Recherche appliquée

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent par gavage un immunosuppresseur destiné à provoquer une entéropathie, puis un acide gras dans l'eau de boisson, pour tester si celui-ci limite les lésions digestives. Le porteur indique que les animaux traités peuvent développer perte de poids, diarrhée, sang dans les selles et douleurs digestives. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la complexité du tube digestif et qu'une étape in vivo est nécessaire pour prouver l'effet protecteur.

Objectifs

La transplantation d’organe est un traitement de choix pour certaines pathologies chroniques ; la greffe améliore la qualité de vie et la survie des patients. Ces dernières années, l’augmentation de la survie du greffon est attribuée à l’utilisation des traitements immunosuppresseurs qui inhibent la réponse immunitaire responsable du rejet. Le recours aux immunosuppresseurs, en fragilisant le système immunitaire, provoque l’émergence d’infections et d’atteintes tumorales, en plus de leurs nombreux effets indésirables. Une meilleure gestion de ces effets pourrait contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des transplantés. L'acide mycophénolique (MPA) est l'un des médicaments immunosuppresseurs les plus utilisés dans les transplantations d'organes solides, comme le rein ou le foie. Le traitement au MPA est associé à des effets indésirables, parmi lesquels les troubles gastro-intestinaux constituent une préoccupation majeure. En effet, plus de 30 % des patients présentent des effets indésirables gastro-intestinaux, allant des nausées aux érosions du tractus gastro-intestinal et aux ulcérations hémorragiques, qui mettent en jeu le pronostic vital. La seule option thérapeutique actuelle consiste en une réduction de la dose ou de la fréquence d'administration, ou à un remplacement par d’autres molécules moins efficaces, ce qui augmente le risque de rejet de greffe. Le MPA est responsable d’altérations du microbiote intestinal, appelées dysbiose. Le microbiote intestinal, qui est constitué de microorganismes comme des bactéries, est nécessaire au processus de digestion et, à travers la production d’acides gras à chaine courte (AGCC) particuliers, il protège la paroi intestinale. Nous émettons l’hypothèse qu’une supplémentation en AGCC spécifique des bactéries pourrait limiter les lésions associées à l’entéropathie induite par le MPA. Notre objectif est d’étudier l’effet d’AGCC donnés dans l’eau de boisson sur une entéropathie modérée provoquée par le MPA chez la souris.

Bénéfices attendus

Le MPA est l’immunosuppresseur le plus utilisé pour éviter le rejet de greffes d’organes solides. L’entéropathie induite par le MPA touche aujourd’hui plus de 30% des patients transplantés : sont proposés à ces patients une diminution de la dose de MPA ou une substitution de cet immunosuppresseur par une autre classe thérapeutique moins efficace sur le maintien et la tolérance de la greffe. La supplémentation en AGCC, déjà testée et proposée à certains patients au cours de la prise en charge de la maladie digestive de Crohn, pourrait amener une amélioration de la qualité de vie pour les patients transplantés en limitant les effets indésirables du MPA.

Procédures

- Préhension pour pesée (animal vigile, tous les animaux, moins de 30 secondes par animal, 17 fois par animal) - Contention pour habituation au gavage (animal vigile, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 9 fois par animal) - Gavage (animal vigile, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 7 fois par animal) - Prélèvement sanguin (animal anesthésié, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 1 fois par animal). Les modes d’administration utilisés (eau de boisson pour l’AGCC et l’administration par voie orale à l’aide d’une canule) ont été décrites dans la littérature pour ces molécules, et sont reconnues efficaces.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables sont attendus pour les animaux traités à l’immunosuppresseur comme une perte de poids, de la diarrhée, la présence de sang dans les selles, des douleurs digestives et des altérations du comportement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever différents organes et tissus nécessaires aux analyses.

Remplacement

L’utilisation de cellules in vitro a permis de démontrer certains effets intéressants du médicament immunosuppresseur MPA et des AGCC. Cependant, les études in vitro ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du tube digestif et des tissus qui l’entourent. Or les effets globaux du MPA et des AGCC, s’ils existent, résulteront de l’interaction du médicament et des AGCC avec différentes cellules au sein de différents tissus et organes. A ce stade des travaux, les études in vitro doivent être complétée par des études sur l’animal afin d’apporter la preuve définitive de l’effet protecteur des AGCC vis-à-vis de l’entéropathie induite par le traitement immunosuppresseur chez les greffés.

Réduction

Dans le but de réduction du nombre d’animaux, le projet comprend 2 étapes : une étude pilote pour déterminer la dose de MPA à utiliser et l’étude à proprement parler des AGCC sur l’entéropathie induite par le MPA. Cette stratégie en deux étapes permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude de l’effet des AGCC. De plus, un test statistique de puissance a été réalisé afin de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour avoir des résultats exploitables. Enfin, des tests statistiques seront réalisés pour analyser les données.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à l’espèce et qui respectent leur bien-être : densité animale, température, hygrométrie contrôlées, présence d’enrichissement, eau et nourriture à volonté. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs et aux manipulations. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement, voire deux ou trois fois par jour si l’état le nécessite. La douleur sera abrégée sans délai via l’administration d’antalgique dérivé de la morphine, ou si l’état le justifie, l’animal sera euthanasié. Les personnes qui manipuleront et observeront les souris sont expérimentées.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence pour l’étude des entéropathies que l’Homme développe. Les animaux utilisés seront des souris adultes d’un poids moyen de 24-26 g âgées de 8-10 semaines au début du projet. A ce stade de développement les souris présentent des caractéristiques physiologiques stables. De plus, ce stade de développement est celui utilisé dans les publications de référence pour le projet.

5 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une tumeur leur est greffée puis elles reçoivent chimiothérapie et immunothérapie deux fois par semaine, avec des prélèvements sanguins répétés, pour valider un anticorps neutralisant une cytokine avant un programme clinique. Le porteur indique que la croissance tumorale peut entraîner des difficultés de locomotion, une ulcération et un état moribond au-delà d'un certain volume. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité des interactions entre système immunitaire et cellules tumorales et juge ces preuves de concept "indispensables".

Objectifs

Les avancées en termes d’immunothérapies dans les cas de cancers sont très encourageantes mais une recherche accrue est toujours de mise afin d’une part de découvrir de nouvelles cibles mais également d’améliorer les traitements déjà existants. Ce projet a ainsi pour but de continuer à approfondir nos données sur les actions et les efficacités de la neutralisation de notre cible, une cytokine (protéine messagère et régulatrice du système immunitaire naturellement présente dans chaque organisme) et ce dans un contexte de développement tumoral (multiplication des cellules tumorales) chez la souris. Après avoir mis en évidence dans un précédent projet, l’intérêt de bloquer cette cible afin d’améliorer la survie des animaux, il s’agit maintenant de trouver les meilleures conditions afin de valider notre outil bloquant (un anticorps thérapeutique) et de le présenter par la suite dans un programme clinique chez l’Homme. Pour cela, différents types de modèles cancéreux seront utilisés comme les mélanomes, les fibrosarcomes, les cancers mammaires, colorectaux, pancréatiques, du poumon ou encore du col de l‘utérus. Grâce à ces modèles de développement tumoraux, nous pourrons analyser chez les souris l’impact du blocage de cette cytokine en synergie (effet cumulé) avec d’autres immunothérapies et chimiothérapies déjà connues en clinique. Ce projet nous permettra également de valider les meilleurs anticorps possibles qui pourront ainsi devenir des candidats pour de futurs essais cliniques antitumoraux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but principal de valider la preuve de concept d’inhibition de notre cible pour induire des effets antitumoraux et de comprendre les mécanismes d’action et les voies de signalisation impliquées. Plusieurs bénéfices seront alors apportés par l’avancement de ce projet. L’utilisation de modèles où le gène de la cytokine a été invalidé (supprimé) d’une part et d’outil inhibant (bloquant) la cible d’autre part permettre de confirmer l’implication de la cible dans des mécanismes de développements tumoraux. Les différents protocoles de traitements testés, détermineront les conditions optimales d’utilisation des outils afin d’arrêter la croissance tumorale. Enfin, les études de suivi de la cible en présence ou absence d’anticorps expliqueront les cinétiques d’action de ces différentes molécules. Toutes ces approches sont indispensables pour pouvoir amener ces technologies dans des essais précliniques réglementaires puis des essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet seront greffés une fois en injection sous-cutanée (SC) sur animal vigil (15 secondes/souris avec contention) ou en injection intra-mammaire (IM) pour le modèle de cancer du sein sur animal anesthésié (4 minutes/souris comprenant l’anesthésie). Pour les procédures 1 et 2, les animaux subiront ensuite une injection de chimiothérapie (en intrapéritonéale (IP) : 10 secondes ou en intraveineuse (IV) dans certains cas rares : 3 minutes) suivis des traitements par les immunothérapies (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en injection SC : 10 secondes, ou en injection IV dans certains cas rares : 3 minutes), cela 2 fois par semaine. Les animaux de la procédure 3 recevront en plus un traitement par les anticorps cibles 2 à 3 fois par semaine (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en injection SC : 10 secondes, ou en injection IV dans certains cas rares : 3 minutes). Certains animaux des procédures 1, 2 et 3 subiront des prélèvements sanguins sur animal vigil à la veine mandibulaire maximum une fois par semaine (0,11mL par prélèvement) sur maximum 5 semaines. La durée de chaque prélèvement est estimée à 1 minute. Les animaux des procédures 4, 5 et 6 subiront des traitements séquentiels en commençant par l’injection de la cible (la cytokine) (en IP : 10 secondes, en SC : 10 secondes, ou en IV dans certains cas rares : 3 minutes). L’anticorps dirigé contre la cible sera ensuite injecté jusqu’à 3 fois par semaine (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en SC : 10 secondes, ou en IV dans certains cas rares : 3 minutes). Dans certains cas (qui seront connus à l’issu des procédures 1, 2 et 3), les souris auront également une l’injection de la chimiothérapie en dose unique (en IP : 10 secondes ou en IV dans certains cas rares : 3 minutes) suivie de l’immunothérapie 2 fois par semaine (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en SC : 10 secondes, ou en IV dans certains cas rares : 3 minutes). Ces animaux subiront des prélèvements sanguins sur animal vigil à la veine mandibulaire en gestes répétés sur 24h (volume maximum de 0,11mL) ou une fois par semaine (0,11mL par prélèvement) sur 4 semaines. La durée de chaque prélèvement est estimée à 1 minute / souris avec contention. Certains animaux subiront un prélèvement de sang en terminal à la veine cave (animal sous anesthésie profonde et sans réveil) afin de collecter un volume de sang suffisant.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs chez la souris avec un problème de locomotion possible au-delà d'un certain volume ou une ulcération de la tumeur pouvant entrainer un état moribond de l’animal si elle évolue trop rapidement. Les injections de chimiothérapie et d’immunothérapie observées lors des études précédentes ne montrent quant à elles aucun effet délétère observable sur l’état clinique de l’animal.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce qu'ils ont atteint le point limite de volume tumoral ou tout autre point limite listé, soit avant pour prélever la tumeur et les organes immunitaires périphériques afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments (à l’aide de technique d’histologie, de cytométrie ou encore de biologie moléculaire).

Remplacement

Il s’agit du suivi de croissance tumorale, il n’existe pas de méthode alternative à ces expériences in vivo. Ces preuves de concept et ces études de mécanismes d’action ne peuvent s’établir que sur de véritables modèles précliniques dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui a démarré par des études bibliographiques, suivies d’études In Vitro approfondies ayant permis d’affiner et de réduire efficacement les pistes de recherches. Cependant, compte tenu des avancées actuelles, à ce stade du projet, il n’est pas possible de substituer l’animal par un modèle in vitro pour continuer ces recherches. Ce dernier ne peut pas retranscrire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules tumorales pour tester nos traitements antitumoraux.

Réduction

L’analyse statistique permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, est réalisée en collaboration avec une unité de biométrie, spécialisée dans les études de biostatistique. L’étude de l’efficacité antitumorale induit deux types d’analyse : -modélisation de la croissance tumorale (en fonction du nombre de jours post-greffe) et comparaison entre les deux groupes de traitement en utilisant un modèle linéaire mixte permettant un delta de 200 mm3. -analyse de survie en considérant le délai nécessaire pour atteindre la médiane (50 % de survie) un delta de 5 jours. Compte tenu de cette analyse et des données obtenues lors de précédentes expériences réalisées au sein du laboratoire le nombre de souris est limité à 10 par groupe et chaque étape est reproduite une fois afin de supprimer le biais pouvant être induite par un problème technique de greffe de cellules ou d’injection de molécule et ainsi avoir un résultat de deux expériences indépendantes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à 20-24°C, 30-50% d'hygrométrie, en portoirs de cages à couvercle filtrant, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Un système d’enrichissement adapté à la souris est mis en place afin de réduire le stress des animaux. Il comporte la présence dans chaque cage d’un tunnel ou d’un dôme en cellulose, de briques Aspen et de carré de cellulose afin que les animaux établissent un nid végétal. Des souris femelles sont utilisées dans nos protocoles expérimentaux car elles présentent un système immunitaire exacerbé, facilitant les mises en évidence d’efficacité pro-immunitaire et anti-cancéreux. Tout au long du déroulement des expériences de croissance tumorale, une observation systématique de l’état clinique des animaux et notamment de l’évolution de la taille des tumeurs est réalisée par du personnel formé et compétent. Les conditions d’utilisation sont encadrées par la règlementation en vigueur et ont pour but de réduire le stress, l’inconfort et la douleur que l’animal pourrait ressentir. Une habituation des animaux sera mise en place en ce qui concerne la contention manuelle (immobilisation de l’animal par l’expérimentateur pour pouvoir l’injecter sans risque) et le placement dans les tunnels de contention (en vue des injections intraveineuses). Ces habituations seront effectuées en amont du début des études et des injections afin de diminuer le stress de l’animal. L’état des animaux sera surveillé quotidiennement pour vérifier l’aspect de la tumeur ou l’apparition de signes cliniques Dans les conditions expérimentales définies (limite du volume tumoral), les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. De plus, au cours de nos expériences antérieures, parmi les paramètres listés ci-dessus, nous n’avons jamais observé de signe de diarrhée, de déshydratation ou de problème respiratoire.

Choix des espèces

La souris immunocompétente de type C57Bl/6 constitue un modèle expérimental de référence. Ces souris dont le système immunitaire est fonctionnel sont greffées avec des cellules tumorales murines de même fond génétique. Ce modèle a déjà permis d’obtenir les premiers résultats à l’origine de ce projet, nous avons ainsi un recul important sur le comportement et les caractéristiques de ce modèle. Il est indispensable pour réaliser les étapes 1 et 2 de ce projet. La 3ème étape nécessite différents modèles de souris immunocompétentes afin de comprendre le rôle du système immunitaire et de suivre la cinétique de la cible au sein de la tumeur et dans la circulation sanguine. Le choix s’est porté sur les modèles les plus caractérisés et sur lesquels nous avons déjà un recul important : C57Bl/6, BalbC. Références bibliographiques : (Rondepierre F et Al. Melanoma Res. 2010 Apr;20(2):77-84, Bertrand et Al. Cancer Res. 2015 May, Eslahi NK et al.Cancer Gene Ther. 2001 Jan;8(1):55-62, Morikane K at al. Int Immunol. 2001- Feb;13(2):233-40, Hannani D et al.Cell Death Differ. 2014;21(1):50-8).

Une souris qui fait une crise de plus de cinq minutes, ou plus de dix crises par jour pendant les enregistrements, atteint un point limite et est mise à mort. 450 souris de lignées génétiquement modifiées sur la voie mTOR, sujettes à des crises d'épilepsie spontanées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées, au plus tard à un an pour celles qui ne font aucune crise. Elles sont génotypées par un prélèvement au bout de la queue à une semaine, puis, selon les groupes, subissent l'implantation d'électrodes dans le crâne suivie d'un isolement pour des enregistrements vidéo-EEG d'une semaine, répétés après une à deux semaines de repos, ou jusqu'à sept tests de comportement de dix minutes à une heure. Le résumé ne nomme aucun de ces tests, destinés à repérer des "altérations comorbides à l'épilepsie".

Objectifs

Le projet a pour but de caractériser les conséquences fonctionnelles de mutations de la voie mTOR retrouvé chez l’homme, qui conduisent à des phénotypes épileptiques. Nous créerons de nouveaux modèles de souris génétiquement modifiées afin de faire un suivi de leur phénotype, ainsi qu’une caractérisation électrophysiologique et comportementale (altérations comorbides à l’épilepsie).

Bénéfices attendus

Le projet permettra de valider les modèles murins d’épilepsie, afin de comprendre les mécanismes à l’origine des crises d’épilepsies et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces avancées sont urgentes en raison de la pharmacoresistance élevée des patients avec une dysplasie focale corticale liée à ces mutations, et la nécessité du recours à la chirurgie de l’épilepsie pour contrôler les crises.

Procédures

**Les lignées maintenues dans le cadre de ce projet peuvent présenter des crises d'épilepsies spontanées. Une chirurgie sous anesthésie et analgésie (1h maximum) sera pratiquée pour l’implantation d’électrode intracrânienne puis isolement et enregistrement EEG (Electro-encéphalographique) afin d’enregistrer l’activité électrique cérébrale sur animal vigile (session d’une semaine séparée par 1-2 semaine de repos) pour détecter des crises d’épilepsie spontanées. Des études de comportement sur animal vigile (7 tests maximum, tous les 2-3 jours, d’une durée minimale de 10 min et maximale d’1h par test) seront réalisées. **

Impact sur les animaux

**Les nuisances attendues sont : 1) Le développement prédit d’un phénotype épileptique avec des crises spontanées dont la fréquence reste à définir (quotidienne, hebdomadaire ou mensuelle selon les modèles), 2) La chirurgie due à l’implantation intra crâniale d’électrodes (douleur, inconfort), et l’isolement des animaux prévus pour l’enregistrement vidéo-EEG de l’activité électrique cérébrale 3) Un stress lié à l’analyse comportementale des animaux.**

Devenir

**Maintien et suivi de lignées dommageables : les animaux implantés seront euthanasiés dès qu’un point limite sera atteint, ou à l’âge d’un an maximum si aucune crise ne survient. Analyse vidéo-EEG (enregistrement de l’activité électrique cérébrale) : les animaux seront euthanasiés à la suite de la détection de crises épileptiques, ou à l’âge d’un an maximum si aucune crise ne survient. Les animaux étant implantés avec des électrodes, nous ne pouvons pas utiliser les animaux pour le comportement car les électrodes pourraient avoir un impact. Des prélèvements pourront être réalisés pour études biochimiques (Western blot). Analyse comportementale : Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.**

Remplacement

L’utilisation d’animaux est justifiée car: (1) Les modifications cérébrales nécessaires ne peuvent être étudiées chez l’humain. (2) La culture cellulaire ne reproduit pas certaines propriétés des crises d'épilepsie dans un cerveau entier. (3) La modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore manquantes

Réduction

**Nous veillerons à générer le minimum d'animaux nécessaires à la fois pour le maintien de nos lignées et pour leur utilisation dans des expériences en vue de produire des conclusions scientifiques statistiquement fiables. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance, nous procèderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le calcul de puissance sera ajusté selon les premiers résultats, car nous ne pouvons pas encore prédire les différences de moyennes et de variabilité entre nos groupes. Nous avons prédit un minimum de 10 animaux par groupe (n=450). **

Raffinement

**Les animaux sont hébergés selon les normes en vigueur et les cages enrichies d’un nid de coton, et d’une maison en cas d’inconfort (animal isolé) ou pour les souris gestantes. Si un animal fait une crise de plus de 5 minutes (par observation dans la cage), cela constituera un point limite. De plus, lors des enregistrements vidéo-EEG (enregistrement de l’activité électrique cérébrale) : si un animal fait plus de 10 crises par jour, cela constituera un point limite. Les animaux feront donc l'objet d'une surveillance étroite par le personnel de soin animalier. Le poids, l'apparence physique et des changements de comportement seront les facteurs pris en compte. Suite à la procédure d’implantation d’électrodes, on administre un analgésique. Ce traitement pourra être prolongé jusqu’au rétablissement de l’animal (si aucun point limite n’est atteint). L'expérimentateur pèsera les animaux chaque jour suivant la chirurgie pendant une semaine, puis une fois par semaine, et évaluera objectivement l'apparence physique de l'animal (convulsions, dos voûté) et son comportement (lenteur des mouvements) au moins une fois par semaine. D'autre part, les animaux feront l'objet d'un suivi postopératoire avec une surveillance rapprochée de l'expérimentateur jusqu'au réveil complet de l'animal et surveillance quotidienne étroite de l'expérimentateur et du personnel de soin animalier pendant les deux semaines suivant la chirurgie. Les mouvements, le poids, la respiration et les réflexes tels que le retrait de la patte seront observés. S'ils révèlent une dégradation ou une souffrance de l'animal, celui-ci sera euthanasié afin d’arrêter la douleur.**

Choix des espèces

**Nous travaillerons sur une espèce animale: la souris. Notre choix a été motivé par des raisons scientifiques: (1) Nos études portent sur des modèles génétiques d'épilepsie nécessitant des modifications génétiques ciblées, possibles chez ces animaux (CRE/lox). (2) L'établissement de lignées pures avec un fond génétique stable et homogène utilisées dans les laboratoires du monde entier permet la reproductibilité et la comparabilité des résultats et donc la réduction du nombre d’animaux. (3) Ces deux espèces sont majoritairement utilisées pour modéliser les crises d’épilepsies. Elles ont donc été explorées de manière exhaustive de la molécule au comportement, permettant une solide base scientifique sur laquelle baser nos travaux. (4) Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. Les animaux seront génotypés par biopsie d’un bout de queue (environ 1 mm) à l’âge de 1 semaine (avant la queue est trop peu développée pour permettre le prélèvement). Pour le suivi, les animaux seront observés dès l’âge de 15 jours (une fois le génotype établi). L'épilepsie apparaissant généralement à l'âge juvénile-jeune adulte Pour les autres procédures, les souris seront utilisées à partir de l’âge 3 semaines (après sevrage). Pour la même raison que l'âge d'observation des animaux, de plus la procédure n°2 impose un isolement des animaux après chirurgie, or cela n'est pas possible avant sevrage.**