Recherche appliquée

10 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie cardiaque à cœur ouvert d'environ cinq heures pour l'implantation d'une valve en textile, puis est tuée au plus tard six mois après afin de récupérer l'implant. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie, d'infection, de pneumothorax voire de mort liés à la thoracotomie et à l'anesthésie. Il affirme que le modèle ovin est "le seul" reconnu pour l'étude des prothèses de valves cardiaques et qu'aucune méthode in vitro ne le remplace.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans le cadre de l'optimisation des implantations de valves cardiaques par chirurgie miniinvasive. Ce type de chirurgie, qui est moins lourde et plus confortable pour le patient, concerne en effet plus de 50% des remplacements valvulaires aujourd'hui. Cependant les valves biologiques utilisées aujourd'hui dans le cadre de cette procédure subissent des contraintes spécifiques qui tendent à dégrader les feuillets de la valve. Ces dégradations qui ne sont pas forcément apparentes au moment de l'implantation, peuvent mettre en péril la durée de vie de l'implant. Le phénomène est particulièrement critique chez les patients jeunes pour lesquels le matériau doit être durable. Le projet a pour objectif d'étudier le potentiel du matériau textile (polyester) comme candidat au remplacement du matériau biologique pour fabriquer des valves synthétiques plus durables pour la procédure transcathéter. La souplesse du textile favoriserait en particulier le pliage de la valve au moment de l’implantation. Des essais in vivo préliminaires réalisés sur le modèle animal de la brebis à partir de 2016 avait mis en évidence que la valve textile reste fonctionnelle à 6 mois, avec cependant une tendance à la rigidification du matériau. Il s'agit maintenant de tester une nouvelle structure textile plus à même de rester souple sur le long terme dans le but d'optimiser la durée de vie de l’implant.

Bénéfices attendus

Les essais in vivo devraient permettre de valider l'hypothese avancée: un textile monofilamentaire hydrophile en surface permet de limiter à la fois la calcification et le développement de la fibrose sur la valve obtenue à partir de ce textile en position mitrale.

Procédures

Les animaux subissent une intervention chirurgicale en chirurgie ouverte dans le cadre d'un remplacement valvulaire. La procedure se deroule sur une matinee (en incluant la mise en place). 10 animaux sont inclus dans l'etude. La durée prévue de l'intervention est de 5h de l’induction au réveil complet de l’animal.

Impact sur les animaux

Pas d'effet indésirable relatif à la biocompatibilité du matériau identifié. Le polyester utilisé est largement biocompatible. Les effets indésirables sont ceux liés à la chirurgie (infection de la plaie, diminution de la fréquence cardiaque/arrêt cardiaque) ainsi que ceux liés à l’anesthésie (allergie à un des médicaments, difficulté au réveil et à l’extubation). Certains effets peuvent être liés aux complications inhérentes à la thoracotomie: fistule bronchopleurale, hémorragie, infection, pneumothorax, douleur voire mort de l'animal. La durée prévue de l'intervention est de 5h de l’induction au réveil complet de l’animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à 6 mois au plus tard. Ils ne peuvent pas être réutilisés ni replacés ni adoptés car la valve implantée doit être récupérée pour analyse.

Remplacement

Les resultats attendus ne peuvent pas etre obtenus autrement que par la voie de l'implantation animale (ni in silico ni in vitro). En effet les mecanismes lies a la calcification et a l'encapsulation d'un implant par de la fibrose sont complexes et multifactoriels donc difficiles a reproduire in vitro.

Réduction

Dans une approche préliminaire, seulement 2 animaux (brebis) seront considerees. Il s'agit d'un nombre minimal qui permet de reproduire 2 fois la meme configuration tout en limitant les essais. En fonction des résultats obtenus, ce nombre pourra ensuite être augmenté juqsu'à 10 maximum poru confirmer la tendance. Malgre le faible nombre global d'animaux utilisés, il sera quand même possible de tirer des conclusions etant donne que des resultats ont deja ete obtenus avec d'autres textiles par le passe. Il sera de fait possible de comparer les comportements obtenus dans le cadre du present projet avec les resultats precedents.

Raffinement

Le Laboratoire où ont lieu les implantations animales est largement reconnu comme un laboratoire où tout est mis en œuvre afin que les contraintes subies par les animaux soient minimales et que leur bien-être soit préservé au mieux. Les animaux sont évalués quotidiennement ou 2 fois par jour et recevront un traitement approprié. S’ils ressentent des signes de souffrance, ils recevront un analgésique par voie intra-musculaire. La souffrance est prise en charge par l’utilisation de points limites précis et adaptés , un arbre décisionnel, et des critères d’arrêt des souffrances

Choix des espèces

Le modele ovin est le seul modele considere au niveau international comme significatif pour l'etude de protheses de valves cardiaques. En comparaison avec le modele porcin, pourtant tres utilise dans le cadre des chirurgies vaculaire et cardiaque, il apparait que ce dernier ne permet que difficilement de pratiquer l'arret cardiaque et la circulation extra corporelle avec reveil qui est necessaire dans le cadre de ce projet. Brebis de 30kg. Il s'agit de prendre un animal en croissance afin de favoriser l'effet calcification.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont contaminés par gavage au césium-137, reçoivent un antidote, puis passent en cage à métabolisme et en tube de contention pour une spectrométrie, avant le prélèvement de leurs organes. L'étude cale un modèle de contamination interne en vue de tester un décorporant, notamment dans un contexte d'"actes de malveillance". Le porteur affirme que le modèle animal reste "indispensable" pour étudier la rétention du césium, tout en reconnaissant que des méthodes in vitro ont servi en amont.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mettre en place un modèle de contamination interne chez le rat. Il permettra de tester l’efficacité d’un nouvel antidote. Pour être plus efficace que les produits disponibles, cet antidote se présentera sous une autre forme d’administration. Si les résultats obtenus par ce modèle expérimental pilote sont concluants, il sera possible de répondre à des appels à projets en lien avec les actes de malveillance. Si ces études nous permettent de conclure, des études complémentaires seront réalisées pour l’enregistrement et l’obtention d’une nouvelle Autorisation de Mise sur le Marché (AMM).

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à mettre en place un modèle expérimental de contamination interne chez le rat afin de pouvoir tester ultérieurement l’efficacité d’une nouvelle formule de décorporation. Selon les résultats obtenus, nous pourrons compléter ces résultats par des études précliniques nécessaires sur la tolérance. Enfin, si la tolérance attendue est confirmée, nous complèterons par la suite les études nécessaires pour l’obtention d’une nouvelle AMM.

Procédures

Pour l’ensemble des animaux, 40 rats : - gavage à jeun du Cs-137 et de l’antidote oral - injection iv de l’antidote injectable - La collecte des urines et des fèces sera réalisée par passage en cage à métabolisme (durant 24 heures) 4 jours avant contamination puis 24h et 72h après contamination (3 collectes). - Une mesure corps entier par spectrométrie gamma (zooradiamétrie) sera effectuée 4 jours avant contamination, juste après contamination et 24h et 72h après contamination (4 mesures d’environ 20 minutes réalisées en tube à contention après une période d’habituation des animaux).

Impact sur les animaux

Les différentes traitements (injections iv, gavages) peuvent générer du stress dû à la contention et aux interventions pratiquées, un inconfort mineur, une hémorragie ou un hématome ou encore une douleur en cas de geste non maitrisé. Le passage en cages métaboliques peut générer stress et inconfort ; de même pour le passage en tubes à contention. D’après le recul acquis au laboratoire, la contamination à la dose utilisée de Cs-137 ne génère pas de conséquences cliniques notables particulièrement pendant la durée de l’expérimentation (72 heures). L’administration à la dose pharmacologique des 2 produits ne génère pas de conséquence clinique notable chez les animaux. En termes de toxicité, il existe des informations disponibles et publiées sur le Cs-137 et le produit de référence. Des données confidentielles concernant la solution injectable ont en outre été transmises au laboratoire.

Devenir

Le prélèvement des organes sera fait post-mortem (les organes sélectionnés sont des cibles biologiques connues du Cs-137). Les prélèvements concernent tous les animaux du projet

Remplacement

Afin d’étudier la décorporation du Cs-137 et sa rétention au sein d’un organisme biologique complexe, le modèle animal reste indispensable et il n’est pas encore remplaçable totalement par des méthodes alternatives. Cependant des méthodes alternatives (in vitro) ont permis en amont du projet de sélectionner la molécule candidate.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet, une étude statistique a été menée. Le nombre minimum d’animaux pour obtenir une puissance statistique suffisante est de 10 par groupe. Cet effectif nous fournira des résultats statistiquement robustes.

Raffinement

Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées à la procédure réalisée afin de limiter au minimum la souffrance animale, une habituation au système de spectrométrie gamma sera réalisée au cours de la phase d’acclimatation pour limiter le stress généré. Si un des indicateurs du bien-être n’était plus respecté, l’euthanasie pourrait s’avérer nécessaire.

Choix des espèces

Le rat est un modèle d’études précliniques utilisé en contamination interne au Cs-137. Les animaux employés dans cette étude pilote seront âgés de 3 mois (stade adulte). Ils permettront de faire la preuve de concept de l’efficacité du modèle expérimental.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de tamoxifène, des gavages cinq jours sur sept pendant quatre semaines et dix séances d'imagerie sous anesthésie, tout en développant un phénotype d'histiocytose langerhansienne, pour tester des molécules sénolytiques. Le porteur indique que la maladie provoque un inconfort et de possibles contraintes pour les animaux. Il affirme qu'aucune lignée cellulaire n'existe et que le modèle murin est "le seul" permettant d'évaluer de nouveaux traitements de cette maladie de l'enfant.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester in vivo des drogues sénolytiques dans un modèle murin d’histiocytose langerhansienne. L’histiocytose langerhansienne est une maladie relativement rare qui touche essentiellement les enfants et peut atteindre n’importe quel organe. Cette maladie consiste en une accumulation dans divers tissus de cellules de type phagocytes. Les patients atteints d’histiocytose langerhansienne sont traités en première intention par chimiothérapie de façon empirique (traitement qui a été testé dans les années 80). 50% des patients rechutent et sont alors traités par d'autres médicaments . Le traitement jusqu’à présent est donné à vie car la maladie revient dès que ce traitement ciblé est interrompu. Il y a donc à l’heure actuelle des enfants traités depuis plus de 5 ans par vces médicaments , avec une quasi impossibilité de suspendre le traitement mais un risque d’effet secondaire à long terme élevé (notamment cancers secondaires). Il est donc absolument primordial d’essayer de trouver des traitements plus efficaces, avec une durée limitée, permettant une éradication définitive de la maladie.

Bénéfices attendus

La mise en évidence d'un traitement sénolytique efficace chez la souris permettra d'ouvrir la voie à un essai clinique chez l'homme (enfants).

Procédures

Les aminaux seront soumis à des injections de tamoxifène (nombre: 4, durée 1 minute) et à des gavages 5 jours sur 7 pendant 4 semaines, durée 1 minute. L'activité bioluminescente sur les animaux sera évaluée par imagerie, 10 fois, durée 10 minutes, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les souris recevront des traitements par injection, ceci peut entraîner un inconfort ou une douleur transitoire, ou par gavage, ceci peut éventuellement entraîner une irritation de l'oesophage. Les souris auront aussi des séances d'imagerie sous anesthésie générale qui n'ont pas de conséquence a postériori. Les souris vont présenter un phénotype d'histiocytose langerhansienne. Cette maladie bien que moyennement aggressive va entrainer un inconfort et de potentielles contraintes pour les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour analyses post-mortem sur tissus .

Remplacement

Il n'existe pas de lignées cellulaires d'histiocytose langerhansienne. De plus, les cellules de l'histiocytose langerhansienne ont comme caractérique principale l'absence de prolifération. Ainsi au sein des tissus endommagés, elles sont très peu nombreuses. Il n'est donc pas possible de les cultiver ex vivo, ce d'autant qu'elles ne prolifèrent pas in vitro (tout comme in vivo). Cette maladie touche essentiellement les enfants. La chirurgie n'est pas une stratégie de traitement proposé dans l'histiocytose, il est donc impossible de travailler sur des prélèvements humains. Néanmoins, dés que possible nous utiliserons au maximum le sprélèvements humains (sang, moelle et tissus) afin de caractériser plus précisement cette maladie et afin de ne pas faire appel aux modèles in vivo. Néanmoins, le modèle animal qui nous décrivons est à l'heure actuel le seul modèle permettant d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements et premettant de comprendre la physiopathologie de cette maladie.

Réduction

Le nombre de souris sera limité au minimum nécessaire. Comme le phenotype est parfaitement pénétrant et reproductible, un nombre minimal d'animaux par groupe permettra d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Aucun réplicat ne sera réalisé.

Raffinement

Les animaux feront l'objet d'une surveillance quotidienne avec examen clinique. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.. La maladie est lentement progressive comme chez l'homme, et son évolution sera surveillée par imagerie de luminescence, permettant un arrêt précoce si nécessaire. Une anesthésie générale par isoflurane sera réalisée lors de l'imagerie. Les animaux seront hébergés en groupe sociaux dans un environnement enrichi.

Choix des espèces

Génétique proche de celle de l’Homme. Modèle de choix en oncologie préclinique, permettant l'utilisation également de souris génétiquement modifiées: modèles de la maladie et détection de certaines acitivités cellulaires (luminiescence, fluorescence). Animaux jeunes, comme la population de patients.

2 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections quotidiennes pendant un mois, puis sont soumis une fois à une contention forcée d'une à trois heures destinée à provoquer un stress, avant que leurs organes soient prélevés pour des mesures électrophysiologiques. Le porteur présente ce travail comme une prestation pour des "clients" des industries pharmaceutique et biotechnologique évaluant leurs molécules. Il affirme que l'usage de tissus fraîchement prélevés est "nécessaire" car la complexité des réseaux neuronaux ne se reproduit pas in silico.

Objectifs

Les groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour identifier des molécules anti-stress. Pour une meilleure appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). Le développement de modèles rongeurs génétiquement modifié (GM) permettent de créer des mammifères mimant des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soient électrophysiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranches et/ou de cellules isolées de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour ce faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) à l’échelle d’une tranche et le Patch-clamp = un enregistrement à l'échelle du neurone. Nous induirons donc un stress chez le rat et enregistreront l’effet de molécule d’intérêt, soit par une exposition, in vivo, au préalable, ou soit par une exposition, ex vivo, sur nos tranches ou cellules. Nous pourrons alors déterminer les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule dans les mécanismes de stress induit par une contention forcée. Le cas échéant, ils pourront ainsi déterminer si une molécule à des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique réglementaire.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du système nerveux central liées au stress. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aiguë, constitue la meilleure approche car elle permet : - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons), - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de disponibilité dans le système nerveux central et dans la circulation sanguine. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques coûteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Les animaux vigiles seront injectés une fois par jour, au maximum et pendant 3 minutes, pour assurer une exposition in vivo de la molécule à tester. Le protocole est d’un mois. Les contentions répétées nécessaires à ces différentes injections génèrent du stress. Ces animaux traités au préalable peuvent subir ces injections soit par voie orale, soit cutanée ou soit par intrapéritonéale. Ils seront, pour les groupes subissant le stress, exposés, une seule fois entre une et trois heures, au maximum, à une contention qui a pour but de générer du stress que nous cherchons à étudier.

Impact sur les animaux

Notre procédure amène des effets indésirables : *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. ; + effets secondaires potentiels des molécules *-Ce projet a pour but de déclencher du stress par une contention forcée d’une à trois heures, nous permettant l’étude des mécanismes du stress.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort car nous utiliserons les organes pour nos mesures.

Remplacement

Les réactions, après un stimulus générant du stress, sont complexes et mettent en jeu les organes sensoriels, les nerfs sensoriels et une intégration au niveau le système nerveux central, permettant une réaction adaptée. Parce qu’il n’est pas envisageable de réaliser sur l’homme les tests que nous proposons et que la gestion de stress pathologique présente un intérêt de recherche important, nous évaluons et et/ou caractérisons des molécules d’intérêt dans le traitement du stress induit chez le rat. Il nous est nécessaire de réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Et ces réseaux doivent être en situation de stress. Pour cela nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un rat préalablement stressé. De plus, nos techniques nous obligent à l’utilisation de tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Par nos techniques, nous réalisons plusieurs tranches pour une noyau cérébral donné, chaque tranche peut subir un protocole particulier. Nous pouvons, par exemple, à partir d’un même cerveau tester plusieurs concentrations d’un même composé, ou plusieurs composés, ou plusieurs protocoles d’enregistrement, chaque protocole répondant à une question particulière. Alors, notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition, diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses au stimulus stressant dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe. Après la première étape, nous pourrons évaluer la significativité statistique. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en proposant quatre conditions différentes maximum. Si elle est absente, l’étude sera suspendue.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (2 rats adultes/cage). Ils bénéficieront d’enrichissement adapté, deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire. Les animaux utilisés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaires. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Les animaux génétiquement modifiés auront quatre jours d’acclimatation et un mois d’hébergement maximum avant d’entrer dans le projet. Il se fera en groupes sociaux de 2 animaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Toute perte de poids en deçà de la limite préétablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques sur des tests que nous maitrisons, nous avons pu établir un nombre d’animaux par condition d’étude soit 10 animaux contrôles et 10 animaux d’intérêt, nous permettant d’obtenir une bonne significativité, réduisant considérablement le besoin en animaux.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du système nerveux central des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de cette espèce un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de cette espèce, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous travaillerons avec des animaux adultes (minimum 6 semaines d’âge) ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée liée au stress. Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.

624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun jusqu'à treize heures, des gavages, des prélèvements sanguins à la queue avec incision, des injections et une chirurgie de prélèvement en veine porte, et pour certaines seize semaines d'alimentation grasse et sucrée induisant obésité et pré-diabète. À la fin, toutes sont mises à mort par dislocation cervicale pour prélever leurs organes. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne remplace l'animal pour cette "physiologie intégrée" entre intestin, pancréas et foie.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie caractérisée par une hyperglycémie chronique, c'est-à-dire par un taux trop élevé de glucose dans le sang. Cette maladie, qui survient généralement avec l’âge, touche davantage les personnes obèses. Elle se caractérise par une insulino-résistance et une perte progressive des capacités de sécrétion d’insuline par les cellules béta pancréatiques, l’hormone qui régule la glycémie. A l’heure actuelle, les traitements utilisés ciblent soit l’action de l’insuline soit sa sécrétion, alors qu’un ciblage des 2 composantes serait plus efficace. Par conséquent, il est crucial d’identifier de nouveau mécanismes contrôlant simultanément l’action et la sécrétion d’insuline pour mieux réguler l’hyperglycémie des patients diabétiques. Le projet vise à valider un nouveau mécanisme intracellulaire impliqué dans la régulation de la glycémie qui implique un dialogue entre l’intestin, le pancréas et le foie via la sécrétion d’une hormone intestinale appelée GLP1, qui est produite par les cellules intestinales après un repas et qui va réguler l’action et la sécrétion d’insuline. Ainsi, l’objectif est de valider chez la souris ce nouveau mécanisme intracellulaire en l’étudiant de manière concomitante dans l’intestin, le pancréas et le foie afin de définir s’il pourrait constituer à l’avenir une nouvelle piste de traitement préventif et/ou curatif de l’hyperglycémie chez les patients diabétiques.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet de recherche est de valider une nouvelle hypothèse mécanistique impliquée dans le contrôle de la glycémie et de mettre en évidence de futurs moyens de prévention et/ou traitement du diabète de type 2. Si nos hypothèses sont validées chez la souris, nous initierons ensuite des tests chez l’homme et tenterons d’identifier des molécules capables de réguler ce mécanisme intracellulaire.

Procédures

Au cours des 4 procédures décrites dans ce projet, les souris seront soumises à : - des mises à jeun (1 à 3 selon les procédures) d’une durée de 6h30 à 13h maximum. - un gavage unique sur animal vigile (durée: 30 secondes) - des prélèvements sanguins de petits volumes (entre 2 et 6 selon les procédures) à la queue des souris pour les mesures de glycémie et d’insuline, associés à une incision unique de la queue puis un grattage du coagulum pour les prélèvements successifs. - des injections (1 à 2 selon les procédures) sur animal vigile lors des tests métaboliques (durée: 30 secondes). - une chirurgie associée à une analgésie 30 minutes avant l’anesthésie générale afin de réaliser un prélèvement sanguin en veine porte. - une alimentation riche en graisse et en sucre durant 16 semaines consécutives qui va induire une prise de poids des souris sans altérer leur mobilité.

Impact sur les animaux

- une prostration, la présence de sang dans la canule ou un gonflement de l’œsophage potentiel suite au gavage. - une sensation de faim et une hypoglycémie suite à la mise à jeun de 12-13h. Ces modifications physiologiques peuvent donc être responsable d’un stress chez l’animal et d’une baisse d’activité les conduisant à nicher dans leur nid. - une douleur transitoire au point d’injection lors des injections au cours des tests métaboliques. - Une hyperglycémie transitoire au cours des test métaboliques. Ces variations de glycémie sont des réponses physiologiques transitoires qui n’affectent pas l’état général des souris. L’hyperglycémie provoquée lors des tests revient à la normale au bout de 90 minutes. - une obésité liée à l’alimentation riche en lipides et en sucrose et un pré-diabète associé à une hyperglycémie modérée. Nos études préalables démontrent que leur prise de poids ne les empêche pas de se mouvoir dans la cage et d’accéder et la mangeoire et que leur pré-diabète ne modifie pas de manière majeure leur prise hydrique ni leur besoin d’uriner.

Devenir

A la fin des procédures, toutes les souris seront mises à mort par dislocation cervicale pour le prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

Ce projet vient compléter des données déjà obtenues in vitro dans des lignées cellulaires de chacun des tissus d’intérêt (colon, foie et pancréas). Néanmoins il s’agit ici d’aller plus loin et de montrer qu’il y a une co-régulation de notre nouveau mécanisme intracellulaire dans ces 3 organes suite à un repas et que cela est nécessaire pour un contrôle optimal de la glycémie. Il s’agit donc d’un projet de physiologie intégrée où aucune alternative non animale n’est disponible. D’autre part, on veut également déterminer si ce nouveau mécanisme physiologique est dépendant ou pas du sexe, et ce paramètre n’est pas analysable autrement que sur animal.

Réduction

Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, nous allons comparer différents traitements en même temps afin de n’avoir qu’un groupe de souris contrôle. Le nombre de souris est calculé au plus juste tout en offrant la puissance statistique nécessaire pour l’interprétation des résultats scientifiques. Les paramètres mesurés étant très variables d’une souris à l’autre, un nombre minimal de 12 souris par groupe est nécessaire. Nous envisageons de potentiellement répéter une fois les procédures afin de compléter les études si nécessaires (soit 24 souris/groupe au maximum en final).

Raffinement

Les souris sont surveillées individuellement 3 fois/semaine et nous utilisons des points limites adaptés à nos procédures. Les gavages seront réalisés par une personne expérimentée à l’aide d’une sonde de gavage adaptée à la taille des souris. Pour les souris soumises à une alimentation riche en lipides et en sucrose, le nombre de souris par cage est diminué pour qu’elles aient suffisamment de place pour se mouvoir. L’alimentation hypercalorique va induire une prise de poids qui ne gêne pas la motricité des souris qui peuvent toujours accéder à la mangeoire. Néanmoins, des croquettes seront rajoutées dans la litière. Pour les prélèvements en veine porte qui nécessite une chirurgie, les animaux sont analgésiés 30 minutes avant d’être anesthésiées.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car leur physiologie est « proche » de l’homme pour le contrôle de la glycémie. Selon les procédures, nous utiliserons soit des souris adultes de 10-12 semaines qui ont terminé leur croissance et ont un poids compatible pour la contention, les gavages et prélèvements sanguins, soit des souris de 5 semaines quand il s’agit de les nourrir avec une alimentation riche en graisse et sucre, dont les effets métaboliques sont plus marqués si débutée rapidement après le sevrage.

1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections vaccinales répétées et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire, geste pouvant provoquer des douleurs oculaires et des lésions de l'œil. Une société privée teste des candidats vaccins contre les allergies et affirme qu'aucune méthode in silico, in vitro ou ex vivo ne permet de mesurer la production d'anticorps neutralisants. Elle justifie de tuer toutes les souris par leur "mémoire" immunitaire les rendant inutilisables pour de nouvelles vaccinations.

Objectifs

Les allergies sont aujourd’hui un problème de santé publique. Ces affections très répandues, particulièrement dans les pays développés, touchent 25 % de la population européenne. Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire qui devient hypersensible à des substances généralement inoffensives. Ceci se traduit par la dérégulation de certaines cytokines et conduit à l’apparition de la pathologie chez l’individu. Ce projet s’inscrit dans le cadre de développement de vaccins contre les allergies. Au sein de notre société, nous avons développé une stratégie de vaccination qui permet de produire, chez le patient, des anticorps contre la cytokine sur-exprimée. Ce vaccin appelé ‘Kinoïde™’ peut se présenter soit sous forme de proteine, soit sous forme d’un acide ribonucleique messager (ARNm). Il n’existe pas à ce jour de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à un vaccin, ce qui nous contraint à les tester chez la souris. L’efficacité du vaccin sera évaluée selon sa capacité à induire une réponse immunitaire capable de bloquer l’activité biologique de la cytokine. Dans le cadre de ce développement, nous devons sélectionner le meilleur candidat vaccin qui induira une réponse immunitaire efficace et de longue durée chez la souris. Pour cela, nous devons dans un premier temps tester plusieurs paramètres spécifiques à chaque vaccin. Nous allons ainsi tester un nombre croissant de doses de vaccin (en deux et trois injections), plusieurs formulations vaccinales ainsi que deux voies d’administration (intramusculaire et souscutanée). Ces études permettront de valider et de sélectionner le vaccin induisant la meilleure réponse immunitaire. Dans un second temps, nous confirmerons l’efficacité du vaccin grâce à des modèles expérimentaux d’allergies développés chez la souris. Une fois l’effet thérapeutique démontré, le vaccin entamera les étapes de fabrication en vue des phases cliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à définir les meilleures conditions d’immunisation, à savoir, la dose de vaccin à injecter, la voie d’administration et le schéma d’immunisation et de prélèvements des vaccins kinoides développés dans notre laboratoire. Les candidats vaccins sélectionnés seront ensuite évalués pour leur efficacité dans des modèles expérimentaux d’allergies developpés chez la souris et à plus long terme chez l'Homme.

Procédures

1) Administration du vaccin : L'injection du vaccin est réalisée sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes soit par voie intramusculaire soit par voie sous-cutanée. Les animaux recevront soit deux injections de vaccin (aux jours 0 et 21) soit trois injections de vaccin (aux jours 0, 7 et 28). Il a déjà été démontré dans la littérature que pour obtenir une réponse immunitaire efficaces 2 ou 3 injections de vaccins étaient nécessaires. 2)Prélèvement sanguin: Les animaux sont anésthésiés à l'isoflurane pendant 5min. Ensuite, le prélévement de sang est réalisé en moins de 30 secondes. Les animaux subiront soit trois prélèvements (aux jours -7, 38 et 58) soit sept prélèvements (aux jours -7, 21, à mois 2, à mois 3, à mois 6, à mois 9 et à mois 12).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des oedèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection par voie intramusculaire se faisant dans le muscle de la patte arrière, une douleur musculaire localisée pourra être détectée quand l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’oeil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'oeil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

L'ensemble des animaux (1040) seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, celles-ci conserveront une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire.

Remplacement

L'étude de l'immunogénicité de nos candidats repose sur la mesure de la production d'anticorps neutralisant après immunisation. La production d'anticorps suite à l'injection d'un vaccin nécessite la mise en place de nombreux processus biologiques et le recrutement de divers types cellulaires. Il n’existe pas à ce jour de méthode in silico, in vitro ou ex vivo permettant de mimer ce contexte biologique et d'induire une production d'anticorps neutralisants.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, les différents groupes seront composés de 10 animaux qui le nombre minimal afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. De plus, afin de ne pas multiplier le nombre d'animaux, nous n'utiliserons que des souris femelles pour la recherche du meilleur candidat vaccin et l'optimisation du schéma vaccinal. Seul le meilleur candidat et le meilleur schéma vaccinal sera testé chez le mâle afin de les valider.

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours), avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter leur angoisse. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections, réalisées en intramusculaire et en sous-cutanée et les prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse, ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, l'administration d'antalgiques est prévue si l’animal présenté un signe de souffrance. Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (tunnel + coton) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adulte, c’est-à-dire de 7 semaines, soit environ 20-25g. En effet, nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature pour tenir compte de la réponse humorale.