Recherche appliquée

Pour savoir si la chaleur aggrave la toxicité d'une mycotoxine présente dans près de la moitié des céréales, 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Elles sont exposées quatre semaines à cette toxine par l'alimentation et placées dans une armoire chauffée à 32-35 °C, avec des mesures de glycémie après douze heures de jeûne. Le RNT décrit une baisse de poids, une respiration accélérée et une activité réduite sous l'effet combiné de la chaleur et du contaminant. La mise à mort sert à prélever le foie et l'intestin pour comparer les réponses des mâles et des femelles.

Objectifs

Tout au long de sa vie, l’Homme est exposé à un large éventail de contaminants alimentaires d'origines diverses. Les mycotoxines sont produites par certaines moisissures et sont les contaminants naturels les plus fréquents présents dans nos assiettes. La mycotoxine étudiée se retrouve dans près de 50 % des céréales et environ 80 % des individus y sont exposés. Le changement climatique qui implique une hausse des températures, bouscule le rythme naturel des cultures et modifie les périodes où les champignons peuvent les infecter, ce qui peut, selon les régions, augmenter ou réduire la présence de cette mycotoxine. Elle perturbe le fonctionnement de l'intestin notamment en provoquant une inflammation qui pourrait jouer un rôle dans l'apparition et la gravité des maladies inflammatoires de l'intestin. Le corps garde normalement une température assez stable, même si elle peut un peu varier. Quand il fait très chaud, il subit un stress thermique: cela perturbe son fonctionnement interne et modifie l’activité de nombreuses cellules. Pour se protéger, l’organisme déclenche une réaction de défense, qui se traduit par une hausse de la température corporelle, une plus forte sollicitation du cœur et une utilisation accrue du sucre comme source d’énergie. Même si plusieurs études montrent que le changement climatique peut faire varier la présence de cette toxine, aucune ne s’est encore penchée sur la façon dont elle pourrait devenir plus ou moins dangereuse pour les organismes vivants. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de cette toxine dans un contexte de forte chaleur et de caractériser ces effets sur différents paramètres physiologiques au niveau du foie et de l’intestin. Nous chercherons à vérifier l'hypothèse que, dans des conditions réalistes d’exposition, ces effets seront différents entre les mâles et les femelles.

Bénéfices attendus

Certains consommateurs sont quotidiennement exposés à des aliments contaminés par la mycotoxine étudiée présente dans les aliments à base de farine de blé, de maïs, etc. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons in vivo chez la souris si l’exposition chronique à la chaleur potentialise les effets de cette mycotoxine. Les données expérimentales permettront d’évaluer l’impact d’une exposition combinée à la chaleur et à la mycotoxine sur le métabolisme général, ainsi que sur la santé digestive et hépatique. Les résultats attendus de ce projet présentent un enjeu important pour la santé publique, compte tenu de l’exposition chronique des consommateurs à cette toxine et de l’augmentation continue des températures associées au réchauffement climatique. Si les hypothèses sont confirmées, les données produites feront l’objet de publications scientifiques et pourront être prises en compte dans l’évaluation du risque d’exposition chez l’Homme.

Procédures

L’objectif de ce projet est d’étudier l’exposition chronique à une mycotoxine lors d’un stress thermique. Les animaux seront exposés à la mycotoxine via l’alimentation pendant 4 semaines et/ou à une chaleur plus élevée que lors d’un hébergement standard (20-24°C) dans une armoire chauffante entre 32-35°C. Les animaux seront pesés une fois par semaine, ce geste dure 15 secondes. Une mesure de la glycémie et de la cétonémie sera réalisée 2 fois au cours de la procédure après 1 et 4 semaines d’exposition. Pour cela, les animaux sont mis à jeun pendant 12h, puis une goutte de sang sera prélevée. Ce prélèvement ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. A la fin de la procédure, un prélèvement de sang sera effectué puis les animaux seront euthanasiés et des organes prélevés pour analyses.

Impact sur les animaux

La consommation d’un aliment contaminé par la mycotoxine peut entrainer une réduction de la prise de poids des animaux. L’exposition à une température ambiante de 32-25°C est susceptible d’induire une augmentation de la fréquence respiratoire, une diminution de l’activité locomotrice, une modification de la prise alimentaire ainsi qu’une augmentation de la consommation d’eau. Une légère perte de poids transitoire lors des 2 premiers jours ou des modifications du comportement peuvent également être observées. Les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention (15s) et une douleur ponctuelle liée à la piqure de l’aiguille.

Devenir

A l’issue de la procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes destinés à être analysés pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des études précédentes ont permis de montrer que la mycotoxine étudiée entraîne des perturbations intestinales et hépatiques, tandis que l’exposition à la chaleur induit un stress thermique pouvant altérer le métabolisme du foie. . En effet, des tests in vitro sur cellules ont déjà été réalisé par le laboratoire pour étudier les effets des mycotoxines. Cependant ces modèles présentent des limites car ils ne reproduisent pas la complexité d’un organisme entier avec les interactions entre organes, ne permettent pas d’évaluer correctement la métabolisation des mycotoxines et ne reflètent pas les effets globaux ou à plus long terme. Lorsqu’elle est ingérée par un organisme vivant, son devenir et ses effets dépendent notamment de son absorption intestinale et de sa métabolisation, processus qui peuvent être perturbés par un stress thermique. Ce projet nécessite donc l’utilisation d’animaux de laboratoire pour étudier les conséquences d’une exposition alimentaire à la mycotoxine dans un environnement plus chaud sur un organisme entier, impliquant l’interaction de différents tissus (foie, tissu adipeux, intestin, cerveau, muscle) et les réponses physiologiques globales du aux adaptations de l’organisme. Il est impossible de reproduire ces interactions complexes en utilisant uniquement des méthodes alternatives, telles que des cultures cellulaires.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=12 animaux/groupe). Cet effectif a été déterminé en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Lors du suivi quotidien des animaux, nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et nous utiliserons une grille d'évaluation de leur état général portant sur l’apparence générale, le comportement, les signes cliniques et l’alimentation. Le cumul du score de chacun de ces critères permettra de décider d’un éventuel arrêt de la procédure. Les souris seront hébergées en groupe pour respecter leurs comportements sociaux et un enrichissement de type abri en inox ou un élément de nidification sera ajouté dans la cage. Une habituation à la préhension par l'expérimentateur sera réalisée avant le début de l'expérimentation pour diminuer ce stress.

Choix des espèces

Les lignées de souris sont largement utilisées dans la recherche sur le métabolisme. Il est connu que la lignée utilisée dans cette étude développe des maladies hépatiques. La souris présente des similitudes avec l’espèce humaine pour ce qui est des maladies et de leurs effets sur le corps. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car nous avons besoin d’avoir un tractus digestif et un système immunitaire mature. Les souris sont adultes à partir de 8 semaines.

Les souris qui perdent 20 % de leur poids sont mises à mort. 1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'un aérosol, puis reçoivent des composés par gavage cinq jours par semaine pendant quatre à huit semaines, l'infection pouvant provoquer une parésie et une perte de poids. Le projet teste de nouvelles molécules avant un éventuel essai clinique, et le porteur revendique un "besoin de générer un maximum de données" pour de "meilleures armes" contre la maladie.

Objectifs

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la sélection in vivo de molécules comme traitement ou encore vaccins avant leur passage en essais cliniques. Le projet européen, dans lequel nous sommes partenaires, est engagé dans le développement de nouvelles molécules anti-tuberculeuses. Ce projet, qui ne compte pas moins de 30 partenaires de 13 pays différents, a pour ambition d’accélérer les processus qui conduiront à la sélection de nouveaux composés et nouvelles combinaisons efficaces comme traitement contre la tuberculose avant leur entrée en phase clinique. Les nouvelles molécules sont synthétisées par des groupes pharmaceutiques partenaires, sont testées par une partie du consortium en charge des expériences in vitro et les plus prometteuses (seule ou en combinaison) passent ensuite à l’étape in vivo pour évaluer leur véritable potentiel sur un organisme vivant. Nous intervenons, avec d’autres groupes, d’autres modèles, à ce niveau-là. Notre participation à ce projet permettra de générer in vivo des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques chez le modèle murin pour un nombre limité de molécules savamment sélectionnées ; données qui, analysées et intégrées à l’ensemble de celles générées par le consortium, participeront donc à l’optimisation et au développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux, à valider ou non leur passage en phase clinique.

Bénéfices attendus

Les données générées par nos expériences combinées à celles des divers partenaires rendront compte de l’efficacité de nouveaux composés contre l’agent pathogène de la tuberculose, dont certains, telle est l’ambition de ce projet, pourront passer en phase clinique. A cela, l’apport de nouvelles technologies, l’apport de nombreuses données inédites pour caractériser la tuberculose et son évolution in vivo (imagerie, biomarqueurs…) seront un support essentiel pour le développent de meilleures armes pour lutter contre cette maladie qui demeure un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial.

Procédures

1. L'infection des souris est effectuée par une exposition à un aérosol. Une seule exposition d’une vingtaine de minutes en début d’expérience. 2. Lors du traitement, les composés sont administrés par gavage 5 jours maximum par semaine pendant 4 à 8 semaines. Le geste technique en lui-même ne prend que quelques secondes. 3. Des prélèvements sanguins de très faible volume seront effectués. Il y aura au maximum 2 prélèvements – à plusieurs heures d’intervalle – sur un nombre restreint de souris sélectionnées. Il s’agit d’un acte rapide de quelques secondes. 4. Des prélèvements de sang seront effectués sur animaux anesthésiés juste avant leur mise à mort prévue pour le prélèvement des organes. Une fois les animaux anesthésiés, le geste technique ne prend pas plus d’1 minute.

Impact sur les animaux

Sur la base de nos expériences, l’apparition de signes cliniques (déambulation perturbée due à un début de parésie et piloérection) plusieurs semaines après une infection avec des bacilles tuberculeux est précurseur d’une perte de poids qui a terme peut conduite à la mort des animaux. Habituellement à partir de leur apparition, un suivi strict du poids d’abord 2 fois par semaine puis à fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué. Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considérée comme point limite et les animaux concernés seront mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Dans le cas présent, et du fait d’un besoin de générer un maximum de données relatives aux expérimentations, les animaux identifiés par un marquage aux oreilles seront pesés une fois par semaine avec pour premier point celui correspondant au jour de l’infection. A noter que la probabilité de voir l’apparition de signes cliniques sera fortement diminuée pour les groupes d’animaux traités avec une molécule anti-tuberculeuse. Une attention particulière sera portée sur le groupe témoin non-traité avec toujours pour point limite la perte de 20 % du poids.

Devenir

Tous les animaux au cours de la procédure doivent être mis à mort pour prélever les organes cibles (poumons et rate) pour déterminer les charges bactériennes.

Remplacement

Cet important projet comprend de nombreuses études in vitro pour évaluer, entre autres, l’efficacité́ bactéricide des composés (exemple : via l’infection de lignée cellulaire). Néanmoins elles permettront de ne répondre qu’à une partie de la problématique. Ces modèles ne permettent pas d’identifier et donc de caractériser, de façon biologiquement pertinente, tout ce qui concourt, par exemple, à la colonisation du poumon et à l’établissement plus ou moins durable des bactéries. En d’autres termes le recours aux souris, chez qui le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons plus ou moins importants selon la virulence de la souche, permet de reproduire les processus rendant compte de ce qui sous-tend les premières phases du parasitisme – colonisation, persistance ...- des différentes populations des bacilles tuberculeux et rend compte de manière plus approfondie des phénotypes complexes d’une interaction hôte-pathogène. Les essais pré-cliniques de nouveaux médicaments antituberculeux reposent entièrement sur la combinaison des méthodologies in vitro avec ces approches in vivo (comprendre la réponse d’un organisme vivant « entier » à un traitement) avant un éventuel passage en phase clinique.

Réduction

Au sein de ce projet, une équipe de statisticiens spécialisés dans les études pré-cliniques a pour rôle de concevoir avec les expérimentateurs les designs expérimentaux en trouvant le meilleur équilibre entre les capacités (techniques et d’hébergement) des différentes équipes et la pertinence des données à générer pour répondre au mieux aux problématiques posées. Et ce, avec toujours en tête, la réduction au minimum du nombre d’animaux nécessaire. Exemples : .pour le groupe témoin traité avec une molécule dont l’efficacité est connue et très bien documentée, seul un nombre limité d’animaux seront mis à mort et uniquement en un seul point de cinétique. La charge bactérienne alors estimée en UFC par rapport à celle avant traitement donneront une tendance sur l’efficacité de la réponse qui sera comparée aux multitudes de données pour ce composé déjà existantes et qui permettront d’établir la cinétique sans avoir eu à utiliser des animaux pour des points de cinétique intermédiaires. .pour une étude avec un nouveau composé et donc avec peu voire pas de donnée de disponible, plus d’animaux seront nécessaires pour décrire la réponse au traitement au cours du temps. Néanmoins, nous ne cesserons d’optimiser au minimum le nombre d’animaux requis. Il peut être envisagé d’avoir 5 animaux pour seulement 1 ou 2 points clefs de la cinétique, comme 4 semaines et 8 semaines – dans le cas d’un traitement de 8 semaines – et ainsi obtenir des données statistiquement robustes sur ces points charnières. Ensuite sur des points intermédiaires comme à 1 semaine, 3 semaines ou 5 semaines après le début de traitement, ne mettre à mort « que » 2 animaux serait suffisant pour estimer la cinétique de la réponse. A nouveau, tout ceci repose sur l’étroite collaboration mise en place avec ces spécialistes de la modélisation informatique d’essais pré-cliniques qui analyseront l’ensemble des résultats du consortium. La procédure expérimentale ne cessera d’être optimisée, notamment en termes de nombre de points d’observation / nombre d’animaux par points au cours du traitement ou encore sur la durée entre l’ingestion des composés et le prélèvement de sang périphérique, avec toujours cette considération à minimiser les contraintes de manipulations et réduire au minimum le nombre d’animaux pour l’obtention de données utiles. A noter qu’il a été délibérément choisi que ce soient les mêmes animaux qui serviront à l’obtention des données pharmacocinétiques et des données pharmacodynamiques.

Raffinement

Des observations régulières des animaux sont effectuées tout au long de l’expérience : d’une part lors de la pesée hebdomadaire depuis l’infection jusqu’au début du traitement puis au cours des administrations quotidiennes des composés. De manière plus précise, nous serons sensibles à l’apparition du moindre signe clinique telles la parésie et la piloérection qui sont précurseurs, sur la base de nos expériences, d’une perte de poids. Dès apparition de ces signes cliniques, un suivi strict du poids à une fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué (de 2 fois par semaine à tous les jours jusqu’à 2 fois par jour, l’animal étant mis à mort en fin de journée s’il est estimé que le point limite sera atteint avant la pesée du lendemain matin). Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considéré comme point limite et l’animal concerné sera mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Il est à noter également que les animaux ne sont jamais privés de nourriture et de boisson. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel.

Choix des espèces

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la recherche in vivo de nouveaux traitements anti-tuberculeux. Le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection tuberculeuse ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons. Pour ce projet nous utiliserons des souris commerciales immunocompétentes C57BL/6 et BALB/c pour lesquelles de nombreuses données bibliographiques d’études pré-cliniques existent. Nous serons également amenés à utiliser un modèle de souris dont l’intérêt est grandissant depuis quelques années : la souris C3HeB/FeJ dite « Kramnik ». Il s’agit d’un modèle plus susceptible à l’agent pathogène Mycobacterium tuberculosis pouvant induire des lésions nécrotiques et reflétant au final plus fidèlement la stratification et la pathogénèse de la tuberculose chez l’homme. Nos travaux sont effectués sur des animaux adultes car nous avons besoin d’organisme mature en particulier sur le plan immunitaire.

Vaccinés à deux reprises, puis infectés deux fois par le virus de la maladie d'Aujeszky par voie oro-nasale, 4 porcs subissent sur onze semaines treize ponctions sanguines totalisant près de 300 ml de sang. Les procédures sont classées en souffrance modérée, avec fièvre, perte d'appétit et possibles troubles respiratoires ou nerveux après l'infection. Le porteur retient quatre animaux comme effectif minimal pour avoir 94 % de chances de détecter les anticorps recherchés. Tous sont tués à la fin pour prélever leurs organes.

Objectifs

Le système immunitaire de chaque individu est conçu pour détecter des microbes et apprendre à les combattre. Cela conduit l’organisme à notamment produire des anticorps qui vont neutraliser ces microbes. Parmi ces anticorps, certains sont communs à plusieurs individus. Identifier et étudier des anticorps communs à plusieurs individus est particulièrement intéressant car cela permet de cibler des réponses immunitaires communes et efficaces contre un microbe, facilitant ainsi la conception de vaccins et le développement de tests de diagnostiques des maladies. La maladie d’Aujeszky est une maladie virale qui touche les porcs et qui se caractérise par des troubles nerveux chez les jeunes, et des troubles respiratoires et de la reproduction chez les adultes. C’est un modèle expérimental souvent utilisé en immunologie pour l’étude des anticorps. Il a été montré que des porcs vaccinés contre le virus de la maladie d’Aujeszky produisaient des anticorps ciblés contre ce virus et que ces anticorps peuvent être communs à plusieurs porcs. De nouvelles techniques permettent aujourd’hui de les caractériser. L’objet de la présente étude consiste à immuniser un groupe de porcs contre le virus de la maladie d’Aujeszky. Il s’agit de caractériser, directement dans les cellules, les anticorps produits contre ce virus en apportant une attention particulière aux anticorps susceptibles d’être communs à plusieurs individus.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont multiples. Tout d’abord, il permettra de mettre au point la méthode de séquençage des anticorps produits par chaque lymphocyte chez le porc. Cette méthode, qui sera mise en oeuvre dans le modèle d’infection par le virus de la maladie d’Aujeszky (VMA) pourra également être appliquée à d’autres modèles infectieux. De plus, les résultats obtenus dans ce projet permettront de caractériser les anticorps capables de reconnaitre des souches de VMA. Ces connaissances peuvent être utiles pour étudier plus finement les interactions virus/anticorps, développer de nouveaux vaccins ou des kits de diagnostic.

Procédures

Tous les actes prévus sur les animaux se feront sur animaux vigiles. Les animaux seront vaccinés à deux reprises avec un vaccin inactivé. Ils recevront donc 2 doses de 2ml en intra-musculaire dans le cou. La vaccination prend moins d’1 minute. Ensuite, à deux reprises, ils recevront 5ml par voie oro-nasale de virus de la maladie d’Aujeszky. L’inoculation oronasale prend moins d’1 minute. Tout au long de la procédure expérimentale, les animaux seront soumis à des ponctions sanguines, 1 à 2 fois par semaine. C’est un total de 13 ponctions sanguines (volume total de sang : 296ml) qui sera réalisé au cours des 11 semaines d’expérimentation. Du fluide oral individuel sera également collecté (0,5 ml de salive) à onze reprises au cours de la procédure. Tous ces actes sont réalisés par un personnel expérimenté et sont effectués le plus rapidement possible (les prélèvements prennent environ 1 min. et 30 sec.). A l’issu de ces actes, les animaux sont récompensés par la distribution d’une friandise type sirop de grenadine.

Impact sur les animaux

La vaccination avec le vaccin inactivé peut provoquer de la fièvre pendant les 24h suivant l’injection du vaccin. Suite à l’inoculation du VMA, les animaux vaccinés peuvent aussi présenter de la fièvre de J2 à J8, une baisse d’appétit et une perte de poids. Les animaux pourront également présenter des troubles respiratoires (ex : toux) et neurologiques (ex : tremblement). Aucun symptome sévère n’est attendu, les animaux étant vaccinés avec un vaccin ayant une bonne efficacité. Toutefois, un soin particulier sera apporté au suivi clinique quotidien de chaque porc. Un suivi rapproché sera mis en œuvre dès que l’évolution de l’état de santé d’un animal le nécessitera. L’animal concerné sera observé le matin, en début d’après-midi et en fin de journée (y compris le week-end) afin d’évaluer l’évolution de son état de santé et de procéder à sa mise à mort en cas d’atteinte de l’un des points limites. Enfin, les prélèvements multiples peuvent engendrer un stress chez l’animal. Pour limiter ce stress, les prélèvements sont réalisés par du personnel expérimenté afin de minimiser au maximum leur durée et l’inconfort qu’ils peuvent provoquer.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récolter les organes d’intérêts pour analyses.

Remplacement

Pour répondre aux objectifs de ce projet, il n’y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal par une étude in vitro ou in silico. En effet, nous avons besoin d’un organisme entier capable d’induire la production d’anticorps suite à la vaccination et à l’infection virale. Ce mécanisme immunitaire est complexe et ne peut pas être reproduit par d’autres modèles (in vitro, ex vivo et in silico).

Réduction

Le nombre de 4 porcs est l’effectif minimal pour avoir une forte probabilité (93,8%) d’atteindre notre objectif de détecter dans au moins 1 porc les anticorps d’intérêt pour les caractériser finement (données obtenues sur la base de nos connaissances préalables et en utilisant la loi binomiale).

Raffinement

L’expérimentation sera conduite dans le respect de l’éthique et du bien-être des animaux. Les animaux seront répartis dans 1 animalerie contenant deux parcs. Du début à la fin de la procédure, chaque parc accueillera 2 animaux. Les porcs seront alimentés et abreuvés à volonté. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets type "mordille", "tourniquet", etc. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine leur sera distribuée. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal pendant toute la durée de la procédure expérimentale. Des points limites précoces ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus de la maladie d’Aujeszky. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de cette procédure. Les porcs seront sevrés à 4 semaines d’âge. Ils seront vaccinés à 8 semaines d’âge puis à 11 semaines, ce qui correspond à l’âge préconisé par le fabricant de vaccin. Les animaux seront ensuite inoculés par le virus de la maladie d’Aujeszky à 13 semaines d’âge, soit 2 semaines après le rappel vaccinal afin de s’assurer que la réponse immunitaire post-vaccinale soit bien établie. Enfin, la deuxième inoculation de virus aura lieu à 16 semaines d’âge. Les 3 semaines d’intervalle entre les deux inoculations sont nécessaires pour laisser le temps au système immunitaire de mettre en place une réponse post-challenge.

Opérés une première fois pour prélever un lambeau de peau et de graisse, 24 lapins enchaînent six interventions sous anesthésie générale étalées sur six mois, biopsies, prélèvements sanguins et micro-injections, dans des procédures classées en souffrance modérée. Chaque animal est hébergé seul pendant toute la durée, ce que le RNT reconnaît comme une source de stress supplémentaire. Le projet cherche à améliorer la récupération de sensibilité après reconstruction mammaire, une technique décrite comme longue et de résultat encore incertain chez l'humain. Tous les lapins sont tués au dernier jour de suivi pour les prélèvements finaux, certains réutilisés entre-temps pour des formations, toujours sous anesthésie, puis tués.

Objectifs

Après une mastectomie, la reconstruction mammaire est souvent réalisée à l’aide d’un lambeau de peau et de graisse prélevé sur le ventre : c’est la technique du lambeau libre de DIEP (Deep Inferior Epigastric Perforator) . Cette méthode, devenue la référence, donne de bons résultats esthétiques tout en limitant les séquelles au niveau du ventre. Cependant, un problème persiste : la perte de sensibilité du sein reconstruit, qui peut gêner les patientes dans leur vie quotidienne, affecter leur image corporelle, leur confort ou leur intimité. Pour tenter d’améliorer cette sensibilité, une technique appelée "neurotisation" a été proposée. Elle consiste à reconnecter les nerfs entre la peau du thorax et le lambeau. Mais cette opération est longue, délicate et n’a pas encore fait la preuve claire de son efficacité. Elle n’est donc pas réalisée en routine. À l’inverse, plusieurs observations montrent que des sensations peuvent revenir, même sans intervention sur les nerfs. On pense que cela est dû à une "repousse spontanée" des nerfs. Mais ce phénomène reste mal compris, et peu d’études ont cherché à l’expliquer ou à l’améliorer. Notre hypothèse est que cette repousse nerveuse naturelle pourrait être une bonne alternative à la neurotisation, si on apprend à mieux la comprendre et à la stimuler. L’objectif principal de notre projet est donc d’identifier des moyens thérapeutiques permettant de stimuler cette réinnervation naturelle dans un modèle animal de lambeaux. Cela permettrait également d’étudier la repousse spontanée des nerfs et de comprendre comment elle fonctionne. Trois moyens thérapeutiques seront testés : • Le tissu adipeux (graisse), riche en cellules qui libèrent des substances aidant à la régénération nerveuse. • Le plasma riche en plaquettes (PRP), utilisé depuis longtemps pour favoriser la cicatrisation, et qui semble aussi utile pour les nerfs. • La curcumine, un extrait naturel aux propriétés anti-inflammatoires et neuroprotectrices, déjà prometteur dans d'autres maladies des nerfs. Ce projet pourrait permettre de proposer à l’avenir une méthode plus simple, naturelle et sûre que la neurotisation pour améliorer la sensibilité après reconstruction mammaire.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche chez l’animal permettra deux avancées importantes : 1. Mieux comprendre comment la sensibilité peut revenir naturellement dans un lambeau de peau après une opération : En évaluant la sensibilité cutanée du lambeau à l’aide d’un test clinique non douloureux ; En observant au microscope comment les nerfs repoussent dans le temps. 2. Tester de nouvelles pistes thérapeutiques, comme l’injection de plasma enrichi en plaquettes (PRP), de tissu graisseux ou d’un composé naturel appelé curcumine (issu du curcuma), pour voir s’ils peuvent aider les nerfs à repousser plus vite ou en quantité supérieure dans le lambeau. Ces derniers tests ne peuvent pas être réalisés chez l’humain pour des raisons de sécurité, ni en laboratoire sur des cellules isolées, car la repousse des nerfs dépend de nombreux facteurs vivants qui interagissent entre eux. De plus, la curcumine n’est pas encore autorisée en usage médical chez l’homme. En identifiant les traitements les plus prometteurs et en comprenant mieux les mécanismes de repousse nerveuse, ce projet pourrait, à l’avenir, permettre de restaurer la sensibilité des seins reconstruits, sans geste supplémentaire lourd, et ainsi améliorer le confort et le bien-être des patientes après leur cancer.

Procédures

Intervention n°1 (J0) : réalisation des lambeaux sous anesthésie générale et des biopsies (durée entre 1 et 2 heures). Intervention n°2 (J7) : évaluation de la sensibilité (vigile, dans la cage d’hébergement – procédure non douloureuse) puis anesthésie générale pour réaliser le prélèvement sanguin permettant d’obtenir le PRP, adipectomie, biopsies, micro-injections dans les lambeaux (durée 1 heure) Intervention n°3 et n°4 : identiques à l’intervention n°2 Intervention n°5 : évaluation de la sensibilité (vigile, dans la cage d’hébergement – procédure non douloureuse) puis anesthésie générale pour la réalisation des biopsies des lambeaux (durée 15 à 30 minutes) Intervention n°6 : évaluation de la sensibilité (vigile, dans la cage d’hébergement – procédure non douloureuse) puis anesthésie générale pour la réalisation des biopsies des lambeaux (durée 15 à 30 minutes), mise à mort.

Impact sur les animaux

L’anxiété et le stress sont des effets indésirables attendus avant, et après chaque intervention. Les nuisances liées à la chirurgie pourraient être, en post-opératoire, des douleurs sur la cicatrice de l’abord chirurgical et des douleurs abdominales : nuisances légères. Les animaux seront hébergés individuellement tout au long du projet pouvant entraîner un stress supplémentaire

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort le dernier jour de suivi, pour les derniers prélèvements de tissus de M6. Le nombre d’anesthésies générales et de prélèvements subis ainsi que la durée longue du suivi (6 mois) rend difficile la réutilisation des animaux pour d’autres procédures. Cependant, lorsque cela sera possible, les animaux, toujours sous anesthésie générale, pourront être réutilisés dans le cadre de formations (autre projet autorisé), et mis à mort ensuite.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la réinnervation au cours du temps de lambeaux sous l’effet de différentes pistes thérapeutiques dans des conditions in vivo. Ces tests ne peuvent pas être réalisés chez l’humain pour des raisons de sécurité, ni en laboratoire sur des cellules isolées, car la repousse des nerfs dépend de nombreux facteurs vivants qui interagissent entre eux. De plus, la curcumine n’est pas encore autorisée en usage médical chez l’homme. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est ainsi indispensable.

Réduction

Ce projet de recherche est exploratoire : il s’agit d’une première étape qui vise à obtenir des résultats préliminaires, utiles pour orienter de futurs travaux. Les données récoltées permettront, si besoin, de concevoir d’autres projets de recherche plus poussés, avec des analyses statistiques approfondies ou l’évaluation d’autres traitements potentiellement intéressants. Ces éventuelles étapes ultérieures feront l’objet d’une nouvelle demande d’autorisation du projet. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux utilisés, seuls trois traitements différents seront testés dans ce projet, que l’on estime les plus prometteurs. Pour chaque traitement, il est nécessaire d’avoir au moins trois animaux afin de pouvoir tirer des premières conclusions fiables. Un quatrième animal par groupe a été ajouté pour prévenir toute perte liée à un problème imprévu (comme un décès post-opératoire), afin de ne pas avoir à recommencer l’étude en cas d’aléa. De plus, le choix a été fait de réaliser 2 lambeaux par lapin, permettant d’avoir un lambeau contrôle et un lambeau expérimental pour un même lapin sans avoir besoin de multiplier le nombre de ceux-ci. Au total, 12 lapins seront inclus dans cette première phase. Si les résultats s’avèrent trop limités ou incomplets pour permettre une interprétation fiable, une seule répétition de l’expérimentation est prévue, ce qui porterait le nombre total maximum à 24 animaux.

Raffinement

Les animaux seront gardés pendant une période d'acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie expérimentale, et leur première entrée en procédure. Leur environnement comportera un enrichissement (bûchettes à ronger, foin...). Les animaux seront suivis quotidiennement et leur état de santé et de bien-être sera évalué tout au long du protocole expérimental. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pendant les procédures chirurgicales et seront suivis au cours de la procédure. Un suivi renforcé sera effectué durant les premiers jours après chaque chirurgie. Si un animal présente un signe de douleur ou de souffrance, des analgésiques pourront lui être administrés. Dans le cas où l'animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique sans qu'il soit possible de le soulager efficacement (atteinte d'un point limite), l'animal sera sorti d'expérimentation et mis à mort.

Choix des espèces

Le lapin est un modèle animal reconnu pour l’étude de ses vaisseaux et de nombreux modèles de lambeaux ont été décrits chez cet animal. La biologie vasculaire a été bien étudiée chez le lapin et est similaire aux mécanismes humains. De plus, le calibre des vaisseaux (veine, artère) d’intérêt chez le lapin est semblable à celui des vaisseaux de la plupart des lambeaux utilisés en reconstruction mammaire chez l’homme. Les animaux utilisés seront des adultes. A ce stade de développement, le calibre des vaisseaux (veine, artère) d’intérêt chez le lapin est semblable à celui des vaisseaux des lambeaux utilisés en reconstruction mammaire chez les humains.

Soumises à des injections, des inhalations sous anesthésie et une trachéotomie en fin de protocole, 6 480 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue. Selon le modèle d'allergie, elles subissent un choc anaphylactique provoqué, avec chute de température corporelle et diarrhées, un gonflement des oreilles ou une dermatite induite par patch. Ces vaccins à ARN visent à prévenir ou réduire des symptômes allergiques que le RNT présente comme sans traitement efficace à long terme aujourd'hui. Le bénéfice reste une perspective, quand les chocs et inflammations infligés aux souris sont, eux, programmés.

Objectifs

La prévalence mondiale des pathologies allergiques est en perpétuelle augmentation à la fois dans les pays développés et en voie de développement. Par exemple, il est maintenant estimé qu’un tiers des français souffrent d’une ou plusieurs formes de pathologies allergiques, dont certaines peuvent s’avérer fatales (p.ex., certaines formes d’asthmes réfractaires aux corticoïdes ou encore des anaphylaxies induites par l’ingestion de fruits à coques). Il n’existe pas à l’heure actuelle de traitement permettant de prévenir les allergies ou de réduire les symptômes allergiques de manière efficace et sur le long terme. La pandémie de Covid-19 a permis de mettre en lumière l’efficacité, la modularité selon la cible thérapeutique, et la production rapide de vaccins à ARN. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de vaccins à ARN dans différents modèles d’allergies majeurs pour permettre de prévenir et de réduire les symptômes allergiques. Nous utiliserons des modèles d’asthme allergique, d’allergie alimentaire, d’anaphylaxie systémique et cutanée et de dermatite atopique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer de nouveaux traitements à visée anti-allergique permettant de réduire les limitations des traitements actuels qui sont principalement symptomatiques, avec moins d’effets secondaires, de prévenir le risque de complications graves comme l’anaphylaxie. Ces traitements possèdent des modes de production facilités et permettraient une réduction des coûts de santé.

Procédures

Chaque injection se fera sur animal vigile et sous contention (20 sec), alors que les inhalations et injections à l'oreille se feront sous anesthésie gazeuse (induction/perte de conscience : 2min ; inhalation ou injection : 30 sec). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal sous anesthésie gazeuse au minimum 1 fois par semaine avec alternance des sites de prélèvement (joue droite puis joue gauche ; induction/perte de conscience : 2min ; prélèvement : 30 sec).. Une trachéotomie sera réalisée sous anesthésie générale après vérification de la profondeur de la narcose et suppression de tout réflexe (10-15min), par du personnel diplomé en « chirurgie de l’animal de laboratoire », en fin de procédure expérimentale.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont en premiers liés à la douleur des aiguilles et à l’inconfort induits par les injections des traitements qui sont de courte durée (5 secondes). Des nuisances supplémentaires peuvent-être associées selon les modèles d’allergies. Le modèle d’allergie alimentaire peut induire un stress lors du gavage des animaux (20 secondes). Il peut aussi provoquer des diarrhées, des douleurs abdominales, la baisse rapide de température corporelle lors de l’induction du choc anaphylactique. Le gonflement des oreilles lié à l’allergie cutanée (anaphylaxie cutanée) peut provoquer une douleur (non quantifiable en l’absence de réactions observables de l’animal). L’application de patch pour induire une dermatite atopique peut géner l’animal et provoquer des démangeaisons.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser des prélèvements de sang et d’organes pour analyser les cellules et les tissus, notamment grâce à des techniques permettant d’identifier les différents types de cellules et d’observer leur organisation au sein des tissus (comme la cytométrie en flux ou l’histologie).

Remplacement

Bien que des expériences in vitro avec des cellules humaines ou d’animaux sont réalisées au laboratoire, celles-ci ne permettent pas de reproduire toutes les intéractions d’un organisme complet. Les maladies allergiques sont des maladies multifactorielles complexes dans lesquelles plusieurs organes du corps jouent un rôle important (épithélium, organes lymphoïdes secondaires, système vasculaire…). Ce projet est multidisciplinaire et vise à démontrer l’efficacité de différents vaccins à ARN dans le développement de différentes maladies allergiques, dans des modèles murins mimant les pathologies humaines. C’est pourquoi, l’utilisation d’animaux est primordiale afin d’étudier les mécanismes mis en jeu dans les différents modèles allergiques.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons 4 animaux contrôle versus 4 animaux allergiques de même âge et sexe pour chaque expérience. Pour une procédure, chaque souris sera son propre contrôle permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés (une oreille traité vs. une oreille contrôle). Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs, le test statistique le plus approprié sera utilisé.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE. Un enrichissement (frisures de papier (sizzlenest), igloos, ou bâtonnets en bois destinés au rongement...) sera introduit dans l’hébergement des animaux. Les animaux seront suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, pilo-érection et/ou grimace, présence de blessure, … . Si un animal présentait un point limite, il serait immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier les maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 7 et 12 semaines, car leur système immunitaire est suffisamment développé pour fonctionner de manière comparable à celui d’un adulte, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et pertinents.