Recherche appliquée

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection d'azoxyméthane, un cancérogène, puis sont nourris de charcuteries testées et placés en cage à métabolisme pendant 48 heures. Le porteur indique que l'étude s'arrête au stade des lésions précancéreuses microscopiques et qu'aucune douleur n'est attendue. Tous les rats sont tués pour prélever le côlon et le sang, afin de comparer l'effet des nitrites et d'antioxydants sur le risque de cancer.

Objectifs

La consommation de charcuteries est associée à une augmentation du risque de cancer du côlon. Sur la base de données épidémiologiques (données issues de questionnaires de volontaires humains et de santé humaine), l’organisation mondiale de la santé (OMS) a classé la charcuterie comme cancérigène avéré pour l’Homme (Classe I). Ces données ont été consolidées par des études expérimentales à l’aide de modèles animaux (rats et souris). Les mécanismes mis en jeu impliquent la production de composés toxiques par la présence de lipide dans l’alimentation et de constituants de la charcuterie tel que le rouge de la viande (fer héminique) et les nitrites ajoutés. Des travaux précédents ont démontré que les antioxydants dans le régime ou ajoutés dans la charcuterie peuvent limiter l’effet néfaste des viandes dont les charcuteries. De plus, ces travaux ont permis d’observer un déséquilibre de la flore intestinale chez le rat comparable à celle observée pendant la cancérogenèse colique. Nous proposons de modifier la production des charcuteries pour limiter le risque de cancer du côlon associé à leur consommation. Nous évaluerons l’effet d’un régime riche en charcuteries et de régimes riches en charcuteries modifiées (réduction de concentration en sel nitrité ou ajout d’antioxydant) sur la formation des composés toxiques, l’inflammation, le microbiote intestinal et la promotion de la carcinogenèse colorectale au stade très précoce. Dans ce projet, nous proposons une procédure où 192 rats Fisher 344 mâles seront nourris avec un régime contenant de la charcuterie modèle type jambon cuit et type saucisson pendant 100 jours. Leur urine et leur fèces seront récupérés séparément et leur côlon post mortem sera prélevé à la fin de l’expérimentation. Ces échantillons permettront des mesures des produits d’oxydation des lipides, de l’inflammation, du microbiote, de marqueurs de la promotion de la cancérogenèse colique et des analyses pour la compréhension mécanistique au niveau du tissu colique.

Bénéfices attendus

Nous proposons d'évaluer des indicateurs de la cancérogenèse précoce tels que le microbiote, son déséquilibre, l'inflammation, la formation de composés toxiques et les lésions précancéreuses coliques (lésions à l'échelle cellulaire). Ce projet nous permettra de comparer différentes charcuteries selon qu’elles contiennent autant de nitrite ou moins que celles du marché ou encore selon qu’elles contiennent des antioxydants ou non.

Procédures

Une injection en intrapéritonéale durant 30 secondes / Tatouage d’identification durant 5 secondes / Passage en cage à métabolisme durant 48h précédé de 3h d'habituation / Aucun prélèvement invasif n'est prévu sur les animaux, seulement la récupération des urines et des fèces, sans contention de l'animal

Impact sur les animaux

Injection d'azoxyméthane en intrapéritonéale : douleur contrôlée / Tatouage : douleur contrôlée (un seul point de tatouage à une oreille) / Passage en cage à métabolisme durant 48h précédé de 3h d'habituation : stress contrôlé / les prélèvements de fèces et urines se font sans contention et l'étude est arrêtée au stade des lésions prénéoplasiques dites précancéreuses microscopiques qui ne concernent que quelques cryptes intestinales et ne provoquent pas de douleur : pas de douleur attendue / les charcuteries ont pour majorité été testées lors d'autres études sur ce modèle rat sans observation de modification sanitaire, les antioxydants ont été testés in-vitro et sélectionnés en fonction de leur non toxicité sur les cellules : pas d’effets indésirables attendus. Cependant les animaux sont continuellement surveillés à l'aide d'une fiche de suivi (sanitaire et comportement) construite spécifiquement pour le rat F344 mâle utilisé dans cette étude (sous couvert de la SBEA qui l'a validée).

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin que le côlon et le sang soient prélevés pour analyses.

Remplacement

Les antioxydants choisis pour ce projet sont testés au préalable pour qu’ils soient efficaces au niveau de leur capacité anti effet du nitrite, antioxydante et au niveau organoleptique (couleur et goût acceptable pour le consommateur). Cependant, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de ces composés, sur la physiologie et le métabolisme d'un organisme entier. L'utilisation d'animaux permet de mesurer et/ou d’examiner des atteintes dans les voies intestinales et coliques (inflammation, atteinte tissulaire). Seule une approche in vivo permet de prendre en compte la complexité de l'épithélium colique sur la physiologie intestinale et leurs rôles dans l'inflammation et l'apparition de dommages à l'ADN dans l'épithélium ainsi que les modifications possibles du microbiote intestinal.

Réduction

Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, leur nombre a été limité au maximum (n=12 animaux/lot). Lors d’expérimentations précédentes conduites sur ce même format et confirmé par un calcul de test de puissance statistique (paramètre suivi : nombre ACF (Aberrant Crypt Foci), un nombre de 12 rats par groupe a été déterminé pour mettre en évidence une modulation significative de la carcinogenèse.

Raffinement

Les animaux auront 5 jours d'acclimatation à leur arrivée de J-12 à J-7. La nourriture, expérimentale et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière sera réalisé 1 fois par semaine au moins. Les animaux seront suivis et surveillés quotidiennement à l'aide d'une fiche de suivi sanitaire (spécifique à cet animal et à cette étude ; validée par la SBEA). Pour ne pas souffrir d'isolement, les rats seront maintenus à 2 par cage (cage conventionnelle). Elles contiendront un enrichissement. Les animaux seront hébergés dans des cages à métabolisme individuelle pendant 48h (J70) précédées de 3h d'habituation (recueil des fèces et urines séparées). Les animaux seront euthanasiés en fin d’étude par 2 (même cage conventionnelle) et dans une salle différente de la salle d’hébergement (stress contrôlé).

Choix des espèces

Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi sur des approches expérimentales in vivo qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus utilisé est le rat chimio-induit (par injection intrapéritonéale d’azoxyméthane) qui a l’avantage de présenter une évolution cellulaire vers le cancer colorectal du tissu colique comparable à la situation humaine. Le rat F344 chimio-induit est un bon modèle pour étudier la modulation des biomarqueurs urinaires, fécaux et coliques associés à l’effet promoteur de l’hème des charcuteries sur une durée de 100 jours. Les mâles adultes sont privilégiés pour analyser le développement des pathologies à l’âge adulte afin d’éviter les effets hormonaux liés aux cycles de la femelle (observés sur l’inflammation et carcinogenèse). L'ensemble des études précédentes ont été menées sur des rats adultes dont la fonction digestive est totalement fonctionnelle. Afin de rester en accord avec ces résultats précédents, il est important de rester au même stade de développement.

10 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un dispositif destiné à remplacer la chirurgie de l'obésité leur est implanté par chirurgie abdominale de deux à trois heures, suivie d'examens radiographiques, de prélèvements sanguins et d'une endoscopie sur un mois. Le porteur décrit des douleurs postopératoires et une série de complications possibles, lésions digestives, infection, obstruction ou déplacement du dispositif. Tous les animaux sont tués à la fin pour inspecter et prélever les organes autour du dispositif, le porteur invoquant la proximité du système digestif du cochon avec celui de l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est de développer un dispositif médical qui serait une alternative à la chirurgie bariatrique (traitant l'obésité) : la solution serait simple, au moins aussi efficace que la chirurgie et minimisant les complications associées, délivrée par la bouche (en endoscopie) et placée dans le tube digestif. Le traitement de l’obésité est un enjeu important de la santé dans le monde. C’est pourquoi trouver une solution aussi efficace et moins invasive que la chirurgie pour le patient permettra une baisse du taux d’obésité. Afin de mener à bien ce projet, l’approche suivante est à l’étude : la première partie de l’intestin grêle est recouverte d’un revêtement non-perméable (la chaussette) qui empêche le mélange gastrique d’être absorbé par les muqueuses intestinales. Cette chaussette a un point d’ancrage entre l’estomac et l’intestin (le pylore). Une première phase de test a été réalisée sur un modèle in vitro. Cette phase animale (tests in vivo) a pour objectif de développer un dispositif avec la simulation des phénomènes physiologiques attendus chez les patients humains : nous testerons dans un premier temps la sécurité en se limitant au positionnement directement dans la région de l’estomac. Cela nous permettra de collecter des données d’utilisation, de prouver l’absence de dangerosité du dispositif et potentiellement de performances (ralentissement de la vidange gastrique) sur l’approche mentionnée ci-dessus.

Bénéfices attendus

L’obésité est définie comme une présence anormale ou excessive de tissu adipeux représentant un risque pour la santé. Ce problème est devenu épidémique avec près de 4 millions de personnes décédant de comorbidités liées au surpoids et à l’obésité chaque année. D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, près de 39 % des adultes dans le monde, représentant près de 1,9 milliards de personnes, étaient en surpoids en 2016. On estime aujourd’hui que plus de 700 millions de personnes souffrent d’obésité. Bien que l’efficacité de la chirurgie qui traite l’obésité (bariatrique) ne soit plus à démontrer, seul 1 % des patients éligibles décident de se faire opérer à cause du risque de complications sévères et des modifications anatomiques irréversibles. Et pour les solutions moins invasives, comme les ballons gastriques, elles sont aujourd’hui associées à une perte de poids limitée et temporaire. Ce projet est nécessaire pour le développement d’une solution endoscopique afin de traiter l’obésité de manière aussi efficace que la chirurgie bariatrique tout en minimisant les complications associées. En effet, il permettra de vérifier la sécurité et potentiellement l’efficacité des dispositifs testés.

Procédures

Pour chaque porc et mini-porc : • implantation du dispositif par chirurgie abdominale sous anesthésie générale (2-3 h), 1 fois au total • Pour chaque session de suivi (J2, J7, J15 et J30) sous anesthésie générale : o Réalisation d’un examen radiographique prenant 45 min, soit 4 au total o Réalisation de prélèvement sanguin prenant environ 2-3 min, soit 4 au total o L’examen endoscopique (camera passant par la bouche permettent de visualiser le dispositif +muqueuse de l’estomac) n’est réalisée que pour le suivi à J30 et prend 30 min, 1 fois au total.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus résident surtout dans la douleur suite au placement du dispositif. Néanmoins, la littérature décrit une série de complications éventuelles : • Lésion du système digestif • Infection avec ou sans fièvre ; • Complications associées aux interventions par endoscopie ; • Obstruction gastrique ou intestinale ; • Déplacement ou rotation du dispositif implanté ; • Carence en vitamines et minéraux ; • Trouble du transit ; • Réaction inflammatoire locale des tissus ; Notre protocole prévoit de surveiller et anticiper ces complications.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Pour comprendre l’impact du prototype et statuer sur sa sécurité, il est nécessaire d’inspecter, d’examiner et photographier les zones entourant le dispositif incluant les muqueuses et les organes. Suivant le déroulé de l'étude, des prélèvements d’organes pourront être effectués (duodénum et autres organes), pour observations macroscopiques et analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet vise à confirmer l’adéquation du dispositif en cours de développement avec le système digestif. Avant d’initier ce projet, des essais sur cadavres humains et sur carcasses d’animaux ont été effectués afin de simuler la procédure et confirmer l’adéquation des dimensions sélectionnées pour les prototypes en cours de développement De plus, des essais in vitro ont été réalisés en laboratoire afin de simuler le déploiement du dispositif ainsi que son comportement lors de contraintes mécaniques simulant le péristaltisme. Des premiers essais pour valider la sécurité ont été menés sur animaux vivants. Les tests de cette présente demande d'autorisation de projet s’inscrivent dans la continuité de ces tests en évaluant de nouveaux prototypes. Néanmoins, la complexité et l’adaptabilité du système digestif limitent notre capacité à simuler l’environnement exact. Le dispositif étant à visée clinique, il est nécessaire d’obtenir des données dans ses conditions réelles d’utilisation, ainsi l'utilisation d'un organisme complet et vivant est indispensable notamment pour le suivi post-implantation. Notre stratégie prévoit d’utiliser un maximum de 10 porcs ou mini-porcs pour la totalité du projet (phase de preuve de concept). Nous fonctionnons pas à pas, et le projet sera arrêté si chaque session ne permet pas d’obtenir les résultats escomptés.

Réduction

Avant d’effectuer cette étude de preuve de concept, plusieurs études incluant une étude pilote ont été réalisées en utilisant un nombre réduit d’animaux. Ces études précédemment réalisées nous ont permis d’obtenir des estimations de l'effet et de la variation qui peuvent servir à calculer la taille de l'échantillon d'études plus importantes. Cette phase de preuve de concept sera effectuée en utilisant un nombre réduit d’animaux jusqu’à la preuve de concept démontrée. Après chaque étude, la décision sera prise de: • passer à la phase suivante (nécessitant une nouvelle demande de projet), si le dispositif est bien toléré et les données obtenues sont concluantes, notamment : paramètres cliniques acceptables, tolérances locales macroscopique et microscopique acceptables, troubles digestifs acceptables, absence d’obstruction gastrique, absence de déplacement significatif du dispositif médical implanté. OU • relancer une étude afin d’améliorer les caractéristiques du dispositif, si celui-ci ne répond pas aux attentes. Cette étape permettra de réduire le nombre d’animaux utilisé jusqu’à démontrer la preuve de concept.

Raffinement

Porcs/mini-porcs seront hébergés sur litière en copeaux afin de leur permettre d’exprimer leur comportement de fouissage (besoin éthologique propres à l’espèce). Des enrichissements du milieu (jouets en caoutchouc) sont mis à disposition pendant l'étude (incluant la période de mise à jeun pré-chirurgicale). Les animaux auront un patch de fentanyl 3 jours après la chirurgie, ce qui nécessitera un isolement temporaire individuel afin qu’ils ne puissent pas se l’arracher entre eux, voire l’ingérer et risquer une overdose. Pour compenser cet isolement, les animaux seront hébergés dans des box attenants avec contact olfactif et visuel et la température de la salle d’hébergement sera augmentée à 21± 2°C (au lieu de 19°C). Les porcs sont ensuite replacés ensemble pour le reste de l'étude. Les animaux suivront aussi un programme de socialisation : en plus du contact avec leurs congénères, un contact quotidien avec l'humain permettra de les habituer et réduire le stress lors de manipulation/geste technique. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité à travailler avec ces animaux. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation/anesthésie (locale ou générale selon les besoins). La douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés: AINS et/ou morphiniques. En cas de perte de poids importante se rapprochant des 20 %, les rations pourront être enrichies avec une solution de nutrition entérale hyperénergétique. Pour tous, les laparotomies seront systématiquement effectuées sous anesthésie, avec une analgésie per-opératoire et une analgésie post-opératoire. Au cours de l’étude, une série d’examens sera effectuée afin de détecter les signes de douleur.

Choix des espèces

Le Porc est l’espèce animale la plus étudiée dans la littérature pour la chirurgie bariatrique. En effet, elle possède de grandes similarités avec les humains au niveau du système gastro-intestinal en termes de dimensions et de physiologie. Nous utiliserons également le modèle mini-porc qui, contrairement aux porcs fermiers qui sont souvent pris en charge jeunes et donc grandissent jusqu’à des poids et tailles importantes, sont étudiés adultes : leur poids dépassera rarement 70-80 kg et permettra une gestion plus facile si l’étude se poursuit après 1 mois. Ainsi en fonction du dispositif testé, le modèle animal qui sera choisi sera celui qui, par son âge lié à son évolution de poids, sera le plus approprié. Pour les porcs et mini-porcs, le critère de sélection principal sera le poids (environ 60-80 kg pour les porcs et 50-70 kg pour les mini-porcs) afin d’avoir des correspondances anatomiques similaires à celles observées en clinique. Cela correspondra à des animaux adolescents (pour les porcs fermiers) et adultes pour les mini-porcs.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire leur est provoquée par instillation quotidienne de chlorure de benzalkonium pendant sept jours, puis leur douleur est mesurée en appliquant une pression croissante près de l'œil jusqu'au clignement, une gêne que le porteur indique ne pas pouvoir soulager par analgésiques "puisque c'est ce paramètre que nous évaluerons". L'étude porte sur le rôle de canaux ioniques dans la douleur oculaire. Le porteur affirme que ce syndrome multifactoriel "ne peut être remplacé" par des modèles in vitro et exige un organisme entier.

Objectifs

La sécheresse oculaire est l'un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez les sujets de plus de 50 ans. La pathologie peut se déclarer chez des sujets plus jeunes en cas de maladie auto-immune, de pollution environnementale, de prise médicamenteuse répétée, après une chirurgie de la cornée ou suite à l'usage intensif des écrans. En conséquence, la prévalence de la sécheresse oculaire est grandissante. Les symptômes regroupent des troubles visuels et des douleurs d’intensité variable qui peuvent devenir chroniques. Les patients se plaignent également d’une sensibilité accrue à la lumière. La sécheresse oculaire est difficile à traiter et ses mécanismes physiopathologiques sont peu connus. Ce constat impose un approfondissement de nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la douleur oculaire. Des mutations dans les gènes codant des transporteurs de potassium appelés K2P sont à l'origine de douleur chez les patients humains et chez les rongeurs (exemple: migraine). Leur fonction dans l'oeil n'a pas encore été caractérisée. Nous disposons 1) de différents modèles de souris dans lesquels les K2P sont absents, et 2) de molécules analgésiques mises au point pour moduler l'activité des K2P. Nous souhaitons combiner ces outils pour caractériser le phénotype oculaire de ces animaux et déterminer l'effet thérapeutique de ces molécules dans la physiopathologie de l'oeil. L'étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée les conséquences d'un traitement de la pathologie oculaire. Ce projet utilisera au maximum 1080 souris. Grâce à nos études préalables in vitro, nous connaissons le mode d'action de ces transporteurs (remplacement). Le recours aux séances d'habituation et à l'anesthésie gazeuse légère et rapide permet de limiter le stress des souris (raffinement). Les prévisions obtenues avec les logiciels statistiques nous permettent d'anticiper le nombre maximal de souris pour obtenir des résultats significatifs et nous réduirons ce nombre en cours de projet dès que nos données seront suffisamment robustes (réduction).

Bénéfices attendus

La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique pouvant être accompagnée de troubles de la vision, de photoallodynie (sensibilité accrue à la lumière) et de dommages de la surface oculaire, et elle représente l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. C’est le plus important signe d’alerte en réaction à une inflammation ou à un traumatisme des structures du segment antérieur de l’oeil (cornée, conjonctive, sclère et structures uvéales). Elle affecte la qualité de la vie et près de 60 % des patients se déclarent gênés dans leurs activités quotidiennes. En outre, 80 % des patients qui souffrent de douleur oculaire ne l’estiment pas suffisamment prise en considération tant par leur entourage que par leur médecin. La douleur chronique oculaire est très difficile à traiter et les mécanismes physiopathologiques, de nature neurogène et/ou inflammatoire, demeurent de nos jours très mal connus. Les traitements actuels sont invasifs, peu efficaces et diminuent la qualité de vie des patients. De ce fait, la sécheresse oculaire est considérée comme un désert thérapeutique malgré son incidence grandissante liée au vieillissement global de la population, l’augmentation du recours à la chirurgie réfractive, l’usage des écrans et la pollution environnementale. Le projet que nous souhaitons développer permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de cette pathologie et éventuellement de proposer une stratégie thérapeutique nouvelle si ce projet donne les résultats escomptés. Les bénéfices suceptibles de découler de ce projet sont une avancée significative dans la prise en charge de la sécheresse oculaire.

Procédures

La procédure 1 dure 2X 1 semaine maximum (à 3 mois et à 12 mois environ), la procédure 2 dure 2 semaines maximum. Dans chaque procédure, la mesure du volume des larmes dure 5 minutes (coton au coin de l’œil); la mesure de la stabilité des larmes dure 10 minutes (anesthésie à l’isoflurane, puis administration d’une goutte de fluorescéine). La mesure de la douleur oculaire par un test qui consiste à appliquer une pression croissante sur la zone péri-orbitale et à mesurer la pression (en grammes) induisant le clignement des paupières et le retrait volontaire de la face par la souris, dure 1h. La séance d'imagerie DOLPLER dure 15 minutes (sous anesthésie légère). Dans la procédure 1, chaque animal subira ces 3 tests 1 fois dans sa vie, et 2 fois dans la procédure 2 (avant et après administration de la molécule régulatrice des K2P). Le modèle de la procédure 2 consiste en une injection quotidienne de BAC (chlorure de benzalkonium) pendant 7 jours. Les molécules régulatrices des K2P ou la solution saline contrôle seront administrées en IP, en 1 injection.

Impact sur les animaux

Chez l'homme, la sécheresse oculaire peut occasionner un ressenti très variable selon les individus allant d'une simple gêne soulagée momentanément par des larmes artificielles à une douleur pouvant être plus inconfortable chez certains patients. Il est vraisemblable que cette variabilité entre individus existe également chez la souris. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la sécheresse oculaire qui sera d'intensité modérée. Elle engendre potentiellement un inconfort voire éventuellement une gêne chronique (comme chez certains patients humains) qui ne pourront être soulagés par des analgésiques puisque c’est ce paramètre (et son soulagement) que nous évaluerons. Les animaux auront 3 et 12 mois environ lors de leur entrée en procédure. La durée des nuisances auxquelles ils seront exposés sera donc de 5 jours pour les souris mutantes pour les transporteurs étudiés: habituation aux tests pendant 2 jours et 3 jours de tests (c'est-à-dire 2 fois 2h de tests à 36h d'intervalle: 1 série de tests pendant la journée, 1 seconde série pendant la nuit). La durée des nuisances sera de 6 semaines maximum pour les souris dans lesquelles nous aurons induit la sécheresse oculaire (habituation aux tests, 7 jours d'établissement du phénotype et entre 1 et 4 semaines de traitement avec une série de tests par semaine). Les effets des traitements seront évalués sur 7, 14 et 28 jours maximum puis les animaux seront mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort selon la législation en vigueur afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.

Remplacement

Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nos études préalables et celles de nos collègues ont permis de caractériser in vitro (neurones en culture) et in vivo (rongeurs) les effets des molécules d'intérêt et de déterminer leur mode d'action sur les K2P. Cette phase du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément in vivo sur l'oeil et quantifier le phénotype oculaire des animaux déficients pour les gènes codant les canaux K2P d'intérêt et les effets thérapeutiques des molécules que nous avons testées.

Réduction

Le nombre d‘animaux (1080) correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution et en considérant mâles et femelles séparément, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs et en particulier si les deux sexes donnent des résultats similaires.

Raffinement

Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests, dans laquelle nous pouvons moduler l'intensité lumineuse pour limiter la photoallodynie et avec un équipement spécialement conçu pour la bonne réalisation des procédures. Ainsi, nous mettrons en place des séances d'habituation en amont de chaque test, et nous réaliserons la plupart de ces tests sous anesthésie légère à l'isoflurane (15-20 minutes). En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer la douleur et de mettre en oeuvre des points limites précoces. Les animaux seront hébergés avec un environnent enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Enfin, l'utilisation de l'imagerie par échographie-Dopler représente un avantage conséquent dans le respect de la règle des 3R et permet non seulement de réduire le nombre d'animaux mais de diminuer leur manipulation car c'est une technique non invasive et rapide sous anesthésie réalisée par l'expérimentateur principal formé à l'utilisation de l'appareil.

Choix des espèces

Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Le modèle murin reproduisant la sécheresse oculaire est un modèle validé et classiquement utilisé dans la littérature. Deux âges seront étudiés: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux.

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles sont génétiquement modifiées et gavées pour déclencher une maladie rénale, ou opérées sous anesthésie pour obstruer le conduit urinaire d'un rein, puis reçoivent des injections quotidiennes de composés ou de placebo pendant plusieurs mois, avec passages en cage métabolique et prélèvement sanguin rétro-orbital avant la mise à mort. L'étude évalue trois composés censés ralentir la maladie rénale chronique et éviter la greffe. Le porteur affirme que les organoïdes rénaux ne reproduisent pas un rein vascularisé et qu'aucune approche in vitro ne peut se substituer au modèle murin.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques sont des maladies génétiques ou acquises. Le rein va subir de nombreuses modifications qui conduisent au développement de petits kystes, associés à une inflammation du rein aboutissant à sa destruction. A terme, la maladie aboutit à l’insuffisance rénale terminale qui nécessite le recours à la dialyse et la transplantation rénale, deux procédures lourdes et coûteuses. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter aux patients d’évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. L’étude proposée ici a pour objectif de valider l’effet thérapeutique de 3 composés sur le développement de la maladie rénale chronique. Ces composés ont été identifiés et validés dans des cultures de cellules rénales. A cette fin, trois modèles animaux seront utilisés. Le premier utilise des souris génétiquement modifiées qui seront gavées à 1 mois pour induire la maladie humaine puis les souris seront traitées quotidiennement par injection avec les 3 composés et leur placebo jusqu’à 5 mois. Le deuxième modèle utilise d’autres souris génétiquement modifiées pour lesquelles la maladie rénale débute à 5 semaines de vie. Ces animaux seront traités quotidiennement par injection avec les 3 composés à partir de 4 semaines (avant le début de la maladie) et jusqu’à 3 mois. Enfin, le troisième modèle utilise une chirurgie qui permet d’obstruer le flux urinaire d’un des 2 reins. Ce modèle chirurgical développe une maladie rénale 2 semaines après la chirurgie. Les animaux seront traités quotidiennement par injection avec les 3 composés 1 semaine avant la chirurgie et jusqu’à deux semaines après.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre de valider l’efficacité thérapeutique d’un ou plusieurs composés identifiés in vitro permettant ainsi à terme d’éviter la greffe rénale aux patients.

Procédures

L’ensemble des animaux seront injectés tous les jours, avec les médicaments ou leur placebo à compter de 1 mois et pour une durée maximale de 4 mois. Les 360 animaux du premier modèle de souris génétiquement modifiées seront soumis à l’âge de 1 mois à un gavage sur 5 jours consécutifs. La durée de l’acte de gavage est d’environ 1 minute. Les 90 animaux du troisième modèle seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale. La durée de la chirurgie est d’environ 5 minutes. Pour les 2 premiers modèles de souris génétiquement modifiées, chaque mois, les urines seront prélevées par massage ventral pour évaluer le défaut de concentration urinaire. Si ce défaut est observé, les animaux seront placés en cage métabolique pendant 48h. Pendant les 48h, les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. Enfin, l’ensemble des animaux sera soumis à un prélèvement de sang rétro-orbital sous anesthésie générale le jour de la mise à mort. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort.

Impact sur les animaux

Chez l’homme l’évolution des maladies rénales chroniques est indolore. A un stade très avancé lorsque la fonction rénale est très altérée (nécessitant le recours à la dialyse ou la transplantation rénale), ces maladies induisent une baisse de l’appétit et une diminution de la masse musculaire. Le protocole établit dans ce projet ne va pas jusqu’à ce stade. Les patients atteints de maladie rénale génétique souffrent de polydipsie (consommation excessive d’eau) et de polyurie (volume d’urine augmenté). Les animaux traités avec le placebo sont donc susceptibles de développer ces symptômes alors que ceux traités avec le(s) médicament(s) devraient s’améliorer. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections répétées des médicaments peuvent entraîner une irritation de la zone d’injection. Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement. Le modèle chirurgical d’obstruction est « indolore » d’un point de vue rénal puisqu’un seul des 2 reins est obstrué, l’autre rein permettant de maintenir une fonction rénale normale. En revanche, suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection.

Devenir

L’ensemble des 810 animaux seront mis à mort afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires (cellules épithéliales, cellules endothéliales, fibroblastes et cellules immunitaires) ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro (y compris les organoides rénaux) ne permettent pas l’étude d’un rein in vitro ayant une vascularisation, un flux urinaire, des fibroblastes et des cellules immunitaires. Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire complet, il n’est pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été établi selon le logiciel InVivoStat pour permettre d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Des souris mâles et femelles seront utilisées et 15 souris par groupe de traitement seront explorées. Pour l’étude statistique, nous utiliserons un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Afin de réduire le traumatisme lié aux gavages et aux injections répétées, des sondes de gavage adaptées à la taille de l’animal et des seringues très fines seront utilisés. Afin de limiter les nuisances liées à la polyurie (volume urinaire élevé), les biberons d’eau et la propreté des cages seront contrôlés régulièrement. Afin de limiter les nuisances induites par la mise en cage métabolique, une période d’adaptation de 24h est réalisée. De plus, la mise en cage métabolique s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné. Les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. Afin de réduire la douleur associée à la chirurgie, une anesthésie générale est réalisée. Un antalgique et un analgésique seront administrés en pré- et post-opératoire. A l’issue des procédures, les souris seront mises à mort sous anesthésie générale préalable. Des points limites spécifiques à chaque procédure ont été définis. Tout animal en souffrance recevra un antalgique et/ou des compléments alimentaires. Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, à la différence des poissons ou des insectes, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons (unités fonctionnelles du rein) fixés après la fin de la néphrogenèse et développe des maladies rénales très semblables à celles observées chez l’homme. Le développement du rein se termine, chez la souris, aux alentours du 14ème jour après la naissance. Les procédures décrites dans ce projet seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 4 semaines donc après la fin du développement rénal. Les souris seront mises à mort à l’âge adulte, temps déjà étudié dans d’autres pathologies rénales.