Recherche appliquée

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur humaine leur est inoculée, avec des injections de traitement deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la tumeur peut nécroser ou s'ulcérer, l'animal étant tué si elle dépasse 2 000 mm³. Il affirme que la validation de ces anticorps ne peut s'effectuer que chez l'animal vivant, l'entrée en essai clinique restant une perspective.

Objectifs

L’immunothérapie constitue un véritable espoir dans le traitement de nombreux cancers, notamment dans ceux sans prise en charge efficace actuellement. Ce traitement consiste principalement en l’administration d’anticorps monoclonaux dirigés contre les cellules tumorales ou leur microenvironnement afin de limiter la croissance tumorale. Plusieurs types d’anticorps monoclonaux peuvent être utilisés dans ce but, sous réserve que le patient présente bien la protéine ciblée au sein de sa tumeur. D’autres anticorps monoclonaux ont une action immunomodulatrice en levant le mécanisme d’inhibition du système immunitaire induit par la tumeur. Ces mécanismes sont communs à plusieurs cancers et ces traitements récents ont des indications dans déjà sept types de cancers : poumon, rein, vessie, tête et cou, mélanome , maladie de Hodgkin et maladie de Merkel et sont actuellement évalués dans de nombreux autres cancers. Bien que des réponses remarquables et prolongées aient pu être observées chez des patients atteints de cancers avancés métastatiques, un nombre important de patients (80 à 60% selon les cancers) restent réfractaires au traitement.

Bénéfices attendus

La première partie de ce projet permettra de compléter la caractérisation de notre produit par confirmation des marqueurs tumoraux identifiés et permettra de de débuter un essai clinique chez l’homme , dans des cancers ou le besoin médical est très important. Dans le cadre du lymphome cette étude permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique de notre candidat médicament et ainsi d’offrir une vrai alternative thérapeutique aux patients atteints de lymphomes T périphériques et ne bénéficiant d’aucune prise en charge actuellement

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur humaine via injection en sous-cutanée sous anesthésie ou via injection en intra-péritonéale sur animal vigile. Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéal pour les traitements (2 fois par semaine pendant 4 semaines) sur animaux vigiles. L'anesthésie pour l'injection en sous-cutanée sera de courte durée :< à 5 min par souris. Pour les injections en intrapéritonéale la manipulation des souris n'excédera pas 1 min.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux sous-cutanées peuvent provoquer de la douleur si la tumeur nécrose ou s’ulcère (points-limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, celui-ci sera mis à mort si la tumeur atteint 2000mm3 (soit moins de 10% de la masse corporelle). Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. Les modèles tumoraux sous-cutanés sont considérés comme des procédures modérées. Les modèles de lymphomes T périphériques peuvent induire une splénomegalie, mais aucune autre altération majeure n’est attendue. L’état clinique et le poids des souris seront suivies 3 fois par semaine. Ces modèles sont également considérés comme des procédures modérées.Une contention légère sera fait sur les souris pour l'administration intrapéritonéale par du personnel qualifié afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Cette manipulation ainsi que la piqure ne durera que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères. La manipulation des souris pour mesurer la masse tumorale n’excédera pas 1 min. elle se fera 3 fois par semaine dont 2 fois en même temps que l’injection des traitements afin d’éviter les manipulations intempestives.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.

Remplacement

Du fait du contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire, la validation d’un traitement par anticorps polyclonaux ne peut s’effectuer que dans un modèle in vivo. Il est nécessaire d’utiliser des animaux pour atteindre les objectifs du projet car cette étude a pour objet l'évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un ou plusieurs traitements en préclinique. Les animaux sont indispensables à cette étape d’évaluation thérapeutique du traitement car ils permettent de tester in vivo l’efficacité ou la non-efficacité du (des) traitement(s), de caractériser le fonctionnement du (des) traitement(s), ainsi que les effets secondaires possiblement liés avant de le tester en clinique chez l’Homme si celui (ceux)-ci est efficace.

Réduction

Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 10 -15 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Les tests statistiques utilisés reposent sur l’analyse de données non paramétriques, calculée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ces tests nous permettent d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.

Raffinement

Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si leur score clinique global atteint 8 sur deux jours consécutifs tel que décrit dans le tableau de score clinique général ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. L’analgésie quant à elle dépendra de la cause. Pour les animaux en souffrance tels que les animaux ayant un score clinique > à 7 sur deux jours consécutifs, l’animal se verra administrer en sous-cutané une injection de buprénorphine à 0.1mg/kg deux fois par jour jusqu’à diminution du score ou exclusion de l’étude. Pour les plaies de surface comme les morsures, après désinfection, les animaux pourront recevoir directement sur la plaie de la tétracaïne.

Choix des espèces

La souris NMRI nude est très largement utilisée pour la mise en place de modèle xénogreffe. De plus elle présente une activité résiduelle du complément murin, ce qui la rend pertinente pour l’évaluer l’activité biologique de nos traitements à base de d’anticorps polyclonaux. Tous les modèles xénogreffe décrit dans ce projet ont été validé et caractérisé dans des publications. Adulte-8-10 semaines, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.

1 200 souris et 300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire leur est greffée, avec jusqu'à deux chirurgies, radiothérapie, imagerie et prélèvements sanguins, puis mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la tumeur peut réduire la mobilité, se nécroser ou métastaser jusqu'aux poumons. Il affirme que l'animal est un passage obligatoire avant l'humain, les bénéfices étant renvoyés au long terme.

Objectifs

Les cancers du sein sont les cancers les plus fréquents chez la femme. Ils représentent une pathologie très hétérogène. Ainsi, deux patients ayant le même diagnostic initial pourront présenter des réponses aux traitements conventionnels très différentes. Un seul type de modèle ne peut donc représenter l’ensemble de ces pathologies. Ce projet vise à évaluer les propriétés anti-tumorales de différentes approches thérapeutiques incluant notamment des candidats médicaments, la radiothérapie ou encore l'utilisation de dispositifs médicaux dans des modèles de tumeurs mammaires obtenues par greffe de cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers du sein. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé ou le dispositif médical testé est actif dans un modèle expérimental de tumeurs mammaires ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

En fonction de l'étude, les animaux pourront subir au maximum 2 chirurgies de 5 à 15 min chacune, sous anesthésie générale, pour l'implantation d'un dispositif médical et l'exérèse chirurgicale de la tumeur mammaire. Ils seront également anesthésiés au moins une fois, généralement par anesthésie gazeuse, pour l'implantation des cellules tumorales. Ils pourront également être anesthésiés plusieurs autres fois au cours de l'étude pendant quelques minutes, généralement par anesthésie gazeuse, afin de procéder à des traitements comme la radiothérapie et/ou à des suivis par imagerie. Dans le cas de radiothérapie, les animaux seront traités généralement pendant 5 jours consécutifs. Les suivis par imagerie se feront eux généralement 1 fois tous les 7 à 15 jours pendant environ 2 mois. Les animaux pourront également subir plusieurs prélèvements de sang dans le respect des recommandations éthiques (volumes prélevés, fréquences et temps de récupération).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur mammaire peut entrainer un inconfort voire une réduction de la mobilité des animaux. Les tumeurs peuvent également développer une nécrose. Des métastases, en particulier au niveau des poumons, peuvent entrainer des difficultés respiratoires. Par ailleurs, les effets potentiellement indésirables du/des produits testé(s) font l’objet d’échange avec nos promoteurs et les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Mise à mort de l'ensemble des animaux à la fin de l'étude pour réaliser des prélèvements d'organes et/ou des observations macroscopiques.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les tumeurs mammaires. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 6-10 animaux/groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • le suivi d’éventuel signes cliniques, • la détermination des points limites, • le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire. • un protocole analgésique adapté pour les chirurgies et la période post-opératoire ainsi qu'un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • la réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans les modèles animaux de tumeurs mammaires obtenues par greffe de matériel biologique d’origine tumorale. Les animaux utilisés sont des animaux adultes âgés de 6 à 10 semaines au moment de l’implantation des cellules tumorales. La prise tumorale est connue pour être moins bonne chez des individus plus âgés.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections intramusculaires répétées de deux candidats myorelaxants, avec prélèvements sanguins, puis sont tués pour analyse du muscle. Le porteur n'attend aucun signe clinique et situe les nuisances dans le stress de contention et la douleur des injections. Il affirme que les modèles cellulaires sont débattus et ne reproduisent pas le système immunitaire, l'étude vérifiant l'absence de réaction immunitaire à ces molécules d'un développeur privé.

Objectifs

Après avoir démontré le bénéfice d’efficacité des produits (FTP-501 et FTP-101) face aux produits de référence utilisés en clinique lors de projets précédents, ce projet expérimental s’intéresse au potentiel immunogène de ces candidats. Cette étude a pour objectif de confirmer la non-présence d’Anticorps Anti-Drug (ADA) suite aux injections des différents composés. Ces molécules pourraient a priori provoquer une réaction immunitaire suite aux injections, diminuant ainsi l’efficacité du traitement et sa tolérance. Il est donc important de vérifier qu’une telle réaction est limitée ou inexistante.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont un impact sociétal important. La dystonie est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé nos 2 premiers Lead (FTP-501 et FTP-101) quasiment au terme de leur développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (FTP-101), et d’autres offrent un effet durable par exemple (FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Ce projet permettra de vérifier qu’aucune réaction immunitaire ne se manifeste suite aux injections et que les produits sont bien tolérés quelle que soit la dose injectée, et bien tolérés après des injections répétées.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection intramusculaire = 3 injections, durée 30 secondes/injection/animal = 1 min 30 sec - Pesée des animaux = 7 pesées / animal => 30 secondes / pesée = 3 minutes 30 sec / animal - Prélèvements de sang = 7 maximum par animal, durée 2 minutes = 14 minutes / animal.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, aucun signe clinique ni effets secondaires n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans nos études précédentes et la littérature. En effet lors de nos précédents projets, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à une seule injection n’a été observé. Nous n’attendons pas ici de réactions suite aux multiples injections. Dans le cadre de nos procédures, les nuisances attendus sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection, une douleur liée aux injections i.m. et les multiples prélèvements de sang (6 maximum).

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. Un prélèvement pour analyse histologique du muscle injecté sera réalisé.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). De plus, nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe (impossible à reproduire dans sa globalité in vitro) et nécessite des expérimentations in vivo.

Réduction

Pour la réduction, la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a été déterminé avec le logiciel G-Power. Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 10 animaux par groupe (5 mâles et 5 femelles). Cependant, si les résultats sont dépendants du sexe, les groupes d’analyse seront de 5 animaux. Cette taille de groupe nous permet néanmoins d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des cages en plastique transparent de 1800cm2 au sol et comportant une plateforme. Les cages seront ventilées individuellement, placés dans une pièce sous air conditionné, avec un cycle jour/nuit de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Ils seront maintenus en groupe de 2 ou 3 rats par cage. Ils disposeront de matériel de nidification (litière en chips de cellulose) puis d’enrichissement : les rats ont un tunnel rouge ainsi qu’un bâton de bois à ronger. Les animaux seont surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur entraîné, et via une approche limitant le stress et la douleur, tout en ne dépassant pas les limites de volume prélevables chez un rat.

Choix des espèces

La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes interne. Nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe et nécessite des expérimentations in vivo. De plus, nous avons choisi le rat d’une part, par continuité avec nos études précédentes et notre expérience sur ce modèle et d’autre part, car il s’agit d’un modèle de choix pour des études de toxicité de composé. Nous utiliserons des rats Sprague Dawley âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 18 semaines maximum en fin d’expérimentation (600g pour les mâles). Des jeunes adultes sont choisis ici pour le bon fonctionnement de leur système immunitaire.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On provoque une inflammation chez des femelles gestantes porteuses d'une mutation, pour observer les effets sur le développement nerveux des embryons, avec suivi par échographie. Le porteur indique que l'injection peut induire un développement anormal in utero et une mise bas prématurée. Il affirme qu'il est impossible de remplacer ce modèle muté, les retombées cliniques étant renvoyées à une meilleure compréhension des pathologies.

Objectifs

Lorsque des infections sont contractées durant la grossesse, il en résulte l’apparition de davantage de pathologies du neuro-développement (PND), autisme, paralysie cérébrale, schizophrénie etc. Ces pathologies sont dues en particulier à un développement anormal du système nerveux. De plus, les naissances prématurées qui peuvent s’y ajouter sont un facteur également aggravant. Il a récemment été montré que des anomalies de motricité apparaissent précocement, avant que les anomalies cognitives ne puissent être diagnostiquées. Des travaux récents ont mis en évidence des mutations dans certains gènes, qui jouent un rôle crucial dans le développement du système nerveux central, et qui sont impliqués dans de telles pathologies neuro-développementales. L’existence simultanée d’une inflammation placentaire accentuerait les conséquences de ces modifications génétiques. Lors d’infections au cours de la grossesse, une inflammation du placenta peut être décelée et impacter le développement des embryons. En cas de fragilités génétiques dues à des mutations chez certains embryons, le développement normal du système nerveux est perturbé, ce qui peut conduire à différentes pathologies neurodéveloppementales. Nous provoquerons une situation d’inflammation chez la souris gestante, et nous analyserons l’effet de mutations dans les embryons sur : (i) des marqueurs inflammatoires présents dans les fluides amniotiques des portées, (ii) le développement neuro-anatomique du système nerveux, (iii) de l’appareil neuro-moteur dont les masses musculaires, ainsi que (iv) le développement du placenta.

Bénéfices attendus

Le gène étudié permet la transmission de signaux de l’environnement en permettant notamment le développement embryonnaire du cerveau. Son étude dans des modèles de souris nous permettra d'obtenir une meilleure compréhension des signaux moléculaires et cellulaires et des facteurs multiples conduisant aux pathologies neuro- développementales dans le contexte inflammatoire de la grossesse. Elle devrait également conduire à une amelioration du pronostic des troubles précoces du développement neuro-moteur.

Procédures

Les souris seront accouplées pour déclencher une gestation. Les accouplements seront réalisés jusqu’à l’obtention de 6 souris gestantes par groupe. Les souris suivies subiront 4 examens d'imagerie non invasive pour le suivi des gestations sous anesthésie générale ne dépassant pas 20 minutes. Au cours de cette gestation, une réponse inflammatoire suite à une seule injection (durée maximale : 30 sec) sous-cutanée d’une molecule déclanchant l’inflammation sera générée pouvant entraîner des défauts de développement in utero.

Impact sur les animaux

Impact de l’agent inflammatoire sur l’état général des souris : une vigilance sera portée sur l’inflammation provoquée, même si des conséquences telles que l’hypothermie sont peu probables aux doses faibles utilisées ici (jusqu’à 40 fois moins que les doses rapportées). Il est attendu que les injections d’un composant bactérien, qui provoque de l’inflammation, induisent un développement anormal des embryons in utero et une possible mise bas prématurée.

Devenir

Mort pour utilisation des tissus : analyses anatomiques et dosages immunologiques.

Remplacement

Il est impossible de remplacer ce modèle murin porteur d’une mutation constitutionnelle pour le gène d’intérêt, mais des études en culture ont permis de montrer son rôle sur le développement de certaines structures du système nerveux. Par ailleurs, nous avons déjà identifié des toxines utilisables en culture cellulaire pour renforcer certains des résultats que nous aurons obtenus dans les souris.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe sera de 6 pour atteindre une robustesse statistique. L'échographie non invasive permettra de déterminer in utero l'apparition d'une létalité dans les portées et de préciser à quel stade elle apparaît, évitant une mise à mort séquentielle des femelles gestantes au cours de la gestation, comme cela est habituellement le cas pour les études de mortalité in utero. Ce suivi nous permettra également d’éviter d’engager une inflammation dans des femelles n’ayant pas ou trop peu de petits.

Raffinement

L'échographie non invasive permettra de caractériser in utero plusieurs paramètres fonctionnels (fréquence cardiaque, flux sanguin et résistance hémodynamique) en plus des informations anatomiques (rapport périmètre cranial / périmètre abdominal). A partir des expériences préliminaires, nous établirons rapidement le timing auquel l’injection sera réalisée (précoce ou tardive) pour n’effectuer dans un premier temps l’étude que sur le stade d’injection qui donne les résultats les plus évidents. Les échographies seront faites sous anesthesie, et nous avons établi une grille qui nous permet d’évaluer l’éventuelle détresse et souffrance des animaux et de les supprimer ou soulager et ainsi d’améliorer leur bien-être. Les conditions d’hébergement seront optimisées en évitant l’isolement des animaux et leur maintien en groups sociaux dans des cages enrichies de cylindres en carton.

Choix des espèces

Choix du modèle murin : le modèle de souris a été choisi car il permet d’étudier les conséquences durant le développement embryonnaire de l’absence d’expression d’une protéine. Modèle mammifère, adapté pour les études à visée clinique : études sur la reproduction/gestation, rôle du placenta. Reproduction rapide, fond génétique homogène, nombre important d’animaux dans une même portée, avec des génotypes différents, permettant une comparaison interne fiable. Nombre de publications ont récemment rapporté que les mutations murines introduites miment la pathologie humaine. Les animaux seront utilisés à pour les études anatomiques du système nerveux, la mise en place des motoneurones qui a lieu précocement et le développement des masses musculaires.

36 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, on leur injecte des nanocapsules dans les disques intervertébraux, avec suivi par IRM pendant six mois, puis mise à mort pour analyse des disques. Le porteur indique une douleur modérée transitoire après l'injection et précise recourir à des animaux réformés destinés à l'abattoir. L'objectif est d'évaluer un traitement des lombalgies avant d'éventuelles études chez l'humain.

Objectifs

Les douleurs lombaires chroniques fréquemment rencontrées chez l’Homme concernent des sujets de tous âges. Le coût de leur prise en charge représente 240 milliards d’euros par an pour la totalité de l’UE. Toutefois, le tribu payé par l’individu malade reste le plus important : les lombalgies sont une cause majeure d’incapacité et de morbidité dans le monde. Le contributeur majeur de ces douleurs lombaires est la dégénérescence des disques intervertébraux (40%), appelée lombalgie discogénique. Le disque intervertébral (DIV) joue un rôle essentiel d’amortisseur dans la biomécanique de la colonne vertébrale. Il subit un processus dégénératif progressif inévitable au cours du temps (vieillissement), qui, lors de dégénérescence discale, est accéléré. Les DIV concernés sont alors plus rapidement altérés, avec pour conséquence une modification de la biomécanique vertébrale et une lombalgie discogénique. Aujourd’hui, aucune option thérapeutique disponible ne permet de ralentir l’évolution de cette maladie. Les traitement préconisés sont symptomatiques : physiothérapie, médicaments antidouleurs ou même chirurgie pour les patients les plus atteints. Les traitements chirurgicaux reposent sur l’exérèse totale du DIV incriminé : les procédures restent très invasives et s’accompagnent le plus souvent d’une convalescence longue et de risques de complications. A plus long terme, une instabilité vertébrale et une aggravation de l’atteinte des DIV adjacents sont souvent observées, aboutissant à des rechutes. L’amélioration des connaissances autour de la physiopathologie discale à l’origine des douleurs lombaires offre aujourd’hui de nouvelles opportunités de traitement. Il s’agit en particulier des approches de médecine régénératrice qui ont pour objectif de restaurer le tissu discal en modifiant la machinerie cellulaire à l’aide de miARN (petites molécules d’acide ribonucléique). C’est dans ce contexte que ce projet a pour objectif de démontrer l’innocuité et l’efficacité d’une injection intradiscale de nanocapsules lipidiques (LNC) renfermant des miARN chez des individus ovins (modèle animal spontané de dégénérescence discale), avant de pouvoir envisager des études cliniques chez l’Homme. L’efficacité thérapeutique sera évaluée contre placebo pour trois concentrations croissantes de miARN, pour un volume d’injection et une concentration en LNC constants : 36 animaux seront répartis en 4 groupes de 9 individus.

Bénéfices attendus

La dégénérescence discale (vieillissement prématuré des disques intervertébraux jouant le rôle d’amortisseurs entre les vertèbres) est responsable de 40% des lombalgies. Actuellement, il n’existe pas de solution thérapeutique permettant de stopper l’évolution de cette maladie ni de restaurer un disque intervertébral (DIV) fonctionnel. Les patients les plus atteints, pour lesquels la physiothérapie et l’administration d’antalgiques ne sont pas suffisantes, peuvent bénéficier d’une intervention chirurgicale au cours de laquelle le DIV incriminé est retiré. Les conséquences d’une telle chirurgie sur la biomécanique de la colonne vertébrale ne sont pas négligeables et les DIV adjacents sont alors d’autant plus sollicités, avec une aggravation de leur atteinte. Le projet que nous menons aspire à développer une nouvelle alternative thérapeutique qui pourrait être proposée aux patients atteints de lombalgie discogénique à des stades précoces, afin de restaurer un fonctionnement cellulaire permettant la synthèse de fibres de collagène et le maintien de l’hydratation du DIV, paramètres indispensables pour qu’il joue son rôle biomécanique. Il ne s’agirait plus de traiter les dégâts causés par la maladie (douleurs, hernie discale) mais de stopper son évolution voire de restaurer un DIV complètement fonctionnel. A court terme, cette expérimentation doit permettre d’évaluer l’innocuité de la procédure mini-invasive décrite (injection intradiscale sous contrôle radioscopique de nanocapsules lipidiques renfermant des molécules de miARN). A moyen terme, elle doit permettre d’évaluer l’efficacité d’une telle injection dans des DIV atteints de dégénérescence discale, et de choisir la dose de miRNA optimale véhiculée par les nanocapsules lipidiques. Et enfin, à long terme, elle doit permettre d’envisager plus rapidement la mise en place d’études cliniques chez l’Homme, l’obtention de résultats encourageants chez un modèle animal spontané représentant un tremplin non négligeable.

Procédures

Chacune des 36 brebis sera manipulée 4 fois pour des soins réalisés systématiquement sous anesthésie générale ou des examens/prélèvements post-mortem : - le premier jour (durée de l’anesthésie = 2h) : radiographies et IRM du rachis lombaire, injection intradiscale des nanocapsules lipidiques dans 3 disques intervertébraux (DIV) lombaires sélectionnés par randomisation. Les animaux sont répartis en 4 groupes de 9 animaux : un groupe placebo (nanocapsules lipidiques vides) et 3 groupes avec des nanocapsules lipidiques renfermant des miARN à trois concentrations différentes. - M1 et M3 (durée de l’anesthésie = 1h) : radiographies et IRM du rachis lombaire - M6 : euthanasie des animaux, radiographies et IRM du rachis lombaire (les DIV étant des tissus non vascularisés, leur aspect à l’IRM reste inchangé pendant plusieurs heures après la survenue de la mort), prélèvement de la totalité des DIV du rachis lombaire (nombre variant entre 6 et 7 selon les brebis) Par ailleurs, les animaux seront soumis à un examen clinique quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation, sur leur site d’hébergement (pas de déplacement prévu pour les animaux). L’examen clinique se fait dans un premier temps à distance (temps mis à profit pour que les animaux s’habituent à la présence humaine) puis de manière rapprochée et individuelle (quelques minutes par animal, sans douleur).

Impact sur les animaux

La procédure décrite ici ne fait appel à aucun geste particulièrement douloureux. L’injection intradiscale par voie transannulaire (injection au sein du noyau pulpeux, élément central du DIV, à travers l’anneau fibreux, élément périphérique du DIV) se fait de manière percutanée (procédure mini-invasive correspondant à un geste de radiologie interventionnelle) et sous anesthésie générale. Une douleur modérée transitoire peut être ressentie par les animaux dans les jours qui suivent l’injection. Le risque infectieux lié à l’injection intradiscale est très faible.

Devenir

L’euthanasie des brebis aura lieu au 6ème mois après le début de la procédure, c’est à dire à l’issue des 6 mois de suivi par imagerie médicale et à la fin de la procédure expérimentale. Cette euthanasie est indispensable afin de pouvoir réaliser les analyses histologiques et immunohistochimiques prévues sur l’ensemble des DIV des brebis concernées par l’expérimentation (216 à 252 DIV au total). Ces analyses permettront d’identifier les modifications résultant des injections intradiscales du nouveau médicament évalué par ce projet, tant au niveau cellulaire que moléculaire (informations non disponibles par imagerie médicale).

Remplacement

Ce projet correspondant à une étude préclinique d’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité d’un nouveau médicament in vivo, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de l’animal. Toutefois, nous avons choisi de faire appel à des animaux de production réformés destinés à l’abattoir (élevage laitier) plutôt qu’à des animaux élevés spécifiquement pour l’expérimentation animale. Toutes les étapes de développement des nanocapsules lipidiques renfermant des miARN ont été réalisées in vitro, sans utilisation de l’animal.

Réduction

A l’IRM, le degré d’atteinte d’un DIV atteint de dégénérescence discale est évalué par la détermination du score de Pfirrmann (valeur allant de I à V). Nous souhaitons pouvoir mettre en évidence, entre chacun des 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes avec une concentration croissante en miRNA), une différence de 1 point dans la valeur moyenne du score de Pfirrmann. Pour cela, après analyse statistique, chaque groupe doit être composé de 27 DIV. En injectant des nanocapsules lipidiques dans 3 DIV lombaires d’un même animal (sélection des DIV recevant une injection de nanocapsules lipidiques par randomisation), nous réduisons le nombre total d’individus utilisés : 9 animaux par groupe, soit 36 animaux au total (108 DIV recevant une injection intradiscale, analyse histologique de 216 à 252 DIV au total). De plus, la méthode de suivi choisie (par imagerie médicale et ne faisant appel qu’à une euthanasie terminale) limite également le nombre d’animaux utilisés (par comparaison avec des procédures où des animaux seraient euthanasiés à chaque temps de suivi). Tests statistiques : Nous avons prévu de comparer des moyennes entre chacun des 4 groupes.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont stabulés en groupe dans des conditions similaires à leur hébergement en élevage. Ils ont accès librement au foin et à l’eau (ad libitum). L’alimentation est complétée par des granulés spécifiques (Terrena, France) et par des pierres à lécher (apport en minéraux). Les animaux bénéficient d’un suivi individuel quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation : examen clinique et évaluation de la douleur/inconfort selon une grille adaptée à l’espèce ovine : intégration dans le troupeau, comportement à l’approche de l’opérateur, appétit et rumination, vigilance, posture (debout, couchée), port de tête à l’arrêt et en déplacement, aspect et posture au niveau du dos et des membres postérieurs, confort global (addition sur une grille de 1 à 10). Prévention de la douleur : De façon générale, la gestion de la douleur per- et post-opératoire suit les règles de l’analgésie multimodale associant l’administration de molécules antalgiques et le recours à l’anesthésie locorégionale. Un examen clinique sera fait quotidiennement par un vétérinaire pour déceler toute complication post-injection.

Choix des espèces

L’espèce ovine est un modèle spontané de dégénérescence discale. Les similitudes avec l’Homme concernent la physiopathologie de cette maladie, les anomalies détectées à l’IRM au niveau des disques intervertébraux (DIV) atteints et l’évolution clinique. Ainsi, la brebis est un modèle classiquement utilisé en médecine régénératrice du DIV. Par ailleurs, la taille des animaux facilite la réalisation des injections (taille relativement proche de celle de l’Homme) et leur hébergement en stabulation est aisé (contrairement aux porcs par exemple). Chez l’Homme comme chez la brebis, la sévérité de l’atteinte des disques intervertébraux lors de dégénérescence discale n’est pas corrélée à l’âge des individus. Nous avons choisi de travailler avec des animaux adultes âgés de 3 à 7 ans (animaux réformés destinés à l’abattoir du fait de problème de production de lait) afin de nous assurer que des lésions de dégénérescence discale seront identifiées à l’IRM chez chacune des 36 brebis de l’étude, sans que d’autres affections liées à l’âge n’interfèrent avec leur santé.

16 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pratique une chirurgie pour interrompre la continuité digestive et créer une stomie, puis un rétablissement par voie endoscopique ou chirurgicale, avant prélèvement des tissus. Le porteur reconnaît que des simulateurs existent pour apprendre la pose des prothèses, mais juge le modèle animal indispensable pour le suivi dans le temps. La première phase sert aussi à la formation d'internes de chirurgie.

Objectifs

Environ 4000 patients sont opérés annuellement en France d’une intervention de Hartmann, dont 80% par chirurgie ouverte, souvent dans le dans le cadre de l’urgence, pour diverses pathologies entraînant une lésion du côlon. Cette intervention consiste à retirer la partie du côlon lésée. La partie basse, le rectum, est refermée (et reste en place dans l’abdomen), et le côlon, en partie haute est relié à l’extérieur du corps via une stomie pour l’évacuation des selles. Cette intervention est généralement réalisée dans le cas où les risques de complications sont trop importants pour réaliser dès la première chirurgie la connexion entre le côlon et le rectum (anastomose). La stomie pratiquée est théoriquement temporaire et le rétablissement de la continuité digestive se fait dans un second temps qui va néanmoins nécessiter une nouvelle opération en chirurgie ouverte. Cependant, compte tenu de la fragilité des patients, moins d’un patient sur deux sera candidat à cette opération, avec des risques supplémentaires. Très récemment, l’endoscopie digestive a permis dans diverses indications de réaliser des anastomoses digestives par voie endoscopique. Cette technique d’anastomose endoscopique a été largement évaluée dans les maladies de l’intestin grêle ou de la voie biliaire principale. Devant le caractère invasif de cette opération de rétablissement de continuité digestive, et avec les progrès des techniques d’écho-endoscopie (échographie sous endoscopie) thérapeutique, les objectifs de ce projet de recherche sont : - De créer un modèle expérimental de colostomie temporaire (intervention de Hartmann) - D’évaluer la faisabilité des anastomoses colorectales par voie endoscopique, au moyen de prothèses permettant l’apposition du côlon et du rectum - De définir les facteurs pronostiques de succès et d’échec de la technique d’anastomose colorectale endoscopique - De comparer la faisabilité et l’efficacité des anastomoses colorectales réalisées en fonction de deux techniques : écho-endoscopie versus chirurgie Par ailleurs, au sein de ce projet, la première phase de chirurgie (intervention de Hartmann), étant une pratique relativement courante, elle pourra également permettre la participation d’internes de chirurgie. Ceci sera fait avec la participation d’un médecin sénior, ce qui permettra de l’inclure dans leur cursus de formation pédagogique chirurgicale.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’une étude pilote in vivo sur modèle expérimental animal portant sur la faisabilité d’une nouvelle technique mini-invasive. Les perspectives sont l’établissement d’un protocole standardisé de la réalisation endoscopique d'anastomose colorectale, avant d'envisager en cas de succès une plus grosse série d'animaux. Cette seconde cohorte permettra de définir plus précisément les facteurs de succès et d’échec de la technique, afin d’identifier quels patients humains pourront par la suite entre candidats à un rétablissement de continuité par endoscopie. Les impacts attendus et les perspectives sont multiples : il s’agit en priorité de pouvoir proposer, après réalisation d’une expérimentation prospective chez l’homme en cas de succès, à des patients aux antécédents lourds une prise en charge moins invasive, et de limiter le risque de ré-intervention pour sténose ou fistule anastomotique.

Procédures

Les animaux seront tous soumis à une procédure chirurgicale destinée interrompre la continuité digestive et à créer la stomie (durée 1h-1h30). Un lot d’animaux sera ensuite traité par voie endoscopique (durée 40 min environ), l’autre lot le sera par voie chirurgicale (1 heure environ).

Impact sur les animaux

Du stress et de l’angoisse peuvent être présents. Une stomie sera pratiquée (abouchement du côlon à l’extérieur du corps), qui sera effectuée en position ventrale plutôt que latérale pour limiter la gêne pour l’animal. Une mise à jeûn des animaux ainsi qu’un lavage intestinal (par prise de médicament) doit être effectuée pour réaliser les manipulations dans les meilleures conditions en limitant les risques pour l’animal. Des risques de blessures entre individus sont envisagés en post-opératoire, notamment au niveau des sutures. Une surveillance particulière sera effectuée ainsi qu’une possibilité d’isolement le temps de la cicatrisation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure à des fins d’analyse des tissus traités pour rétablir la continuité digestive.

Remplacement

Des modèles de simulation (virtuel, mécanique ou sur organe isolé) existent pour apprendre la technique de pose des prothèses utilisées dans ce projet. Cependant, l’objectif étant l’étude de la faisabilité de cette procédure, cela nécessite un suivi dans le temps, et ainsi l’utilisation d’un modèle animal est indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum concernant les procédures les mieux maitrisées (3 anastomoses colorectales manuelles et 3 anastomoses mécaniques). La participation d’internes de chirurgie (sous la surveillance de médecins séniors) pendant la première phase chirurgicale leur permet de se former aux techniques évoquées précédemment sur un modèle vivant utilisé en formation et ce, sans utilisation d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d’acclimatation de 2 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie et leur première entrée en procédure. Ils seront suivis quotidiennement et leur état de santé sera évalué tout au long du protocole expérimental. Leur environnement sera enrichi (ballon, jouets divers ) pour leur permettre d’exprimer des comportements normaux. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés par groupes stables afin de favoriser les interactions. Les protocoles chirurgicaux se feront sous anesthésie générale et analgésie. L’analgésie pourra accompagner l’animal en post-opératoire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le porc est un modèle animal dont l’anatomie digestive est particulièrement proche de l’anatomie humaine. Il constitue le modèle de référence pour la formation et la recherche depuis de nombreuses années. Animaux âgés de 3 à 6 mois à leur arrivée afin qu’ils présentent une corpulence suffisante pour l'utilisation du même type de matériel que pour un humain adulte.

Des souris sont rendues malades par une injection intradermique cinq jours par semaine pendant quatre à six semaines, soit 20 à 30 injections de bléomycine ou d'acide hypochloreux, qui provoquent une fibrose de la peau et des poumons censée reproduire la sclérodermie systémique. 134 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection unique de cellules souches issues du tissu adipeux dans la veine de la queue, et le porteur décrit des démangeaisons, de petites plaies au point d'injection et une fibrose pulmonaire qui, selon lui, "n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires". Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leur sang, leurs poumons, leur rate et leur peau.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser des cellules stromales mésenchymateuses d'origine adipocytaire (ASCs) en clinique (traiter des patients atteints de sclérodermie systémique). Ainsi, nous évaluerons leurs effets thérapeutiques (réduction de l’inflammation et de la fibrose cutanée et /ou pulmonaire), leurs interactions avec différents types de cellules immunitaires et le(s) mécanisme(s) impliqué(s) dans leurs effets thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera de valider si la thérapie cellulaire de cellules stromales et en particulier d'origine adipocytaire (ASCs) est efficace pour contrer les troubles majeurs de la sclérodermie systémique que sont la fibrose cutanée et pulmonaire et, dans une moindre mesure, la production d’anticorps et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 4 semaines (procédure N°1 et N°2 ) ou pendant 6 semaines (procédure N°3) et à une seule injection intraveineuse dans la veine caudale de cellules souches stromales d'origine adipocytaire (ASCs).

Impact sur les animaux

L'injection intra-dermique de Bléomycine ou d'acide hypochloreux peut entrainer une gène (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des petites plaies ou des irritations cutanées au point d'injection. Ces souris développent une fibrose cutanée au point d'injection et une fibrose pulmonaire modérée, limitée à la région sous-pleurale qui n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau)

Remplacement

Il est important de voir les effets thérapeutiques des cellules mésenchymateuses stromales au niveau de l’animal entier portant une maladie surtout quand celle-ci touche plusieurs tissus ou organes et qu’elle est caractérisée par une autoimmunité (présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine), impossible à reproduire in vitro. La souris possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, nous testerons la tolérance des souris à l'injection des cellules souches stromales adipocytaires (ASCs) uniquement dans la procédure N°1 et sur un nombre réduit de souris c'est à dire 5 souris/groupe au lieu de 10 pour les groupes de souris malades.

Raffinement

Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 dans des cages enrichies. Une observation quotidienne des souris sera réalisée (apparence physique, comportement), une pesée sera réalisée une fois par semaine et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou anti-douleurs adaptés (après avis du vétérinaire) pourront être leur être administré.

Choix des espèces

Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte les adultes