Recherche appliquée

240 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée chirurgicalement des défauts osseux pour y déposer des biomatériaux, sous anesthésie, avec prélèvements sanguins par cathéter posé à l'oreille. Le porteur indique que l'intervention peut provoquer une fracture du fémur ou une inflammation chronique douloureuse. L'objectif déclaré est d'obtenir les autorisations d'études cliniques et de mise sur le marché, le porteur affirmant qu'il n'existe pas d'autres méthodes.

Objectifs

Ce projet fait partie d’un ensemble de programmes de recherche qui s’intéressent à l’ingénieurie tissulaire et au développement de biomatériaux susceptibles de stimuler la formation de tissus osseux, seuls ou en association avec des cellules souches mésenchymateuses (CSM) isolées et/ou de molécules actives. L’objectif de ce pojet est de confirmer l’apport de ces biomatériaux sur la cicatrisation osseuse par l’utilisation du modèle lapin. Les résultats in vivo, permettraient d’obtenir les autorisations nécessaires pour des études cliniques chez l’homme ainsi que les autorisations de mise sur le marché (marquage CE-Conforme au exigences de l'Union Européenne, FDA-Food and Drug Administration - Etats-Unis).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de s’assurer de la tolérance et du comportement de biomatériaus et de potentiels principes actifs destinés in fine à un usage en médecine humaine.

Procédures

Une anesthésie générale pour réaliser une procédure chirugicale d'induction de défauts osseux avec dépôt du biomatériau associé ou non à un principe actif (durée de l'anesthésie/intervention entre 60 et 90 minutes). Un prélèvement de sang sous anesthésie générale à l'aide d'un cathéther intra-artériel posé à l'oreille pour mélange avec le biomatériau quand dicté par le protocole (tonte, désinfection, mise en place du cathéter, sécurisation du cathéter en place, désinfection du bouchon perforable, aspiration d'un à 5 mL de sang selon le protocole, procédure totale prenant environ 5 minutes). Une anesthésie généraleavant euthanasie (durée d'environ 15 minutes entre l'injection des anesthésiants par voie sous-cutanée et l'administration de l'euthanasique)

Impact sur les animaux

En raison de l’objectif de l’étude, les effets indésirables majeurs sont la survenue d’une fracture du fémur ou le développement d’une réaction inflammatoire prolongée au niveau des sites d’implantation pouvant générer une douleur locale et une inflammation chronique. La survenue d’une fracture consistue une atteinte immédiate d'un point limite. Un retentissement systémique de la réaction inflammatoire prolongée avec baisse d'activité et de l'appétit entraînant une perte de poids constitue également un des points limites lorsqu'un échec thérapeutique à l'administration d'antalgiques et de soins locaux est constaté.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement post-mortem, examen par imagerie et analyse histologique.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes d'étude de la tolérance de l'hôte permettant d’éviter ou de remplacer l’utilisation d’animaux pour l’approche thérapeutique abordée dans ce projet.

Réduction

Compte-tenu d’études comparables déjà publiées et des travaux précédement réalisés sur la plateforme, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique. Le test statistique retenu pour comparer les différentes conditions sera un test non paramétrique de comparaisons multiples de données quantitatives de plus de deux échantillons indépendants (N

Raffinement

Les manipulations se dérouleront dans le strict respect du bien-être des animaux. L’hébergement est assuré dans des cages conformes à la réglementation en vigueur. Le modèle chirurgical est maîtrisé et réalisé par des chirurgiens qualifiés. Des traitements analgésiques adaptés seront mis en place et ajustés au niveau de douleur identifiée individuellement sur chaque lapin. Toute maladie concomitante apparaissant pendant l’étude fera l’objet de soins et de traitements adaptés. L’échec aux traitements conventionnels et l’impact de la maladie sur les résultats de l’étude seront évalués comme point limite. Les animaux ont accès librement aux granulés spéciaux pour lapins et à l’eau de boisson (ad libitum). L’enrichissement du milieu se fait par des jouets et des blocs de foin compacté et une tablette surélevée permettant aux lapins de se placer au-dessus ou en dessous. Les moyens mis en œuvre pour détecter, identifier et mettre un terme sans délai aux douleurs, souffrances et angoisses potentielles consiste en une surveillance quotidienne des animaux, des modifications importantes du comportement (agitation, agressivité, positions anormales, immobilité), une modification de l’apparence physique (contractures, poils ébouriffés) et un arrêt de l’alimentation entrainant une perte de poids supérieure à 10-15%. En cas d’apparition de l’un de ces symptômes, l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié dans les plus brefs délais. Par ailleurs, le soin des lapins est assuré par un personnel qualifié dans un hébergement conforme et enrichi. Les animaux sont manipulés dans un environnement calme et sous sédation ou anesthésie dès lors que la manipulation est stressante et source d’inconfort. L’immobilisation chimique est réalisée par voie sous-cutanée ce qui évite de requérir à une contention physique pour réaliser l’injection des produits sédatifs et analgésiques.

Choix des espèces

Le choix des lapins est fondé sur plusieurs critères : - Animaux adultes : maturité squelettique - Modèle de reconstruction osseuse chez le lapin largement répondu et décrit dans la littérature

246 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie créant un défaut osseux dans le crâne, avec deux défauts par animal, pour y implanter un biomatériau. Ils sont ensuite tués pour prélever la voûte crânienne et évaluer la repousse osseuse. Le projet teste un hydrogel destiné à traiter la péri-implantite dentaire, le porteur affirmant qu'il n'existe pas de solution de remplacement pour l'étude du tissu osseux.

Objectifs

La pose d’implants dentaires est un traitement courant en dentisterie et se répand de plus en plus parmi les praticiens au fil des années. Cependant, en raison de l’exposition permanente aux agents infectieux, la péri-implantite touche aujourd’hui 20% des patients implantés. Si elle n’est pas traitée, elle peut conduire à la perte totale de l’implant et des complications systémiques. La péri-implantite se définit par la formation d’un biofilm bactérien à la surface de l’implant qui entraine une forte inflammation des tissus environnants conduisant à une perte osseuse massive. Les traitements utilisés aujourd’hui par les praticiens (antibiotiques à larges spectres, désinfection de l’implant) ne montrent pas d’efficacité à long terme et peuvent engendrer une résistance bactérienne. Pour pallier à l’utilisation des antibiotiques, un intérêt grandissant est porté aux agents antibactériens inorganiques tels que les nanoparticules, ions métalliques ou polyphénols. Ainsi, l’objectif de notre projet est de développer un matériau innovant en combinant deux hydrogels aux propriétés distinctes. Dans un premier temps, un mélange d’hydrogel, de granules de céramique biphasées (BCP) et de nanoparticules d’hydroxyapatite dopées avec un cation pourra adhérer à l’implant et présentera des propriétés antibactériennes, ostéoconductrices et pro-régénératives. Dans un second temps, une membrane composée d’un mélange d’hydrogel et de chitosan présentant une dégradation lente, sera positionnée afin d’empêcher la croissance des tissus épithéliaux autour de l’implant. L’hydrogel et la membrane ont déjà été étudiés au laboratoire. L’hydrogel a été montré comme cytocompatible in vitro et biocompatible in vivo dans un modèle d’injection en sous-cutané chez la souris. La membrane a quant à elle été montrée comme biocompatible et agissant comme une barrière à l’invasion des cellules du tissu gingival dans un modèle ex-vivo d’explants de cellules gingivales humaines dans le cadre de la parodontite. Cette étude in vivo sera menée chez le rat en deux contextes : une procédure en site orthotopique (implantation des composites dans des défauts osseux de calvaria) afin de juger l’effet du composite sur la repousse osseuse et une seconde procédure en site orthotopique (implantation des membranes dans des défauts osseux de calvaria) afin de juger l’effet de la membrane sur la croissance des tissus épithéliaux autour de l’implant.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de valider in vivo l’effet ostéogénique d’un composite d’HA-Si + BCP + cation dans le cadre de la péri-implantite. Cette étude pourrait participer à l’élaboration d’un nouveau traitement de la péri-implantite qui serait utilisable en une seule fois, pratique pour les cliniciens et efficace au long court, en terme de régénération osseuse et effet antibactérien. Ce traitement permettrait donc aux patients de retrouver une bonne qualité de vie d’éviter l’apparition de complications systémiques de la péri-implantite.

Procédures

Les animaux seront soumis à l’implantation d’un biomatériau chargé en cation au niveau d’un défaut osseux critique de calvaria de rats réalisé au préalable (temps opératoire max : 20 minutes). Cette procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé.

Impact sur les animaux

Un des modèles les plus pertinents utilisés pour étudier la régénération osseuse est le défaut critique (5mm) de calvaria chez le rongeur. Par conséquent, ce modèle d’étude sur le rat consanguin Lewis a été étudié depuis plusieurs années, validé et publié. Les effets indésirables attendus peuvent être une difficulté de récupération de l’animal suite à l’anesthésie (stress, perte de poids, comportement anormal), l’apparition de douleurs au site d’implantation, une gêne fonctionnelle due à une réaction inflammatoire ou une mauvaise cicatrisation.

Devenir

En fin d’expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés grâce au dispositif d’euthanasie qui respecte respecter une phase d’endormissement suivie de l’euthanasie (durée totale 8 minutes), permettant ainsi une phase progressive d’endormissement sans douleur pour les animaux. Les calvarias seront ensuite prélevés et préparées pour réaliser des analyses au laboratoire qui permettront l’évaluation la repousse osseuse.

Remplacement

L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux fonctionnalisés en termes de biocompatibilité et d’ostéoconduction. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés en raison de l’étude menée sur le tissu osseux. Des études in vitro de cytocompatibilité des composites et d’étude de leur effet ostéogénique ont été réalisées et ont permis le choix de deux formulations, qu’il est maintenant nécessaire de tester in vivo sur le petit animal.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, le biomatériau utilisé a été sélectionné en amont et déjà testé pour sa biocompatibilité et sa capacité d’ostéoconduction in vitro. et in vivo. Pour les deux procédures réalisées en site orthotopique, les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de rats, soit 2 défauts par animaux, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. Par ailleurs l’étude de la bibliographie nous a permis de déterminer le nombre d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs afin de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants à l’obtention de résultats significatifs et à la valorisation des résultats de cette étude. Pour la phase d’analyse, les tests statistiques utilisés dépendront de la distribution des données.

Raffinement

Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à son sacrifice en fin d’étude. - Pour la chirurgie, une anesthésie générale et l’admission d’analgésiques sont prévus. -Aucune souffrance (ou très faible) n'est attendue lors des manipulations prévues. Une grille de score, des points critiques et un arbre décisionnel adaptés sont mis en place et les animaux seront observés tous les jours par les opérateurs et équipe d’animaliers. En cas d’apparition de symptômes, et si persistance malgré le traitement antalgique adapté, l’animal sera sorti de l’expérimentation et mis à mort dans les plus brefs délais.

Choix des espèces

Le modèle de défaut osseux critique de calvaria chez le rongeur est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude de la régénération osseuse et est parfaitement validé. Les animaux inclus dans cette étude seront des rats mâles âgées de 12 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance osseuse physiologique.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent six injections de tamoxifène, une greffe de cellules tumorales, et pour une partie une chirurgie d'ablation des ganglions lymphatiques, avec un suivi par imagerie sous anesthésie deux fois par semaine. Elles sont ensuite tuées pour prélever plusieurs organes. Le projet étudie le rôle d'une protéine dans les métastases et le lymphœdème, le porteur affirmant que l'étude d'un "organisme entier" ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

Le projet vise à déterminer le rôle de notre protéine d’intérêt, une phosphatase, dans les vaisseaux lymphatiques dans deux contextes liés au cancer : (1) les métastases d’origine lymphatique et (2) les lymphoedèmes post-résection des ganglions lymphatiques. Les métastases représentent la dissémination d’une tumeur dans le corps. Les lymphoedèmes sont des accumulations de fluide dû à un défaut des vaisseaux lymphatiques pour évacuer le surplus de fluide. Dans certains cancers, la résection des ganglions, soit l’opération de retirer les ganglions lymphatiques proches de la tumeur, est souvent nécessaire pour prévenir la formation des métastases. Malheureusement, cela peut avoir des effets négatifs tels que le lymphoedème. Par cette étude, nous voudrions répondre aux questions suivantes : (1) est-ce que l’expression de cette protéine dans les cellules lymphatiques joue un rôle majeur dans le développement de métastases, notamment dans la lymphangiogenèse associée ? (2) Cette protéine est-elle impliqué dans la formation de lymphoedème suite à une résection de ganglions lymphatiques ?

Bénéfices attendus

Les résultats préliminaires in vitro montrent que notre protéine d’intérêt, une phosphatase, a un effet sur la prolifération, la migration et le bourgeonnement des cellules endothéliales lymphatiques. Ceci suggère que cette protéine pourrait donc avoir un rôle dans la régulation de la formation des vaisseaux lymphatiques (lymphangiogenèse). Si cela est aussi observé in vivo, ce projet nous permettra d’ajouter un nouveau régulateur dans le processus et également une meilleure compréhension du rôle des phosphatases dans la lymphangiogenèse. La formation des vaisseaux lymphatiques est un processus important pour le bon fonctionnement de l’organisme et un dérèglement de ce processus entraîne souvent le développement ou l’aggravation d’une pathologie comme par exemple les lymphoedèmes (accumulation de fluide dans une partie du corps) ou les métastases (dissémination de cellules tumorales). Ainsi, tout régulateur de la lymphangiogenèse peut devenir une cible thérapeutique pour activer ou inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques afin de prévenir ou de guérir les pathologies. Par exemple, dans le cas des cancers avec un risque de métastase, les deux voies les plus probables pour les cellules tumorales sont les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Donc, en inhibant la formation de ces vaisseaux à la périphérie de la tumeur, le risque de métastase diminue. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de lymphangiogenèse comme traitement additionnel pourrait améliorer le traitement des cancers. On observe déjà ce type de traitement pour inhiber la formation de vaisseaux sanguins autour de la tumeur. Cependant, pour inhiber la lymphangiogenèse, il est nécessaire de mieux comprendre le mécanisme de formation des vaisseaux pour pouvoir cibler les régulateurs. Dans notre cas, notre protéine d’intérêt pourrait devenir une cible pour inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques dans les tumeurs. Cela pourrait également devenir une cible thérapeutique contre la formation de lymphoedème qui a aussi pour origine un dysfonctionnement des vaisseaux lymphatiques.

Procédures

Avant chaque procédure, tous les animaux (soit 320 max) recevront 6 injections de tamoxifen réparties sur 2 semaines. Chaque injection dure moins d’une minute par souris. Pour chaque procédure, les animaux sont anesthésiés sous isoflurane (un gaz) ou par injection d’anesthésiants. Pour l'injection de cellules tumorales en sous-cutanée, les animaux recevront une application d'analgésique local avant l'injection de cellules. Les animaux subissant une chirurgie plus importante recevront une injection d’analgésique avant chirurgie. 160 souris auront une injection de cellules tumorales (mélanome ou cancer du poumon) en sous-cutané, 80 souris auront une injection de cellules du cancer du sein au niveau des glandes mammaires et 80 souris subiront une chirurgie pour retirer les ganglions lymphatiques de la patte. Chaque chirurgie n’excède pas 5 minutes par souris. Après chirurgie, tous les animaux seront gardés en observation pendant le développement de la maladie jusqu’à la mise à mort. Si nécessaire, les souris recevront 1 ou 2 injections supplémentaires d’analgésique contre la douleur ou l’application d’un désinfectant cutané contre le risque d’infection. Les souris ayant reçu une injection de cellules tumorales auront un suivi du développement de la tumeur par imagerie 2 fois par semaine. Pour cela, les souris seront anesthésiées par isoflurane et recevront une injection d’un composé permettant la localisation des cellules tumorales avant d'être placé dans un imageur adapté pour une acquisition d’image sur animal vivant. L'acquisition d'image prend 6 à 25 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront suivis quotidiennement avec une fiche de suivi hebdomadaire et une pesée 3 fois par semaine. L’apparence et le comportement des animaux seront marqués sur la fiche de suivi. Pour chaque expérience, les animaux pourront présenter une perte de poids, des signes de douleur ou de gêne avec possible prostration, cachexie, tremblement ou isolement (voir chaque procédure pour plus de détails). Tous ces critères sont considérés comme des points limites lorsqu’ils dépassent un certain seuil. Le seuil est déterminé par le personnel de l’animalerie qui a une longue expérience de ce type de procédure. Lorsqu’un point limite est atteint, l’animal est immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance inutile.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus nécessaires aux analyses visant à déterminer s’il y a une différence au niveau de la formation des métastases et de lymphoedème. Ainsi plusieurs tissus et/ou organes seront prélevés sur chaque animal.

Remplacement

Le projet vise à caractériser le rôle d’une protéine spécifique au niveau des vaisseaux lymphatiques lors de métastases (dissémination de cellules tumorales) et de lymphoedème (accumulation de fluide dans une partie du corps). Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro. L’étude des métastases demande un organisme entier puisque les cellules tumorales circulent d’un organe à un autre en utilisant le système circulatoire de l’organisme. Le lymphoedème est également une pathologie qui s’étudie à l'échelle d'un corps entier. Il est également important de noter que des interactions complexes entre différents types cellulaires est nécessaire pour l’observation de ces phénomènes.

Réduction

Pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochables, un nombre de 10 souris par génotype sera nécessaire pour chaque expérience et les expériences seront répétées 4 fois (1 expérience pour ajuster les protocoles et 3 expériences pour prouver la reproductibilité des résultats) pour chaque procédure. La variabilité entre les expériences et entre les animaux pouvant être importante, un nombre d’animaux suffisant et plusieurs expériences permet d’avoir des résultats scientifiquement robustes. Nos 2 génotypes d’intérêt sont les souris avec une délétion inductible de notre protéine et les souris sans délétion inductible. Nous avons optimisé nos croisements pour n’obtenir que les génotypes d’intérêt à chaque portée pour limiter le nombre d’animaux. Donc 2 x 10 souris = 20 souris/expérience. Donc pour la procédure 1, où nous avons 2 lignées cellulaires différentes : 20 souris x 4 expériences x 2 lignées cellulaires = 160 souris. Pour la procédure 2 : 20 souris x 4 expériences = 80 souris. De même pour la procédure 3. Donc, nous estimons le nombre maximal d’animaux à 320. Pour la procédure 2, nous n’utiliserons que des souris femelles pour l’étude sur le cancer du sein. Afin de ne pas perdre les mâles des mêmes portées, nous les utiliserons pour les autres procédures en essayant de garder quand même une certaine mixité. Le ratio femelle/mâle des procédures 1 et 3 sera donc plus de l’ordre du 1 pour 3 que du 1 pour 1 dans certaines expériences en parallèles avec celles de la procédure 2. Les études statistiques seront réalisées avec les tests statistiques adaptés aux résultats.

Raffinement

Une surveillance d’une grande attention sera faite après chaque geste expérimental. Pour les injections de tamoxifen de chaque procédure, 10 minutes d’observation et une vérification 1h après. En cas d’inconfort ou de souffrance, l’animal sera tout de suite pris en charge par les soigneurs et sacrifié si son état est trop grave. En cas de saignement grave au niveau du site d'injection, l’animal sera immédiatement sacrifié. Pour chaque acte chirurgical, les souris seront anesthésiées et placées sur un tapis chauffant (37°C) avec une application de gel ophtalmique sur les yeux pour prévenir le dessèchement oculaire. Lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutané (procédure 1), un analgésique local sera utilisé pour prévenir la douleur dû à l’injection. Lors de l’injection des cellules tumorales dans la glande mammaire (procédure 2) et l'opération de retrait des ganglions lymphatiques (procédure 3), un analgésique et un désinfectant cutané seront utilisés pour réduire la douleur et prévenir les infections. Après chirurgie/implantation, les souris sont remis dans leurs cages avec leurs congénères (5 souris/cage) et observées jusqu’à leur réveil avec une vérification 1h après. Les cages seront enrichies en accord avec la procédure expérimentale. Des tunnels seront présents dans chaque cage. De la nourriture humide sera mise à disposition dans les cages si nécessaire, par exemple pour aider à l’alimentation suite à la chirurgie. Pour toutes les procédures expérimentales, il y aura un suivi quotidien des animaux et chaque changement physique ou comportemental sera noté sur une fiche de suivi quotidienne. Tout comportement anormal grave comme la prostration ou des tremblements entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal. Pour des changements plus légers, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et une décision sera prise en concertation avec le vétérinaire, les soigneurs et le responsable du projet pour définir la meilleure prise en charge de l’animal. Les soins seront toujours effectués par les mêmes expérimentateurs pour réduire le stress des animaux et tout le personnel de l’animalerie impliqué dans ce projet a les compétences et l’expérience nécessaire pour la partie expérimentale. Au cours du projet, nous nous maintiendrons informer des possibles améliorations de raffinement adaptables à nos procédures.

Choix des espèces

Le projet vise à caractériser le rôle de notre protéine d’intérêt au niveau des vaisseaux lymphatiques lors de métastases (dissémination de cellules tumorales) et de lymphoedème (accumulation de fluide dans une partie du corps). Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro puisque cela demande une conformation 3D à l’échelle d’un organisme entier, mais également des interactions complexes entre différents types cellulaires. L’implantation de tumeur chez la souris est par ailleurs une expérience couramment utilisée pour l’étude de la formation des métastases. La lignée de souris de notre projet, déjà existantes, permettra de déléter spécifiquement notre protéine au niveau des vaisseaux lymphatiques. Ce modèle nous permettra d’étudier l’implication de l’expression de notre protéine d’intérêt au niveau des vaisseaux lymphatiques dans les cas de métastases et de lymphoedème. Les souris sont également immunocompétentes car les cellules immunitaires peuvent avoir une grande influence sur les vaisseaux lymphatiques, notamment dans les cas de cancers où le microenvironnement est important. Nous commencerons les expériences sur des souris âgées entre 6 et 8 semaines afin d’avoir une bonne induction de la délétion de la protéine. L’utilisation de jeunes animaux permet également une croissance tumorale optimale et un système immunitaire performant. En effet, dans notre étude, il se peut que le système immunitaire ait un rôle important en lien avec les vaisseaux lymphatiques que nous étudions. Ces expériences d’implantation de tumeur peuvent prendre plusieurs semaines à plusieurs mois, particulièrement pour l’observation de métastases, donc il est mieux de commencer le plus tôt possible.

314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe d'un lymphome que le porteur décrit comme envahissant les tissus et aboutissant à la mort de l'animal, puis des injections de cellules et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes sont tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs tissus. Le projet évalue des cellules NK humaines produites selon un procédé breveté comme immunothérapie anticancéreuse, en vue d'un dossier réglementaire pour un essai clinique.

Objectifs

Nous produisons des lymphocytes « Natural Killer » humains à partir de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon, en passant par un stade de précurseur lymphoïde, selon une technique brevetée, qui permet d’obtenir en 2 à 3 semaines de très grandes quantités de lymphocytes NK immatures, présentant un degré de pureté supérieur à 90. Nous avons également montré que nous pouvions combiner la culture à une modification génétique par transduction lentivirale, qui permet d’apporter des propriétés antitumorales supplémentaires (par exemple un récepteur antigénique chimérique appelé CAR, dirigé contre un antigène tumoral). Les lymphocytes produits sont fonctionnels in vitro. Notre objectif est de caractériser in vivo la biodisponibilité et la fonction de ces cellules lymphocytaires, non modifiées ou modifiées génétiquement pour exprimer un CAR, et à les comparer à des lymphocytes matures du sang et des lymphocytes dérivées de cellules souches hématopoïétiques selon un protocole qui ne passe pas par l’étape précurseur lymphoïde. Ces deux sources de lymphocytes sont utilisées dans le cadre d’essais cliniques, mais présentent un certain nombre des défauts (résistance à la transduction, expansion limitée, apparition précoce de marqueurs d’épuisement). Nous utiliserons comme modèle une souris immunodéficiente humanisée et suivrons des schémas expérimentaux publiés. Nous répondrons à la question de la biodisponibilité in vivo des lymphocytes après greffe chez la souris. Nous validerons dans une étape pilote le modèle tumoral. Enfin, nous explorerons la capacité des lymphocytes armées avec un CAR à détruire des cellules tumorales par imagerie sur souris anesthésiée. Ce projet nous apportera les réponses scientifiques et les preuves précliniques du potentiel de ces cellules en immunothérapie anti-cancéreuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider la capacité des cellules NK produites dans nos conditions (brevetées) à persister après greffe. Il permettra également de valider la fonctionnalité des cellules NK. Au terme du projet, s’ils sont positifs, les résultats seront utilisés pour documenter le dossier exigé qui sera soumis aux autorités réglementaires pour la mise en place d’un essai clinique de phase I/II pour le traitement des lymphomes B. Les schémas expérimentaux et les résultats serviront de base à l’exploration de l’efficacité des cellules NK pour traiter des tumeurs solides.

Procédures

Aucun prélèvement sur animaux vigiles, ni procédures chirurgicales n'est prévu dans l'étude. Les interventions se limiteront à : 1) Injection d'agent de conditionnement. Durée de l’intervention : 30 secondes/souris. L’ensemble des souris (314) sont injectées 1 fois avec cet agent. Durée de l’intervention : 30 secondes/souris. 2) 3 jours après l’injection de l'agent de conditionnement, injection(s) de l'agent théeapeutique NK et/ou des cellules cancéreuses après anesthésie générale : 172 souris injectées 1 fois; Durée de l’intervention 5 minutes/ souris. 142 souris injectées 2 fois. Durée de l’intervention : 15 min/souris. 3) Injection de molécule pour permettre le suivi par bioluminescence après anesthésie générale. Maintien de l’anesthésie gaseuze durant l’aquisition au lecteur de bioluminescence. 164 souris injectées et anesthésiées 8 fois maximum pendant 1 mois. Durée de l’intervention : 15 min/souris. 4) Prélèvement de sang après anesthésie générale : 150 souris, 1 prélèvement par souris juste avant la mise à mort. Durée de l’intervention : 10 min/souris. 5) Mise à mort par dislocation cervicale immédiatement après le prélèvement de sang. Toutes les souris (314) sont concernées. Durée de l’intervention : 1 minute/souris. Au total, 150 souris subiront 4 injections et 1 prélèvement de sang. Les 22 aurtes souris subiront 12 injections et 8 séances d’imagerie. Les 142 souris restantes subiront 13 injections, 8 séances d’imagerie et 1 prélèvement de sang.

Impact sur les animaux

Le modèle tumoral est un modèle d’un lymphome de Burkitt, une tumeur liquide qui envahit les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate) et aboutit à la mort de l’animal. Les cellules NK ne provoquent pas d'effets indésirables. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses par voie caudale provoquent une douleur localisée légère. Les injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire provoquent une douleur localisée et un stress.

Devenir

Tous les animaux du projet (314) seront mis à mort pour prélèvement de tissus et leurs analyses (à J4 ou J7). Ces dernières nous permetteront d'étudier la biodisponibilté.

Remplacement

Notre protocole de production de cellules NK est, en soit, une méthode de Remplacement partiel, puisque nous partons de cellules souches humaines isolées de sang de cordon ou ou de donneurs adultes pour produire et expandre des cellules NK ex vivo avec un système complètement in vitro, sans nécessité de faire maturer les cellules humaines chez la souris. Les expériences chez l’animal interviennent au terme d’un long développement et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique. Les cellules NK produites selon le nouveau procédé ont été complètement caractérisées phénotypiquement et fonctionnellement. Toutefois, les expériences in vitro ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, des cellules NK dans les différents organes immunitaires, ou leur capacité à migrer dans les tumeurs, et à les détruire. L’efficacité des approches de thérapie cellulaires ne peut être évaluée in fine que in vivo dans un modèle mimant la maladie humaine. Les expériences sur l’animal sont donc justifiées avant leur application chez l’homme.

Réduction

Pour répondre à des questions de biologie cellulaire et moléculaire, nous utiliserons des cultures primaires, ce qui réduit fortement l’utilisation d’animaux. Cependant, les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études in vivo pour les réponses physiopathologiques liées à une manipulation génétique ou traitement pharmacologique. Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés.

Raffinement

Afin de limiter la souffrance et le stress infligés aux animaux, une surveillance rapprochée et l’utilisation d’antalgiques sont prévues. Des points limites ont été établis afin d’anticiper la mise à mort de l’animal si nécessaire. Dans le modèle tumoral en particulier, dans le cas où l’induction de la tumeur est à l'origine de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité (diminution des mouvements, perte d'appétit, perte d'intérêt de l'exploration, perte de poids, comportement stéréotypique lié au stress), l’expérience sera interrompue et l'animal mis à mort. Pour réduire le stress éventuel engendré par la procédure, les animaux seront hébergés dans un environnement exempt d’organisme pathogène, enrichi à l’aide de coton (pour la nidification), de tunnels de polycarbonate (pour les activités journalières) et de bâtons en bois (pour développer leurs exigences naturelles comme ronger, grimper et se cacher). D’autres outils seront disponibles à la demande pour éviter l’ennui si des animaux se retrouvent seuls dans les cages. Si une souffrance est avérée avec un score supérieur à 6 défini dans les procédures, les NSG-IL15 seront mises à mort pour une étude macroscopique des organes et/ou de l’immunohistochimie et/ou une analyse du statut sanitaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé car sa génétique est proche de celle de l’homme et elle permet d’avoir des nombres d’animaux suffisants pour faire des tests statistiques. Par ailleurs, il existe de nombreux outils (ex : anticorps) qui sont développés parfois exclusivement chez la souris. Les essais précliniques sur animaux sont exigés par les autorités réglementaires dans tout dossier préalable à la demande d’un essai clinique chez l’homme. Il est à noter que seuls les protocoles mis au point et validés in vitro seront testés chez l’animal. Les animaux utilisés seront au stade adulte, entre 10 et 12 semaines de vie. Ce choix se base sur l’âge auquel les lymphomes B se déclarent chez l’Homme et sur un protocole ayant montré des résultats encourageants.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie porte une mutation qui provoque une arthrite spontanée avec inflammation et douleurs articulaires dès l'âge de quatre semaines et jusqu'à la fin du protocole à vingt semaines, pendant lequel elles reçoivent les molécules testées durant douze semaines. Elles sont ensuite tuées pour des prélèvements. Le projet évalue des dendrimères contre la polyarthrite rhumatoïde, le porteur invoquant le "besoin" de nouveaux traitements et le caractère difficilement modélisable in vitro de la maladie.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie chronique, inflammatoire qui affecte principalement les articulations, induisant de forte douleur et une réduction de la mobilité articulaire. Dans la polyarthrite rhumatoïde, un réseau de médiateurs inflammatoires favorise l’inflammation chronique et la destruction osseuse. L’objectif de ce projet est d’utiliser le modèle animal basé sur la délétion d’un gène impliqué dans la résolution de l’inflammation, IL-1ra, pour étudier l’efficacité thérapeutique de nouveaux candidats médicaments dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Ce modèle animal conduit à un développement spontané et rapide d’une arthrite inflammatoire dont les caractéristiques tissulaires sont fortement similaires à la polyarthrite rhumatoïde humaine. Ce modèle animal a déjà été utilisé pour évaluer l’efficacité d’une molécule anti-inflammatoire pour le traitement de la polyarthrite rheumatoïde. Notre équipe étudie ces nouvelles molécules ayant une activité modulatrice du système immunitaire en ciblant plusieurs cellules inflammatoires. Nous avons validé ces propriétés anti-inflammatoires sur des cellules humaines et, pour certains, dans des modèles animaux en prouvant l’efficacité thérapeutique de ces nouvelles molécules dans d’autres modèles de maladies inflammatoires chroniques et aigües. Dans ce projet, ayant recours à 370 animaux, notre objectif est d’évaluer leur potentiel thérapeutique pour traiter la polyarthrite rhumatoïde dans le modèle IL1ra -/-, seuls ou en combinaison avec un traitement de référence pour cette maladie, le méthotrexate.

Bénéfices attendus

Dans la polyarthrite rhumatoïde, le système immunitaire attaque les tissus de l'organisme affectant principalement les articulations, ce qui peut entraîner de graves lésions articulaires, de fortes douleurs et un véritable handicap pour les patients. Cette maladie affecte près de 150 000 personnes en France et 10 % des patients montrent une invalidité grave en moins de 2 ans. Les traitements, dits de fond, pour cette maladie tels que le méthotrexate présentent une efficacité limitée et présentent de conséquents effets secondaires. Plus récemment, les biothérapies ciblées mises au point permettent l’obtention d’une réponse favorable dans près de 75% des cas, mais ces traitements sont très couteux et n’entrainent une rémission prolongée que chez 25% des patients. Ainsi, ces données, bien qu’encourageantes, montrent la nécessité du développement de nouveaux traitements ayant peu d’effets secondaires, peu couteux et entrainant des réponses durables. Des résultats préliminaires laissent à penser que les dendrimères PPH que nous avons développés pourraient répondre à ce besoin. Ainsi, les bénéfices attendus de ce projet sont de démontrer l’activité anti-inflammatoire et l’efficacité thérapeutique des dendrimères PPH sur un nouveau modèle de polyarthrite rhumatoïde. Cette étude - en combinaison avec nos datas confirmant l’activité immuno-modulatrice de nos composés obtenus dans d’autres modèles (in vitro et in vivo) et des études de toxicologie menées chez le rongeur et chez des primates non humains montrant que notre molécule candidate principale ne présente pas de toxicité - permettra d’avancer considérablement notre étude pré-clinique dans le but de mener par la suite des études cliniques chez l’Homme.

Procédures

Les animaux recevront des injections ou des administrations par voie orale des molécules à tester pendant 12 semaines (S8 à S19). Ces gestes, rapides et indolores pour les souris, seront réalisés sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les souris IL-1ra -/- peuvent subir une inflammation et des douleurs articulaires dès l’apparition des symptômes à l’âge de 4 semaines jusqu’à la fin du protocole expérimental (âge de 20 semaines). Si les animaux présentent des signes de douleur, nous administrons une analgésique. Si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids trop importante est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les souris concernées seront euthanasiées. De plus, pour limiter le stress des animaux, les souris seront hébergées avec d’autres animaux tout au long du protocole (5 souris par cage) et des objets enrichissants (du coton et des tubes en cartion) seront disposés dans les cages.

Devenir

À l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des pélèvements seront effectués pour les dosages biochimiques et les analyses histologiques.

Remplacement

Le travail de notre équipe s’inscrit dans la recherche et le développement de nouveaux médicaments pour combattre les maladies inflammatoires. Le processus de développement d’un nouveau médicament comporte plusieurs étapes. L’étude préclinique est la seconde étape fondamentale de ce processus. Elle fait généralement appel à l’expérimentation animale. C’est un pré-requis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. Ces expériences in vivo ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées in vitro. En outre, la polyarthrite rhumatoïde est une pathologie complexe qui résulte de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires et, de fait, est difficilement modélisable in vitro ou ex vivo.

Réduction

Nous avons planifié les expériences dans l’optique de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous réaliserons à l’issue des traitements des analyses anatomiques (histologie des articulations), cellulaires (analyses des cellules immunitaires dans les articulations et circulantes) et moléculaires (dosage de cytokines) à partir d’échantillons prélevés sur un même animal. Le nombre d'animaux à inclure sera déterminé, et nos résultats analysés, avec des analyses statistiques appropriées. Enfin, le modèle d’arthrite choisi est robuste (incidence élevée) et reproductible, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires par groupe.

Raffinement

Nous avons conçu nos expériences dans l’optique de réduire le stress et la douleur pour les animaux. Pour limiter le stress, les souris seront hébergées avec d’autres animaux tout au long du protocole (5 souris par cage). Du coton et des tubes en carton seront disposés dans les cages comme objets enrichissants. Si les animaux présentent des altérations physiques signes de douleur (flan creusé/dos voûté, yeux enfoncés/vitreux, anomalie respiratoire sévère, comportement anormal extrême tel qu’une aphasie ou un grattage excessif) un analgésique sera administré. Si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids de plus de 20% est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les souris concernées seront euthanasiées.

Choix des espèces

Les souris sont fréquemment utilisées pour modéliser la polyarthrite rhumatoïde et, en particulier, avec le modèle expérimental (IL-1ra -/-), que nous avons sélectionnées. Le choix d’utiliser des souris a aussi été conforté par le fait qu’il existe un plus grand nombre d’outils d’analyse disponibles (dont les réactifs immunologiques), par rapport aux autres espèces comme le rat. Nous avons choisi la souris IL-1ra -/-. Cette souche mutée pour l’antagoniste au récepteur à l’IL-1, est adaptée pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments pendant une longue durée. La souris BALB/cA sera utilisée comme contrôle non arthritique. Les souris seront âgées de 8 semaines ce qui est en conformité avec les précédentes études.

60 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'injection de vecteurs viraux dans le cerveau, puis des prélèvements mensuels de sang et de liquide céphalo-rachidien, avant d'être tués par perfusion intracardiaque pour prélever leur cerveau. Le projet valide des outils de thérapie génique avant un passage chez l'humain. Le porteur justifie le recours au primate en invoquant explicitement l'"éthique spéciste" qui interdit ces approches invasives chez l'humain, et la proximité anatomique du macaque avec l'espèce humaine.

Objectifs

En raison du vieillissement progressif de la population et de l'absence de traitements curatifs, le nombre de personnes souffrant de maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, Alzheimer et autres démences, sclérose latérale amyotrophique…) a considérablement augmenté au cours des dernières décennies et devrait croître de manière régulière dans les années à venir. Qu’elles soient génétiques ou acquises, un grand nombre de ces affections pourraient bientôt bénéficier de l’apport de nouvelles stratégies innovantes basées sur la thérapie génique. Cette approche utilise des virus modifiés ; ils ont perdu leur pouvoir de se multiplier mais peuvent apporter après modification de leur génome, dans des cellules ou des organes malades, un gène réparé, ou des molécules qui soignent. On parle alors de vecteurs viraux. La famille des virus adéno-associés (AAV) sont des outils de thérapie génique très utilisés. De nombreuses recherches « in vitro » sont menées pour améliorer sans cesse leur efficacité en termes de quantité /qualité produite, de tolérance, de diversité de molécules rapportées, de ciblage des cellules au sein des organes à soigner. La phase suivante de validation de ces outils sont des études « in vivo » chez l’animal pour vérifier leur non toxicité, leur tolérance, leur diffusion, leur capacité d’entrée dans les cellules cibles (on parle de transfection). Pour le cerveau, la voie la plus efficace d’administration de ces vecteurs viraux pour l’heure est l’injection intracérébrale par stéréotaxie. La mesure des effets des vecteurs viraux se fait ensuite par des analyses biochimiques sur de prélèvements biologiques puis cellulaires après leur mise à mort pour prélever le cerveau. Les études précliniques nécessitent de valider ces outils chez le Primate Non Humains (PNH). Le but de ce projet est de valider dans le cadre d’une activité pré-clinique de service chez le macaque de nouveaux vecteurs viraux qu’ils soient porteurs d’une molécule « contrôle » fluorescente ou de protéines d’intérêt à visée thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensable avant les essais chez l’homme. Les expérimentations sont essentiellement menées sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’administrer un nouveau composé à l’homme sain ou malade compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. A terme, nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils de thérapie génique chez un modèle de grand animal, pour demander par la suite une autorisation d’essai clinique chez des patients atteints de formes précoces et sévères (formes génétiques en particulier) des maladies neurodégénératives.

Procédures

Procédure chirurgicale: 1 par animal, la durée de la chirurgie est de 60-120 min en fonction du nombre de structures ciblées et leur volume d’injection. Prélèvement sanguins: 2 par animal mensuel et LCR (liquide céphalo-rachidien): 1 par animal mensuel, la durée d'un prélèvement est de environ 15 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou au prélèvement biologique fait sous anesthésie générale. Pour la chirurgie: stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible, infection au niveau des points de sutures. Pour les prélèvements (sang, LCR) : : stress de la contention et de l’anesthésie, stress, hématome, douleur possible. L’effet l’administration des AAV et de leur toxicité possible est l’objet de ce projet, même si les AAV sont réputés pour leur faible toxicité, une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de les détecter.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque aux temps expérimentaux définis pour étudier l’efficacité du traitement sur le modèle animal pathologique. Le cerveau et éventuellement d’autres tissus seront alors prélevés puis mis à disposition pour réaliser les analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité pré-clinique de service. Des études préliminaires réalisés chez le rongeur ont permis de valider la diffusion et la non-toxicité des vecteurs AAV. Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH, vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 3) Enfin, dans le cadre des modèles de maladies neurodégénératives, l’objectif à terme (bien que non décrit dans le présent projet) est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (moteur, cognitif) de ces affections qui en tant que telles ne peuvent être étudiées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. Dans bien des cas par exemple les immunothérapies (ce qui est le cas avec les AAV) testées ne peuvent interagir qu’avec des tissus provenant de PNH, ce qui impose souvent l’utilisation du modèle primate.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques avec un nombre évalués à 3 études par an, comprenant 4 animaux par étude (soit un total de 60 animaux sur 5 ans). Nous bénéficions d’un plateau de haute technicité (cadre stéréotaxique, Imagerie, stabulation) nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les composés testés en traitement sur nos PNH auront été préalablement testés in vitro par nos clients, pour déterminer les doses à utiliser et s'affranchir d’éventuels effet toxiques. Enfin, les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude s’ils sont destinés de prime abord pour des études histologiques visant à confirmer l’efficacité au niveau cellulaires des différents traitements, peuvent également renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque). Ceci afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’état des animaux est observé et quantifié selon des critères objectifs permettant d’établir des scores de bienêtre et de déterminer des points limites à partir desquels les actions adaptées sont menées (des massages, le maintien de l’animal au chaud autour d’une couverture, la modification de la nature et le change plus régulier de la litière, l’augmentation de la fréquence des pesées, le gavage avec des complément alimentaire, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons en dehors de la sphère médicamenteuse pour améliorer l’état de santé de nos animaux).. Pour un score sup à 10, le sujet sort immédiatement du protocole d’expérimentation, pour réaliser les traitements et les soins nécessaires en accord avec le vétérinaire jusqu’à son rétablissement (score inférieur à 5). Au-delà de 15 , la décision d’euthanasie compassionnelle sur avis vétérinaire est prise. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adapté au poids de l’animal, Les prélèvements de LCR sont faits sur animaux sédatés. Les prélèvements de sang sur animaux vigiles avec une légère contention. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. L’échelle de bien être est là aussi utilisée pour estimer la gêne occasionnée par ce geste. Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.).

Choix des espèces

L’utilisation des vecteurs viraux a déjà fait l’objet d’une validation préalable chez les rongeurs (rats, souris) tant chez des modèles naifs que sur des modèles de maladies neurodégénératives. Bien que notre projet n’implique pas la modélisation d’une maladie neurodégénérative per se chez le PNH, l’utilisation de la thérapie génique en tant qu’expérience préliminaire permettra une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques sous-tendant les déficit mnésiques et/ou moteurs observés dans ces pathologies. A terme, nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance de notre stratégie de thérapie génique chez un modèle de grand animal, pour demander par la suite une autorisation d’essai clinique chez des patients atteints de formes précoces et sévères (formes génétiques en particulier) de ces maladies. Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger les patients, en démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Les maladies neurodégénératives sont des maladies chroniques progressives qui touchent le système nerveux central. Leur fréquence augmente avec l'âge chez l’homme. Afin d’être au plus prêt de cet état, dans ce projet, les animaux utilisés seront donc adultes.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien de tamoxifène pendant cinq à quinze jours, dont le porteur reconnaît le risque de perforation de l'œsophage ou de passage dans les poumons, subissent un test d'effort sur tapis roulant une heure par jour et un séjour de sept jours en cage métabolique isolée. À la fin, les 650 sont tuées pour prélever leurs organes. Le projet étudie le rôle de deux facteurs de transcription dans la croissance musculaire, le porteur affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne peut reproduire ce processus.

Objectifs

Le muscle squelettique est un tissu hautement spécialisé capable de se régénérer et de s’adapter à son environnement. La mécanotransduction se définit par la façon dont la cellule intègre le signal mécanique et le transforme en signal biochimique lui permettant de réagir, de s’adapter et même de modifier l’expression de ses gènes. Nous nous intéressons à 2 facteurs de transcription qui ont récemment été identifiés pour jouer un rôle clef dans la mécanotransduction dans divers tissus dont le muscle squelettique. De récentes données, montrent que ces 2 facteurs sont importants pour maintenir le bon fonctionnement du muscle squelettique adulte et la taille des organes car leur dérégulation peut conduire à un phénotype musculaire retrouvées dans différentes pathologies musculaires telles que les dystrophies musculaires. Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels spécifiquement dans le muscle.

Bénéfices attendus

A terme ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à des désordres de croissance, de régénération et de respiration mitochondriale dans le muscle. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans d’autres pathologies musculaires et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Des souris seront soumises à des injections par gavage quotidiennement durant 5-15 jours pour induire l'inactivation de gènes spécifiques et seront ensuite mises à mort pour examen des tissus. Des souris seront soumises à un test d'effort musculaire à l'aide d'un tapis de course informatisé pendant 1H sur une période de 5 jours consécutifs pour évaluer les fonctions métaboliques dans le tissu musculaire. Des souris seront placées en cage métaboliques pendant 7 jours.

Impact sur les animaux

Certaines souris pourraient dévéloppées des problèmes de locomotion. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’oesophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. La mise en cages métaboliques des animaux pendant 7 jours peut générer un stress lié à l’isolement.

Devenir

A l'issue des Procédures, l'ensemble des 650 animaux seront mis à mort afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

La croissance et régénération musculaire est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle cellulaire ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations hormonales. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes concernés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.

Réduction

L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. De plus, l’expérience du laboratoire montre qu’un groupe de 50 animaux est suffisant pour le test statistique choisi. Des groupes de 50 animaux seront donc utilisés. De plus, nous utiliserons un nombre minimal d'animaux pour avoir une puissance statistique (n= 650).

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement, d’élevage et de soins sera respecté par l’emploi de points limites précoces entraînant la mise à mort des animaux. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton et de « maisons » en carton. Les animaux sont observés tous les jours par le personnel qualifié pour assurer leur bien-être. Pendant les procédures, les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites tous les jours. Par ailleurs, toute procédure douloureuse ressentie par les souris entrainant une douleur, une souffrance ou une angoisse entrainera la mise à mort de l'animal. Le traitement au tamoxifen est donné sous forme de gavage quotidien qui sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des gavages sera réduit au minimum possible. Selon les seuils atteints, l’interruption de la procédure et la mise à mort anticipée de l’animal sera possible.

Choix des espèces

Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes de la signalisation hippo jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons également de nombreux outils (anticorps, vecteurs, méthodes) adaptés à la souris ; 4) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. L’âge des animaux choisis pour l’induction au tamoxifen sera de 1 à 3 mois. Il est nécessaire que l’organogenèse soit terminée. L’âge de mise à mort sera choisi en fonction de l’âge de la survenue du phénotype musculaire attendus vers 1,5-4 mois.

612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales sont injectées dans leur poumon par chirurgie, puis elles reçoivent des agents d'imagerie radioactifs et subissent jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie ainsi que des prélèvements sanguins et des traitements anticancéreux. À la fin, toutes sont tuées pour prélever leurs organes. Le projet cherche à valider par imagerie TEP cinq biomarqueurs prédictifs de l'efficacité de thérapies, le porteur renvoyant le bénéfice pour les patients au transfert clinique ultérieur.

Objectifs

Les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) représentent environ 75 à 80 % des cancers bronchiques. Des progrès significatifs dans la compréhension des dérèglements moléculaires sous-jacents aux CBNPC ont ouvert de nouvelles opportunités de thérapies ciblées et plus personnalisées. Celles-ci nécessitent d’utiliser des indicateurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique, quantifiables au cours du temps, ce que l’on appelle des biomarqueurs (ce peut être un gène, une protéine, un mécanisme cellulaire…). Ces biomarqueurs prédictifs permettront de cibler au mieux le choix thérapeutique en fonction des patients et de leur pathologie. L’une des méthodes employées pour évaluer un biomarqueur d’une tumeur consiste à effectuer des prélèvements de tissus tumoraux (biopsie) et/ou sanguins et à y quantifier le biomarqueur. La méthode est invasive et complique la prise en charge du patient. De plus, les prélèvements effectués ne sont pas nécessairement représentatifs ni de l’intégralité du volume tumoral, ni de l’évolution au cours du temps de la tumeur. L’imagerie moléculaire, notamment l’imagerie hautement quantitative par tomographie par émissions de positon (TEP) permet une visualisation corps entier, au cours du temps de ces biomarqueurs d’intérêt. L’objectif du projet est d’évaluer par imagerie TEP couplée avec l’imagerie IRM ou optique cinq nouveaux biomarqueurs prédictifs de l’efficacité de thérapies ciblées antitumorales, particulièrement les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (tels que des immunothérapies associés à des chimiothérapies et/ou à de la radiothérapie interne ou externe). Cette évaluation se fera en utilisant des modèles de cancers pulmonaires chez la souris. Les biomarqueurs évalués seront soit tumoraux soit liés au système immunitaire qui joue un rôle clé dans l’efficacité de ces thérapies ciblées. L’évaluation de ces nouveaux biomarqueurs en y associant des ligands spécifiques aux biomarqueurs d’intérêt en imagerie TEP permettra d’apporter des preuves suffisantes de l’importance de ce couple biomarqueur et imagerie TEP pour un transfert chez l’humain. Les résultats de ce projet devraient permettre de valider cette approche pour ensuite transférer au niveau clinique la méthodologie.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de valider de nouveaux biomarqueurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique d’un traitement donné, essentiels pour améliorer la prise en charge des patients. Malgré des résultats prometteurs des différents axes thérapeutiques, que ce soit l’immunothérapie, la radiothérapie et les thérapies ciblées (i.e. ciblant spécifiquement certaines protéines, afin de bloquer des mécanismes tumoraux), seulement une partie de la population bénéficie de l’efficacité de ces thérapies : de multiples facteurs liés à la tumeur elle-même (son sous-type) et au patient (le stade de sa maladie, son système immunitaire, des facteurs génétiques…) font que le pronostic d’efficacité ne sera pas le même pour deux patients. Pour soigner le plus grand nombre, il faudrait pouvoir répartir les patients en sous-groupes homogènes pour lesquels on pourrait prédire quelle thérapie est la plus adaptée. Cette meilleure stratification des patients est largement facilitée par l’utilisation de biomarqueurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique. Actuellement, la quantification des biomarqueurs prédictifs repose principalement sur des techniques invasives et locales, telles que l’immunohistochimie sur des biopsies de patient. L’imagerie TEP est une technique corps entier, très faiblement invasive, dynamique et hautement quantitative. L’objectif du projet est de valider ainsi des couples biomarqueurs et radioligands à base d’anticorps ou de peptides pour de l’imagerie TEP afin de prédire l’efficacité thérapeutique, offrant ainsi un outil décisionnel complémentaire aux biopsies à l’oncologue pour mieux personnaliser le traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : La mise en place du modèle tumoral (30 minutes d’intervention, une seule injection par animaux) : des cellules tumorales seront injectées dans le poumon pour la formation de tumeurs dans l’environnement primaire de la lignée cellulaire. L’injection d’agents d’imagerie radioactifs (imagerie par tomographie par émission de positon), fluorescents (imagerie optique) et/ou IRM pour le ciblage de biomarqueurs d’intérêt et pour le suivi du volume tumoral, réalisée via une injection systémique (temps d’injection 5 minutes, nombre d’injection total par souris : maximum 3). Une anesthésie lors des différentes sessions imageries (temps d’anesthésie durant l’imagerie entre 15 minutes et 70 minutes, en comptant un maximum de 8 sessions d’imagerie à des dates différentes pour un suivi dynamique du traceur dans le cas de l’imagerie par tomographie). Un prélèvement sanguin sur animaux sous anesthésie (maximum 5 minutes, 2 fois maximum par session d’imagerie à des jours différents).

Impact sur les animaux

La mise en place de modèles tumoraux peut induire une gêne au niveau du site d’implantation de la tumeur. Un suivi régulier des animaux sera réalisé. Les effets indésirables prévus sur les animaux : • L’injection des radioligands en intra veineux peut induire une courte douleur (moins de 5min). • Les souris seront endormies lors des sessions d’imagerie (1h30 maximum) par voie gazeuse (isoflurane 1,5% à 2,5%). Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. • Le geste chirurgical induira une douleur au niveau du thorax. L’acte chirurgical durera 20min. Les traitements (radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapie et thérapie ciblée) peuvent avoir une toxicité non spécifique au niveau des organes sains. La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines. Cette toxicité sera limitée par l’utilisation de dose thérapeutique décrite et validée dans la littérature.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Ceci permettra de prélever les organes afin de pouvoir effectuer les analyses ex-vivo sur ceux-ci.

Remplacement

Dans une première approche, toutes les stratégies thérapeutiques sont testées sur des cultures cellulaires et des organoïdes afin de déterminer leur pertinence et pour certains biomarqueurs, leur surexpression au niveau des tumeurs. Les tests in vitro préliminaires mis en place permettront de définir au préalable la stratégie appliquée in vivo afin de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons pour l’évaluation sur le modèle murin. Cependant, le microenvironnement tumoral est difficilement reproductible in vitro. Afin de valider les biomarqueurs et la stratégie associée par imagerie, les tumeurs doivent être implantées dans l’organe cible, ici le poumon.

Réduction

L’imagerie permet des études longitudinales en pharmacocinétique et par conséquent ne nécessite pas l’utilisation d’animaux à chaque temps, réduisant drastiquement le nombre de groupe d’animaux nécessaires pour des études classiques en pharmacologie. Chaque donnée d’imagerie individuellement ou globalement permettra après analyses de définir la distribution des agents thérapeutiques de manière longitudinale en gardant la puissance statistique de l’étude.

Raffinement

Toutes les interventions invasives, à savoir les injections systémiques, seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse complétée par une anesthésie locale et des soins post-opératoires adaptés afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Un suivi régulier et des points limites permettront d’éviter toute souffrance animale. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 en milieu enrichi.

Choix des espèces

Ce projet a comme objectif d’évaluer de nouveaux biomarqueurs prédictifs selon quatre axes thérapeutiques prometteurs (les immunothérapies, la radiothérapie, la chimiothérapie couplé à l’immunothérapie et les thérapies ciblées). La souris est l’animal de choix pour la mise en place de modèle tumoraux, ayant une taille adaptée pour la manipulation et l’imagerie corps entiers. Les modèles permettant une implantation de la tumeur dans son environnement d’origine sont largement utilisés pour examiner le microenvironnement tumoral essentiel pour valider les stratégies thérapeutiques et les biomarqueurs prédictifs. Les souris utilisées dans ce projet auront atteint un stade jeune adulte (5 semaines) à adulte ( 8 semaines). Cette tranche d’âge permet d’être représentative des cancers pulmonaires chez les patients majoritairement à l’âge adulte.