Recherche appliquée

680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées ou traitées pour supprimer leur système immunitaire, greffées de cellules ou de morceaux de tumeur sur les flancs, avec des prélèvements de sang répétés à la mâchoire. Le porteur indique une baisse de température et un réveil tardif après anesthésie, une douleur possible à l'implantation de la tumeur et des hématomes aux points d'injection. Le projet vise une thérapie ciblant une protéine des liposarcomes, en présentant la souris comme un "organisme entier" impossible à remplacer par la culture cellulaire.

Objectifs

Les liposarcomes sont définis comme étant des tumeurs malignes rares se développant dans les tissus mous et dont les cellules tumorales ressemblent à du gras. Les liposarcomes représentent environ 20% des sarcomes, avec près de cinq milles nouveaux cas par an en France et un pic d’incidence autour de 60 ans. L’évolution des liposarcomes est très rapide et le diagnostic est difficile. Aujourd’hui le seul traitement efficace est la chirurgie. Pour améliorer la prise en charge des patients en offrant une alternative moins lourde que la chirurgie et découvrir de nouveaux traitements, cette étude est nécessaire. Nos objectifs sont de développer une thérapie ciblant une protéine clé de ses tumeurs appelée MDM2 et le métabolisme des acides aminés ainsi que de mieux comprendre le lien entre la tumeur et l’organisme que la tumeur est capable d’influencer pour faciliter sa croissance. L’essence même de la question posée (effet de l'inhibition de la production de serine sur la croissance tumorale des liposarcomes) implique l’utilisation d’un organisme vivant tel que la souris, afin d’illustrer au plus proche de l’homme sa complexité métabolique et immunitaire, sans solutions alternatives satisfaisantes.

Bénéfices attendus

Ce projet, à court terme, permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents des liposarcomes en étudiant plus particulièrement le rôle et la fonction de nos protéines et gènes d’intérêts. L’utilisation de souris non modifiées génétiquement, ainsi que des mâles et des femelles, permettra de modéliser au plus proche de l’humain le métabolisme et les mécanismes mis en place lors d’un cancer. Ces souris seront traitées avec des médicaments permettant la disparition des protéines cibles. Ceci nous permettra de voir si l’élimination de ces protéines induit une diminution de la croissance tumorale et in fine de traiter ces liposarcomes. De plus, les souris prédisposées génétiquement à une inactivation de certains gènes permettront de valider l’impact de l'absence de ces protéines sur la prise et la croissance des liposarcomes. A la fin du projet, l’objectif est d’emmener, vers la clinique, une nouvelle thérapie fasse à la problématique de santé publique qu’est le cancer humain et plus précisément, le liposarcome.

Procédures

Dans un premier temps, les souris seront irradiées au rayon X (1 fois 5min ou 1 fois 5 min et 1 fois 3min) ou traiter avec une drogue (5min 3 fois) afin d’inactiver leur système immunitaire. Lors de cette procédure le personnel qualifié sera emmené à réaliser des greffes de cellules et morceaux de tumeurs sur les flancs des souris (5min par greffe) ainsi que des prélèvements sanguins au niveau de la machoire (150µl chacun et 2min par prélèvement). Une prise de sang 4 jours avant l'irradiation, une 4 jours après puis une fois par semaine jusqu'à la fin de l'expérience. Les prélèvements seront effectués au niveau de la mâchoire par une personne qualifiée.

Impact sur les animaux

L’irradiation des animaux nécessite l’endormissement au préalable des souris avec une injectionde Ketamine-Xylazine ce qui peut entrainer une baisse de température des souris et un réveil tardif. La chirurgie visant à implanter un bout de tumeur dans l'animal peut provoquer une douleur. Lors du traitement des animaux, l’injection dans le bas du ventre à répétition peut entrainer l’apparition d’hématome sous-cutané. Pour ces injections nous privilégierons le côté droit de l’animal mais, sur le long terme cela peut entrainer une gêne/douleur au site de l’injection et un stress modéré pour les animaux. Lors de ces injections, il y aura une contention de l’animal ce qui peut conduire à un stress modéré pour les animaux. L’augmentation de la taille de la tumeur peut entrainer une gêne/ douleur chez l’animal.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en respectant les règles de bien-être animal. Leurs organes seront prélevés afin d’étudier au niveau moléculaire et anatomiques (aspect des tumeurs et organes etc) les effets de nos traitements ou modifications génétiques.

Remplacement

Dans le laboratoire, nous avons déjà réalisé des essais sur cellules et sphéroides (modèles cellulaires 3D) afin de mieux comprendre le lien entre les cellules de liposarcomes et musculaires. Cependant ce système ne permet pas d'appréhender la complexité d'un organisme entier ainsi que la distance réellement présente inter-tissus. De plus, des procédures sur souris ne possédant pas de système immunitaire ont déjà été réalisé afin de montrer l'efficacité des traitements sur les liposarcomes. Mais au vue du lien étroit entre la cytokine impliquée et le système immunitaire, il est important de tester ces traitements dans un contexte où celui-ci est présent. C'est pourquoi il est nécessaire de réaliser ces procédures expérimentales sur animal immunocompétent. Nous avons tous les éléments nécessaires que nous avons pu obtenir sur cellules pour limiter le nombre de groupes expérimentaux et d’animaux et pour aller directement sur la question qui nous intéresse. De plus, notre objectif, in fine, est de prouver l’efficacité d’une telle thérapie et d’amener en clinique cette nouvelle thérapie contre les liposarcomes. Ainsi, l’utilisation d’animaux et notamment de souris est indispensable à la suite de notre projet.

Réduction

Nos résultats expérimentaux effectués sur des cellules et nos précédentes expériences sur souris immunodéprimées nous permettent d’appréhender les résultats attendus et ainsi diminuer les conditions expérimentales. Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini en prenant en compte de tests statistiques, sans que cela ne nuise à l’objectif scientifique. C’est sur cette base que nous avons estimé à 680 animaux, le nombre d’animaux nécessaires pour l’ensemble de notre projet.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et seront pesés deux fois par semaine. De plus, les tumeurs seront mesurées deux fois par semaine afin de ne pas atteindre un volume tumoral trop important (>1000 mm3). Une réduction de 20 % de la masse corporelle sera considérée comme un indicateur de toxicité. Une attention particulière sera portée aux points suivants afin de limiter la souffrance et la détresse : – Une absence d’hydratation ou de prise de nourriture afin d’anticiper une perte de poids excédant 20 % du poids initial – Une gêne dans la locomotion – D’autres signes de douleur tels que l’isolement des autres animaux, les yeux fermés ou creux, le dos voûté – Un saignement ou autre perte de liquide physiologique – Un changement du rythme respiratoire – Tout autre comportement anormal de l’animal tel que la prostration ou la vocalise lors de la préhension De plus, les injections dans le bas du ventre à répétition peuvent entrainer l’apparition d’hématome sous-cutané. Pour ces injections nous privilégierons le côté droit de l’animal mais, sur le long terme cela peut entrainer une gêne/douleur au site de l’injection. En cas d’apparition d’hématome abdominaux elles seront interrompus le temps de sa résorption. Lors de l’endormissement, une crème OCRY-gel sera appliquée au préalable sur leurs yeux afin de prévenir la cécité des animaux. Les souris seront mises sous une lampe chauffante le temps de leur réveil. De plus, de la nourriture et eau en gel sera déposée dans leur cage pour qu’elles puissent se nourrir plus facilement. Lors de la chirurgie, nous appliquerons de la lidocaïne au niveau du site d'incision afin d'insensibiliser cet endroit.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, car elle dispose d’un système génétique, métabolique et immunitaire proche de l’homme. Des modèles génétiquement modifiés permettant l'absence de nos protéines d'intérêts ont été générés et utilisés dans la recherche scientifique. De plus, les souris nous permettent d'étudier le cancer humain par le biais de greffe de tumeur humaine. Ainsi l’expérimentation sur ces modèles, déjà établis, nous permettra de voir l’efficacité du traitement et de comprendre au mieux l’impact de celui-ci sur un organisme entier. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes afin de s’affranchir de tous les effets des hormones et de la croissance juvénile sur le métabolisme.

80 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe sous la peau des cellules cancéreuses humaines du pancréas sous anesthésie, puis on les soumet à un champ de pression mécanique une heure par jour, cinq jours par semaine pendant trois semaines. Le porteur indique un stress lié aux anesthésies répétées et une douleur modérée possible due à la croissance des tumeurs. Ce projet teste l'effet d'une pression mécanique sur des tumeurs pancréatiques, les retombées pour les patients étant annoncées à long terme, les souris étant tuées pour prélever les tissus cancéreux.

Objectifs

Le cancer du pancréas représente un problème de santé publique en occupant le deuxième rang des cancers digestifs en France. Ce cancer est très souvent de très mauvais pronostic et est diagnostiqué à un stade avancé avec un nombre de cas en constante augmentation. Il devrait être la deuxième cause de mortalité par cancer en Europe en 2030. Dans le but de développer de nouvelles pistes de traitement des cancers du pancréas de très mauvais pronostic, nous nous proposons d’étudier l’impact d’un champ de pression mécanique sur le développement de ces cancers. En effet, des études antérieures ont montré qu’un champ de pression mécanique inhibait la croissance des cellules cancéreuses pancréatiques en culture. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer les effets anti cancéreux d'une contrainte mécanique sur le développement du cancer du pancréas après greffe de cellules cancéreuses du pancréas humain chez la souris.

Bénéfices attendus

Compte tenu des échecs des différentes thérapies mises en œuvre dans le traitement du cancer du pancréas, nous nous dirigeons vers de nouvelles pistes thérapeutiques des cancers du pancréas. Les avancées au cours de ces dernières années sur les contraintes mécaniques appliquées aux tumeurs nous laissent envisager l’intérêt des champs de pression sur les tumeurs pancréatiques pour en inhiber sa progression. Les retombées attendues de ce projet seront de caractériser une nouvelle thérapie du cancer du pancréas et à plus long terme de soigner ce type de cancer chez l’homme.

Procédures

On réalise deux injections sous la peau de souris femelles adultes (1 injection sur chaque flanc de l'animal), de cellules cancéreuses humaines de pancréas, sous anesthésie. Les cellules vont s’implanter à l’endroit de l’injection et commencer à croître. Cette injection dure moins de 30 secondes. La taille des tumeurs va être suivie. Lorsque les tumeurs auront démarré leur croissance, les souris seront soumises à un champ de pression mécanique sous anesthésie gazeuse à raison de 1 heure, 5 jours par semaine et ce pendant 3 semaines. Les souris vont être suivies tous les jours et les points limites évalués chaque jour de traitement (5 jours par semaine). A l'issu du traitement, les souris vont être suivies et leurs tumeurs mesurées encore 2 semaines, période durant laquelle elles ne subiront pas de traitement. L’ensemble des souris sera alors évalué 3 fois par semaine quant à leur état général, leur poids et la taille des tumeurs, mesurées à l’aide d’un pied à coulisse, au cours du temps.

Impact sur les animaux

1) Un stress physique serait une nuisance induite par les anesthésies répétées et (2) une douleur modérée peut être engendrée par la croissance des tumeurs sous-cutanées. Les animaux ne subissent pas d'autres stress ou douleurs dans ce projet.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés et les tissus cancéreux seront prélevés pour analyses.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte tenu de la complexité physiologique de la tumeur comprenant plusieurs types cellulaires impossible à reproduire avec des cellules en culture, nous obligeant de travailler à l'échelle d'un organisme. Des études sur cellules en culture sont, par ailleurs, prévues pour étudier d’autres paramètres qui complèteront ce volet d’expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant dans chaque sous-groupe pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Chaque souris sera implantée avec des cellules cancéreuses aboutissant au développement d'une tumeur sur chaque flanc, ce qui nous permet de réduire de moitié le nombre d'animaux qui entre dans l'expérience.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les animaux seront anesthésiés au moment de la greffe des cellules cancéreuses sous la peau. Au cours de l’expérience, une surveillance visuelle quotidienne et un suivi de l’état général des animaux (3 jours par semaine durant 3 semaines puis 3 fois par semaine durant les 2 semaines d’observation post traitement) seront réalisés. De plus nous avons établi une grille de score qui définit les actions à mettre en œuvre (administration d’analgésie en cas de douleur, euthanasie lorsque un point limite est atteint). Des conditions d’hébergement standard adaptées sont appliquées avec une alimentation standard sans limite de quantité. Enfin, un enrichissement composé de coton et de lanières cartonnées en accordéon sera proposé aux animaux afin qu’ils puissent se confectionner des nids.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser l’espèce souris dans notre projet de recherche car la physiologie du cancer du pancréas induit dans cette espèce animale est proche de celle chez l’Homme. Nous pourrons ainsi répondre aux questions que nous nous posons sur les effets d’un champ de pression mécanique sur le développement de ce type de cancer chez l’Homme. De plus, ce modèle apporte 2 autres avantages : sa taille et sa masse qui limite les quantités de traitement à administrer et le nombre extrêmement grand d'outils biologiques qui permettent la caractérisation des tissus cancéreux chez la souris. Les souris utilisées sont des femelles adultes pour que les animaux restent au même stade de développement tout au long de l’expérience. Nous avons privilégié des femelles pour limiter les conflits entre mâles hébergés dans une même cage.

1 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une inflammation chronique de l'intestin par injection rétro-orbitale de lymphocytes T sous anesthésie, puis des injections répétées trois fois par semaine pendant huit semaines de composés fournis par des laboratoires clients. Le porteur indique une perte de poids, des selles molles, des diarrhées et des saignements rectaux attendus pendant l'étude, tout en affirmant que les doses testées n'induiront aucun effet indésirable. Ces prestations évaluent des composés contre les maladies inflammatoires de l'intestin, les souris étant tuées le jour de l'analyse de leurs organes.

Objectifs

Les différents laboratoires privés ou publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact de leurs composés thérapeutiques sur les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI). Les MICI sont des troubles gastro-intestinaux chroniques caractérisés par une inflammation intestinale chronique, des réponses dérégulées contre le microbiote intestinal et un dysfonctionnement de la barrière épithéliale. Les MICI se présentent sous deux formes principales, la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn. L'incidence et la prévalence des MICI sont en constante augmentation dans le monde et ces maladies sont associées à une morbidité marquée et ont un impact majeur sur la qualité de vie et la capacité à travailler. Les traitements conventionnels actuels visent à atténuer l'inflammation. Cependant, environ un tiers des patients ne répond pas au traitement ou devient réfractaire avec le temps. L'objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques ciblant les maladies chroniques de l’intestin afin de diminuer les échecs thérapeutiques. Pour cela, nous induirons des modèles murins de MICI et nous testerons différents composés thérapeutiques afin d’évaluer leurs effets sur le développement des MICI. A l'issu de l'expérimentation, la composition du système immunitaire sera évaluée et des études histologiques seront menées afin d'évaluer l'efficacité des différents traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer en phase pré-clinique l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques ciblant les maladies inflammatoires de l’intestin, maladies dont actuellement un tiers des patients recevant des traitements anti-inflammatoires ne répond pas ou devient réfractaire avec le temps .

Procédures

La procédure expérimentale repose sur : - une induction de l'inflammation de l'intestin par une unique injection intraveineuse rétro-orbitale (150 μl) de lymphocytes T CD4+ dépourvus d'une sous population régulatrice sous anesthésie générale gazeuse induite à l'isoflurane. Cette procédure dure 3 minutes et 30 secondes, temps comprenant la phase d’endormissement de 3 min à l’isoflurane et 30 secondes pour l’injection rétro-orbitale. - des injections intrapéritonéales (dose-poids de 200μl de mélange/20g de souris) 3 fois par semaine pendant 8 semaines maximum de molécules thérapeutiques afin d'évaluer leur efficacité. La durée de cette procédure est de 1 minute par souris, temps comprenant la pesée, la contention et l’injection des composés ; - des pesées 1/2j afin de suivre le développement de la pathologie pendant 8 semaines maximum. En effet, le poids est un critère d'évaluation clinique de la pathologie. Cette procédure est rapide et dure 20 secondes par souris ; - et un unique prélèvement sanguin de 200μl par voie submandibulaire afin de récolter le sérum le jour de la caractérisation du système immunitaire et des études histologiques. Cette procédure dure 1 minute par souris, temps comprenant la contention et la prise de sang.

Impact sur les animaux

L'induction de l'inflammation de l'intestin par injection intra veineuse de lymphocytes T CD4+ dépourvus d'une sous population régulatrice entrainera une perte de poids et probablement des selles molles, diarrhées et / ou saignements rectaux sur la durée de l'expérimentation (5 à 8 semaines dépendamment de l'induction de la pathologie). Les tests de toxicité des composés thérapeutiques seront effectués en amont par les laboratoires demandeurs. Les doses injectées n'induiront donc aucun effet indésirable sur les animaux dans le cadre de ce projet. Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress (anesthésie, pesées, injections et prise de sang). Chaque gestes techniques sera réalisé par du personnel expérimenté et expert dans ces actes dans le respect du bien-être animal afin de limiter les contraintes subies par l’animal.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’expérience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire (immunophénotypage) ou pour l’histologie.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Les modèles de MICI étant hétérogènes, le nombre utilisé pour ces expériences sera de 10 animaux par groupe expérimental, sexes identiques, soit mâles ou femelles dépendamment du partenaire, afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience. Le nombre de groupe sera amené à varier selon les besoins du partenaire, notamment si plusieurs molécules ou doses sont à tester.

Raffinement

Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation EOPS, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des injections.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux déficients en lymphocytes T « hôtes » adultes de plus de 8 semaines avec un poids supérieur ou au minimum égal à 22g. En effet, les animaux doivent avoir un poids suffisant pour être stable au début du protocole afin de suivre le développement de la pathologie entrainant une perte de poids de 20% dans le groupe contrôle. Les animaux « donneurs » de lymphocytes T CD4+ dépourvus d'une sous population régulatrice seront également utilisés à l’âge adulte car le système immunitaire doit être mature.

390 lapins et poules vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections destinées à leur faire produire des anticorps, puis des prélèvements sanguins répétés, avant d'être mis à mort pour récupérer la quasi-totalité de leur sang. Le porteur décrit des réactions locales possibles, gonflement ou abcès, et générales, fièvre, perte de poids, baisse d'activité. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est assez efficace, écartant la production d'anticorps par criblage de phages jugée "décevante" malgré son existence depuis 1990.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de poules et lapins. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic… Ce projet respecte la réglementation relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques en vigueur.

Bénéfices attendus

1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements, possibilité d'observation chez les animaux de réactions locales (gonflement, abcès...) et/ou générales (augmentation température, perte de poids, diminution de l'activité...) après les administrations.

Devenir

Les animaux inclus dans ces études seront mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité du volume sanguin circulant selon les besoins et surtout de respecter le principe de précaution.

Remplacement

La production d'anticorps (AC) polyclonaux nécessite 1 immunisation de l'animal dans le cadre de ce projet. Il n'existe actuellement aucune méthode substitutive assez efficace pour répondre aux objectifs du projet. Une nouvelle approche a été publiée en 1990 pour le développement d'AC par un système de criblage de collection de phage qui ne nécessite pas l'immunisation d'animaux, mais les résultats restent très décevants. En effet, depuis 1990, aucun anticorps n'est utilisé en thérapie ou en diagnostic clinique malgré un certain nombre de publications scientifiques utilisant cette technologie. Seuls 1 AC anti-TNFα et plus récemment des AC neutralisants du SARS-Cov-2 ont été développés à partir de collection de donneurs humains dont les derniers sont des donneurs ayant été en contact avec le virus, donc immunisés. A ce jour, l'alternative aux immunisations animales consiste à développer des AC synthétiques à partir de banques ou "Library" synthétique pour le criblage d'un nombre important de fragments de molécules ("binders"), ayant une bonne interaction avec l'antigène. Ces fragments sont plus petits que les AC et peuvent réagir avec une certaine affinité avec l'antigène mais aussi tout autre antigène ayant une structure proche de celle recherchée. Ces réactions croisées sont, parmi d’autres inconvénients, souvent rencontrées par cette approche synthétique. Un autre inconvénient majeur, est que le fragment ne reconnait qu’1 seul épitope (partie d'une molécule capable de stimuler la production d'un anticorps), alors qu’un sérum polyclonal est multi-épitope, ce qui permet d’augmenter la sensibilité de la détection et aussi faciliter son développement dans le temps. Tous les AC synthétiques développés et publiés à ce jour sont dirigés contre des protéines recombinantes qui ont été utilisées pendant les étapes de criblage. Leur utilisation est très limitée et ne dépasse pas l’étape de résultats préliminaires, puisqu’ils ne reconnaissent pas les protéines endogènes (élaborées par l'organisme) qui ont des structures natives et conformationelles. Les AC synthétiques ne reconnaissent pas certaines modifications des protéines qui leur donnent telle ou telle fonction biologique. C'est pourquoi la majorité de ces anticorps n'est pas utilisée par la communauté scientifique qui continue de travailler et publier avec les anticorps conventionnels. L'approche de criblage par phage est testée en parallèle pour comparer les performances et valider ou non cette alternative.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum. Entre 2 et 6 animaux (poule ou lapin) seront inclus par étude. Le nombre sera choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Pour les poules, un nombre de 8 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 240 poules sur 5 ans (calcul à partir de 6 poules par étude). Pour les lapins, un nombre de 5 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 150 lapins sur 5 ans (calcul à partir de 6 lapins par étude). La réglementation en vigueur relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques sera respectée.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : lapins = bois à ronger, foin/paille, de quoi grimper et se cacher... ; poule = perchoir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères et un enrichissement compensatoire. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lapin est une espèce particulièrement immunoréactive, permettant ainsi d’obtenir un sérum disposant d’une concentration importante en anticorps, avec des anticorps de forte affinité. En plus de leur immunoréactivité importante, les poules disposent d’anticorps spécifiques, les immunoglobulines Y, notamment extraits à partir du jaune d’oeuf. Ainsi, l’immunisation de poules permet de contrôler facilement le taux d’anticorps en limitant la contrainte imposée aux animaux. De plus, il existe des différences de séquences entre la partie constante des immunoglobulines Y et des immunoglobulines G. L’utilisation d’immunoglobulines Y permet ainsi de réduire le bruit de fond, les réactions croisées et les signaux aspécifiques. Les anticorps de poules sont également une alternative aux anticorps de lapin pour les expériences nécessitant des anticorps provenant de plusieurs hôtes différents. Le choix de l’espèce se fera donc en fonction de l’utilisation prévue des anticorps. Les lapins seront âgés de 6 semaines à 2 ans environ et les poules d'1 jour à 2 ans environ, car c’est à ces stades qu’ils sont entièrement immunocompétents.

405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection induisant un cancer mammaire, jusqu'à trois examens d'imagerie sous anesthésie, une injection de sonde et un prélèvement de sang terminal avant la mise à mort. Le porteur indique n'avoir observé aucun effet indésirable notable au cours de deux années d'études antérieures et suit les tumeurs au pied à coulisse. Il présente la validation in vivo de ces agents de contraste comme "primordiale" et "indispensable", aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui la dissémination métastatique.

Objectifs

Depuis 2 ans, les études de notre client, menées dans le projet autorisé sur la « validation in vivo de nouveaux agents de contraste spécifiques pour la netrin-1, potentiel biomarqueur du cancer mammaire métastatique », ont démontré des résultats prometteurs in vitro e in vivo. La suite des études a permis la conception d’autres agents de contraste pour le même biomarqueur (nétrine-1), ainsi que l’identification d’autres biomarqueurs pour lesquels notre client a cependant conçu des sondes d’imagerie, qui ont été synthétisées et testés in vitro. Notre client souhaiterait pouvoir les étudier in vivo, sur des souris témoin ainsi que des souris porteuses de tumeur mammaire. Pour cette nouvelle demande, il s’agit de pouvoir effectuer le même type de procédures autorisés que dans le projet précédent, mais, cette fois, concerne l’étude de plusieurs biomarqueurs, en utilisant des sondes d’imagerie de petite taille, à administrer par voie intraveineuse.

Bénéfices attendus

L’imagerie moléculaire, notamment le ciblage de biomarqueurs spécifiques, représente une alternative de choix pour une détection précoce de cancer étant donné que les changements physiologiques apparaissent bien avant les changements morphologiques que ces biomarqueurs engendrent et doit permettre un diagnostic précoce. Les études in vitro réalisées au préalable démontrent une affinité ou une réponse au biomarqueur de choix pour certaines des sondes développées par notre client et leur validation in vivo sur des modèles de cancer est primordiale.

Procédures

Induction de cancer mammaire : 1 injection par animal 5 minutes maximum sous anesthésie générale gazeuse. Suivi par imagerie : au maximum 3 examens non invasifs sur 24h avec 1 délai d'1h minimum entre 2 examens sous anesthésie générale. Administration de la sonde 1 seule injection par voie intraveineuse sur souris vigile. Prélèvement de sang sur animal anesthésié volume de 400μL puis mise à mort. Mesure de la tumeur au pied à coulisse: sur animal vigile, 2 minutes, 1 fois par semaine.

Impact sur les animaux

Concernant la mise en place du modèle de cancer mammaire, les dommages attendus sont liés au développement d’une tumeur et nous mettrons en place un suivi ainsi que des points limites pertinents permettant d’anticiper toute douleur ou stress qui pourrait être provoqué chez l’animal. La douleur infligée par l’injection des cellules et réactifs pour l'imagerie, elle, correspond à celle d’une piqûre d’aiguille. Après ces 2 ans d’études, nous n’avons pas remarqué d’effets indésirables ou nuisances dues au développement tumoral ni à l’administration des sondes. La cinétique par imagerie scintigraphique 3D ainsi que la biodistribution ex vivo ont été réalisées 10 jours post induction. A ce stade, les tumeurs sont

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.

Remplacement

Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes, tissus et types cellulaires, conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur survie et dissémination dans l’organisme. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro, le recours aux animaux est indispensable. Par ailleurs, ce projet vise à vérifier le ciblage spécifique d’un agent de contraste vers la tumeur ; et de comprendre la biodistribution de ces agents de contraste parmi les différents organes, ce qui n’est possible qu’en utilisant un animal vivant. Pour ces raisons l’utilisation du modèle animal souris est fondamental, puisque l’étude préclinique en particulier ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour chacune des sondes, pour chaque procédure et à chacun des 6 souris sont induites avec des cellules 4T1 en intramamaire. Nous en sélectionnons 3 sur les 6 de taille de tumeur identique pour effectuer les examens. L’analyse statistique sera effectuée avec le logiciel GraphPad PRISM V7 pour comparer les lots expérimentaux. Etant donné le nombre réduit de souris par lot, des tests Mann-Whitney non paramétriques avec correction de Welch seront utilisés pour déterminer les différences entre chaque lot change selon la distribution des échantillons, et le test de Kruskal-Wallis non paramétrique suivi par un post-test de Dunns ou Tukeys de comparaison de groupes multiples.

Raffinement

Les animaux seront observés scrupuleusement et des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance au cours de l’expérimentation. Les études réalisées depuis 2 ans ont montré très peu de souffrance des animaux. Les points limites n’ont jamais été atteints (pas de perte de poids observée, pas de tumeur >200mm3, pas de nécrose sévère des tumeurs mammaires. De plus, durant les examens d'imagerie et l'induction du modèle tumoral, les souris seront anesthésiées. Enfin, les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec du celluron. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. La lignée de cellules 4T1 est une lignée d'origine murine. Elle est classiquement administrée au laboratoire sur la lignée de souris BALB/c By. Le fournisseur de la lignée cellulaire (ATCC) indique qu'elle provient de souris BALB/c By (Aslakson CJ, Miller FR. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52: 1399-1405, 1992). Un lot de souris BALB/c By témoin sera aussi étudié. 5 - 6 semaines, stade où les bourgeons mammaires ne sont pas complètement développés et où les conditions hormonales de la souris sont adéquates pour la croissance tumorale.

83 200 souris et rats vont être utilisés, la plupart tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles subissent une chirurgie de transfert d'embryons d'environ quinze minutes sous anesthésie générale, pour servir de mères porteuses. Le porteur indique que ces femelles réimplantées sont tuées au sevrage des petits, sauf quelques-unes gardées comme sentinelles sanitaires, et que 156 rates sont réutilisées. Il justifie la voie chirurgicale par un taux de naissance 2,5 fois supérieur à la méthode non invasive, qu'il juge sans réelle "valeur ajoutée éthique".

Objectifs

Ces transferts d’embryons ont pour but de mettre à disposition de la communauté scientifique des animaux sains. En effet, la présence de contaminants dans les colonies de rongeurs de laboratoire peut introduire un biais dans les résultats obtenus et leur analyse, ainsi qu'avoir des conséquences néfastes sur le bien être de ces animaux. La cryoconservation et le transfert d’embryons permettent de réduire considérablement les populations de rongeurs de laboratoire, en ciblant la naissance d'une majorité d'animaux d'intérêt scientifique. En effet, à partir d’embryons décongelés, de sperme suivi d’une fécondation IN VITRO ou encore de collecte d’embryons post accouplements naturels, les embryons collectés et lavés en milieux stériles appropriés sont réimplantés dans des femelles pseudogestantes qui vont en assurer le développement IN UTERO et leur élevage jusqu’au sevrage. Enfin, au-delà des 2 arguments cités ci-dessus, le transfert d’embryons permet également d’autres améliorations telles que le retour à un microbiote caractérisable, améliorer les conditions d’élevage, sécuriser sanitairement les échanges lors de collaboration,… Ce projet est donc un élément de base dans la gestion et l'élevage des colonies de rongeurs de laboratoire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont d'obtenir rapidement des rongeurs d'intérêt scientifique et de haute qualité sanitaire issus de femelles réimplantées ayant la capacité de donner les meilleurs taux de naissances possibles post transfert embryonnaire par voie chirurgicales.

Procédures

Les animaux subissent une procédure chirurgicale unique d'une durée moyenne de 15 minutes après anesthésie générale

Impact sur les animaux

La chirurgie de transfert d'embryon est composée d’un protocole chirurgicale unique et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum.

Devenir

Les femelles réimplantées seront mises à morts au sevrage des petits sauf quelques-unes qui seront utilisées en tant que sentinelles pour le contrôle du statut sanitaire des portées. Les animaux sevrés seront envoyés au donneur d’ordre pour des fins scientifiques.

Remplacement

Des solutions commerciales de kits de transfert d'embryons par voie naturelle sont proposées par différentes compagnies. Les méthodes dites "non invasives" (par voies naturelles) offrent des taux de naissance de l'ordre de 2.5 fois moins comparativement à la méthode chirurgicale. Cela nécessite donc l'utilisation d'un plus grand nombre de donneuses d'embryons et de mères porteuses pour obtenir un même résultat. Les taux de naissances obtenus et les spécificités techniques associées à leur utilisation ne permettent donc pas encore une réelle valeur ajoutée éthique pour les transferts d'embryons par des quantités réduites d'animaux au strict minium pour atteindre les objectifs scientifiques souhaités. Les transferts d'embryons dans des femelles pseudgestantes B6CBA/F1 permettent également la réalisation de shéma d'accouplement (IN VIVO ou IN VITRO) avec des taux d'animaux d'intérêts supérieurs à ceux issus d'accouplements naturels. Ces transferts évitent ainsi de nombreux accouplements naturels pour une cible finale en terme de nombre d'animaux d'intérêt identique dont les femelles du modèle ne pourraient pas: ovuler, assurer une gestation ou encore allaiter correctement.

Réduction

L'aspect réduction du nombre d'animaux est traité via une politique de réduction au strict minimum nécessaire de femelles réimplantées pour atteindre des objectifs fixés par les utilisateurs finaux. Les revitalisations de modèles maintenus au format congelé lorsqu'ils ne sont pas en études actives, les décontaminations par transfert embryonnaires, les expansions rapide de colonies par fécondation IN VITRO,... sont toutes des solutions qui répondent complètement aux 3R et à l'objectif de réduction d'animaux en élevage. La production d’animaux expérimentaux par des méthodes alternatives, intégrant des transfert d’embryons, permet de rationaliser les besoins des chercheurs : - en évitant les élevages permanents desquels une infime partie des animaux produits est utilisée. - en offrant une homogénéité des lots, une qualité génétique et sanitaire supérieure, et un microbiote standardisé. - en permettant de réduire la quantité d’animaux produite aux uniques besoins. Un élevage moyen d’un modèle produit environ 500 animaux par an, ce qui arriverait à une quantité de 2 500 000 animaux nés sur 5 ans pour 1000 modèles. Pour le même nombre de modèle, le transfert embryonnaire pour produire les lots d’animaux expérimentaux sur 83 700 mères porteuses permet une réduction minimale de 10 fois la quantité d’animaux produite en élevage continue. Cette méthode répond efficacement aux attentes d’une démarche 3R.

Raffinement

Le raffinement sera obtenu par l'application d'une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux avec une grille d’évaluation adaptée pour déceler tout signe clinique et atteinte des points limites, par un hébergement avec enrichissement adapté à l'espèce et à son état physiologique et par un protocole analgésique maitrisé lors de la chirurgie. D'après notre historique, les taux de gestations et taux de naissance sont similaires à ceux d'accouplements naturels et nous avons une absence de mortalité post chirurgie. Ces éléments témoignent d'une procédure maitrisée.

Choix des espèces

L’espèce choisie doit être identique à celle du modèle scientifique et pour lesquel le recours à cette technique est nécessaire. Parmi les rongeurs, les espèces les plus utilisées par la communauté scientifique sont les souris et les rats. Pour les souris, nous avons choisi l’hybride B6CBA/F1 qui est la plus reconnue scientifiquement pour ses qualités reproductrices pour assurer une gestation et un sevrage d'un plus grand nombre de petits avec un gabarit homogène et donc une standardisation optimale du process. Pour les rats, la souche Sprague Dawley est reconnue comme étant la plus appropriée pour cette même technique et pour ses qualités reproductrices. L’âge est déterminé par l'âge de maturité des fonds génétiques et la faculté des animaux utilisés à mener à bien la production d’une portée jusqu’à son sevrage : -Rats: Sprague Dawley de 10 à 12 semaines -Souris: B6CBA/F1 de 10 à 15 semaines

1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une incision de la peau et du muscle de la patte arrière sous anesthésie pour induire une allodynie, puis reçoit des candidats médicaments par diverses voies avec parfois des prélèvements de sang répétés. Le porteur indique que le modèle repose sur la douleur provoquée par l'incision plantaire et signale des risques de non-réveil ou de mauvaise cicatrisation. Il présente ces deux modèles comme intégrés à "l'offre de service" de l'entreprise, destinée à des clients développant des analgésiques.

Objectifs

Dans le cadre de son travail, le laboratoire teste des candidats médicaments. Le but de ce projet est de tester des molécules dans un modèle de douleur post-opératoire chez la souris. Les douleurs post-opératoires sont des douleurs survenant à la suite d’une intervention chirurgicale. Les patients atteints de ces douleurs présentent des symptômes caractéristiques tels qu’une hyperalgésie (sensation douloureuse ressentie comme encore plus douloureuse) et une allodynie (sensation non-douloureuse ressentie comme douloureuse). Ce type de douleur est encore principalement traité par des opiacées, mais aussi des antiépileptiques ou anti-inflammatoires. Le traitement ne peut donc pas rester perdurer sur du long terme sans entrainer dépendance, accoutumance ou de lourds effets secondaires. Aux vues du nombre d’opération réalisées chaque jour, il est important de trouver des molécules fiables et efficaces pour traiter les douleurs post-opératoires. Deux modèles précliniques de douleur ont donc été mis au point pour étudier les nouveaux traitements contre ces douleurs post-opératoires. Un de ces deux modèles consiste à inciser seulement la peau plantaire, alors que l’autre consiste à inciser en plus les tissus profonds. L’incision de la peau et des tissus profonds induit une douleur plus importante que l’incision de la peau seule. L'incision de la peau et des muscles imite mieux la chirurgie invasive (une douleur aiguë intense) et conduit à une douleur chronique (entre 4 et 5jours). Ce modèle de douleur post-opératoire peut être associé avec des tests d’allodynie mécanique : von Frey électronique ou monofilament de von Frey. Ces tests sont couramment décrits dans la littérature. Le test de monofilament de von Frey est utilisée avec la méthode dit “up-and-down” et va permettre de déterminer le seuil 50% de retrait de la patte en gramme. Le von Frey électronique va, lui, permettre de donner une valeur en gramme du seuil de retrait de la patte.

Bénéfices attendus

Ces deux modèles seront intégrés dans l’offre de service de l’entreprise qui pourra ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés avec un modèle proche de la clinique, qui permet de proposer de tester ces candidats médicaments sur l’allodynie mécanique chez la souris.

Procédures

Les animaux sont soumis à une incision de la peau et une incision du muscle de la patte arrière droite, cela dure environ 4-5min par animal. Ils sont soumis à l’administration de composés à potentiel anti-douleur par voie p.o., ip., sc., i.v. ou i.m. Les souris peuvent recevoir une injection ou deux si le client demande une co-admnistration. Le geste de l'admnistration dure 1minute environ. Les souris peuvent aussi être soumises à des prélèvements de sang afin de surveiller la pharmacocinétique d’un composé. Cela peut être des prélèvements uniques ou répétés en fonction de la demande client.

Impact sur les animaux

La nuisance principale est liée au modèle lui-même qui consiste en l’induction d’une allodynie par incision de la voute plantaire des animaux. Pour limiter la douleur lors de l’induction du modèle, l’incision est réalisée sous anesthésie gazeuse. De plus, les effets indésirables peuvent être un non-réveil suite à l’anesthésie sous isoflurane ou une mauvaise cicatrisation de la plaie. Des nuisances associées à la pharmacologie peuvent également apparaitre (tremblement, sédation, déshydratation). Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie (IC, jugulaire, rétro-orbital). Les administrations et prélèvements peuvent donc présenter des nuisances pour les souris.

Devenir

Le modèle de douleur post-opératoire chez la souris entraine une activation des processus inflammatoires. Les processus inflammatoires sont mobilisés dans de nombreux modèles de douloureux même chronique comme les neuropathies. Il est donc difficile d’évaluer l’impact que pourrait avoir cette chirurgie sur un autre modèle de douleur. De plus, les administrations de candidat médicaments peuvent aussi créer des interactions ou des modifications biologiques difficiles à évaluer dans le cadre de ce travail. Il n’est donc pas cohérant de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité de la société.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle et confirmé lors des études subséquentes réalisées par la société. Cet effectif par groupe a été confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance via BiostaTGV.

Raffinement

Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Le test avec les monofilaments de von Frey comporte une valeur de cut-off à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance. Pour limiter le stress les animaux sont habitués au dispositif de tests aussi. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation et 24h aux salles de tests). De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, papier kraft et briquettes en bois à ronger). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude ou à défaut par un autre technicien du laboratoire (formé à l’expérimentation animale niveau I ou II). Concernant l'anesthésie, les animaux pour la chirurgie POP sont sous isoflurane durant maximum 5minutes, un système de chauffage et d'aspiration sont intégrés à la table d'anesthésie gazeuse afin de garantir un réveil plus confortable pour les animaux.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein d’ANS Biotech. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature. 1560 souris seront utilisées pour ce projet. Le découpage de ce nombre par procédure se présente ainsi : - 780 souris subiront la procédure n°1 - 780 souris subiront la procédure n°2 Soit un total de 1560 souris Lots 10 animaux/groupes x 5 groupes + 2 animaux x 3 études/an x 5ans = 780souris par procédure

12 singes cynomolgus vont être utilisés, gardés vivants à l'issue pour d'autres protocoles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit jusqu'à vingt-cinq injections sur quinze jours, douze prises de sang sous anesthésie, six échographies ovariennes et deux laparotomies sous anesthésie générale, pour tester une molécule d'induction de l'ovulation. Le porteur affirme n'avoir constaté aucun effet secondaire lors d'expériences précédentes et fixe le point limite à une perte de 5 pour cent du poids. Il revendique le cynomolgus comme "l'espèce réglementaire reconnue" pour la reproduction, dont le cycle serait très proche de celui de la femme.

Objectifs

Dans les sociétés industrialisées, les problèmes de fertilité humaine sont de plus en plus fréquents. Pour pallier à ce véritable problème sociétal, la médecine moderne dispose de traitements hormonaux qui stimulent l’ovulation chez la femme. Au cours du traitement, les patientes reçoivent des doses massives d’hormones. Certaines d’entre elles sont réfractaires et doivent subir plusieurs traitements successifs permettant de définir pour chacune d’elle « au cas par cas » le dosage approprié capable d’induire une bonne maturation folliculaire. L’autre point délicat du traitement est l’étroitesse du champ d’action entre une bonne stimulation ovarienne et un risque d’hyperstimulation. Nous développons une solution alternative aux traitements hormonaux d’induction de l’ovulation chez la femme qui apporte une meilleure efficacité. Le but de cette étude est de tester un nouveau traitement d’induction de l’ovulation chez le primate non-humain le singe Cynomolgus (Macaca fascicularis), modèle proche de la femme. Le nouveau traitement sera comparé à un traitement d’induction de l’ovulation classiquement utilisé chez la femme.

Bénéfices attendus

Le but de notre expérience, à long terme, est de développer un nouveau traitement d'induction de l'ovulation chez la femme, tout en améliorant le bien-être et le confort des patientes.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections (sur animaux vigiles, 25 injections maximum par animal sur 15 jours et chaque injection durera 2 minutes maximum (en incluant l'isolement de l'animal, l'injection, et le retour dans le groupe)), des prises de sang (sur animaux anesthésiés, 12 prises de sang par traitement et par animal, à raison de 1,5 ml de sang prélevé par prise de sang, chaque prise de sang dure maximum 15 minutes (anesthésie de l'animal, sorti de la cage, prise de sang, réveil et retour dans la cage)). Les animaux seront également soumis à des échographies ovariennes par voie transabdominale, sous anesthésie générale. Il y aura 6 échographies par traitement et par animal, et chaque échographie dure environ 30 minutes. Enfin, tous les animaux subiront 2 laparotomies à au moins 2 mois d'intervalle. La laparotomie est réalisée sous anesthésie générale et dure environ 1 heure.

Impact sur les animaux

Lors de nos expériences précédentes comportant les mêmes procédures sur le singe cynomolgus, nous n'avons constaté aucun effet secondaire de notre molécule. Au long cours, seront surveillés l’apparence physique, la réponse à différents stimuli (interaction avec les animaliers lors des soins journaliers et avec les éléments d’enrichissement), le comportement avec les congénères pour l’ensemble des macaques. L’animal qui n’interagit pas sera isolé et emmené à l’infirmerie pour consultation du vétérinaire référant et analyses. A chaque anesthésie seront répertoriés le poids, le pouls, la saturation, et un examen clinique complet. Une diminution de 5% du poids ou des modifications du comportement (prostration dans un coin, relation avec les congénères, accès à la nourriture…) constitueront le point limite et nécessiteront l’arrêt de l’étude pour l’animal concerné. Les animaux sont observés quotidiennement au moins 3 fois par jour (distribution de fruits).

Devenir

A la fin de l'expérimentation, c'est à dire une fois que toutes les expériences décrites dans ce projet sont terminées, les animaux pourront être utilisés pour d'autres protocoles. La décision sera prise par le vétérinaire référent de l'animalerie et la cellule bien-être.

Remplacement

Des effets sur la fonction de reproduction ne peuvent pas être observés uniquement in vitro sur cellules ou ex-vivo. En effet, la régulation de la reproduction est issue d’une communication étroite entre l’hypothalamus, l’hypophyse et les ovaires, et requière un organisme vivant entier. D’un point de vue physiologique, le cycle sexuel du singe cynomolgus est très proche de celui de la femme et présente les mêmes particularités. Il est de 30 ± 4 jours, avec une phase lutéale et une phase folliculaire similaire à celles de la femme. De plus, comme chez la femme, le singe cynomolgus ne présente pas de période d’anoestrus ce qui n’est pas le cas du macaque rhésus.

Réduction

Le nombre d'animaux est faible, mais sera suffisant pour observer les effets souhaités.

Raffinement

Nous avons raffiné nos procédures (prise de sang sous anesthésie, procédure d’imagerie non invasive). Le système d’élevage ne sera pas modifié et il y aura un enrichissement social (hébergement en groupe, surface suffisante par animal, présence de jouets). Lors de nos expériences précédentes comportant les mêmes procédures sur le singe cynomolgus, nous n'avons constaté aucun effet secondaire de notre molécule. Au long cours, seront surveillés l’apparence physique, la réponse à différents stimuli (interaction avec les animaliers lors des soins journaliers, avec les éléments d’enrichissement,…), le comportement avec les congénères pour l’ensemble des macaques. L’animal qui n’interagit pas sera isolé et emmené à l’infirmerie pour consultation du vétérinaire référant et analyses. A chaque anesthésie seront mesurés le poids, le pouls, la saturation, et un examen clinique complet. Une diminution de 5% du poids ou des modifications du comportement (prostration dans un coin, relation avec les congénères, accès à la nourriture…) constitueront le point limite et nécessiteront l’arrêt de l’étude pour l’animal concerné. Les animaux sont observés quotidiennement au moins 3 fois par jour (distribution de fruits).

Choix des espèces

Le traitement d’induction de l’ovulation étant destiné à être utilisé chez la femme, nous avons besoin de le tester et de faire la preuve de concept in vivo chez l’espèce la plus proche de la femme d’un point de vue physiologique. Le singe cynomolgus est l’espèce réglementaire reconnue et utilisée pour l’étude de la fonction de reproduction chez la femme. D’un point de vue physiologique, le cycle sexuel du singe cynomolgus est très proche de celui de la femme et présente les mêmes particularités. Il est de 30 ± 4 jours, avec une phase lutéale et une phase folliculaire similaire à celles de la femme. De plus, comme chez la femme, le singe cynomolgus ne présente pas de période d’anoestrus ce qui n’est pas le cas du macaque rhésus. Le but étant d’induire une stimulation ovarienne, les animaux doivent être des femelles pubères de 36 mois minimum.