentiellement efficaces en clinique. L’évaluation de ces traitements innovants permettra de définir leur efficacité anti-tumorale ainsi que les informations nécessaires pour choisir leur posologie en vue de leur utilisation future en clinique. Ce projet se base sur l’utilisation de modèles de tumeurs humaines greffées sur souris castrées ou PDX pour Patient Derived tumor Xenografts. Ces modèles développés au cours des dernières années sont donc des souris castrées porteuses d’une tumeur humaine. Ce sont actuellement les seuls qui permettent de reconstituer sur animal la complexité des tumeurs humaines. Les résultats obtenus sur ces modèles permettent ainsi une réelle extrapolation en médecine humaine. Nous disposons actuellement d'une collection de 24 PDX différentes représentatives des tumeurs hormono-résistantes.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 procédures chirurgicales distinctes d’une durée de 30 minutes maximum par souris, toutes deux réalisées sous anesthésie générale : 1/ Implantation interscapulaire d'un fragment tumoral 2/ Castration chirurgicale par incision cutanée bilatérale inférieure à 1cm au niveau de l’aine pour les mâles ou au niveau des reins pour les femelles. Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées minimum 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale. Selon les traitements, les animaux recevront au maximum 3 administrations quotidiennes. Dans le cadre d'une meilleure connaissance des modèles, des prélèvements de sangs pourront être effectués, dans le respect des directives européennes.

Impact sur les animaux

Actes chirurgicaux d’implantation tumorale et de castration. Hypothermie au moment de l’anesthésie. Stress physique au moment des prélèvements sanguin.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur d'un fragment tumoral, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. Leur réutilisation n'est pas possible compte tenu des procédures expérimentales que ces animaux ont subies (greffe de fragment tumoral, traitement par des molécules) qui pourraient avoir un impact négatif sur les résultats d'une autre étude.

Remplacement

Il est essentiel, avant toute administration à l’Homme, de valider le potentiel thérapeutique de chaque traitement innovant dans des modèles permettant d’étudier tous les paramètres observables, depuis l’administration jusqu’à l’élimination des composés administrés tout en prenant en compte les interactions possibles avec les cellules non-tumorales de l’organisme. Ces études in vivo constituent une des nombreuses étapes du développement préclinique d’un médicament mais ce travail sur animal ne peut être remplacé.

Réduction

Les modèles de PDX utilisés sont parfaitement maitrisés et permettent de n’utiliser que le nombre strictement nécessaire d’animaux pour obtenir des résultats pertinents. Les traitements retenus pour ce projet auront été sélectionnés au préalable lors d’études in vitro permettant la réduction du nombre de groupe à tester. Il sera, de plus, possible d’évaluer plusieurs traitements au sein d’une même étude, sur un même modèle tumoral (1 seul groupe contrôle pour plusieurs traitements différents) et ainsi réduire le nombre total d’animaux inclus dans le projet. Toujours d’après les résultats in vitro, seuls les traitements démontrant les meilleurs effets anticancéreux seront testés in vivo permettant au mieux de réduire le recours aux études in vivo aux traitements ayant le meilleur potentiel thérapeutique anticipé.

Raffinement

Nous utiliserons toutes les données compilées préalablement dans le cadre du développement préclinique du traitement à évaluer. Ceci permettra de prédéfinir les doses potentiellement efficaces et minimisant les effets secondaires. Nous pourrons ainsi raffiner l’étude en étant certain de travailler à des doses permettant d’évaluer l’efficacité des traitements et non leur toxicité, en minimisant ou supprimant tout effet secondaire indésirable pouvant masquer l’objet de l’étude. Les animaux seront acclimatés au moins 7 jours avant d’être greffés, puis seront greffés sous anesthésie avec un mélange d'anesthésique et de tranquillisant. Seuls les animaux présentant des tumeurs en croissance et inclus dans la phase de traitement seront castrés. Outre la surveillance quotidienne post-greffe et castration, les animaux seront surveillés au moins une fois par jour pendant le traitement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement dans le comportement ou l’état de santé des animaux. En cas de modification du comportement normal ou de l’état de santé des animaux surveillés, des actions visant à prévenir douleur ou angoisse comme par exemple interruption du traitement seront appliquées. Le projet dont la durée sera de 5 années sera constitué de 40 études visant à évaluer différents traitements innovants sur différents modèles de PDX. Les études comprendront chacune 163 animaux au maximum, soit un total de 6520 animaux au maximum.

Choix des espèces

Différentes souches de souris toutes immunodéficientes, afin de ne pas rejeter les fragments tumoraux d’origine humaine, provenant d'éleveurs agréés, peuvent être utilisées dans le cadre du projet. Les animaux seront tous des souris adultes âgées de 5 à 13 semaines en fin de période d'acclimatation, afin d’optimiser la prise de greffe car le système immunitaire résiduel qui se développe avec l’âge peut empêcher les tumeurs de pousser. La majorité des études (90%) nécessitant une castration sera réalisée sur des souris mâles (modèles prostates).

40 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant vingt-huit jours, elles reçoivent une alimentation dosée à dix fois la limite réglementaire européenne en déoxynivalénol, une mycotoxine, pour dégrader leur paroi intestinale, avec marquage par transpondeur et prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour prélever l'intestin. Le porteur décrit une perte de poids, un refus de s'alimenter et une inflammation de l'anus. Il indique que les tests in vitro sur cellules humaines ne suffisent pas et qu'il faut connaître le mode d'action de la toxine chez le poisson visé, en vue d'un additif alimentaire.

Objectifs

Le projet présenté ici a pour objectif de développer un modèle de dégradation de la paroi intestinale chez la truite arc-en-ciel en vue du développement d’un additif alimentaire comme stratégie de prévention aux mycotoxines retrouvées dans les régimes alimentaires de poissons. Les mycotoxines sont des métabolites secrétés par des moisissures.Elles sont produites par une large variété de denrées alimentaires avant, pendant et après la récolte. Lorsqu’elles sont présentes en trop grande quantité dans l'alimentation des animaux, une fois ingérées par l’animal, elles peuvent s'avérer toxiques, notamment chez les poissons d’élevage et peuvent entraîner des conséquences sur leur santé et leurs performances. Les effets des mycotoxines varient en fonction de leur nature, de leur concentration et des espèces contaminées. Leur particularité et leur danger tiennent aussi à une forte résistance à la chaleur, même après l'extrusion de l'aliment. Parmi toutes les mycotoxines, la déoxynivanélol, est celle la plus couramment trouvé représentant un facteur de stress « naturel » avec comme voie d’entrée le tractus digestif, son effet est difficilement décelable sans recours à des analyses spécifiques. Contrairement aux possibles utilisations de produits chimiques ou autres toxines pour induire le délabrement intestinal, la déoxynivalénol est une toxine qui est présente naturellement dans l’alimentation des poissons. Elle constitue donc un moyen pour développer le modèle de délabrement intestinal, tout en permettant de mieux appréhender son mode d’action qui sera utile et applicable aux actuels problèmes de l’industrie aquacole. Cependant, selon le groupe CONTAM de l’EFSA (Autorité Européenne de Sécurité des Aliments), les données disponibles sur la toxicité de la déoxynivalenol sont limitées pour les poissons d’élevage et aucun critère d'effet spécifique pour les effets aigus n'a été identifié. De plus, les données disponibles sont relatives aux effets sur les paramètres immunitaires, hépatiques ou neuroendocriniens mais pas sur les paramètres intestinaux. À la vue du peu de données disponibles, il a été choisi de doser la toxine dans des conditions permettant d’induire un plausible délabrement de la paroi intestinale soit à un niveau d’inclusion de 50 mg/kg d’aliment correspondant à 10 fois la dose règlementaire européenne mais aussi à une dose suffisante pour bien comprendre le mode d’action et détecter les effets au moyen des méthodes d'analyses sélectionnées.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet à court terme permettront de comprendre le mode d’action de cette mycotoxine au niveau intestinal et contribueront ainsi à répondre aux problèmes actuels de l’industrie aquacole et aussi à développer un additif alimentaire correcteur chez la truite arc en ciel. Les résultats de ce projet aideront à revoir à la baisse le nombre d’animaux utilisés par traitement. En effet, à ce jour, aucune donnée n’est disponible sur l’effet de cette mycotoxine sur les paramètres étudiés chez la truite arc en ciel. Le fait de mieux connaitre les écarts types de nos paramètres d’intérêt permettra de raffiner les tests statistiques utilisés pour définir le nombre d’animaux nécessaires et suffisant pour répondre à l’hypothèse de l’étude. De plus, si une corrélation est faite entre les effets au niveau de l’intestin et le niveau de biomarqueurs ciblant la santé intestinale au niveau sanguin, un seul et même animal pourrait être utilisé pour évaluer l’effet aigu et chronique de la mycotoxine (cinétique sanguine) dans une prochaine étude pilote d’évaluation de l’effet d’un additif correcteur, diminuant au moins de moitié le nombre d’animaux utilisés.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 28 jours. Chaque poisson anesthésié sera identifié une fois au début de la procédure par un transpondeur placé dans le muscle du dos. La moitié des animaux (soit 20 poissons) seront soumis à un prélèvement sanguin à jour 7 et l’autre moitié à la fin de l’étude (J28). A chaque temps (J7 et J28), un volume sanguin de 4 ml nécessaire et suffisant, pour analyser la concentration plasmatique des mycotoxines et des biomarqueurs, est prélevé en une seule fois sur chaque poisson anesthésié. Pour chaque prise de sang, le temps ne dépassera pas 1 minute. A la fin de la prise de sang, les poissons sont euthanasiés (procédure sans réveil) pour le prélèvement des contenus et des tissus intestinaux.

Impact sur les animaux

Perte de poids, diminution du facteur K (coefficient révélant l'état physiologique des poissons en terme de poids, de longueur, relation taille-poids), refus de s’alimenter, inflammation de l’anus.

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements biologiques tels que les intestins et les contenus intestinaux.

Remplacement

Des alternatives non animales, réalisées in vitro ont démontré l’effet néfaste et cytotoxique de la déoxynivalenol sur des lignées cellulaires intestinales humaines. Ces méthodes confirment l’effet délétère de la mycotoxine, la déoxynivalenol. Cependant, le développement d’un additif alimentaire correcteur implique de connaitre le mode d’action de la mycotoxine chez l’animal auquel il est destiné. La procédure expérimentale utilisant des animaux vivants, est, sur la base des connaissances acquise in vitro, nécessaire pour comprendre et évaluer l’effet de la mycotoxine au niveau de l’intestin de la truite arc en ciel spécifiquement.

Réduction

Les alternatives non animales décrites dans la littérature sur l’effet de la déoxynivalenol chez la truite arc en ciel ont ciblés des paramètres immunitaires, hépatiques ou neuroendocriniens mais pas intestinaux. Une seule étude a montré l’impact de la déoxynivalénol ajoutée à 5.5 mg/kg sur l’intégrité intestinale chez le saumon. Sur la base des résultats rapportés dans cette étude, un test statistique de référence a permis de réduire le nombre d'animaux par groupe à 10 sans affecter l'effet attendu. Ainsi, 2 groupes d’animaux seront considérés avec 2 temps de prélèvements (7 j post traitement avec la mycotoxine et 28 jours post traitement). Pour chaque temps de prélèvement, 10 animaux par groupe seront utilisés et prélevés afin de pouvoir bien évaluer les paramètres d’intérêt de ce projet.

Raffinement

Avant toute manipulation (pesée ou prélèvement) au cours d’une étude, les truites arc en ciel sont sédatées puis anesthésiées à. Utilisation d'un anesthésique local par voie intramusculaire une fois l'animal marqué afin de réduire la douleur après le marquage. La capture et le stress dus à la sortie des bassins pour la pesée individuelle des animaux et pour le marquage au-dessus de la ligne media et les prises de sang (approche ventrale) sont réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’un mousse humide pour poser l’animal sur le support de contention et d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que la densité des animaux par bassin (

Choix des espèces

Les additifs alimentaires susceptibles d’être développés afin d’atténuer les effets des toxines, sont destinés à être incorporés dans les aliments destinés aux poissons d’eau froide. Il peut s’agir de la truite qui fait partie de la famille des salmonidés, utilisée comme modèle pour les poissons d’eau froide car il est taxonomiquement proche du saumon, et également un animal plus résistant aux conditions d'élevage, avec un taux de croissance plus élevé. Truites jeunes/adultes pesant entre 550 et 650 grammes. Cette taille de poisson est nécessaire pour pouvoir effectuer les échantillonnages de tissus et les prélèvements de sang demandés par l’étude

3 000 souris, rats et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire est provoquée par un dysfonctionnement des glandes de Meibomius, avec administrations souvent quotidiennes de produits par gouttes, injections ou voie intraconjonctivale, entraînant picotements, brûlures, rougeurs et gonflements des paupières, avant mise à mort pour des analyses ex vivo. Le porteur présente les examens comme non invasifs et proches de ceux pratiqués en cabinet. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne mime l'œil "dans sa globalité" et retient trois espèces pour couvrir leurs particularités anatomiques.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de proposer des modèles expérimentaux de sécheresse oculaire chez le rat, la souris et le lapin afin de tester l'efficacité de nouveaux traitements. L’œil sec est une maladie multifactorielle des larmes et de la surface oculaire, plus fréquente chez les femmes et les personnes âgées. Elle concerne 5 à 35% de la population. Les manifestations cliniques sont variées et impactent considérablement la qualité de vie des patients. Les modèles de sécheresse oculaire chez les rongeurs et le lapin sont relativement bien décrits dans la littérature. Les dysfonctionnements des glandes de Meibomius (DGM ou MGD) sont des troubles chroniques répandus affectant la santé et le bien-être de millions de personnes dans le monde. Ces dysfonctionnements constituent une anomalie chronique et diffuse des glandes de Meibomius, caractérisée, en principe, par une obstruction des canaux excréteurs et/ou des modifications qualitatives/ quantitatives des secrétions glandulaires, dont les conséquences potentielles sont : Altérations du film lacrymal, symptômes d’irritation oculaire, inflammation clinique, maladie de la surface oculaire. Les DGM sont classifiés selon deux grandes catégories, en fonction des sécrétions meibomiennes : hypoexcrétion (la cause la plus fréquente du DGM) et hyperexcrétion. En conclusion, les DGM peuvent provoquer des altérations du film lacrymal, des symptômes d’irritation, d’inflammation et de sécheresse oculaires. C’est de loin la première cause de sécheresse dite « évaporative ».

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

Les procédures expérimentales nécessitent l'administration, le plus souvent quotidienne, de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie intramusculaire, intrapéritonéale, intraconjonctivale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles, sous anesthésie locale ou sous anesthésie légère. Leurs durées sont réduites au maximum pour le bien-être de l'animal. Ces examens ne durent que quelques secondes pour la plupart, 5 minutes environ pour le plus long.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont essentiellement celles observées dans la maladie à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, des rougeurs palpébrales, des gonflements des paupières. Toutes ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire de courte durée et éventuellement une hyperémie des conjonctives comme on peut le constater chez l’homme.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre des réalisés les évaluations ex vivo (évaluations histologiques sur tissus, dosages de produits...).

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est de plus soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à d’importantes interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide des tests statistiques Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 12 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.

48 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant deux interventions chirurgicales sous anesthésie et un prélèvement de 30 ml de sang. Une matrice trachéale décellularisée est implantée dans un muscle pour tester sa vascularisation, avec ou sans immunosuppresseur, en vue d'un futur remplacement de trachée chez l'enfant. Le porteur indique que tous seront tués à l'issue de la seconde intervention pour prélever la matrice, tout en évoquant par ailleurs un possible retour à la ferme pour une partie des animaux. Il présente le recours à l'animal comme "indispensable" avant des essais cliniques, le porc ayant une trachée proche de celle de l'homme.

Objectifs

Chez l’enfant, plusieurs pathologies trachéales congénitales en échec de traitement pourraient bénéficier d’un remplacement trachéal. A ce jour, il n’existe pas de stratégie consensuelle. La technique de décellularisation par ingénierie tissulaire est une stratégie prometteuse : l’élimination des cellules, de leur matériel génétique et de leurs antigènes permet d’obtenir une biocompatibilité accrue avec un risque de rejet faible ; d’autre part, le respect des propriétés biochimiques et biomécaniques de la matrice extracellulaire garantit les capacités de biointégration, limite les risques de malacie cartilagineuse et évite la pose d’un stent prolongé. Nous avons fait le choix de la décellularisation et avons développé une technique fiable et reproductible d’obtention d’une matrice trachéale décellularisée. La première phase du remplacement trachéal est une étape préliminaire de maturation. Elle consiste à implanter la matrice dans un muscle afin d’obtenir une vascularisation adéquate pour assurer la survie du greffon. La néovascularisation induite permet la biointégration et la colonisation cellulaire ; en contrepartie, elle expose également la matrice extra-cellulaire a des phénomènes immunitaires de réaction à corps étranger. Cette réponse non spécifique peut induire une biodégradation rapide et/ou fibrose et sténose. Pour cette raison, l’utilisation d’un traitement immunosuppresseur provisoire durant la phase de maturation pourrait être bénéfique, a fortiori chez l’enfant, chez qui les indications de remplacement sont exceptionnellement tumorales. Ce projet a pour objectif principal de comparer, avec et sans traitement immunosuppresseur, la biointégration d’un substitut trachéal lors de la phase de maturation de la matrice. L’objectif secondaire de ce projet est d’évaluer la durée minimale de maturation pour obtenir une néovascularisation efficace.

Bénéfices attendus

En plus des résultats cliniques, mitigés, déjà publiés, l’une des raisons empêchant un passage en clinique des biomatériaux pour un remplacement trachéal est l’absence d’étude rigoureuse préclinique, dans un modèle animal représentatif de l’anatomie humaine. Ce projet est la première étude systématique de biointégration de MTD dans un modèle porcin. Les bénéfices à court terme seront (1) la connaissance des mécanismes immunologiques en jeu dans la biointégration d’un tissu décellularisé, (2) la détermination de la durée adéqutae de préparation de la matrice à l’implantation afin d’obtenir une vascularisation efficace, (3) l’étude de l’efficacité et la pertinence d’un traitement immunosuppresseur dans un modèle porcin. Les bénéfices à long terme de cette étude seront la preuve de concept de la bio-intégration d’une matrice décellularisée et le passage en clinique pour des remplacements trachéaux. De plus, des résultats positifs permettront d’élargir les indications aux sténoses trachéales courtes. L’interposition d’un tissu biocompatible pourrait être une aide chirurgicale pour limiter les tensions des sutures et les sténoses secondaires. Enfin, le recours à un tissu biocompatible pour d’autres indications de chirurgie des voies aériennes pourrait être possible, notamment pour les chirurgies de sténose du larynx.

Procédures

24 porcs auront deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale. La première intervention dure 60 minutes. La deuxième dure 45 minutes. Un prélèvement sanguin de 30 mL sera réalisé lors de chaque anesthésie générale. Les interventions auront lieu sur une période de 15 jours à 60 jours, en fonction des sous-groupes.

Impact sur les animaux

La première intervention peut être génératrice de stress et de douleur modérée dont la durée prévisible est de 3 à 4 jours. L’infection du site opératoire est une complication potentielle. Le prélèvement du muscle sterno-céphalique peut entrainer des douleurs modérées à la mobilisation de la tête. Il n’y pas de trouble de déglutition attendu. La perte de poids, sauf cause infectieuse, n’est pas attendue. Pour les animaux qui auront un traitement par immunosuppresseurs, la susceptibilité aux infections est augmentée durant toute la durée du traitement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la deuxième intervention pour prélèvement de la matrice trachéale implantée, et pour le prélèvement de la trachée native.

Remplacement

Le remplacement n’est pas possible car l’étude porte sur la bio-intégration d’un substitut au sein d’un organisme vivant complexe (avec une anatomie proche de celle de l’homme). Il n’y a ni modèle in vitro ni modèle in silico. Par ailleurs, cette étude n’a pas été rapportée par une autre équipe à ce jour. Le recours à l'expérimentation animale est indispensable pour ce projet avant la réalisation d’essais cliniques chez l’homme.

Réduction

Nous avons déjà débuté les procédures chirurgicales d’implantation sterno-céphalique (Procédure 1) sur des porcs mis à mort dans d’autres expérimentations animales. Ces chirurgies préliminaires nous permettent d’affiner et de perfectionner les techniques chirurgicales au prélable. Cette stratégie nous permet de ne pas créer de sous-groupe d’étude préliminaire. Le nombre total d’animaux a été calculé en respectant les critères pour une analyse statistique non paramétrique par échantillons appariés. Pour des analyses significatives comparatives, le nombre de 4 animaux dans chaque bras (avec ou sans traitement) pour chaque durée de maturation (J15, J30 ou J60) a été défini a priori, soit 24 animaux au total. Le critère d'évaluation principal est l’activité inflammatoire au sein de la MTD. Les paramètres étudiés seront : la nécrose du muscle sterno-céphalique, la dégradation de la MTD, la présence de trous au sein de la MTD, la réduction de calibre, la quantité d’anticorps antiHLA, la quantité d’ADN circulant, l’infilitration cellulaire et sa caractérisation, les taux plasmatiques de cellules inflammatoires et le taux de cytokines. Lors de l’explantation de la MTD maturée, la trachée native réséquée est prélevée pour des études histologiques, immunologiques et biomécaniques. Les prélèvements non utilisés seront cryopréservés ou fixés pour une possibilité d’étude rétrospective sans recourir à de nouvelles expérimentations animales. Enfin lors de la mise à mort, sur le principe de la mutualisation des prélèvements, d’autres tissus du porc pourront également être mis à disposition de nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, de manière globale, en expérimentation animale.

Raffinement

La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi). Le vétérinaire référent du Laboratoire passera une fois par semaine voir les animaux ainsi qu’à la demande des zootechniciens si besoin. Durant les périodes post-opératoires immédiates, le suivi des animaux est quotidien à l’aide d’une grille de suivi des points limites définis a priori (alimentation, perte de poids, dyspnée, douleur). Les animaux auront un traitement antalgique adapté. Afin d’éviter une surinfection de la zone de greffe, une antibioprophylaxie systématique sera administrée. En cas de signes externes de souffrance (perte de poids, cachexie, prostration, fièvre) ou de dyspnée persistante pendant plus de 24h, les animaux seront mis à mort pour raisons humanitaires. Pour les porcs qui seront mis à mort à 60 jours, un retour à la ferme sera envisagé.

Choix des espèces

Parmi les différents modèles animaux envisageables (rongeurs, lapins, chèvre, mouton, porc), le porc a une trachée dont les caractéristiques anatomiques et biomécaniques se rapprochent le plus de celle de l’homme. De plus, des modèles de porcs bénéficiant de remplacement trachéal par aorte cryopréservée ou par substitut trachéal ont déjà été étudiés et publiés. Enfin, les mécanismes immunologiques porcins ont été bien décrits. Cette connaissance établie facilitera notre analyse de la réaction inflammatoire potentielle sur le site de greffe, avec ou sans traitement immunosuppresseur. Animaux mâtures sexuellement pour limiter la croissance des tissus, plus intense chez chez les animaux en croissance (juvéniles). L'âge est relativement secondaire en revanche nous visons des animaux dont le poids est stabilisé entre 45 et 60 kg. Cette stabilité (relative) du poids est habituellement atteinte entre 12 et 18 mois.

1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis subissent injections, gavages, huit prélèvements sanguins, neuf séances d'imagerie et des mesures de tumeur, avant d'être tuées pour les analyses. Le porteur reconnaît une douleur liée à la croissance tumorale, souvent associée à une perte de poids. Il présente la souris comme "le modèle de choix et de référence" pour valider in vivo un agent censé renforcer les lymphocytes T contre le cancer.

Objectifs

Ces dix dernières annéees, les immunothérapies ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant nos défenses immunitaires à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards de chimiothérapie et radiothérapie. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus in vitro montrent une potentialisation des outils cellulaires à la base des immunothérapies dans le contexte du cancer.

Procédures

Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : - 8 prélévements sanguins (1 goutte), la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 9 séances d'imagerie, la durée de ce geste est évaluée à 3 minutes - 6 mesures de la tumeur à l'aide d'un pied à coulisse, la durée de ce geste est évaluée à 2 minutes - 4 administrations par gavage, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes - 9 injections intrapéritonéales, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 injection sous-cutanée, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 séance de rasage du flanc droit à l'aide d'un rasoir électrique, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes - 1 injection intraveineuse, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute

Impact sur les animaux

Des nuisances potentielles pourraient résulter du stress généré lors des injections et plus globalement par la manipulation hebdomadaire des animaux, mais également de la douleur résultant de la croissance tumorale qui est souvent associée à une perte de poids

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.

Remplacement

Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une potentialisation des fonctions antitumorales après traitement par un inhibiteur pharmacologique nouvellement identifié. Le recours aux modèles animaux permettra de valider in vivo, dans des modèles précliniques, le gain résultant de l'utilisation de cet inhibiteur sur des approches d'immunothérapies au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par palpation des tumeurs et par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d'étude sont faits le plus souvent en même temps afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base de nos travaux antérieurs et de la littérature montrant que 18 à 24 souris par groupe permettent de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les interventions (injections intraveineuses et prélèvements sanguins) seront précédées d'une anesthésie générale, afin de prévenir la douleur. Nous utiliserons l'imagerie pour un suivi de la charge tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basé sur cette approche pour les études ultérieures. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entraina une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix et de référence pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Les modèles murins permettent en effet d'apprehender la complexité de la réponse tumorale. Ces modèles permettent notamment d'apprehender la possibilité de rencontre des cellules de l'immunité et des cellules tumorales au sein de l'organisme. Ces modèles permettent également de prendre en compte la survie des cellules immunes et le maintien de leur activité antitumoral au sein du microenvironement tumorale, qui le plus souvent met en place des mécanismes pour inhiber la réponse immune. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).

242 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles inhalent du styrène ou des isomères du xylène six heures par jour, cinq jours par semaine, pendant une à quatre semaines, et une partie subit une chirurgie du crâne pour implanter un système de contention à vis destiné à mesurer les mouvements oculaires, avant la mise à mort et le prélèvement des oreilles. Le porteur indique que les fortes concentrations peuvent déprimer le système nerveux et provoquer des effets narcotiques et des troubles de l'équilibre. Il présente l'étude comme la validation in vivo d'une toxicité déjà suggérée in vitro, en vue d'un éventuel test de criblage des polluants industriels.

Objectifs

Ce projet vise à étudier la potentielle toxicité de quatre solvants aromatiques présents dans l’industrie, le styrène et les trois isomères du xylène, sur l’organe périphérique de l’équilibre, le vestibule, situé dans l’oreille interne. Il s’agit également de comparer cette potentielle toxicité à celle décrite avec ces solvants sur la cochlée, organe périphérique de l’audition, également situé dans l’oreille interne.

Bénéfices attendus

La toxicité vestibulaire de certains solvants aromatiques a été suggérée précédemment par une étude in vitro. La présente étude permettra de valider (ou d’infirmer) ces informations grâce à une approche in vivo. Si les résultats in vivo confirment les résultats obtenus in vitro, alors ce test pourra potentiellement être proposé comme test de criblage afin d’identifier les polluants industriels susceptibles de perturber l’équilibre des salariés.

Procédures

Les animaux seront exposés par inhalation à différentes doses de styrène ou d’un des 3 isomères du xylène. Cette exposition durera entre une et quatre semaines, à raison de 6 heures / jour, 5 jours par semaine. Afin de déterminer les effets de ces différentes substances sur l’oreille interne, l’audition et l’équilibre des animaux seront testées avant exposition, à la fin de l’exposition puis 4 semaines après. L’audition sera estimée par la mesure des produits de distorsion, une méthode non invasive utilisée pour le dépistage des surdités chez les nouveaux nés. Chez le rat, elle nécessite une anesthésie médicamenteuse légère. L’équilibre sera estimé par des tests comportementaux et par la mesure de la persistance des saccades oculaires après rotation (nystagmus post-rotatoire). Cette dernière mesure demande une contention de la tête, qui nécessite l’implantation à demeure d’un système de contention (pas de vis). Cette chirurgie crânienne est réalisée, une seule fois, 4 semaines avant le début de l’exposition. Chez la moitié des animaux, un prélèvement sanguin à la queue sera réalisé sous anesthésie gazeuse en sortie d’exposition. Au terme des expérimentations, les animaux seront mis à mort et les oreilles prélevées pour observer les dommages causés par les expositions aux solvants.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront opérés afin de recevoir un dispositif de contention pour mesurer les mouvements oculaires. Afin d’éviter les douleurs post-chirurgicales, un antalgique morphinique sera délivré avant de réaliser l’anesthésie. Par ailleurs, il n’est pas exclu, que les animaux recevant une anesthésie par voie générale ou gazeuse, dans le but de réaliser des tests auditifs ou des prélèvements sanguins, ressentent du stress. Néanmoins, celui-ci devrait être mineur car les animaux sont habitués à être manipulés et les gestes sont opérés par du personnel qualifié. Les tests comportementaux, mais également la mise en rotation des animaux lors de la mesure des saccades oculaires, pourraient générer chez les animaux, pendant un court instant, un désagrément se traduisant par des troubles de l’équilibre. Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant 6 heures/jour, 5 jours par semaine durant 4 semaines. Ces concentrations élevées pourront avoir un effet dépresseur sur le système nerveux central et des troubles sensori-moteurs comme des effets narcotiques pourront alors être observés. Néanmoins, ces troubles ne devraient pas persister dans l’heure qui suit la sortie des chambres d’inhalation.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 2 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques.

Remplacement

La toxicité de certains solvants industriels sur la cochlée a été démontrée par de nombreuses études sur l’animal et par des approches épidémiologiques en entreprise. En revanche, les effets de ces substances sur le vestibule (récepteur de l’équilibre), qui se trouve également dans l’oreille interne, n’ont jamais été étudiés in vivo. Il est à noter, cependant, qu'un modèle de culture de l’organe récepteur, développé au laboratoire, a suggéré une toxicité de ces solvants sur le vestibule. Ces données in vitro doivent être confirmées par une étude in vivo avant d’alerter les services de santé au travail de la dangerosité de ces subtances sur cet organe. La présente étude se propose d’exposer des rates au styrène et aux différents isomères du xylène par inhalation. L’évaluation de la toxicité se fera par des mesures fonctionnelles, comportementales et histologiques qui permettront de comparer de manière objective les effets toxiques sur la cochlée et sur le vestibule. Des analyses histologiques seront également réalisées post mortem. Cette étude évalue donc la fonction de deux systèmes sensoriels ainsi que diverses réponses réflexes. Ces méthodes ne peuvent être appliquées que sur des organismes vivants. D’autre part, pour modéliser la toxicité de ces agents chimiques chez l’Homme, il est nécessaire qu’ils soient métabolisés par des organismes vivants

Réduction

La démarche consiste à tester dans une première phase expérimentale (phase 1) les effets vestibulaires d’une forte concentration de styrène pendant une exposition courte (5 jours). Si celle-ci ne génère pas d’effet vestibulaire, une nouvelle exposition à la même concentration sera réalisée pendant 4 semaines (phase 2). Si aucune vestibulotoxicité n’est observée, la recherche de seuil d’effet (phase 3) ne sera bien évidemment pas réalisée, et les expérimentations seront stoppées. Dans le cas contraire, la phase expérimentale 3 sera menée en exposant les animaux à des concentrations de styrène plus faibles (la durée dépendra des résultats des phases 1 et 2). Enfin, la phase 4 s’attachera à évaluer la vestibulotoxicité de chacun des isomères du xylène (la durée de l’exposition dépendra une nouvelle fois des résultats des phases 1 et 2). Le dispositif crânien des rates destinées aux mesures des saccades oculaires après rotation ne permettant pas les mesures des produits de distorsion acoustique, des lots de rates dédiés spécifiquement à ces tests seront prévus. Ainsi pour chaque solvant et concentration, 2 groupes expérimentaux seront prévus, l’un pour la mesure des saccades oculaires après rotation et l’autre pour les mesures de comportement suivies des mesures des produits de distorsion acoustique (idem pour les contrôles). Lors de chaque campagne, un maximum de conditions expérimentales seront testées simultanément afin de limiter le nombre de groupes contrôles associés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance (logiciel G-Power). Le résultat de ce calcul est de 10 animaux par groupe. 22 animaux surnuméraires (soit 10% de l’effectif prévu) seront nécessaires en cas de mortalités (anesthésie, perte de casques...). L’étude nécessitera au maximum 242 rates (dont les 22 surnuméraires). Ce nombre pourrait être réduit si les résultats des phases 1 et 2 sont négatifs.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les rates seront placées dans les conditions standard d’hébergement pour cette espèce (température, hygrométrie). Aucune expérimentation ne sera réalisée lors de la première semaine afin de laisser le temps aux rates de s’habituer à leur nouvel environnement. Par ailleurs, les rates, animaux nocturnes, seront placées en cycle inversé jour-nuit de 12h / 12 h afin de réaliser les expérimentations pendant leur phase d’activité. Elles seront stabulées à 2 ou 3 par cage pour permettre les liens sociaux de s’établir. Les animaux seront habitués à être manipulés en amont des expérimentations. Les animaux soumis à une intervention chirurgicale recevront une médication adaptée à savoir une analgésie pré-opératoire avant de réaliser l’anesthésie et des anti-inflammatoires seront administrés en post-opératoire. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance ou une perte de poids trop importante nécessitant une prise de décision immédiate. Ils seront hébergés en cage individuelle pendant deux semaines afin d’assurer une bonne cicatrisation. L’utilisation de cages ouvertes et transparentes leur permettra de créer des liens sociaux et des contacts visuels, olfactifs et auditifs nécessaires à leur bien-être. La litière utilisée sera constituée de carrés de cellulose et leur environnement sera enrichi par des tunnels en carton ou du « sizzle nest » pour constituer des nids. Pendant les phases d’exposition par inhalation aux solvants, les rates seront également surveillées toutes les deux heures afin de déceler d’éventuels signes cliniques traduisant un mal-être de l’animal qui nécessiterait d’isoler immédiatement l’animal. Des fiches de suivi seront renseignées à cet effet.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études de toxicologie et, est un modèle recommandé pour les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. Par ailleurs, le métabolisme des solvants par le rat est proche de celui de l'Homme. De plus, les expérimentations doivent être menées sur des souches de rat pigmentées comme les rats Long Evans puisque la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne, comme chez l'Homme. Les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants. Par ailleurs, la plupart des études expérimentales portant sur les systèmes sensoriels de l'audition et de l'équilibre ainsi que les études comportementales ont été menées avec cette souche de rat ce qui facilitera la comparaison avec nos résultats obtenus au sein du laboratoire. Des femelles ont été choisies pour réaliser les expérimentations car celles-ci grossissent moins avec l’âge que les rats mâles et le dispositif pour enregistrer le mouvement oculaire après mise en rotation de l’animal ne permet pas de faire ces mesures sur des animaux de plus de 300 g. Les rates seront utilisées, pour les mesures fonctionnelles, à l'âge adulte entre 16 et 18 semaines car l'oreille interne ainsi que les enzymes intervenant dans le métabolisme des toxiques doivent être matures.