Recherche appliquée

216 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, les mères réutilisées et tous les nouveau-nés tués jusqu'à l'âge de trois ans. Les nouveau-nés sont infectés par le virus respiratoire syncytial et le SARS-CoV-2, leur microbiote perturbé par des antibiotiques, et subissent jusqu'à trente prélèvements sanguins par an, dix-sept lavages broncho-alvéolaires et dix ponctions de moelle osseuse. Le porteur étudie l'effet du microbiote sur la réponse immunitaire du nouveau-né, en s'appuyant sur l'impossibilité éthique de telles expériences chez l'enfant humain. Il affirme que seul le primate non-humain présente une proximité suffisante avec l'humain pour ce type d'étude.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’explorer le rôle du microbiote dans l’immunité, dès la naissance, et d’anticiper les effets délétères causés par son altération (dysbiose) précoce, dans le cas notamment des infections respiratoires virales chez l’enfant. Le système immunitaire est immature à la naissance et se développe dans les premières années de vie par interaction avec l’environnement. Le microbiote intestinal, qui regroupe l’ensemble des micro-organismes qui peuplent nos intestins, est acquis principalement lors de l’accouchement par voie basse puis via le lait maternel. Il interagit avec le système immunitaire au travers des composés issus de son métabolisme, les métabolites, et des cytokines produites par les cellules immunitaires. Le microbiote est indispensable au rôle de barrière des muqueuses et pour l’apprentissage de l’immunité locale, en régulant la reconnaissance des espèces pathogènes ou non et en assurant ainsi l’homéostasie locale. La littérature montre qu’une dysbiose perturbe les capacités du système immunitaire à faire face à une infection. Or ce microbiote peut être facilement fragilisé, notamment par l’utilisation d’antibiotiques, pratique courante en pédiatrie. Même s’il se reconstitue, les effets à court et à long terme de cette fragilisation transitoire restent mal compris. Notre hypothèse est que cette perturbation chez le nouveau-né peut-être responsable de la sévérité observée de certaines pathologies respiratoires de la petite enfance. Comprendre le rôle du microbiote paraît donc déterminant pour appréhender ces situations et envisager des stratégies thérapeutiques pertinentes adaptées. Dans ce projet nous nous intéressons à différents virus ayant un profil pathologique propre à l’enfant. C’est le cas du virus respiratoire syncytial (VRS), principal responsable de bronchiolites aigües, et du virus SARS-CoV-2 de la COVID-19, dont les présentations cliniques sont différentes de ce que l’on observe chez l’adulte, pouvant être sévères (infection VRS) ou asymptomatiques (SARS-CoV-2). L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du microbiote sur la réponse immunitaire du nouveau-né primate non-humain à une infection virale. Nous comparerons des microbiotes altérés ou non par une antibiothérapie dans les premiers jours de vie, sur des animaux nés par voie basse et allaités. Nous évaluerons des stratégies thérapeutiques basées soit sur la vaccination maternelle, soit sur une intervention néonatale (vaccin ou traitement probiotique).

Bénéfices attendus

Ces travaux sur le primate non-humain permettront d’approfondir les connaissances en immunité pédiatrique actuellement limitées chez le nouveau-né humain pour des raisons évidentes d’éthique, mais aussi d’accès aux différents compartiments (sang, muqueuses, moelle, poumons) et de volume disponible pour les échantillons. Le bénéfice attendu dans un premier temps est une meilleure compréhension des interactions et des mécanismes régulateurs entre système immunitaire et microbiote au cours des premiers temps de vie d’un nouveau-né, période au cours de laquelle se façonne la capacité du système immunitaire à réagir à une infection virale ainsi que sa mémoire immunitaire. En analysant ensuite l’impact d’un microbiote intact ou altéré sur la réponse immunitaire à une infection, nous espérons pouvoir anticiper les effets délétères causés par une dysbiose précoce. Et en explorant des stratégies préventives (vaccination maternelle ou néonatale, administration néonatale de probiotiques), pouvoir contrer ces effets le plus précocement possible en l’ajustant aux capacités et aux besoins spécifiques du nouveau-né. Quant aux bénéfices à long terme, notre réseau autour de l’immunité pédiatrique et nos collaborations avec des pédiatres nous permettront également de confirmer et comparer nos résultats à ce que l’on observe chez les enfants en clinique. Les nouveau-nés bénéficieront des résultats obtenus sur le modèle préclinique pour mieux appréhender et idéalement prévenir les effets délétères d’une dysbiose précoce sur la réponse immunitaire à une infection respiratoire ultérieure et éventuellement à d’autres infections ou agressions.

Procédures

Mères : - Anesthésie : 40 en moyenne. Pour chacune des interventions, durée 30min à 1h - Echographies : 2 à 3 fois avec un intervalle d’un mois entre, 30min par examen - Prélèvement de sang : une fois par semaine pendant huit semaines au cours de la gestation. Ensuite une à deux fois par mois jusqu’au sevrage. Enfin une fois par semaine pendant un mois après le sevrage. Jusqu’à 25 fois en moyenne. 5min par prélèvement - Ecouvillonnage des muqueuses aux mêmes dates que le sang. Jusqu’à 25 fois en moyenne. 10min - Lait maternel : aux mêmes dates, Jusqu’à 25 fois en moyenne. 10min par collecte - Lavage broncho-alvéolaire : sept lavages. Un pendant la gestation, puis six après la naissance avec un intervalle minimum de deux semaines entre. 20min - Ponction de moelle osseuse : cinq ponctions. Quatre ponctions à deux mois d’intervalles jusqu’au sevrage, puis un mois après sevrage. 20min - Vaccination : deux injections au cours de la gestation. 5min Nouveau-nés : - Anesthésie : entre 18 et 30 en moyenne la première année, puis 12 et 4 fois la deuxième et troisième année respectivement, entre 15 et 30min - Contention : jusqu’à 12 fois pour certains points rapides (avec sang et écouvillons) jusqu’à 2 mois de vie maximum. - Prélèvement de sang : 2-3 fois/semaine (0-2 mois de vie), puis toutes les deux semaines (2-6 mois), toutes les trois semaines (6-12 mois), tous les mois (1-2 ans) et enfin tous les trois mois (2-3 ans). Jusqu’à 30 fois en moyenne la première année, puis 12 et 4 fois la deuxième et troisième année respectivement. 5min par prélèvement - Ecouvillonnage des muqueuses : compartiments nasal, oropharyngé, salivaire, rectal, anal, vaginal (si femelle) et oculaire, aux mêmes dates que le sang. Jusqu’à 30 fois en moyenne la première année, puis 12 et 4 fois la deuxième et troisième année respectivement. 10min - Lavage broncho-alvéolaire : jusqu’à 17 lavages. 20min - Ponction de moelle osseuse : jusqu’à 10 ponctions. 20min - Exposition virale : une exposition. 30min - Vaccination : deux injections. 5min - Traitement antibiotique ou probiotique : administration quotidienne pendant une à quatre semaines. 20min - Imagerie in vivo : trois sessions. Moins d’une heure - Euthanasie en fin d’étude

Impact sur les animaux

Nous distinguons les effets de l’expérimentation sur le nouveau-né primate non humain des effets liés aux infections et traitements. Nous devons maîtriser la fréquence et la durée des interventions lors des premiers jours de vie afin de ne pas interférer avec la croissance du nouveau-né ni impacter la relation mère/nouveau-né. Cela peut se traduire par un impact sur la prise de poids de l’animal en croissance, à savoir une absence de prise de poids voire une perte. Sur certains points précoces, le nouveau-né sera seulement immobilisé pour ne pas risquer le rejet du petit par sa mère lié à des odeurs non reconnues ou une réactivité moindre suite à l’anesthésie, ainsi qu’une hypothermie difficile à gérer chez le nouveau-né. Ce projet repose sur notre expérience passée qui a démontré que nous pouvons suivre un schéma expérimental tel que celui décrit, sans impacter la croissance des nouveau-nés ni la relation avec les mères. Les pathogènes entraînent chez le nouveau-né des formes asymptomatiques, légères ou modérées, d’après la littérature et notre expérience. Des symptômes pourront être relevés (fièvre, baisse d’activité, lésions pulmonaires) mais sont transitoires et résolus en moyenne après deux semaines. La vaccination maternelle ou néonatale, de même que l’administration d’antibiotiques, pourront être associés à une réaction locale au site d’injection qui serait transitoire, avec érythème et gonflement, résolue en quelques jours. Enfin l’administration de probiotiques par voie orale se fera autant que possible par succion et non par gavage, en respectant les volumes préconisés. Comme il n’est pas possible d’entraîner un nouveau-né à la manipulation pour limiter le stress, une attention toute particulière sera portée aux techniques employées ainsi qu’au matériel utilisé pour être adapté au mieux aux spécificités du nouveau-né, avec du personnel spécifiquement formé et entraîné sur le modèle.

Devenir

Tous les nouveau-nés primates non-humains seront euthanasiés à des âges différents, jusqu’à l’âge de 3 ans, pour accéder aux organes et ainsi à l’analyse fine des différents compartiments d’intérêt (charge virale, populations immunitaires, microbiote, métabolites, histologie…). Les femelles primates non-humains seront sorties du projet un mois après le sevrage et pourront être réutilisées. Elles servent de contrôle des différents systèmes matures et adultes, mais il n’est pas nécessaire d’accéder aux tissus, nos données de laboratoire seront utilisées si nécessaire.

Remplacement

Ce projet nécessite l’étude du système immunitaire et du microbiote en fonctionnement, et ces systèmes intégrés et leurs interactions ne peuvent pas être reproduits in vitro. De même, reproduire in vitro des symptômes dans le cadre d’une pathologie respiratoire n’est pas possible. Dans la mesure du possible, des tests ex vivo seront réalisés en amont sur des explants de poumons par exemple, pour déterminer une souche et/ou une dose de virus adaptées à notre modèle. Le recours à l’animal reste donc indispensable. Nous utiliserons un modèle de primate non humain, le macaque cynomolgus, pour sa proximité phylogénétique avec l’Homme : il présente une forte homologie au niveau des acteurs et de l’organisation de la réponse immunitaire et vaccinale mais aussi de la composition microbiotique, contrairement à ce que l’on peut retrouver chez d’autres modèles animaux. Il sera exposé à des virus auxquels il est sensible à l’infection, aussi bien chez le jeune que chez l’adulte.

Réduction

Nous avons établi un nombre minimum d’animaux par condition afin de déterminer si les variations observées entre les différents groupes sont bien dues aux conditions expérimentales et non aux variations propres à chacun des individus. Nous avons ainsi établi des groupes avec un maximum de six animaux par groupe. Ce chiffre représente le nombre maximum d’animaux par groupe et dans certains cas il pourra être réduit pour des phases préliminaires. Par ailleurs tous les modèles auront été validés sur des animaux adultes et/ou juvéniles à la faveur d’autres projets, avant de les transposer au nouveau-né.

Raffinement

Les animaux seront suivis tous les jours avec une attention particulière pendant les deux premières semaines de vie. Des grilles d’évaluation permettront de suivre et détecter tout écart au bien-être animal. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures seront prises (arrêt des interventions, traitement, sortie d’étude), selon avis du vétérinaire et de la structure du bien-être animal. Egalement en cas d’apparition de douleurs ou de signes cliniques liés aux prélèvements ou à l’infection, un traitement symptomatique pourra être mis en place. L’unité minimale d’hébergement des animaux sera le couple mère/enfant qui ne sera séparé qu’au-delà de l’âge minimal réglementaire de sevrage pour cette espèce afin de reformer de nouveaux groupes. Dans l’ensemble, le groupe social multifemelles et multi-nouveau-nés sera favorisé au maximum. Toute intervention sera faite sous anesthésie générale réversible pour permettre un réveil rapide des animaux, avec une anesthésie non systématique du nouveau-né lors des premières semaines de vie, lorsque la balance bénéfice/risque n’est pas favorable (risques d’hypothermie ou de rejet maternel trop importants) par rapport au temps nécessaire pour l’intervention. Enfin, toutes les techniques et analyses ont été miniaturisées afin de réduire les volumes de sang nécessaires à prélever.

Choix des espèces

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact d’une perturbation du microbiote d’un nouveau-né sur sa réponse immunitaire à une infection respiratoire, et ainsi évaluer le bénéfice de certains traitements ou vaccins sur les effets délétères liés à cette perturbation. Seuls les primates non humains présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et immunologiques, en terme de réponse immunitaire et vaccinale, suffisamment proches de l’Homme pour permettre une étude pertinente de ces phénomènes. Nous avons choisi le macaque cynomolgus, qui a déjà été modèle d’infection pour nos virus d’intérêt dans des études scientifiques, et chez qui les techniques et outils d’exploration du système immunitaire et du microbiote sont disponibles et maitrisés. Notre étude, qui s’intéresse à des développement in utero et néonataux, nécessite d’avoir accès à des femelles gestantes et aux nouveau-nés issus de ces gestations.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent l'ablation des glandes lacrymales pour provoquer une sécheresse oculaire douloureuse, puis l'instillation d'une solution qui active les nocicepteurs et provoque une sensation de brûlure, avec des tests nommés de sensibilité cornéenne et d'imagerie de la cornée. Le porteur veut cartographier les circuits neuronaux de la douleur oculaire chronique et le rôle de l'inflammation. Il affirme qu'une approche sur animal entier reste incontournable car ces circuits impliquent tout l'encéphale.

Objectifs

La cornée est le tissu le plus innervé de l’organisme et le générateur de douleur le plus puissant. La sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes. Elle engendre des douleurs, picotements, sensation de brûlure oculaire et sensibilité à la lumière (photophobie) avec des atteintes cornéennes. C’est une douleur chronique qui affecte de façon dramatique la qualité de vie des patients (anxiété, dépression) et qui en fait l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Les douleurs oculaires chroniques sont les plus difficiles à traiter notamment car les circuits neuronaux et les mécanismes qui en sont à l’origine sont encore mal connus. Ce projet, en utilisant un modèle murin de sécheresse oculaire qui mime les symptômes de la pathologie humaine, a pour but de cartographier précisément les circuits neuronaux impliqués dans la douleur cornéenne. Le rôle de l’inflammation dans ces douleurs sera également évalué. Ce projet repose sur l’utilisation de souris sauvages afin de mettre en évidence les circuits cérébraux de la douleur oculaire et de souris transgéniques afin d’évaluer le rôle de l’inflammation dans ces douleurs.

Bénéfices attendus

La prise en charge de la douleur chronique oculaire est actuellement un enjeu majeur alors que les traitements restent peu efficaces. Le bénéfice attendu de ce projet est d’aboutir à une meilleure caractérisation des circuits neuronaux de la douleur cornéenne et de permettre d’améliorer notre compréhension de ses mécanismes d’initiation et de maintien, encore largement inconnus, afin de faire le lien entre manifestations cliniques et mécanismes neurologiques fin de développer des traitements réellement efficaces.

Procédures

Les procédures expérimentales nécessitent de tester la sensibilité cornéenne au niveau basal, puis durant et après le développement de la douleur neuropathique cornéenne (CNP). Dans toutes les procédures, les animaux seront soumis à des tests de sensibilité cornéenne, imagerie de la cornée, avant puis durant et après la mise en place de la CNP. Ces tests ne durent qu’entre 1 à 5 minutes. - Test de sensibilité cornéenne : animal vigile, réalisé 3 fois (J0, J7 et J14), durée du test : 2 minutes/session - Imagerie de la cornée : animal anesthésié, réalisé à J0, 1 injection d’anesthésique et le test dure 3minutes. - Imagerie IVCM : animal anesthésié, réalisé 1 fois (J0), durée du test : 5 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l’aide de techniques non invasives (lampe à fente, biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’Homme par un ophtalmologiste sous anesthésie locale et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Le test de la sensibilité cornéenne se fera chez l’animal vigile contrairement aux études d’imagerie de la cornée qui nécessitent une ’immobilisation complète de l’anima. Ces tests seront alors pratiqués sous anesthésie générale. Le modèle de sécheresse oculaire est induit par exérèse des glandes lacrymales. La stimulation nociceptive cornéenne se fait par instillation d’une solution activant les nocicepteurs cornéens. L’instillation est réalisée une fois et dure 1 minute. La solution est lavée par dépôt d’une goutte de PBS. Toutes les procédures comprennent une euthanasie qui nécessite l’injection d’un analgésique puis d’une dose létale d’anesthésique.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront celles observées dans la sécheresse oculaire à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. La douleur de la chirurgie d’exérèse sera contrôlée par une analgésie pré, per- et post-opératoire. Cette étude sera effectuée grâce à l’utilisation de souris transgéniques. Le fait de naître transgénique est en soi un potentiel effet indésirable pour les animaux. Néanmoins, les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable, suggérant qu’elles ne souffrent pas de la présence du transgène. Les tests pratiqués peuvent engendrer une gêne transitoire de courte durée comme on peut le constater chez l’Homme. Le test de sensibilité chimique sera réalisé, chez l’animal éveillé, par l’instillation d’une solution contenant un alcaloïde activant les neurones nocicepteurs entrainant ainsi une sensation de douleur (brûlure) et une inflammation.

Devenir

Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants se justifie par la nécessité de mettre en évidence des circuits neuronaux complexes impliqués dans la douleur cornéenne et qui impliquent l’ensemble de l’encéphale. Le modèle que nous utilisons ne peut pas être remplacé par une approche alternative in-vitro car la douleur cornéenne chronique est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier. Une approche intégrative sur l’animal entier reste incontournable.

Réduction

Nous utiliserons 280 animaux dans ce projet. Afin de respect la règle de réduction, nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique.

Raffinement

Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton, maison en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 21°C et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour/12h nuit. Le taux d’humidité des cages est contrôlé. Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites validés par le comité local du bien-être animal en concertation avec les responsables de l’animalerie. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin de mettre à mort l’animal en dernier recours. Pour éviter toute souffrance les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement la mise à mort de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’euthanasiant chimique. Les tests de la lampe à fente et l’imagerie confocale in-vivo qui peuvent induire un stress et nécessitent que l’animal soit immobile seront réalisés sous anesthésie générale légère.

Choix des espèces

Dans la littérature, les modèles de douleur oculaire ont majoritairement été développés chez des souris mâles et femelles adultes. Les animaux utilisés seront adultes (âgés de 2mois) à leur arrivée dans notre animalerie. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation de 7 jours. Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis.

650 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère. 110 femelles gestantes subissent une réduction de l'irrigation de l'utérus puis sont tuées au sevrage, et 540 ratons subissent soit cette privation avant la naissance, soit une immobilisation des pattes arrière 18 heures par jour de la naissance au sevrage. Le porteur indique une spasticité, des douleurs, un retard de croissance et des troubles moteurs et cognitifs induits par ces modèles. Le projet teste l'exercice, une protéine musculaire et la lactoferrine du lait bovin pour prévenir des troubles neurodéveloppementaux, les rats étant ensuite opérés sans réveil pour des enregistrements avant prélèvement des tissus.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux (TND) chez l’enfant liés à la prématurité ou à l’hypo-activité physique sont croissants. Le microbiote chez ces enfants est perturbé, tout comme la communication entre les sytèmes immunitaires, intestinaux et nerveux, conduisant à plus d’inflammation précoce et à l’apparition de TND divers. Ces troubles neurodéveloppementaux et intestinaux semblent exister dans nos modèles animaux. Nous cherchons ici à prévenir ou remédier précocément à l’apparition de ces TND par plusieurs traitements. Les objectifs de ce projet visent à déterminer l’impact de traitements comme 1) la lactoferrine issue du lait bovin, aux propriétés immunitaires bénéfiques, anti-inflammatoires et facilitatrices du métabolisme du fer, 2) l’exercice physique et l’enrichissement, et 3) l’irisine, une substance neuroprotectrice produite par les muscles et médiatrice des effets bénéfiques de l’exercice, sur i) le microbiote, la perméabilité hémato-intestinale/encéphalique, ii) les processus inflammatoires, et iii) la structure et les fonctions cérébrales, tels que réflexes et comportements sensorimoteurs, comportements cognififs et fonctions exécutives, et les corrélats électrophysiologiques de ces troubles, que l’on observe dans nos 2 modèles animaux: 1) de prématurité basé sur une hypoperfusion intra-utérine (Lot 1: 270 animaux) ou 2) de troubles de l’acquistion de la coordination, basé sur une restriction sensorimotrice (Lot 2: 270 animaux) au cours du développement.

Bénéfices attendus

Composant majeur du colostrum et du lait humain, la lactoferrine bovine (bLf) est une glycoprotéine aux propriétés anti-inflammatoires, antiseptiques et facilitatrices du métabolisme du fer. L’administration prénatale de cette glycoprotéine vise à contribuer au développement harmonieux du microbiote, diminuer l’inflammation par une réduction de la perméabilité des barrières hémato-intestinale/encéphalique, améliorer le développement cérébral en minimisant les lésions cérébrales diffuses, observées dans notre modèle de prématurité et réduire les troubles divers du comportement que l’on retrouve dans nos 2 modèles animaux. La bLf est actuellement utilisée dans des essais cliniques chez les enfants prématurés et a montré des effets bénéfiques sur les infections, la mortalité et les comorbidités chez ces enfants, ainsi que l’absence d’effets secondaires. Notre étude préclinique vise à améliorer les connaissances concernant les effets de la bLf sur le développement cérébral et les mécanismes d’action, avec une portée à terme sur le développement de prochains essais cliniques. La sédentarité et l’hypo-activité physique en général, comme l’indiquent de nombreuses ONG ou l’OMS, induisent de multiples troubles du développement du métabolisme et du cerveau. De même, les enfants prématurés ou atteints de troubles de la coordination qui présentent généralement une hypo-activité, de moindres interactions sociales et avec l’environnement développent de multiples troubles du neurodéveloppement (TND). Ce programme de recherche vise à étudier la remédiation précoce des TND observés dans nos 2 modèles animaux induits par un programme d’enrichissement de l’environnement pour favoriser et multiplier les interactions sociales et environnementales et des exercices physiques controlés qui contribuent au développement neuromusculaire harmonieux. L’irisine, une substance sécrétée par les muscles en exercice, favorise la neuroprotection et le développement cérébral harmonieux. Nous étudierons les effets bénéfiques potentiels de l’administration de l’irisine pour contrer l’apparition des TND dans nos 2 modèles animaux. L’irisine commence à être étudiée intensivement et nos données précliniques permettront d’étudier les effets de l’irisine chez des enfants atteints de TND qui présentent une hypo-activité physique et de faibles interactions sociales et avec l’environnement par le biais d’essais cliniques.

Procédures

Les femelles gestantes du lot 1 (hypoperfusion intra-utérine) seront soumises à une sténose des artères utérines au jour embryonnaire 17 (E17) sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, puis seront mises à mort au sevrage par anesthésie gazeuse suivie d’une dose léthale d’euthasol car non réutilisables pour d’autres gestations. Les ratons issus des femelles du lot 2 (restriction sensorimotrice) subiront une restriction de mouvements par immobilisation des pattes postérieures durant 18h par jour de la naissance au jour du sevrage (30 jours). Les femelles du lot 2 seront mises à mort après plusieurs gestations successives, de manière comparable à celles du lot 1. Les femelles gestantes et/ou allaitantes des lots 1 et 2 seront soumises à 2 diètes alimentaires (supplémentation en lactoferrine ou un régime isocalorique) durant la période prénatale ou postnatale, ou sur les 2 périodes selon le groupe expérimental. Chaque groupe expérimental de ratons des lots 1 et 2 subira après sevrage un des traitements suivants : Un enrichisssement et des exercices physiques consistant à élever une dizaine de rats du même sexe dans une grande cage où est disposée une roue d’activité, l’administration d’irisine ou de solution saline isotonique par injection intrapéritonéale, des tests comportementaux variés, tels que le test de la nage de l’âge de 14 à 28 jours, un test de locomotion acrobatique sur échelle inclinée ou automatique le lond d’un corridor (Catwalk), le test d’agrippement pour mesurer la force de préhension, le test de l’open-field dans une arène vide, le von Frey électronique pour mesurer le niveau de sensibilité tactile, le test nociceptif pour déterminer la latence de retrait lors de l’application de stimulus thermique, le test de l’elevated plus maze pour évaluer le niveau de désinhibition des animaux, le test de reconnaissance d’objets pour tester les capacités mnésiques. Chaque animal des lots 1 et 2 subira également un prélèvement sanguin à l’âge de 1 et 2 mois. Enfin à lâge de 3 mois, chaque animal subira de manière terminale une chirurgie cranienne et des muscles sous anesthésie gazeuse profonde pour effectuer ensuite des enregistrements électrophysiologiques, un dernier prélèvement sanguin, puis après mise à mort par injection léthale d’euthasol le prélèvement des tissus intestinaux, musculaires et du système nerveux. Les animaux subiront également le contrôle quotidien du poids et les manipulations correspondant aux différentes interventions citées.

Impact sur les animaux

La MIUH (hypoperfusion intra-utérine) à E17 et la restriction de mouvements lors de la SMR induisent une inflammation systémique au cours du développement, un neurodéveloppement atypique, la présence de lésions cérébrales, un retard de croissance, des troubles sensorimoteurs, locomoteurs avec une mobilité réduite, comportementaux et cognitifs, ainsi que des signes de spasticité. La spasticité correspond à des spasmes et co-contractions de muscles antagonistes, liée à une hyperréflexie ou hyperexcitabilité du réseau spinal, qui peut conduire à des douleurs. Les nuisances principales dans nos 2 modèles sont liées à la présence de spasticité (i.e. réduction de la mobilité) et un retard de croissance, que nous contrôlons régulièrement. Ce retard de croissance est compensé graduellement au cours du temps dans nos 2 modèles. La spasticité et les troubles locomoteurs, comportementaux et cognitifs perdurent chez les animaux adultes. Les traitements proposés (lactoferrine, exercices et enrichissement, administration d’irisine) dans ce projet de recherche visent à limiter l’inflammation, réduire les lésions cérébrales, améliorer le neurodéveloppement, la mobilité et la perte de poids, donc leur bien-être et limiter ainsi les nuisances induites, comme nous cherchons à effectuer chez l’enfant atteint de troubles du neurodéveloppement (TND). Nous cherchons également à évaluer l'impact de ces interventions (MIUH, SMR et supplémentations en lactoferrine) sur le microbiote intestinal, dont l'altération peut aussi conduire à des nuisances, telles qu'une dysbiose. D’autre part, les animaux subissent également de nombreuses interventions dans ce projet, comme des anesthésies, injections et prélèvements sanguins répétés ou réguliers en sous-cutané (sc) ou intrapéritonéal (ip), une supplémentation alimentaire en lactoferrine bovine ou en caséine (diète isocalorique), des tests comportementaux, le contrôle quotidien du poids, l’implantation des puces RFID, et les manipulations de l’animal correspondantes qui peuvent entraîner des nuisances et des effets indésirables, telles que du stress, une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les femelles gestantes des lots 1 et 2 (n = 110) seront mises à mort après une ou plusieurs reproductions et les 540 ratons issus de ces femelles seront soumis à partir de l'âge de 3 mois à une chirurgie avec anesthésie profonde sans réveil pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques, puis après mise à mort des prélèvements de tissus sanguins, nerveux, intestinaux et musculaires une fois la session d'enregistrements achevée pour chaque animal.

Remplacement

Le rat est un mammifère dont les mécanismes neurobiologiques mis en oeuvre après une une hypoxie-ischémie intra-utérine ou une restriction de mouvements au cours du développement sont proches de celui de l’humain. Ces mécanismes ne peuvent être étudiés sur des cultures cellulaires ou in silico, mais uniquement sur un modèle animal vivant, pas de remplacement possible en l’état.

Réduction

Réduire le nombre d’animaux. Autant que possible, ce sont les mêmes animaux qui sont engagés dans les différents tests sensorimoteurs et comportementaux, ainsi que dans les analyses électrophysiologiques et neuro-anatomiques des réseaux neuronaux correspondants. Le nombre d'animaux a été réduit au maximum (n = 15 animaux max. par groupe expérimental) tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisants (différences statistiquement observables entre les animaux expérimentaux, traités et les animaux contrôles). Nous chercherons notamment à réduire le nombre de femelles gestantes nécessaires à produire les ratons hypotrophes du lot 1 (hypoperfusion intra-utérine ou MIUH) et si c'est possible se limiter à 10-12 animaux par groupe lorsque les bornes de significativité sont atteintes, en utilisant des tests paramétriques (ANOVAS à mesures répétées avec 1 ou 2 facteurs indépendants) et non-paramétriques (Tests de Wilcoxon, Kruskal-Wallis ou Mann-Whitney) selon la distribution des résultats.

Raffinement

Dans tous les cas, les procédures expérimentales seront réalisées en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux, et en étant particulièrement vigilant sur le bien être et les points limites. Des points limites sont établis afin de réduire toute source d'angoisse et de souffrance et d'assurer le bien être animal. Le suivi des points limites et l'observation régulière de l'état général des rats dès la naissance permettent d'arrêter à tout moment l'expérience pour éviter l'angoisse et la souffrance de l'animal (voir Annexe 2 pour les détails des observations et interventions adaptées). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, 2 à 3 animaux sont regroupés par cage pour un enrichissement social et disposent de nourriture, d’eau ad libitum et d’objets pour compléter l’enrichissement dans les conditions standard. Nous nous efforçons à chaque instant d’affiner nos procédures afin de garantir le bien être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés, notamment une relaxation des animaux par manipulation avant, pendant et après tout prélèvement, intervention et test comportemental. Les analgésiques et anesthésiques utilisés sont adaptés aux expérimentations et conformes à la législation en vigueur.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l’accès in vivo aux modifications d’activité neuronale dans l’encéphale et la moelle épinière dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail expérimental sur l’animal entier et vivant anesthésié. Nous utilisons des rats Sprague-Dawley jeunes et adultes, mâles et femelles car nous ne pouvons pas effectuer l'hypoperfusion intra-utérine (MIUH) chez la souris, un modèle bien trop petit et délicat, ni la restriction sensorimotrice au cours du développement chez la souris, car les souris femelles allaitantes éliminent leurs souriceaux à la suite de telles manipulations. Les rates sont bien plus conservatrices et protectrices avec leur progéniture que les souris qui tendent à éliminer plus facilement leur progéniture. D'autre part, les microchirurgies (ex: sténose par pose de micrcoils) et les enregistrements électrophysiologiques ne peuvent être conduits chez la souris, car modèle trop réduit en taille et trop fragile, comparativement au rat qui est définitivement le meilleur choix dans notre cas. Comme cette étude porte sur le neurodéveloppement structurel et fonctionnel après expérimentation prénatale (Lot 1 = MIUH: sténose jour embryonnaire 17) ou postnatale (lot 2 = SMR de la naissance au sevrage: 1 mois), nous effectuons des traitements pré- et postnataux (1 semaine avant la naissance au sevrage), des tests fonctionnels sensorimoteurs et comportementaux étalés de la naissance à l'âge adulte, des prélèvements sanguins à 1 et 2 mois, et enfin une analyse électrophysiologique finale à partir de 3 mois, suivie de prélèvements des tissus sanguin, nerveux et musculaires une fois l'animal mort.