Recherche appliquée

15 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans un autre projet après une période de repos. On leur injecte à plusieurs reprises une cytokine par voie intraveineuse pour provoquer délibérément des démangeaisons, filmées pendant deux heures, afin de tester un anticorps monoclonal contre la dermatite atopique. Le porteur indique que l'objectif final est la commercialisation d'un nouveau produit et décrit le chien comme l'espèce cible, un test sur une autre espèce ne serait pas informatif selon lui. Les démangeaisons provoquées poussent les chiens à se gratter, se mordiller et se frotter, effets présentés comme transitoires.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité chez le chien d’un anticorps monoclonal sur les démangeaisons induites par une cytokine. L’objectif final étant la commercialisation d’un nouveau produit permettant de traiter la dermatite atopique qui est la plus fréquente des maladies cutanées allergiques du chien. Un objectif secondaire de ce projet est de comparer l’efficacité de deux cytokines, produites sur deux systèmes cellulaires différents, sur l’induction du prurit chez le chien.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la production d’un nouveau produit dans le cadre de développement de nouvelles options thérapeutiques dans la prise en charge de la dermatite atopique chez le chien. La dermatite atopique est une maladie inflammatoire chronique qui réduit significativement la qualité de vie de l’animal.

Procédures

La première phase expérimentale se déroulera sur 24 jours de prétests incluant les interventions suivantes pour 12 chiens : 1. Trois injections intraveineuses d'une cytokine sur animaux vigiles (avec pose d’un cathéter ou micro-perfuseur) à 6 ou 7 jours d’intervalles pour induire le prurit et filmer pendant 2 heures (J-20, J-14 et J-7) 3. Un prélèvement sanguin sur animaux vigiles pour la réalisation d’analyses sanguines (J-7). Puis la seconde phase expérimentale se déroulera sur 62 jours pour 8 à 12 chiens et incluant les interventions suivantes : 1. Une injection sous cutanée d'anticorps monoclonal sur animaux vigiles au démarrage de l’étude (J0). 2. Trois injections intraveineuses d'une cytokine sur animaux vigiles (avec pose de cathéter ou micro-perfuseur) pour induire le prurit et filmer pendant 2 heures à 30 ou 31 jours d’intervalles (J1, J30 et J61). 3. Quatre prélèvements sanguins sur animaux vigiles à 30 ou 31 jours d’intervalles (J0, J14, J30 et J61) pour analyses sanguines.

Impact sur les animaux

L’injection de la cytokine par voie intraveineuse provoque délibérément une démangeaison transitoire chez le chien qui se dissipe naturellement en 1 à 2 heures. Le chien peut se gratter, se lécher, se mordiller les pattes, le flanc ou la région anale, trottiner, secouer la tête et se frotter le corps. Aucune lésion durable n'est attendue. Un érythème au niveau des zones léchées ou grattées plus intensément est cependant possible et réversible très rapidement, soit en moins de 24 heures. Les effets indésirables potentiellement attendus suite à l’administration du produit d’essai ou de référence sont mini¬mes. Des troubles gastro-intestinaux et une réaction locale au site de l’injection peuvent être observés dans de rares cas. Au moment des prélèvements sanguins ou injections de produit par voie intraveineuse ou sous-cutanée, les animaux subissent une nuisance limitée liée au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille sous la peau entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction.

Devenir

A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre projet, suite à un repos suffisant.

Remplacement

L'utilisation de chiens sur ce projet est justifiée car ils représentent l’espèce cible du produit et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. Le produit d’essai est un anticorps monoclonal caninisé, tester son efficacité sur une autre espèce que l'espèce cible ne serait pas informatif. D’autre part, aucune étude alternative ne peut à ce stade remplacer l’étude sur l’espèce cible. Il s'agit d'une étude pilote "preuve de concept" avant de s’engager sur la voie des études d’enregistrement.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet correspond au minimum requis pour réaliser une preuve de concept. Ce nombre ne permet pas une analyse de non-infériorité mais permet d'une part de démontrer que le produit test réduit le prurit chez les chiens recevant le challenge avec la cytokine et d'autre part que cette réduction est comparable à celle du produit de référence, appliqué à la même dose.

Raffinement

La salle de test est séparée de la salle d’hébergement habituelle des animaux. Les chiens, par groupe de 3 individus, seront habitués à l’environnement de cette salle de test pendant minimum 14 jours avant le début de l’étude pour limiter leur stress. Des enrichissements seront présents dans les box (jouets, radio…). Durant l’étude, les volumes administrés respecteront les recommandations du Gircor en fonction de la voie d’administration. Après l’injection de la cytokine, les animaux seront filmés et suivis pendant 2 heures afin de détecter tout signe de prurit très intense. Dans ce cas, l’animal concerné sera pris en charge immédiatement. Les mesures mises en place dépendront de la gravité et la nécessité de l’exclusion de l’étude sera évaluée au cas par cas. Si les résultats du produit d’essai sont statistiquement inférieurs au produit de référence lors du premier test de la seconde phase expérimentale, l’étude sera stoppée. Il ne sera pas nécessaire de faire les 2 tests suivants. Durant toute la durée du projet l’état clinique des chiens sera suivi et documenté (poids, état de la peau, condition générale, appétit, état des selles). Des analyses hémato biochimiques sont prévues pour surveiller les paramètres physiologiques des animaux.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce cible du produit testé. Le produit d’essai est un anticorps monoclonal caninisé, tester son efficacité sur une autre espèce que l'espèce cible ne serait pas informatif. Les animaux seront des adultes de 8 à 15 kg, correspondant au stade de développement indiqué pour le traitement.

2660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, elles subissent sous anesthésie une injection chirurgicale dans l'oreille interne pour tester des thérapies géniques contre la surdité d'origine génétique. Le porteur renvoie les bénéfices au long terme, un éventuel passage en clinique après démonstration d'efficacité sur les modèles cellulaires et animaux. Il décrit le recours à l'animal comme "nécessaire", faute selon lui de méthode alternative validée pour prédire l'efficacité in vivo.

Objectifs

La surdité est le déficit sensoriel le plus fréquent ; il touche 1 enfant sur 1000 à la naissance, un enfant sur 700 avant l’âge adulte et un pourcentage important de la population adulte. On estime actuellement à 80 % les origines génétiques des surdités de l’enfant. La part génétique des surdités apparaissant à l’âge adulte reste à déterminer mais sera probablement importante. Plus de 100 formes génétiques différentes sont actuellement identifiées dans les surdités isolées. Les thérapies actuelles pour les pertes d’audition sont pour l’essentiel des dispositifs médicaux, qui amplifient le son ou stimulent directement les neurones de la cochlée. Ces deux approches présentent des limites en termes d’efficacité particulièrement pour la perception du son dans un environnement bruyant, car tous les sons vont être amplifiés de façon quasi identique. Les thérapies géniques, sont des solutions pour restaurer la fonction auditive perdue ou altérée, dans le cas de surdité d’origine génétique. Une des difficultés de la thérapie génique est de trouver une solution pour atteindre la cochlée. Il y a plusieurs obstacles à franchir pour atteindre cette cible en raison des particularités anatomiques et physiologiques de l’oreille interne. Ce projet a pour but de proposer un modèle vivo qui permettra de valider l’efficacité de thérapies géniques afin de traiter les pertes auditives.

Bénéfices attendus

A court terme, valider ou non la poursuite d’un programme de développement de thérapie génique pour traiter les troubles de l’audition. A long terme, permettre le passage en phase clinique de thérapies géniques qui auront démontré une efficacité dans les modèles cellulaires et vivo des troubles de l’audition.

Procédures

L’injection unique par chirurgie d’une durée de 30 minutes, dans l’oreille interne des nouveau-nés est réalisée sous anesthésie générale. Aucun prélèvement ne sera effectué sur l’animal vivant. Les tissus de l’oreille pour des analyses histologiques, seront prélevés post mortem.

Impact sur les animaux

Une anesthésie et une injection avec un abord chirurgical, chez le nouveau-né, pour l’administration des substances d’essais directement au niveau de la cochlée. Ceci pouvant engendrer une douleur et/ou inflammation/suppuration post-opératoire. Une euthanasie en fin d’étude pour collecter les tissus frais de l’oreille pour des analyses histologiques.

Devenir

Tous les animaux des procédures 1, 2 et 3 sont euthanasiés en fin d’étude. L’ immunohistologie est nécessaire pour confirmer l’efficacité des produits, et ne peut se faire que post mortem.

Remplacement

Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas, à ce jour, de méthodes alternatives validées pour prédire l’efficacité in vivo les thérapies géniques en développement. Les atteintes des cellules ne peuvent pas être étudiées uniquement via la culture cellulaire ou les modèles informatiques car nous ne pouvons pas reproduire la complexité des mécanismes conduisant aux troubles de l’audition. Les candidats médicaments qui sont testés auront, lorsque c’est possible, préalablement démontré une activité sur des modèles vitro ou ex vivo afin de poursuivre les projets in vivo avec les candidats les plus prometteurs.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon les résultats de la bibliographie. Entre 6 et 10 nouveau-nés sont nécessaires pour tester chaque vecteur (AAV).

Raffinement

Dans nos études, les impératifs éthiques associés tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique, la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal seront intégrées. Les animaux disposent d’éléments participant à l’enrichissement de leur environnement et à l’améliorer des conditions d’hébergement. Apres administration intracochleaire, les nouveau-nés réveillés sont replacés avec les autres nouveau-nés de la portée. Des points limites spécifiques et adaptés sont mis en place afin de prévenir toute dégradation de l’état de santé des animaux. Un raffinement des techniques d’anesthésie est prévu dans la procédure N°1 afin d’obtenir la meilleure couverture anesthésique possibile.

Choix des espèces

La souris est l’espèce phylogénétiquement inférieure et est un modèle établi dans la littérature pour les études auditives. Les modèles de thérapie génique cochléaire sont développés chez le nouveau-né. Ceci en raison de l’abord chirurgicale qui est simplifié et d’autre part les nouveaux nés ne développent pas de pertes d’audition après l’acte chirurgical contrairement aux animaux adultes. C’est pourquoi ce stade de développement est le plus pertinent pour ce type de modèle. Les modèles de thérapie génique cochléaire sont développés chez le nouveau-né. Ceci en raison de l’abord chirurgical qui est simplifié et d’autre part les nouveau-nés ne développent pas de pertes d’audition après l’acte chirurgical contrairement aux animaux adultes. C’est pourquoi ce stade de développement est le plus pertinent pour ce type de modèle.

2880 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés en cages individuelles avec restriction de mouvement puis soumis à un jeûne de dix-sept heures, pour mesurer la digestibilité d'aliments destinés à l'élevage de volailles. Le porteur décrit l'utilisation de l'espèce d'élevage comme "indispensable" puisqu'elle est la cible directe des résultats, et affirme qu'aucun modèle in vitro fiable n'existe. Les oiseaux sont tués en fin d'essai pour prélever les caecums, le porteur précisant qu'il est impossible de les donner ou de les commercialiser.

Objectifs

L'équipe met en place des essais de digestibilité sur poulets afin d’évaluer de la manière la plus précise possible la valeur nutritionnelle des matières premières, coproduits ou aliments destinés aux volailles. Les matières premières et coproduits ne cessent d’évoluer, par les changements des itinéraires techniques plus respectueux de l’environnement, l’apparition de nouvelles sources de protéines locales et l’optimisation des procédés qui génèrent des co-produits valorisables par les animaux. Les mesures de digestibilité permettent de faire le bilan entre les nutriments consommés par l’animal, ceux réellement absorbés et utilisés pour les fonctions physiologiques et de croissance, et ceux rejetés dans les déjections. Les résultats ainsi obtenus permettent aux fabricants d’aliments et aux éleveurs d’adapter au mieux la qualité nutritionnelle des aliments aux besoins des animaux. Cela contribue au maintien d’une flore digestive équilibrée (moins de fermentations indésirables) et à la bonne santé des animaux, mais aussi à réduire les rejets (azoté, phosphore, …) dans l’environnement. Dans ce type de protocole, l’utilisation de l’espèce d’élevage est indispensable, puisqu’il s’agit de la cible directe dans l’utilisation des résultats.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de poursuivre l’acquisition de données de digestibilité fécale chez le poulet nécessaires afin de formuler au mieux les aliments d’élevage pour limiter les désordres digestifs liées à un déséquilibre nutritionnel mais aussi les rejets dans l’environnement tout en développant les connaissances sur des matières premières, notamment locales. Les essais de digestibilité permettent d’évaluer des hypothèses de manière fine et donner des valeurs de référence de la valeur nutritionnelle d’une matière première ou d’un aliment avec un nombre d’animaux très réduit. Les résultats contribuent à alimenter les bases de données disponibles pour la filière, utilisables en France mais aussi à l’étranger ou l’accès à l’expérimentation est plus difficile (Tables d'alimentation). A long terme, les données issues de ce projet permettront d’affiner le développement déjà initié de méthodes de prédiction dans le proche infra-rouge de la digestibilité, directement en remplacement partiel ou total des essais en cage (et éventuellement des mesures sur fientes fraîches à terme et en élevage).

Procédures

Sans objet.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent un hébergement collectif en cages puis en cages individuelles avec restriction de mouvement et enfin une période de jeûne de 17H. Les régimes alimentaires évalués ne sont pas de nature à produire des désordres digestifs ni perte de poids particuliers.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés. Des prélèvements pourront être faits sur les poulets selon les thématiques. Il est impossible des les donner ou commercialiser.

Remplacement

Les matières premières, coproduits et additifs utilisés en alimentation animale ont une « valeur biologique » variable. Ils peuvent varier avec l’espèce végétale, la variété, le procédé appliqué, l’ajout d’additifs, etc. La modélisation et les équations de prédiction ne peuvent donner que des valeurs moyennes qui ne rendent pas compte de cette variabilité et surtout pas de la variabilité entre animaux eux-mêmes. Seule l’évaluation sur animaux permet de mesurer avec précision la valeur nutritionnelle et le niveau de rejets d’un aliment et de tester des hypothèses dans la compréhénsion des phénomènes digestifs. De plus, à ce jour aucun modèle in vitro fiable n’existe.

Réduction

Tous les essais donnent lieu à des analyses statistiques. Le dispositif permet d’utiliser le plus petit nombre d’animaux (9 à 12) pour obtenir des différences statistiques ayant un sens biologique (3 % d’écart de digestibilité ou de performances) entre traitements (6 à 8 traitements). Les différences entre traitements sont le plus souvent étudiées avec une analyse de variance à un ou plusieurs facteurs, suivie d’un test en post-analyse, différent selon les besoins.

Raffinement

Plusieurs éléments contribuent à l’enrichissement du milieu. Les animaux ont une perception visuelle, auditive et olfactive des congénères (cages accolées et grillagées), même pendant les périodes en individuel. Un objet d’enrichissement (chaine) est installé dans chaque cage pour leur donner la possibilité de s’occuper, même si ce sont des animaux dont les activités principales restent le repos (50-70 % du temps) et l’alimentation (avec très peu d’activité exploratoire, qui diminue avec l’âge même dans un environnement d’élevage (en groupe et avec litière) surtout pour les poulets à croissance rapide. Cela peut différer pour les poulets à croissance lente, avec des périodes d'exploration plus importantes. Les périodes d’isolement sont réduites au maximum afin de laisser les interactions possibles (facteur d’enrichissement) pendant les périodes d’hébergement en groupe. Dans nos essais, les poulets à croissance rapide bougent peu du fait de leur tempérament, mais il est très rare d’observer des troubles locomoteurs dans nos installations. Nous travaillons sur une souche de poulet à croissance rapide car ce type d’élevage représente 80 % de la production française de poulet (et cette proportion avoisine les 95 % pour le reste de l’Europe). Comme nous produisons des références et des résultats qui sont utiles pour les éleveurs (à travers les fabricants d’aliments), il est normal de travailler sur la production majoritaire sur le territoire.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est le poulet, et plus précisément des animaux des souches commerciales, retrouvées en élevage (à croissance rapide ou croissance lente). L’utilisation digestive des nutriments est spécifique à chaque espèce. Les données issues de ces essais permettent d’alimenter les matrices de formulation qui servent à calculer les apports nutritionnels des aliments, afin de les adapter au mieux aux besoins des volailles, sans rejets. Ce sont des animaux en croissance, le stade physiologique où les besoins des animaux sont les plus importants et variables.

384 souris, 192 mâles et 192 femelles, porteurs ou non d'une mutation du récepteur Rarb, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès 4 semaines d'âge, elles sont gavées une fois par jour pendant quatre semaines avec l'un de trois traitements ou une solution saline, puis passent cinq tests : locomotion face à la nouveauté, coordination des membres, activité locomotrice enregistrée sur 32 heures, réflexes et mémoire, avant que la moitié soit tuée par perfusion intracardiaque sous anesthésie générale. Le porteur espère prévenir ainsi les symptômes d'une maladie neurologique rare, la MCOPS12, un bénéfice qu'il formule au conditionnel. Il qualifie ces tests de "non aversifs" et écrit en capitales que la souris "N'EST PAS REMPLAÇABLE".

Objectifs

Des mutations ponctuelles du recepteur à l’acide rétinoique beta (Rarb) sont à l’origine d’une maladie neurologique rare (MCOPS12) responsable de symptomes cognitifs et moteurs importants et progressifs. En effet, cette pathologie possède un caractère neurodeveloppemental ainsi qu’un caractère neurodégénératif (perte progressive de mobilité, perte de la coordination des membres), avec un pronostic vital ne dépassant pas l’adolescence. Des modèles murins de cette pathologie ont été générés et nous permettront d’étudier les mécanismes associés à ces mutations ponctuelles. Les souris mutantes présentent des symptomes moteurs similaires (n’affectant pas fondamentalement la vie des animaux qui peuvent marcher et se redresser sans aucun problème) à ceux observés chez les souris porteuses d’une mutation invalidant complètement l’activité du récepteur. Nos études antérieures ont permis d’identifier le rôle du récepteur dans le dévelopement et dans la fonction du striatum, la structure cérébrale impliquée dans le contrôle moteur et la cognition. Nous avons montré que pendant le développement embryonnaire RARb contrôle le développement d’une sous-population de neurones (appelés neurones de type 1) dans le, alors que à l’âge adulte nous avons identifié son rôle dans la neuroprotection d’une autre sous population de neurones (appelés neurones de type 2). Notre objectif est de prévenir et/ou de normaliser les symptomes moteurs et cognitifs en modulant l’activité des neurones de type 1 et 2 afin de prévenir leur mort et/ou leur dysfonctionnement pour éviter l’apparition des symptomes. Les effets liés au mode d’administration des traitements seront contrôlés grâce à un traitement supplémentaire avec une solution saline, pour s’assurer qu’aucun effet observé ne soit en réalité que le résultat du stress causé par l’administration des composés. Nous avons donc 4 traitements différents à tester.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter de nouvelles pistes de traitements pour la maladie sur laquelle nous travaillons. En effet, notre objectif est de prévenir l’apparition des symptomes moteurs et cognitifs grâce aux différents traitements que nous allons utiliser en empêchant la perte de certains neurones responsables de ces symptomes. Si un ou plusieurs traitement(s) montre(nt) des effets bénéfiques, nous pourrions envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour les patients.

Procédures

Les trois traitements pharmacologiques et le traitement contrôle avec de la solution saline (4 traitements différents) se feront sur des cohortes différentes provenant de 4 groupes distincts d’animaux porteurs, ou non, d’une mutation et agés de 4 semaines. Tous les traitements se feront par voie orale (gavage des animaux, 15 secondes par traitement) pendant 4 semaines, à raison d’un traitement par jour. Nous utiliserons 12 animaux par groupe et par traitement (12 x 4 x 4), soit 192 mâles et 192 femelles = 384 animaux au total. Les 4 semaines de traitement seront suivies d’une batterie de tests comportementaux non aversifs que chaque animal passera une seule fois : test 1 = 30 minutes, évaluation de la locomotion induite par la nouveauté, test 2 = 3 x 5 minutes, évalution de la coordination des membres, test 3 = 32h, évaluation de l’activité locomotrice, test 4 = 30 minutes, évaluation des reflexes, test 5 = 30 minutes, évaluation de lé mémoire. Un delai minimum de 1 jour sera respécté entre chaque test comportemental, afin de diminuer l’effet du stress sur les résultats obtenus. La moitié des animaux de chacun des 4 traitements = 192 animaux (96 mâles et 96 femelles), sera ensuite euthanasiée par perfusion intracardiaque après anesthésie générale. Une vérification de la perte des reflexes au niveau des membres et palpébral est réalisée avant tout acte chirurgical.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables ne dépasseront pas la gêne occasionnée par le gavage des animaux. En effet, les tests comportementaux effectués ne sont pas sujet à causer de la souffrance. Une légère modification de l’activité motrice et cognitive est à prévoir après les traitements, sans toutefois causer d’effets indésirables. Ces effets légers seront perceptibles jusqu’à deux heures après le traitement.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisé seront mis à mort afin de récolter le matériel biologique pour des analyses cellulaires et moléculaires qui compléteront les résultats obtenus en comportement.

Remplacement

Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les réseaux neuronaux dans leur ensemble. En effet, la complexité biologique de la signalisation calcique et de la neurotransmission ne permet par de remplacer les animaux par des modèles mathématiques ou in vitro, parce qu’il ne reflettent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.

Réduction

Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux utilisé (groupe de 12) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues à la suite du test Openfield (le moins discriminant des tests effectués ici) ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques. Une différence significative entre les groupes (de même sexe) sera recherchée. De plus, nous n’utiliserons qu’un seul groupe d’animaux traités avec le vehicule (contrôle). En effet, les différents traitements seront préparés et administrés de la même manière, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux contrôle. Enfin, la réalisation de la procédure numéro 2 dépendra des résultats obtenus dans la procédure numéro 1. En effet, nous n’utiliserons la seconde procédure uniquement si les résultats de la première procédure ne sont pas concluants. En effet le caractère moins séléctif de la seconde molécule, permettra de moduler la signalisation calcique plus largement.

Raffinement

En vue de RAFFINER les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses et effectuées par des personnes compétentes et qualifiées (formations conception et chirurgie des rongeurs). Elles consistent uniquement en des études comportementales, effectuées avec ou sans traitement préalable de composés pharmacologiques à des doses faibles. Les molécules pharmacologiques permettent de révéler des dysfonctionnements ou de limiter/supprimer le phénotype. Les traitements par gavage seront réalisés par des expérimentateurs formés à l’aide de canules souples afin d’éviter toute lésion interne. Un suivi du poids des animaux sera mis en place deux fois par semaine (le mardi et le vendredi), afin de detecter rapidement un signe de mal être. Les animaux seront aussi analysés méticuleusement tous les jours à l’occasion des traitements afin de vérifier leur état général.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle des mutations d’un gène dans la mise en place et la progression d’une maladie neurologique progressive rare, les performances comportementales et les fonctions de la signalisation calcique, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain et de la disponibilité de différentes lignées porteuses de mutations géniques ciblées permettant de couvrir l’ensemble des processus physiopathologiques : neurodégénérescence et neurodéveloppement. Pour les tests programmés nous utiliserons dans la plupart des cas des animaux de 4 semaines afin d’oberver les changements de comportements des animaux à la suite des traitements, avant même l’apparition de des symptomes.

36 coqs vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés individuellement pendant deux ans, placés quatre jours par semaine dans une cage à surface réduite pour collecter leurs fientes et mis à jeun vingt-quatre heures à chaque bilan, le porteur reconnaissant l'hébergement individuel prolongé comme la nuisance majeure. Les coqs sont tués à la fin de cette période. Le porteur mesure la valeur nutritionnelle d'aliments pour volailles et affirme que le recours à l'espèce d'élevage est "indispensable".

Objectifs

L'unité met en place des essais de digestibilité sur coqs afin d’évaluer de la manière la plus précise possible la valeur nutritionnelle des matières premières, coproduits ou aliments destinés aux volailles. Les matières premières et coproduits ne cessent d’évoluer, par les changements des itinéraires techniques plus respectueux de l’environnement, l’apparition de nouvelles sources de protéines locales et l’optimisation des procédés qui génèrent des co-produits valorisables par les animaux. Les mesures de digestibilité permettent de faire le bilan entre les nutriments consommés par l’animal, ceux réellement absorbés et utilisés pour les fonctions physiologiques et de croissance, et ceux rejetés dans les déjections. Les résultats ainsi obtenus permettent aux fabricants d’aliments et aux éleveurs d’adapter au mieux la qualité nutritionnelle des aliments aux besoins des animaux. Cela contribue au maintien d’une flore digestive équilibrée (moins de fermentations indésirables) et à la bonne santé des animaux, mais aussi à réduire les rejets (azoté, phosphore, …) dans l’environnement. Dans ce type de protocole, l’utilisation de l’espèce d’élevage est indispensable, puisqu’il s’agit de la cible directe de la thématique. Le coq est utilisé en tant que référence pour les volailles, puisqu’il s’agit d’un animal adulte dont les besoins ne sont liés qu’à l’entretien et non pas à des fonctions physiologiques particulières comme la croissance, la ponte etc…

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de continuer l’acquisition de données de digestibilité fécale chez le coq nécessaires afin de formuler au mieux les aliments d’élevage pour limiter les désordres digestifs liées à un déséquilibre nutritionnel mais aussi les rejets dans l’environnement tout en développant les connaissances sur des matières premières notamment locales. Les essais de digestibilité permettent d’évaluer des hypothèses de manière fine et donner des valeurs de référence de la valeur nutritionnelle d’une matière première ou d’un aliment avec un nombre d’animaux très réduit. Les résultats contribuent à alimenter les bases de données disponibles pour la filière et à développer des équations de prédiction utilisées par les formulateurs. Les mesures in vivo (quelques équipes en France à les réaliser), permettent le maintien de la validité et l’adaptation continue de ces équations, et au développement d’autres pour des matières premières et co-produits qui ne cessent d’évoluer. Le coq est un modèle pour les volailles, les mesures sont rapides et plus facilement réalisables que sur poulets pour notamment évaluer de nouvelles matières premières.

Procédures

Les coqs sont hébergés en individuel. A chaque série (7 jours), ils sont placés 4 jours en cage avec une surface au sol diminuée pour permettre de collecter les fientes. Le reste du temps, ils sont dans une cage plus grande leur permettant une plus grande liberté de mouvement. Les coqs sont mis à jeun 24 heures en début et en fin de collecte de fientes.

Impact sur les animaux

La nuisance majeure reste l’hébergement en cage individuelle pendant une période prolongée, qui réduit les comportements potentiels dans un environnement plus riche, et cela malgré les améliorations faites depuis 2017 qui ont beaucoup contribué au bien-être des animaux (plus de surface, perchoir, surface de grattage). D'autres nuisances, mais dans une moindre mesure, sont les mises à jeun de 24 h autour de la phase de bilan. Néanmoins, les coqs (souche légère) adultes ayant peu de dépenses énergétiques à ce stade, réagissent bien à ce stress de courte durée et aucune dégradation de leur état n’a jamais été observée. Aucun effet indésirable des aliments distribués, bien adaptés à leur état physiologique, n’est attendu.

Devenir

Les coqs issus de la procédure d'hébergement individuel et de mise à jeun sont euthanasiès après 2 ans d’hébergement au sein de la station avec des périodes de mesures et des périodes de repos. Les animaux sont en cage réduite 4 jours par semaine de bilan. Par an, il y aura un maximum de 20 bilans, avec 4 jours consécutifs en cage réduite par bilan. Les bilans sont étalés sur l'année. Dans cette surface réduite, les animaux passent donc un maximum de 80 jours par an, non consécutifs.

Remplacement

Les matières premières, coproduits et additifs utilisés en alimentation animale ont une « valeur biologique » variable. Ils peuvent varier avec l’espèce végétale, la variété, le procédé appliqué, l’ajout d’additifs, etc. La modélisation et les équations de prédiction ne peuvent donner que des valeurs moyennes qui ne rendent pas compte de cette variabilité et surtout pas de la variabilité entre animaux eux-mêmes. Seule l’évaluation sur animaux permet de mesurer avec précision la valeur nutritionnelle et le niveau de rejets d’un aliment.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum de répétitions, pour être capable de mettre en évidence un écart de 1 à 2 % de valeur énergétique, niveau suffisant d’un point de vue biologique et zootechnique. L’adaptation facile du coq à l’environnement et l’homogénéité des réponses entre individus, permet de générer un grand nombre de données avec un nombre réduit d’animaux.

Raffinement

Les animaux ont une perception visuelle, auditive et olfactive des congénères (cages accolées et grillagées). La surveillance journalière, la manipulation des mangeoires et des abreuvoirs, permettent une habituation des animaux à la présence humaine. Un perchoir est installé dans chaque cage ainsi qu'une surface de grattage. Les cages disposent d’un fond coulissant permettant la réduction de surface pour les bilans, sans manipulation stressante pour les animaux. Les perchoirs ne seront pas accessibles pendant les collectes de fientes car il y a un risque que les fientes tombent dessus, ne soient pas totalement récupérées ou soient souillées, et que cela ait un impact sur la collecte totale.

Choix des espèces

Seule l’évaluation sur animaux permet de mesurer avec précision la valeur nutritionnelle et le niveau de rejets d’un aliment. La mesure chez l’espèce d’intérêt agronomique, "poules" (Gallus gallus), permet d’approcher au mieux les réponses en élevage. Le coq est un modèle utilisé classiquement. Les valeurs obtenues sur coqs permettent d’estimer la valeur nutritionnelle chez les animaux en croissance et la poule pondeuse, au moins de manière comparative. Ce sont des animaux adultes, donc en phase d’entretien (pas de croissance), ce qui facilite le bilan et donne des résultats très homogènes au sein du même traitement (forte puissance expérimentale).

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une intervention chirurgicale sur la trachée leur injecte un composé qui déclenche une fibrose pulmonaire, précédée d'injections d'anticorps ou d'aspirine visant les plaquettes, avec un risque de gêne respiratoire. Les animaux sont tués au bout de quatorze jours pour des lavages des bronches et le prélèvement des poumons. Le porteur affirme que la culture cellulaire ne reproduit pas la complexité d'un "organisme entier" et qu'il est "nécessaire" d'utiliser des animaux vivants.

Objectifs

Les plaquettes sont des éléments du sang connus pour leurs rôles dans la coagulation et la cicatrisation. Ce rôle cicatriciel est accompli par liaison des plaquettes au collagène via des molécules de liaison appelées récepteurs. Or, la fibrose peut se définir par une accumulation pathologique excessive de fibres de collagène. Le but du projet est donc d'étudier l'implication des plaquettes dans le développement de la fibrose pulmonaire et pouvoir identifier les récepteurs favorisant ce développement afin d'en faire des cibles thérapeutiques potentielles.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de pouvoir fournir des éléments supplémentaires sur les mécanismes des plaquettes impliquées dans la fibrose pulmonaire, qui est une pathologie pour laquelle il n'existe encore aucun traitement curatif. Nous allons utiliser des souris dont certains récepteurs plaquettaires ont été modifiés. Nous pourrons comparer les résultats obtenus dans les différentes lignées de souris afin de pouvoir mettre en évidence l'implication d'un récepteur en particulier dans cette pathologie, ce qui permettra peut-être de trouver un traitement.

Procédures

Les animaux, sous anesthésie et analgésie subiront une légère intervention chirurgicale d'une durée totale de 15 minutes consistant en une petite incision au niveau de la trachée qui permet d'y injecter un composé chimique induisant une fibrose pulmonaire. Avant cette chirurgie, certains animaux auront une injection intraveineuse d'anticorps ciblant les plaquettes sanguines, qui sera répétée 2 ou 4 fois en fonction de l'anticorps, ou auront de l'aspirine dans l'eau de boisson en continu afin d'inactiver les plaquettes. Juste avant la chirurgie et à la fin de la procédure qui dure 14 jours , les animaux auront également un prélèvement sanguin sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

Des projets menés au laboratoire sur le thème du développement de la fibrose pulmonaire nous indique que le bien être de l'animal n'est pas altéré, les souris sont alertes et dynamiques. Cependant, il est possible dans de rares cas que la souris ressente une légère gêne respiratoire. Les injections intraveineuses répétées et la suture (3 points) au niveau de la trachée peuvent également engendrer une gêne modérée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de laprocédure s'ils n'atteignent pas les points limites défini dans ce projet avant. Cela est nécessaire pour effectuer les prélèvements (sang, lavages broncho-alvéolaires et poumons) qui vont permettre d'analyser la fibrose pulmonaire et les marqueurs plaquettaires et inflammatoires .

Remplacement

Nous n'avons pas la possibilité de remplacer les animaux dans ce projet. En effet, même si la culture cellulaire nous permet, au sein de ce projet, d'étudier les molécules inflammatoires produites par les cellules pulmonaires impliquées dans la pathologie que nous étudions, elle ne permet pas de reproduire la complexité de fonctionnement d'un organisme entier en cas de développement d'une fibrose pulmonaire. Il n'existe pas de dispositif aujourd'hui permettant de mimer tous les paramètres conduisant à la maladie. Il est nécessaire d'utiliser des animaux vivants pour étudier le rôle des plaquettes dans cette pathologie.

Réduction

Nous ferons appel à des techniques permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement. En effet, nous réaliserons un lavage des bronches et des alvéoles puis nous récupèrerons les poumons afin de procéder à différents marquages plaquettaires ainsi qu'un dosage du collagène. Nous pourrons donc réaliser des analyses histologiques et des dosages sur le poumon d'une même souris afin de limiter le nombre de souris à utiliser. Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature et au sein de notre laboratoire lors d'études précédentes. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis tout au long du protocole et tout sera mis en oeuvre pour éviter toute souffrance (anesthésie, analgésie). La douleur post-opératoire est traitée préventivement grâce à l’administration d'un antidouleur. Les jours suivant la chirurgie, l'apparence des souris (cicatrisation de la plaie, posture de la souris, souris prostrée ou pas, déplacements ou pas, vitesse de respiration) et leur poids seront suivis quotidiennement et des points limites précoces ont été mis en place pour leur éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Notre modèle de fibrose pulmonaire chez la souris est le plus utilisé et le mieux décrit dans la littérature scientifique. En effet, il est utilisé depuis plusieurs décennies et permet de retrouver des caractéristiques proches de la pathologie humaine . Les animaux sont utilisés à l'âge adulte entre 8 et 12 semaines, la pathologie étant trop sévère chez des souris âgés. De plus, l'utilisations de souris jeunes permet de diminuer le risque de mortalité dû au développement de la fibrose.