Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude des effets et du mécanisme d’action d’un Peptide sur l’interaction gamétique et le développement embryonnaire murin 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
2 136 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles reçoivent des injections hormonales pour stimuler l'ovulation, et une partie subit une microchirurgie de réimplantation d'embryons sous anesthésie suivie d'un suivi échographique jusqu'à la mise bas. Toutes sont ensuite tuées pour récolter les embryons ou compter les souriceaux nés. Le projet teste un peptide breveté censé augmenter les taux de fécondation en assistance médicale à la procréation, le porteur affirmant qu'il n'est "pas possible de contourner le recours au modèle animal".
Objectifs
Les troubles de la fertilité et leurs incidences sur les sociétés humaines sont un problème majeur de santé publique et un enjeu économique substantiel pour l’avenir. Depuis cinquante ans, nous assistons à une chute de la fécondité des couples surtout dans les pays industrialisés en raison notamment de l'âge plus avancé des femmes pour leur premier accouchement (30 à 35 ans aujourd'hui versus 23 ans il y a 30 ans) qui induit une moindre qualité de l'ovule et des problèmes de développement embryonnaire. Une molécule qui permettrait de pallier cette baisse de qualité ovulaire et embryonnaire et d’augmenter les taux de succès de l’AMP (Assistance Médicale à la Procréation) serait donc prometteuse. Un peptide a été découvert lors d’études faites sur l’interaction gamétique. Ajouté au milieu d’insémination, il augmente les taux de fécondation chez la souris et les index de fusion chez l’humain. Sur la foi de cette propriété, un brevet a été pris pour cette molécule. Des tests ultérieurs ont démontré un effet sur la maturation des ovocytes humains immatures et le développement préimplantatoire d’embryons humains donnés pour la recherche. Nous souhaitons développer la recherche fondamentale nécessaire au développement du peptide, pour préciser à quel(s) stade(s) du processus de fécondation il agit, son mode d’action et ses applications possibles. Ce projet nécessite l'utilisation de 1296 souris au total sur une durée de 5 ans.
Bénéfices attendus
Les résultats de nos travaux devraient permettre d’identifier les mécanismes moléculaires liés aux effets du Peptide en fécondation in vitro et d’améliorer, à plus long terme, les taux de naissance lors des tentatives d’AMP (Assistance Médicale à la Procréation).
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 types d'intervention. La stimulation hormonale de souris donneuses d'embryons par injection intrapéritonéale -de moins de 10s- à 46-48h d'intervalle de 2 hormones : Hormone n°1 : pour stimuler la maturation des follicules ovariens / Hormone n°2 : pour provoquer l’ovulation 46-48h après l’injection de la première hormone. Un autre groupe d'animaux (femelles pseudo gestantes)sera soumis à la microchirurgie de réimplantation d’embryons et un suivi gestationnel (2 échographies, à J7.5 post coït et J11.5 post coït) par échographie.Les femelles seront conservées jusqu'à la mise bas. La micro-chirurguie se fait sous anesthésie générale et dure entre 15 à 20 minutes pour chaque souris.
Impact sur les animaux
Certains effets indésirables peuvent apparaître lors de la micro-chirurgie effectuée: - une infection ou un suintement au niveau de la zone incisée. - une souffrance propre à l'acte chirurgical.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récolter les embryons produits ou pour dénombrer le nombre de souriceaux nés à l'issue de la mise bas, suivant la procédure concernée.
Remplacement
Il n’est pas possible de contourner le recours au modèle animal pour la production de spermatozoïdes et d’ovules.Des études in vitro ont déjà menées permettant de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire. A chaque fois que cela est possible, des tests et des lignées cellulaires traitées avec le Peptide seront utilisées pour des étapes annexes afin de réduire au strict minimum le nombre de souris utilisées.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au minimum. La stimulation hormonale permet de réduire le nombre de souris femelles donneuses d'ovocytes et d'embryons utilisées. Le suivi échographique des femelles réimplantées permet d'optimiser le nombre de femelles nécessaires dans le cadre du suivi gestationnel. Les nombres d'expérience demandées tiennent compte des variables de production connues en ce qui concerne la stimulation hormonale, les taux de fécondation, et des éventuelles non gestations des femelles receveuses après réimplantation des embryons. Il est donc possible que le nombre d'expériences sur lesquels les calculs du nombre de souris se basent soit plus faibles que le nombre initialement prévu dans le projet. Le nombre de souris a été déterminé en tenant compte du nombre nécessaire d’embryons à obtenir, en se basant sur des expériences déjà réalisées de stimulation hormonale et des tests de puissance statistique adaptés.
Raffinement
Une grille de suivi et des points limites ont été définis pour chaque procédure. Les souris réimplantées sont anesthésiées et l'analgésie adéquate est apportée.
Choix des espèces
Les études impliquant l’espèce humaine sont particulièrement encadrées par les autorités compétentes. Ainsi avant d’engager des personnes dans des protocoles de recherche incluant potentiellement la naissance d’enfants, il est demandé des études préalables dans les espèces animales au mode de reproduction analogues. La souris constitue de ce point de vue un modèle d’étude particulièrement efficace alors qu’il n’existe pas de modèle cellulaire alternatif. En effet, grâce aux connaissances acquises ces dernières années sur la génétique de la souris et du fait de la conservation entre l’homme et la souris de la majorité des gènes impliqués dans la formation des gamètes, la fécondation et le développement embryonnaire, la souris représente actuellement le modèle de choix pour étudier les troubles de l’infertilité. Pour ce projet, des souris de 6 à 12 semaines maximum, jeune adulte et adulte ayant atteint la maturité sexuelle, seront nécessaires pour fournir les ovocytes ou les zygotes après accouplement. Des souris de 8 à 16 semaines seront utilisées pour recevoir les embryons transférés. Des femelles âgées de 1 an seront également utilisées. Le peptide est supposé agir à tout âge mais devrait être d’autant plus efficace que l’altération des ovocytes est moindre. Il est essentiel de savoir dans quelles mesures les améliorations des taux de fécondation et d’implantation seront efficaces chez des femelles plus âgées et éventuellement les posologies et mode d’administration du peptide à employer.
Génération d’une réponse anticorps anti-protéine thérapeutique chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Des babouins sont immunisés contre trois candidats médicaments développés par un partenaire, pour obtenir de leur sang des anticorps qui serviront de contrôle positif dans les tests réglementaires de ce partenaire, chez le singe comme chez l'humain. 6 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, deux au plus par groupe. Chacun reçoit deux injections intradermiques du candidat médicament, à J0 et J21, et subit deux prises de sang, à J0 et J31, chaque fois sous anesthésie légère, hébergé pendant le protocole dans une cage individuelle accolée à celles de ses congénères. Le porteur qualifie cette immunisation de "vaccination non invasive". Les babouins peuvent venir d'un protocole précédent, et ils sont gardés en vie à l'issue pour intégrer un autre protocole de niveau léger ou modéré, après avis du vétérinaire.
Objectifs
Notre partenaire, développe des candidats médicaments , dont l’objectif thérapeutique est soit dans le traitement de cancer soit dans des indications en auto-immunité. Trois candidats médicaments (CM) sont actuellement en développement et sont prévus d’être introduits en clinique dans les 2 ans. Dans le cadre du développement de tests permettant la détection et la mesure des anticorps dirigés contre les candidats médicaments (anti-CM-1, anti-CM-2 et anti-CM-3), produits chez le primate et chez l’homme, tests utilisés respectivement lors d’études précliniques réglementaires effectuées chez le primate et dans le cadre des études cliniques réalisée chez l’homme, notre partenaire désire générer des anticorps polyclonaux de primate qui seront utilisés comme contrôle positif dans ce test. Ces anticorps peuvent être obtenus par vaccination non invasive de primates, suivie d’une prise de sang limitée au volume éthiquement acceptable, à partir duquel seront purifiés les anticorps.
Bénéfices attendus
Les anticorps produits chez le primate dans ce protocole seront purifiés et serviront de contrôle positif dans le tests d'anticorps anti-candidat médicament, utilisés respectivement lors d’études précliniques réglementaires effectuées chez le primate et dans le cadre des études cliniques réalisée chez l’homme.
Procédures
Injection du candidat médicament (30 min) à J0 et à J21 sur animaux sous anesthésie légère, et prélèvement de sang en petit volume (30 min) à J0, et à J31, sur animaux sous anesthésie légère.
Impact sur les animaux
Les animaux reçoivent deux injections intradermiques lors de l’immunisation, qui peut induire une légère inflammation cutanée, et donc une légère douleur (type vaccin). Nous n'attendons pas d'effet indédirable suite aux 2 prélèvements sanguins espacés d'un mois (petits volumes).
Devenir
Les animaux issus de cette procédure peu invasive, de sévérité modérée, seront gardés en vie, et pourront intégrer un autre protocole de classe légère ou modérée en fonction de la compatibilité des objectifs scientifiques et uniquement après avis du vétérinaire référent.
Remplacement
Il n'existe pas de remplacement possible pour ces expérimentations qui répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement. L'alternative non animale serait d’utiliser des anticorps humains anti-candidat médicament (anti-CM) comme contrôles positifs dans les tests d’immunogénicité. Cependant, ces molécules ne sont pas disponibles. Il est nécessaire d’obtenir des anticorps anti-CM comme contrôles positifs dans les tests d’immunogénicité, qui puissent être reconnus par des anticorps secondaires anti-humains. Or des anticorps de ce type ne peuvent pas être obtenus in vitro, car ils ne seraient pas reconnus par les anticorps secondaires anti-humains. Bien que l’utilisation de tels anticorps anti-CM déjà disponibles ait été envisagée, elle ne permettait pas la détection d’anticorps anti-CM humains. Cela aurait invalidé le test, qui présente un caractère réglementaire. Ainsi l'immunisation d’animaux dont les anticorps peuvent être reconnues par des anticorps humaines doit être utilisée à cette étape du développement.
Réduction
Le nombre maximum de 2 animaux par groupe est suffisant pour la production et la purification d’une quantité suffisante d’anticorps polyclonaux. Cependant si l'immunisation d'une seul animal satisfait à la quantité et à la qualité des anticorps produits, le second animal ne sera pas utilisé. Aucun test statistique n’est nécessaire. D’autre part, de façon à réduire le nombre d’animaux utilisés et dans la mesure du possible, les primates inclus dans cette procédure expérimentale, pourront être réutilisés d’un protocole précédent après avis favorable du vétérinaire.
Raffinement
De façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie et un traitement analgésique leur sera donné de façon adaptée en cas de réactions secondaires suite à l’immunisation. La fréquence d'observation des animaux est doublée lors des immunisations, passant de 3 à 6 fois par jours, et consiste en des examens cliniques de l’animal vigile, permettant une prise en charge individuelle et adaptée. Les animaux seront hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Au cours du protocole expérimental les individus traités seront hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de l’espace.
Choix des espèces
Les PNH, particulièrement les babouins, représentent l’espèce animale de choix pour la génération d’anticorps de référence pouvant servir de contrôles positifs pour doser les anticorps anti-anticorps thérapeutique générés à la fois chez le singe (macaque) et chez l’homme. Il s’agit d’animaux jeunes adultes (4 à 15Kg) dont le système immunitaire est mature.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
Après une injection unique d'un virus modifié (AAV), soit dans une veine par voie rétro-orbitale sous cinq minutes d'anesthésie gazeuse, soit directement dans le cerveau lors d'une craniotomie de 70 minutes, des souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer passent un test en labyrinthe en Y d'une journée et le test de la piscine de Morris, quatre à huit jours d'entraînement suivis d'un jour de test. 172 souris, issues de couples reproducteurs commerciaux, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Le virus doit faire produire à leur cerveau une "protéine X" que le résumé ne nomme pas, et le porteur cite parmi les effets attendus une douleur possible à la pose des barres d'oreille, un risque de saignement, une infection de l'œil après l'injection rétro-orbitale et une perte de poids de 5 à 7 %. Le jour de leur mise à mort, leur sang et leur liquide céphalo-rachidien sont prélevés sous anesthésie, et les souris de l'élevage de la lignée sont tuées sans prélèvement.
Objectifs
Aucun traitement n'étant aujourd'hui en mesure de combattre de façon efficace la progression des maladies neurodégénératives, nous avons pour objectif de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Comment ? En nous tournant vers la thérapie génique, qui consiste à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau dans le but de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans la maladie d'Alzheimer (MA) dans un modèle murin de la maladie. Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié (AAV) permettant de délivrer l’ADN au cœur même des cellules. Cependant, dans l’optique d’une application clinique chez l’Homme, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux AAV modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle murin de la maladie MA. Les objectifs de l’étude sont : 1) Démontrer la fonctionnalité de l’AAV et donc de confirmer l’efficacité thérapeutique de l’administration intracérébrale. 2) Comparer l’efficacité thérapeutique de deux AAV par administration intracérébrale ou intraveineuse. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA.
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV codant pour la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec phénotype dommageable seront utilisés. Les couples reproducteurs commerciaux seront utilisés. Les animaux seront injectées une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (70 minutes sous anesthésie gazeuse avec injection d'analgésique en pré-operatoire ,et application d'analgésique sur le site incisé. Des études comportementales (le test du labyrinthe d'expérimentation en Y ou Y-maze, et le test de la picine de Morris) seront réalisées afin d’évaluer les effets des vecteurs injectés sur les déficits cognitifs. le test du Y-maze sera realisé en une session d'une jounrée. Le test de la piscine de Morris comprend des sessions d'entrainement de 4 à 8 jours, puis un test effectué en une journée, juste apres la session d'entrainement. Le jour d'euthanasie, un prélèvement du liquide céphalo-rachidien et sanguin sera realisé sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Parmis les effets indésirables attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1)Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro-orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV pourrait être observée (5 à 7% du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études), bien que les concentrations des AAVs utilisées soient déjà évaluées in vitro dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris.7) un stress lié à la manipulation de des animaux lors des tests comportements
Devenir
l’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des actes prévues que ce soit pour l’élevage (sans prélèvement) de la lignée ou à l’issue des procédures (avec prélèvement pour analyse).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (172) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. La taille des effectifs a donc été établie grâce à un calcul de puissance. Afin de limiter le nombre total d’animaux essentiels au projet, les tests de comportement et les analyses histologiques, biochimiques et moléculaires post-mortem seront dans la mesure du possible réalisés sur les mêmes animaux. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’informations en utilisant un minimum d’animaux. Les différents paramètres (comportementaux, biochimiques, histologiques, etc) seront analysés grâce à des essais appropriés en fonction des demandes/exigences expérimentales.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection locale d’analgésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l’injection. Une surveillance particulière de l’œil sera faite en post opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. Le geste de l’injection intraveineuse est maitrisé par l’applicateur. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. De plus, les tests comportementaux étant réalisés de façon hebdomadaire sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux jeunes adultes (souris : 4-8 semaines) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 6 semaines puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections stéréotaxiques ou intraveineuses de manière précoce (4-8 semaines) afin de maximiser les effets bénéfiques du traitement sur la neuropathologie et le comportement).
Le risque d’obésité associé au retard de croissance intra-utérin est-il lié à la programmation du système endocannabinoïde ?
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Ils subissent un gavage au glucose puis des séries de six prélèvements sanguins à la queue, une injection d'insuline suivie de six autres prélèvements, et un hébergement en cage individuelle que le porteur reconnaît comme un stress chronique chez ces animaux sociaux. À la fin, tous sont tués pour prélever sang, muscles, tissus adipeux, cœur et foie. Le projet vise à relier retard de croissance intra-utérin et obésité adulte via le système endocannabinoïde, le porteur affirmant l'impossibilité d'utiliser un autre modèle, l'étude longitudinale de la gestation à l'âge adulte n'étant selon lui pas réalisable chez l'humain.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'étudier chez des rats nés avec un retard de croissance, si des altérations précoces du système endocannabinoïde peuvent contribuer au développement ultérieur de l'obésité et de la résistance à l'insuline à l'âge adulte.
Bénéfices attendus
De nombreuses études, épidémiologiques, cliniques et expérimentales sur modèles animaux, ont à présent clairement établi que l’environnement nutritionnel pendant les périodes critiques du développement, les périodes fœtale (gestation) et néonatale, peut induire une programmation métabolique ayant des effets à long terme sur la physiologie de l’organisme favorisant la survenue de maladies métaboliques chroniques à l’âge adulte, comme l’obésité, le diabète, l’athérosclérose ou le cancer. Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est un problème de santé publique qui concerne près de 10% des naissances en France. Le RCIU découle le plus souvent d’altérations de la fonction placentaire réduisant les apports en nutriments au fœtus. Avec la prématurité, le RCIU constitue la première cause de morbi-mortalité néo-natale mais également un facteur de risque de survenue de maladies métaboliques chroniques à l’âge adulte. Cette « programmation métabolique fœtale » affecte le fonctionnement de multiples organes et circuits métaboliques et implique des mécanismes complexes qui ne sont pas complètement compris. Bien que le rôle du système endocannabinoïde dans la régulation de l’homéostasie glucidique et lipidique et du tissu adipeux soit bien connu chez l’adulte, l’impact de la programmation métabolique fœtale, en particulier du RCIU, sur le fonctionnement de ce système n’a, à ce jour, jamais été étudié. Ce projet d’étude est donc particulièrement pertinent et permettrait de définir de nouvelles pistes d’intervention nutritionnelle périnatale pour prévenir les conséquences à long terme d’un RCIU, en ciblant le système endocannabinoïde.
Procédures
Les rats subiront diverses interventions au début, au milieu et/ou à la fin du protocole. Elles auront pour but de 1) mesurer la composition corporelle sur animal vigile via une technique non invasive peu stressante réalisée une fois/animal, 2) mesurer la tolérance au glucose. Les animaux subiront un gavage avec une solution de glucose puis 6 prélèvements de sang de 300μl chacun seront réalisés au niveau de la queue. Ces prises de sang interviendront à T0 (juste avant le gavage) puis 15, 30, 60, 90 et 120 minutes après. Ce test sera réalisé 1 fois/animal, et 3) mesurer la sensibilité à l'insuline. Les animaux subiront une injectionintrapéritonéale d'insuline (dose finale de 0.75mU/g de poids) puis 6 prélèvements de sang de 300μl chacun seront réalisés au niveau de la queue. Ces prises de sang interviendront à T0 (juste avant le gavage) puis 15, 30, 45, 60 et 120 minutes après. Ce test sera réalisé 1 fois/animal.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable particulier n’est attendu en lien avec les différents régimes et les différentes mesures réalisées. Afin de mesurer précisément leur consommation alimentaire pendant toute la durée du protocole expérimental, les rats seront hébergés en cage individuelle. Cet hébergement individuel affectera le bien-être de ces animaux sociaux en induisant un stress chronique que nous cherchons à réduire en favorisant les contacts acoustiques, olfactifs et optiques avec leurs congénères et en fournissant un enrichissement adapté dans la cage. L’enrichissement de l’environnement sera mis en place avec différents items tels que tunnels en pvc, des maisonnettes en plastique translucide rouge, boule en inox, papier pour se faire un « lit ».
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses qui permettront de répondre aux objectifs du projet. Ainsi, juste avant la mise à mort des rats, sera prélevé la totalité du sang puis juste après la mise à mort, seront prélevés les muscles les tissus adipeux sous cutané et rétro-abdominal, le coeur, le foie et le muscle gastrocnemien.
Remplacement
Pour ce projet, nous avons décidé d’utiliser des rats sprague-dawley. Nous avons choisi ce modèle en raison de l’impossibilité d’utiliser un autre modèle pour répondre clairement à nos objectifs, à savoir étudier les altérations du système endocannabinoïde induites au cours de la période de gestation par un retard de croissance intra-utérin (RCIU, modèle de prématurité) et une fois adulte. Il est possible d’étudier le système endocannabinoïde via des prélèvements sanguins et des biopsies tissulaires chez l’homme adulte. Cependant, le prélèvement de nombreuses biopsies musculaires et adipeuses chez le nouveau-né prématuré rend cette alternative très difficile à mettre en œuvre. De plus le design longitudinal de cette étude couvrant une période de vie allant de la gestation jusqu’à l’âge adulte n’est pas réalisable chez l’homme. Des modèles cellulaires d’adipocyte ou de muscle squelettique, peuvent être utilisés pour tester des conditions physiopathologiques modifiant le système endocannabinoïde. Cependant, la diversité cellulaire des tissus adipeux et musculaires et leurs interactions sont également très complexes et difficiles à reproduire in vitro. Enfin, il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro, ou in silico, permettant de reproduire les échanges placentaires entre la mère et le fétus contrôlant le développement fœtale et la gestation, d’autant plus que les mécanismes et les conditions responsables du RCIU sont encore mal compris.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de rats nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 15% des teneurs circulantes en endocannabinoides entre les rat contrôles et les rats nés avec un RCIU. Des études ultérieures réalisées chez des rongeurs adultes ont montré que ce paramètre peut varier entre 10 et 50 % en fonction du degré d'obésité. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de rats nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée au RCIU, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 10 rats. Le nombre total de rats nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 40 rats males et 40 rats femelles: 10 rats contrôle et 10 rats RCIU au sevrage (pour chaque sexe), 10 rats controles et 10 rats RCIU âgés de 7 mois (pour chaque sexe). Pour obtenir ceux-ci 10 femelles rattes seront utilisées (nombre minimu recommandé par Janvier Labs pour obtenir le nombre de rats nécessaire). soit un total de 90 animaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les rats seront hébergés individuellement dans des cages T4. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Si un animal présente 3 points limites notables (tels que manque de toilettage, hypoactivité, agressivité, maigreur...) ou 1 point sévère (tels que mutilation, perte de poids supérieure à 20% en quelques jours), il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.
Choix des espèces
Notre projet vise à documenter les altérations précoces du système endocannabinoides induite par le retard de croissance intra-utérin (RCIU) en réponse à un régime hypoprotéique (modèle mimant la prématurité du nouveau né), et leurs conséquences à long terme sur le développement de l'obésité et de l'insulinorésistance une fois adulte. ces mesures seront réalisées au sevrage des rats (j+22 postnatal) et à 7 mois (rats adultes). Ce type d'expérimentation nutritionnelle ne peut pas être menée chez la femme enceinte. Notre étude nécessite le prélèvement de différents tissu et plasma qui sont difficiles à obtenir en particulier chez des nouveaux-né prématurés et requièrent également un suivi jusqu'à l'age adulte qui n'est pas envisagebale chez l'homme. Notre projet vise à documenter les altérations précoces du système endocannabinoides induite par le RCIU et leurs conséquences à long terme sur le développement de l'obésité et de l'insulinorésistance une fois adulte. Aussi, pour répondre à cette problématique, les rats seront utilisés au sevrage (j+22/23 postnatal) ou à l'âge de 7 mois (adulte).
Criblage de principes actifs pour la recherche d’Immunothérapie dans des modèles de lymphome du système nerveux central
- Recherche appliquée
- Cancers
158 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur greffe des cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, avec prélèvements sanguins réguliers et traitements, la tumeur pouvant provoquer perte de poids, ataxie et apathie. Le projet crible des molécules d'immunothérapie contre le lymphome cérébral. Le porteur indique qu'un criblage in vitro a limité le nombre de molécules testées, mais qualifie les expériences in vivo d'indispensables avant tout essai clinique.
Objectifs
Les lymphomes primitifs du système nerveux central (LCP) sont des lymphomes qui se développent dans le cerveau. Ils peuvent être associés à une atteinte de l’œil, des méninges et du liquide céphalo-rachidien. Ce sont des lymphomes rares de mauvais pronostic avec les traitements actuels. Dans le cerveau, les tissus (microenvironnement) entourant le lymphome ne peuvent développer que des réactions immunologiques peu efficaces. . Cette caractéristique peut être responsable d’une mauvaise efficacité des traitements anti-lymphomateux et en particulier des immunothérapies qui représentent un progrès majeur pour le traitement des lymphomes systémiques (se développant en dehors du système nerveux central). Dans ce projet, notre collaborateur procèdera au criblage de nombreuses molécules de notre partenaire industriel sur des modèles in vitro afin de sélectionner les molécules candidates à tester sur des modèles in vivo. Ceci permettra de limiter le nombre d’animaux utilisés. Nous évaluerons l’efficacité clinique de cette sélection de molécules sur nos modèles de LCP murins. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de molécules et de combinaison de molécules, et d’évaluer leur impact sur le microenvironnement immunologique cérébral. La perspective de ce travail est de développer des essais thérapeutiques cliniques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre d’une part, d’identifier des molécules et/ou associations de molécules innovantes efficaces contre le lymphome cérébral et documenter comment ces molécules modulent le microenvironnement immunologique cérébral. A partir des connaissances ainsi acquises, des essais cliniques pourront ensuite être proposés chez les patients avec l’objectif d’améliorer le pronostic de cette maladie.
Procédures
Dans une première procédure, des cellules tumorales seront greffées dans le cerveau des animaux sous anesthésie générale (environ 40min). Des prélèvements sanguins seront réalisés tous les 15 jours sur ces animaux (durée du geste
Impact sur les animaux
L’implantation de tumeur cérébral entraine, chez les animaux implantés dont la tumeur a pris, les symptômes suivants (possiblement) : perte de poids, ataxie, apathie. Les traitements par chimiothérapie peuvent également entrainer des effets secondaires en fonction de leur nature qui vont principalement se traduire par une perte de poids. L’état général des animaux sera évalué dès l’apparition des premiers symptômes en regard avec la grille de score. Pour limiter au maximum leur souffrance, les animaux recevront des soins supports ou seront euthanasiés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Le criblage initial sur des modèles in vitro permettra de limiter le nombre de molécules/association de molécules à tester sur des modèles in vivo, et limitera ainsi le nombre d’animaux nécessaires pour les expérimentations in vivo. Ces expérimentations in vivo restent néanmoins indispensables en amont des essais cliniques chez les patients et pour étudier le microenvironnement cérébral.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés au plus bas tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d’un outil statistique.
Raffinement
Pour limiter la souffrance des animaux, les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Les animaux seront observés 5 fois par semaine pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal être. Pour limiter le stress des animaux, un délai minimal de 3 jours est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine minimum afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées avant l’apparition de signes de souffrance des animaux tels que décrits dans la grille de score.
Choix des espèces
La souris est le modèle communément utilisé en cancérologie : les souches sont parfaitement définies et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. L’existence de souches immunodéprimées nous intéresse particulièrement pour l’établissement de modèles tumoraux à partir de xénogreffes. Nous travaillerons sur des souris adultes âgées de 6 semaines chez qui le cerveau est totalement développé.
Etude de la comorbidité schizophrénie – troubles de la consommation d’alcool dans le modèle « MAM »
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 070 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposés dès l'adolescence à l'alcool et à des cannabinoïdes, ils sont soumis à des sessions de consommation d'alcool puis à une craniotomie pour implanter une électrode mesurant la dopamine. Le projet étudie la comorbidité entre schizophrénie et troubles de la consommation d'alcool sur un modèle induit dès la période embryonnaire. Le porteur affirme que ces mécanismes psychiatriques complexes ne sont pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in silico.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact d'expositions précoces aux drogues sur les troubles de la consommation d'alcool à l'âge adulte dans un modèle animal de schizophrénie. En effet il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'acool et de cannabis sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool et d'agent cannabinoides sur les comportements des animaux modèles de schizophrénie mais également sur la neurotransmission dopaminergique. En effet la dérégulation de ce système de neurotransmission est directement impliquée aussi bien dans les troubles de la conosmmation d'alcool que dans ceux associés à la schizophrénie.
Bénéfices attendus
L'exposition précoce à l'alcool durant l'adolescence est nécessaire pour l'observation à l'âge adulte d'une consommation exagérée d'alcool. Nous n'avons pour le moment aucune information concernant la co-exposition avec des agents cannabinoides, drogues très fréquemment consommée par les adolescents et les jeunes adultes atteints de schizophrénie ou non. Grâce à ces expériences, nous pourrons obtenir des données importantes concernant les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent les troubles de la consommation d'alcool dans un modèle pertinent pour l'étude de la schizophrénie. L'aspect neurobiologique de ce projet aidera la communauté scientifique à mieux comprendre l'impact d'une exposition précoce à des drogues couremment utilisées sur les systèmes dopaminergiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des sessions de consommation d'alcool volontaire soit dans la cage de stabulation (24 heures 1 jour sur 2 pendant 8 à 15 semaines), soit dans des cages d'auto-administration opérante (sessions de 15 minutes, 5 jours par semaine sur une période de 4-5 mois). A l'âge adulte une partie des animaux seront soumis à une craniotomie (30 à 40 minutes) dont l'objectif est d'implanter une micro-électrode d'enregistrement de la libération de dopamine, neurotransmetteur crucial aussi bien dans les troubles observés dans la schizophrénie que dans les troubles de la consommation de drogues.
Impact sur les animaux
Douleurs post-opératoires de palier 1 l'âge adulte suite à l'implantation des canules par craniotomie. Durée prévue : 2-3 jours
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de cette procédure pour nous permettre de collecter les cerveaux pour des analyses histologiques, biochimiques ou génétiques nécessaires pour finalser le projet.
Remplacement
Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme la schizophrénie ou l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à chacune des expériences a été estimé sur la base d'expériences précédentes utilisant un autre modèle animal de schizophrénie et en prenant en compte la variabilité interindividuelle observée aussi bien dans les modèles animaux que dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet. De plus nous réaliserons les expériences aussi bien sur les mâles que sur les femelles pour ne pas avoir à éliminer les animaux surnuméraires mais également, dans le but d'une réduction, ne pas à avoir à refaire tout ce projet ultérieurement uniquement sur les femelles (et donc euthanasier les ratons mâles surnuméraires à ce moment).
Raffinement
Tout au long du projet les animaux seront surveillés quotidiennement et des points limites adaptés à chaque procédure expérimentale ont été établis avec une prise en charge de la douleur et de la souffrance potentielles adaptée à chaque procédure. Les animaux seront stabulés dans des cages enrichies grâce à une buchette en bois et un tunnel en carton.
Choix des espèces
Le modèle MAM est un modèle décrit chez le rat et nous développons ce projet dans le cadre d'une collaboration multicentrique qui a très largement décrit ce modèle en France. Pour poursuivre nos études en commun, nous devons utiliser le même modèle que nos collaborateurs. Le rat est un modèle idéal pour l'étude de la comorbidité troubles de la consommation d'alcool/schizophrénie en particulier en ce qui concerne certaines études comportementales comme l'auto-administration d'alcool qu'il est plus difficile d'observer chez les souris. Les animaux seront utilisés tout au long de leur vie. La mise en place du modèle MAM se déroule au cours de la période embryonnaire et les animaux issus des cette première procédure seront utilisés jusqu'à l'âge adulte. Tous les petits seront soumis à la procédure d'exposition aux drogues pendant la période d'adolescence (entre les jours 28 et 50). Les rats seront conservés jusqu'à l'âge adulte pour évaluer les effets d'une telle pré-exposition précoce sur les comportements et la neurobiologie à l'âge adulte.
Etude de microdialyse cérébrale pendant et après l’administration d’un nouveau médicament chez le primate non-humain.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
9 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique d'environ trois heures pour implanter une canule cérébrale, puis reste maintenu en chaise de contention pendant environ six heures lors des séances de microdialyse. Le projet évalue la capacité d'un médicament à franchir la barrière hémato-encéphalique. Le porteur justifie le recours à ces primates non-humains par leur proximité phylogénétique avec l'humain.
Objectifs
Le présent projet a deux objectifs liés entre eux : le premier objectif est d’évaluer la capacité d'un médicament à traverser la barrière hémato-encéphalique après son administration (par voie intraveineuse, sous-cutanée ou orale), le second objectif est d’évaluer la capacité du médicament à induire une réponse pharmacodynamique dans le cerveau. Le premier objectif est donc de démontrer la pénétration cérébrale, pour cela, il est nécessaire d’évaluer la concentration tissulaire libre du médicament dans le cerveau à l’aide de la microdialyse. Le second objectif est de démontrer que le médicament permet d’activer le récepteur cérébral cible.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’évaluer la capacité d’un médicament à traverser la barrière hémato-encéphalique et sa capacité à induire une réponse pharmacodynamique dans le cerveau. En cas de réussite, le médicament pourra être testé chez l’homme.
Procédures
Après une période d'acclimatation suffisante (un mois minimum), les animaux subiront une chirurgie d'implantation de canule cérébrale. Ces canules de guidage seront implantées sous anesthésie générale et analgésie lors d'une chirurgie stéréotaxique d'une durée approximative de 3 heures. Les animaux bénéficieront d'une période de récupération de 7 jours afin notamment que la barrière hémato-encéphalique se reforme. A la fin de cette période de récupération, les animaux seront placés en chaise à contention pour laquelle ils auront été entraînés précédemment. La sonde de microdialyse sera insérée, via la canule de guidage dans le cerveau. Le microdialysat à la sortie de la sonde sera collecté et la sonde stabilisée le temps nécessaire. Après l'administration du médicament, la collecte des microdialysats sera poursuivie avec des aliquots prélevés toutes les 20 minutes. Des prélèvements sanguins seront réalisés à intervalle régulier. La perfusion et collecte cérébrale sera poursuivie pendant 6h. Une semaine après cette première microdialyse cérébrale, les animaux seront à nouveau placés en chaise à contention. la sonde de microdialyse sera insérée, via la canule de guidage, dans le cerveau. Le microdialysat à la sortie de la sonde sera collecté et la sonde stabilisée le temps nécessaire. Après l'administration du médicament (par une autre voie ou à une autre dose que la première fois), la collecte des microdialysats sera poursuivie avec des aliquots prélevés toutes les 20 minutes. Des prélèvements sanguins seront également réalisés à intervalle régulier. La perfusion et collecte cérébrale sera poursuivie pendant 6h. Les volumes et les doses administrés aux animaux seront en accord avec les recommandations éthiques en vigueur et validés par les sponsors. Les volumes prélevés et le temps de repos accordé aux animaux entre chaque prélèvement seront en accord avec les recommandations éthiques. Les administrations et prélèvements sont donc très ponctuels, la contrainte principale étant le séjour d'environ 6 heures en siège à contention. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de la procédure afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse. En fin de protocole, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour récolte de liquide céphalorachidien et de différents organes pour analyses.
Impact sur les animaux
Pendant et après la chirurgie d’implantation de la canule, comme toute chirurgie et malgré les moyens mis en place, il subsiste un risque de douleur ou d’inflammation. Des signes cliniques au niveau du site chirurgical et des sites d'administration (intraveineux ou sous-cutané, liés ou non à la molécule) peuvent apparaître (hématome, œdème léger, etc.). Pour les besoins de la microdialyse cérébrale, les animaux seront maintenus en siège à contention plusieurs heures d’affilée. Malgré les mesures mises en place, il est possible, du fait des différences intra-individuelles, qu’un animal présente toujours des signes de stress pendant les contentions en siège.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour récolte et analyse des organes.
Remplacement
Les études de preuve de concept chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de démontrer la faisabilité ou de valider un nouveau procédé. Ici, l’objectif est de prouver que la molécule est capable à la fois de passer la barrière hémato-encéphalique et d’agir sur les cibles du cerveau, le modèle animal est donc indispensable.
Réduction
Dans ce projet, un nombre maximum de 9 animaux (3 animaux par étude) sera utilisé afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant d'atteindre les objectifs scientifiques.
Raffinement
Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse (grille d’observation du bien-être). Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux après la chirurgie et entre les prélèvements ainsi qu’entre les administrations. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable de la procédure. Les animaux bénéficieront du programme d’enrichissement défini par la structure du bien-être animal de l'installation, notamment la mise disposition de jouets dans les hébergements et la distribution de friandises systématique en fin de journée. Une rotation du matériel d’enrichissement, incluant une désinfection, sera organisée une fois par semaine pour éviter la lassitude et renouveler l’intérêt des animaux. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux dans des volières conformes aux recommandations pendant toute la durée de l’étude. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. La chirurgie d'implantation de la canule sera réalisée par une équipe experte (extérieure à la société) qui a déjà réalisé cette chirurgie à de nombreusezs reprises et notamment il y a quelques années au sein de notre société. La technique chirurgicale est donc parfaitement maîtrisée ainsi que le protocole d'anesthésie/d'analgésie et de récupération de chirurgie. Le site chirurgical et les sites d'administration seront suivis pendant plusieurs jours après la chirurgie et les administration pour détecter tout signe clinique potentiel. Pour les besoins de la microdialyse cérébrale, les animaux seront maintenus en siège à contention plusieurs heurex d'affilée, la chaise à contention sera donc adaptée pour améliorer le confort des sièges et permettre aux animaux d'être quasiment autonomes (accès aux jouets, aux friandises, au biberonà, tout en gardant une interaction constante avec le manipulateur. Un entraînement spécifique des animaux sera mis en oeuvre pendant la phase d'acclimatation afin de réduire au maximum leur stress le jour des mises en siège prolongées.
Choix des espèces
En raison de la grande proximité phylogénétique entre le Primate Non-Humain (PNH) et l’Homme et en particulier des similitudes du fonctionnement cérébral et des comportements entre ces deux espèces, le modèle primate constitue un modèle de choix pour l’évaluation de molécules qui ont pour cible des récepteurs cérébraux. Le macaque cynomolgus a été choisi car le système nerveux central est connu pour être différents entre les rongeurs et les primates concernant par exemple l'expression ou le métabolisme des transporteurs d'efflux. Il apparaît qu'il existe une meilleure corrélation entre l'expression des protéines d'adhésion et de transport entre l'homme et le singe cynomolgus qu'entre l'homme et les rongeurs. De plus, il existe une meilleure corrélation entre le taux de recyclage du LCR du macaque cynomolgus et l'homme qu'entre la souris et l'homme.
Etude de l’effet antitumoral d’une combinaison de nanoparticules activées par la radiothérapie avec un agent immunothérapeutique chez les souris BalB/C et C57 Black6
- Recherche appliquée
- Cancers
11 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal porte deux tumeurs greffées et reçoit des injections répétées et des séances d'irradiation, le développement tumoral pouvant provoquer nécrose et automutilation. Le projet teste des nanoparticules activées par radiothérapie associées à des immunothérapies contre le cancer. Le porteur affirme que ces mécanismes immunitaires dans un organisme entier ne peuvent être reproduits en culture cellulaire, un tri in vitro ayant précédé les greffes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer un traitement sur des souris possédant un système immunitaire intact et porteuses de deux tumeurs (une sur chaque flanc droit et gauche, pouvant être de nature identique ou différente). Le principe sera d’étudier la réduction du volume tumoral sur la tumeur gauche non-traitée, à la suite du traitement de la tumeur droite et de mettre en exergue l’effet à distance du traitement appliqué via le système immunitaire de l’organisme (effet abscopal). Le traitement de la tumeur droite sera induit par l’injection de nanoparticules activées par radiothérapie, ou par de la radiothérapie seul, ou par une combinaison de ces traitements avec un agent immunomodulateur. Les immunomodulateurs (AIM) peuvent agir à différents niveaux dans le cadre de la réponse immunitaire antitumorale. Par conséquent, il sera intéressant de regarder l’effet de nos nanoparticules sur les différents niveaux de fonctionnement du système immunitaire, c’est pourquoi différents AIM seront évalués en combinaison avec les nanoparticules et la radiothérapie pour ce projet.
Bénéfices attendus
Les nanoparticules activées par la radiothérapie ont démontré leur capacité à tuer les cellules cancéreuses plus efficacement que la radiothérapie seule. D’autres données ont montré que ces nanoparticules sont capables de rendre la tumeur plus attractive pour les cellules immunitaires, par rapport à la radiothérapie seule. Cela permet donc une meilleure réponse immunitaire contre la tumeur. Ces observations font le lien avec les raisons justifiant l’utilisation des nanoparticules activées par la radiothérapie en association avec des agents immunothérapeutiques. Les traitements de patients par des agents immunomodulateurs (AIM) ne fonctionnent que dans 10 à 30% des cas. Dans la majorité des cas (70-90%), l’utilisation de ces agents ne fonctionne peu ou pas, car les tumeurs traitées ne présentent quasiment pas de réponse immunitaire anti-tumorale avant le traitement (au contraire des patients répondants). Ceci souligne la nécessité d’une réponse immunitaire anti-tumorale déjà présentes pour que ces traitements fonctionnent.
Procédures
Injection sous-cutanée : sous anesthésie locale, sur tous les animaux des procédures. 2 injections le même jour (flanc gauche et droit). Réinjection possible une fois, si disparition des greffes tumorales. Maximum 1min/animal. Injection intra-veineuse : animal vigile en contention dans un système permettant l’accessibilité à la veine caudale de l’animal. 1 injection/animal. Maximum 5min/animal. Injection intra-tumorale : sous anesthésie générale de courte durée sur tous les animaux des procédures impliquant l’injection de nanoparticules (ou glucose). 1 injection/animal. Maximum 2 min/animal. Injection intra-péritonéale : lors des procédures précisant l’administration d’agents immunomodulateurs ou lors de traitements de soin pouvant être répéter le cas échéant. Maximum 1 min/animal. Irradiation des tumeurs sous-cutanées : animal vigile en contention et protégé dans un système adapté permettant l’irradiation de la tumeur uniquement. 1 irradiation/jour sur une durée de 1 à 5 jours. Maximum 20 min/animal. Prélèvements sanguins : 1) Une fois avant traitement par ponction de la veine caudale. 2) Juste avant l’euthanasie, un prélèvement pourra être effectué au niveau de la veine mandibulaire sous anesthésie générale par ponction. Maximum 5min/animal.
Impact sur les animaux
Bien que l’animal soit dans un système de contention permettant uniquement l’exposition de la tumeur aux radiations, la radiothérapie peut parfois provoquer une perte de poids, une difficulté à se nourrir, liées à l’irradiation du système digestif de l’animal. L’injection des cellules tumorales en sous cutané et l’injection intra-tumorale sont des gestes pouvant occasionner une angoisse ou de la douleur pour l’animal. Bien qu’aucune toxicité ou effet secondaire ne soit attendue, les composés utilisés peuvent potentiellement occasionner de la douleur pour l’animal. Le développement tumoral peut également provoquer des nuisances pour la souris notamment avec l’apparition de nécrose et la mutilation de l’animal (ronge les zones nécrotiques).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés dés lors d’une atteinte d’un des points limites, ou lorsque l’animal arrive à la fin d’une des procédures décrites pour analyses. Les différents prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
L'étude porte sur des mécanismes complexes qui ont lieu dans un organisme entier et implique la réponse immunitaire. Il n'est pas possible de remplacer par une culture cellulaire ou un organoïde. En revanche, les lignées cellulaires cancéreuses ont d'abord été testées in vitro pour sélectionner les plus pertinentes pour être greffées sur des animaux.
Réduction
Les données des publications scientifiques avec les nanoparticules en combinaison avec la radiothérapie sur les cellules cancéreuses utilisées (prise de greffe, croissance tumorale, courbes de survies) ainsi que sur les agents immunomodulateurs (mode d’administration, dose efficace, toxicité) nous ont permis de réduire au maximum le nombre d’animaux requis pour cette étude. L'expérience acquise et un calcul de puissance de test statistique ont contribués à limiter au strict minimum dans l’étude le nombre d’animaux nécessaire afin d'optimiser l’évaluation du traitement, soit 11520 au maximum sur 5 ans. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de 5 animaux/cage, dans des conditions apyrogènes (nourriture stérilisée et eau disponible à volonté), dans des portoirs ventilés avec température et humidité ambiante contrôlées. Du coton et ou du kraft sera mis à disposition dans la cage afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des maisonnettes qui leur servent d’abri. L'inconfort, la douleur ou l'angoisse des animaux potentiellement liés à la toxicité du composé (bien qu’aucune toxicité ne soit attendue) seront traités par des médicaments adaptés. Aussi, pour éviter toute souffrance aux animaux, ils seront sous anesthésie générale lors des procédures d’injections intra-tumorale et sous anesthésie locale lors des procédures d’injections sous-cutanées. Une habituation des animaux sera mise en place pour les systèmes de contention en amont des injections intra-veineuse et des irradiations. Enfin, des points limites adaptés seront mis en place pour permettre de limiter la douleur à son minimum tout au long des procédures expérimentales. Tout animal présentant une perte de poids par rapport au poids initial sans reprise sera euthanasié. Une dégradation de l’état général (signe de faiblesse, poil hérissé, refus de s’alimenter) entraînera l’isolement de l’animal. Des mesures thérapeutiques seront mises en place telles que l’administration de compléments nutritifs. Si malgré les traitements mis en place les signes cliniques persistent ou progressent, l’euthanasie sera réalisée. Tout animal présentant une nécrose ulcérant de la tumeur ou un volume tumoral total trop important sera euthanasié.
Choix des espèces
La sélection de cette espèce de rongeur est basée sur le fait que les modèles de tumeurs greffées chez des souris immunocompétentes (ayant un système immunitaire pleinement fonctionnel) sont très répandues pour l’étude de traitements anti-cancéreux à travers toute la recherche en immuno-oncologie. Les lignées cellulaires choisies sont issues soit de la souche BalbC (ex : cellules CT26), soit de la souche Black6 (ex : cellules B16F10). Ces souris ayant un système immunitaire pleinement fonctionnel, il est nécessaire d’injecter les lignées cellulaires dans la souche de souris d’origine afin d’éviter tout rejet de greffe. Des souris de 7-8 semaines, jeunes adultes, ont été sélectionnées. Pour des raisons techniques, le poids des animaux doit être au minimum de 20 grammes afin d’assurer de bonnes conditions de traitement par radiothérapie. Pour les irradiations localisées, les animaux sont disposés dans des systèmes de contention exposant uniquement la zone d’intérêt. Ces systèmes sont adaptés à des souris de taille adulte.
Validation du site extrapéritonéal pour la délivrance aiguë et chronique de l’insuline chez le rat diabétique
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
187 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit un diabète par streptozotocine, puis on implante par chirurgie cathéters, pompes et dispositifs de délivrance d'insuline, avec de nombreuses mesures de glycémie et prises de sang. Le porteur signale perte de poids, douleurs post-opératoires, risques d'infection et stress liés aux injections répétées. Le projet vise à valider la voie extrapéritonéale d'administration de l'insuline, et le porteur affirme que ces effets sur plusieurs organes ne peuvent être modélisés in vitro.
Objectifs
L’insuline sécrétée par les îlots de Langerhans du pancréas est la principale hormone permettant de réduire le taux de sucre dans le sang (appelée glycémie). Dans le cas du diabète de type 1 et dans certains stades avancés du diabète de type 2, sa sécrétion est trop faible pour obtenir une régulation correcte de la glycémie. De l’insuline est alors administrée aux patients pour palier à ce manque, par injection sous la peau (appelée voie sous-cutanée), ou dans certains cas directement dans l’abdomen (voie intrapéritonéale). Cependant, ces deux voies d’administration présentent des inconvénients notamment liés à diminution de l’efficacité de l’insuline, pour la sous-cutanée, et à des problèmes d’infection et d’adhésion tissulaire pour l’intrapéritonéal. La voie extra-péritonéale, correspondant à l’espace entre le péritoine (une fine membrane au qui recouvre les organes et qui comporte de nombreux vaisseaux sanguins) et les muscles abdominaux, semble être une alternative intéressante, en permettant un passage rapide de l’insuline dans le sang, tout en étant à distance des organes. Cependant, aucune étude n’a pour le moment été réalisée sur l’administration de l’insuline en continu en extra-péritonéal. Cette étude a donc pour objectif de montrer, chez le rat diabétique, les bénéfices d’une administration extra-péritonéale d’insuline par rapport aux voies sous-cutanée et intra-péritonéale.
Bénéfices attendus
Les seules données disponibles à ce jour sur la délivrance extrapéritonéale d’insuline concernent des injections uniques, afin d’évaluer une efficacité à court terme. Ce projet complèterait ces données en permettant d’évaluer les effets d’une adiministration chronique d’insuline en extrapéritonéale. Cela permettra ainsi d’étudier à la fois la régulation de la glycémie mais également d’autres marqeurs comme le niveau de stress oxydant ainsi que la réaction des tissus au site extrapéritonéal à un contact prolongé avec de l’insuline. Le principal bénéfice attendu est de démontrer que la voie extrapéritonéale peut constituer une réelle alternative aux voies sous-cutanée et intrapéritonéale, pour l’administration d’insuline aux patients diabétiques de type 1.
Procédures
[Gestes techniques réalisés : 1- Mesure de glycémie sur une goutte de sang (volume 6µL) sur animal vigile – Durée
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sont : - perte de poids en lien avec l’état diabétique - des douleurs suite aux chirurgies réalisées pour la mise en place des cathéters, des pompes et du dispositif de délivrance d’insuline - risque d’infection suite aux implantations (pompe péristaltique, cathéter, dispositif de délivrance) - Un inconfort lié au positionnement de la pompe en sous-cutanée sur le dos de l’animal. - un stress en lien avec la répétition des injections d’insuline dans les cathéters ou les mesures de glycémies et prises de sang au cours du suivi
Devenir
La justification du sort des animaux est commune aux 3 procédures. Les 3 procédures de ce projet nécessité l’utilisation d’animaux avec un niveau de diabète suffisament conséquents pour observer les effets d’insuline administrée selon différentes voies ou avec différents systèmes d’administration. Par conséquent les animaux avec une glycémie trop basse sont écartés de l’étude. Ayant reçu une injection de streptozotocine, qui agit sur différents organes en plus de détruites les cellules béta des îlots pancréatiques, ils ne peuvent être utilisés pour d’autres projets sans risque d’amener un biais expérimental. Ils sont donc mis à mort. Ensuite, la finalité de chacune des procédures est d’étudier l’impact sur les tissus d’une délivrance d’insuline répétée (procédure 1) ou continue via des cathéters (procédure 2) ou un dispositif de délivrance diffuse (procédure 3). Cela nécessite des prélèvements de différents tissus qui nécessitent la mise à mort des animaux.
Remplacement
Les effets de l’administration chronique de l’insuline en extrapéritonéal mettant en jeu plusieurs tissus et organes, elle ne peut être modélisée in vitro. Ces deux paramètres sont évalués par des suivi de glycémie et des prises de sang qui ne sont pas réalisables in vitro.
Réduction
L’effectif des différents groupes prend en compte les sources de variabilité importantes de l’étude, telles que l’induction du diabète, les implantations de cathéter, pompes péristaltiques et de dispositifs de délivrance. Cela permettra d’avoir, selon l’expérience acquise par le laboratoire, suffisamment d’animaux pour réaliser des analyses statistiques sur les différents marqueurs étudiés (glycémie, poids, insulinémie). La plupart des groupes expérimentaux de ce projet combinent au moins deux des sources de variabilité cité plus haut, c’est pour cette raison que les effectifs ont été fixés à 12 animaux par groupe. Pour les animaux contrôles, sur lesquels aucune chirurgie n’est pratiquée, la variabilité est moins importante et l’effectif des groupes est réduit à 8 animaux. Le test statistique utilisé sera l’ANOVA pour des données ayant une distribution suivant une loi normale ou Kruskal-Wallis dans le cas contraire. Les groupes composés d’animaux diabétiques et non diabétiques sont répétés dans les deux phases du projet impliquant l’implantation de pompes péristaltiques. Cela obéit à une logique de rigueur scientifique, qui invite à ce que les cages hébergent des animaux des différents groupes, pour une meilleure représentativité des contrôles.
Raffinement
Le raffinement intervient au niveau Il intervient au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress. Pour l’ensemble des 3 procédures, où interviennent des chirurgies pour l’implantation des cathéters (procédure 1), de pompes péristaltiques (procédure 2 et 3) et de dispositif de délivrance (procédure 3) le raffinement intervient lors de l’anesthésie, réalisée au gaz pour un réveil plus rapide et de la prise en charge post-opératoire par l’administration d’un anti-inflammatoire et anti-douleur. Afin de réduire les risques d’infection, les chirurgies sont réalisées sous hotte à flux laminaire, avec l’utilisation d’un protocole de désinfection de la peau spécifique, ainsi que des champs opératoires stériles et une désinfection des instruments par chaleur humide. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. En accord avec cette grille d’évaluation, des points limites prédictifs ont été déterminés afin de soustraire les animaux aux procédures expérimentales en cours d’étude, tels qu’une persistance de l’état diabétique (perte de poids, hyperglycémie) malgré l’administration d’insuline, une infection post-opératoire non traitable.
Choix des espèces
Le choix du rat est d’abord justifié par de fortes similitudes avec l’Homme sur le plan métabolique, au niveau de la régulation de la glycémie. Ce choix est également motivé par la capacité des rats à bien supporter les chirurgies, et par la possibilité d’accéder à la même voie d’administration de l’insuline que chez l’Homme (sous-cutanée, intra-péritonéale, extra-péritonéale) Enfin, nous avons également choisi d’utiliser le rat pour les premières études précliniques, pour limiter autant que possible le nombre de gros animaux (porcs et primates) nécessaires pour les études suivantes. Les rats Wistar seront de jeunes adultes, âgés de 7 semaines, coïncidant avec un poids de 200g environ. C’est à ce poids que le protocole d’induction du diabète présente le meilleur taux de succès. En effet, avec des âges/poids inférieurs la mortalité est plus élevée, tandis qu’à des âges/poids supérieurs le taux de réussite diminue. De plus, à cet âge, le système immunitaire est suffisamment mature pour que les animaux puissent subir des chirurgies sans risques accrus d’infections.
Etude des séquelles de la malaria cérébrale par neuroimagerie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et sévère. Elles sont infectées par un parasite provoquant une malaria cérébrale, une partie n'étant pas traitée et développant perte de poids, hypothermie et troubles neurologiques avant d'être tuées, les autres suivies par IRM sous anesthésie pendant six mois puis soumises à des études comportementales non détaillées. Le projet étudie les séquelles cérébrales de la maladie. Le porteur affirme que le recours à l'animal est incontournable, aucune méthode in vitro ou in silico n'existant selon lui.
Objectifs
La malaria est une cause majeure de morbidité et de mortalité avec 241 millions de cas cliniques et plus de 627000 morts en 2020 (OMS). Elle est causée par un parasite du genre Plasmodium inoculé par le moustique Anophèle. La majorité des décès survient chez les enfants de moins de 5 ans en Afrique sub-saharienne. La malaria cérébrale, complication la plus létale de l’infection par Plasmodium falciparum, se traduit par une encéphalopathie accompagnée de convulsions, de pertes de conscience, et d’un coma conduisant au décès dans 15 à 20 % des cas, tandis que des déficits neurologiques peuvent subsister chez les survivants. Il n’existe à ce jour aucun traitement efficace de cette complication. Dix à 20 % des sujets survivant à une malaria cérébrale présentent des troubles neurologiques importants immédiatement après la maladie (cécité corticale, parésie, hypotonie, ataxie, épilepsie, troubles de la mémoire, de l’élocution etc...) qui peuvent régresser ou persister. Chez d’autres sujets, sans séquelles apparentes après la maladie, des atteintes neurologiques telles qu’une épilepsie, ou une hyperactivité avec déficit de l’attention se manifesteront plus tardivement. Alors que les séquelles de la complication cérébrale contribuent au coût humain, social et économique de la malaria en compromettant le développement et l’éducation des enfants qui en sont atteints, elles ne sont que très peu étudiées. Malgré l’autorisation en 2021 d’un vaccin contre la malaria (RTS,S/AS01) destiné à la population pédiatrique, il est peu probable qu’il conduise à l’éradication de la maladie et de sa complication la plus létale, puisqu’on estime qu’il ne permettra de réduire que 30% de la mortalité résultant des formes sévères de malaria. Nous utiliserons un modèle de malaria cérébrale avec survie obtenu chez la souris infectée par Plasmodium Berghei ANKA et traitée par un antimalarique dès l’apparition des signes neurologiques (504 souris seront utilisées). Ce modèle nous permettra d’étudier sur le long terme l’évolution des séquelles cérébrales sur les plans anatomique, métabolique, vasculaire et fonctionnel. Nous mettrons en œuvre des techniques d’imagerie non-invasives (IRM) réalisées sous anesthésie. Ces études permettront d’obtenir une information sur la distribution spatiale et temporelle des lésions, et de vérifier différentes hypothèses comme l’atteinte persistante des capillaires ou l’altération des connexions neuronales (connectome) aux niveaux structural et fonctionnel.
Bénéfices attendus
Cette étude repose sur l’emploi d’un modèle de malaria cérébrale chez la souris très utilisé en pathologie car présentant de nombreux points communs avec la maladie pédiatrique. Elle s’appuie aussi sur des méthodes avancées de neuroimagerie transposables à l’homme qui permettent l’exploration non-invasive du cerveau. L’étude par imagerie de la malaria cérébrale chez la souris a permis d’identifier pour la première fois en 2005 l’œdème cérébral ischémique comme principale caractéristique de la maladie et cause de décès. Ces résultats ont été confirmés 10 ans plus tard par deux études conduites sur des cohortes pédiatriques en Afrique, les enfants malades ayant bénéficié d’un examen clinique par neuroimagerie. L’objectif de notre projet est l’identification des lésions ou anomalies sous-tendant les déficits neurologiques chez les sujets ayant survécu au syndrome cérébral. Ces travaux réalisés sur un modèle expérimental très proche de la maladie humaine devraient permettre de mieux comprendre la nature des séquelles cérébrales chez les animaux ayants survécu à une malaria cérébrale qu’elles soient structurales, métaboliques, vasculaires, ou fonctionnelles. Notre étude est susceptible de fournir des marqueurs diagnostiques/pronostiques transposables à l’homme qui permettraient d’améliorer le suivi des patients et d’évaluer l’efficacité d’interventions thérapeutiques.
Procédures
Inoculation du parasite : les animaux induits pour la malaria cérébrale seront inoculés avec le parasite par une unique injection intrapéritonéale à l’état vigile, l’intervention n’est pas douloureuse et ne dure que quelques secondes. Examen clinique : le suivi des animaux induits pour la malaria et non traités par un antimalarique inclura 2 prélèvements sanguins pour suivi de la parasitémie. Le prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la queue sera réalisé à l’état vigile, sans contention. Les animaux malades et traités subiront 3 prélèvements. Traitement : les souris induites pour la malaria et traitées recevront une injection intrapéritonéale quotidienne à l’état vigile du traitement anti-malarique pendant 10 jours. Les groupes contrôles recevront une injection quotidienne à l’état vigile d’une solution saline ou du traitement antimalarique selon les groupes. Imagerie cérébrale: les animaux seront imagés sous anesthésie, la durée de l’examen sera inférieure à 1h30. Les animaux contrôles et les animaux induits pour la malaria cérébrale et traités subiront 7 examens au total sur une période de 6 mois. Les souris induites pour la malaria cérébrale mais non traitées seront imagées deux fois (une semaine avant inoculation et une fois pendant la maladie). Les animaux contrôles et les animaux induits par la malaria cérébrale seront soumis à deux études comportementales, une fois à la fin du suivi de six mois.
Impact sur les animaux
Les animaux contrôles seront examinés par IRM avant administration d’une solution saline ou de chloroquine (selon les groupes), puis une fois par mois pendant 6 mois après la fin du traitement. La solution saline et la chloroquine seront administrées en ip une fois par jour pendant 10 jours. Elles ne produisent aucun effet délétère détectable par examen clinique ou monitoring physiologique. L’examen IRM sera conduit sous anesthésie gazeuse. Les seules nuisances ou effets indésirables possibles pour ces deux groupes sont essentiellement la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, très rare avec l’isoflurane administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique permet en général de détecter les premiers signes de défaillance et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux. Les animaux induits pour la malaria cérébrale et non traités seront examinés par IRM avant l’injection du parasite. Quatre à 6 jours après l’injection, les animaux présenteront les premiers signes de la maladie (perte de poids, poil hérissé, yeux mi-clos, léthargie). Puis, 6 à 8 jours après l’inoculation, les manifestations neurologiques apparaitront (hypothermie, diminution de la coordination et de la motricité) pouvant conduire au coma et à la mort. Les animaux seront imagés lors des premières manifestations neurologiques et euthanasiés sous anesthésie. L’examen par IRM et l’euthanasie auront lieu avant la survenue d’une hypothermie sévère, de convulsions et du coma. Les animaux induits pour la malaria cérébrale et traités à la chloroquine seront examinés par IRM avant l’injection du parasite. Ils seront traités dès l’apparition des premières manifestations neurologiques. Ils seraient euthanasiés s’ils présentaient une aggravation de leur état, la chloroquine étant inefficace à un stade avancé de la maladie. Les animaux traités efficacement par la chloroquine seront suivis comme les groupes contrôles par IRM pendant 6 mois. Les animaux ayant eu une malaria cérébrale sont moins actifs que les sujets contrôles. Les autres effets indésirables possibles sont liés au risque anesthésique pendant les examens IRM.
Devenir
A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de prélever le cerveau en vue d’analyses biochimiques ou immunohistochimiques selon les cas.
Remplacement
Le recours à l’animal est incontournable car la détection des séquelles cérébrales et le suivi de leur évolution au cours du temps ainsi que leur impact sur la fonction cérébrale ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro ou in silico. Notre projet étudiera l’évolution de plusieurs paramètres cérébraux comme le métabolisme, le débit sanguin, le connectome structural, et le connectome fonctionnel. Le suivi de ces paramètres nous permettra d’identifier la nature des séquelles de la malaria cérébrale et de mieux comprendre leur impact sur la fonction cérébrale à divers âges de la vie.
Réduction
L’utilisation de techniques d’imagerie non invasive permettra de réduire le nombre d’animaux grâce au suivi longitudinal de chaque individu ce qui permettra le recueil d’un grand nombre de données anatomiques, métaboliques et fonctionnelles sur un même animal dans des conditions de stress minimal.
Raffinement
Le raffinement concernera toutes les procédures du projet ainsi que les conditions d’hébergement des animaux et devrait permettre de réduire le stress, l’angoisse et la douleur. En ce qui concerne l’induction de la malaria cérébrale et son traitement, un examen clinique quotidien permettra de déceler sans retard des signes d’aggravation neurologiques qui nécessiteraient de recourir à l’euthanasie. Tous les examens cliniques par imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse avec surveillance physiologique. Un délai d'acclimatation minimum de 14 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec cycle jour/nuit, nourriture et boisson ad libitum et enrichissement environnemental. Les cages contiendront des rondins de bois à ronger, du coton pour la nidification, un refuge en plastique, et une roue fast-track avec igloo afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels.
Choix des espèces
L’inoculation du parasite murin Plasmodium Berghei ANKA chez la souris est un modèle validé et reconnu de malaria cérébrale pédiatrique qui a permis des avancées majeures dans la compréhension des mécanismes pathogéniques de cette maladie. Dans la majorité des études utilisant le modèle obtenu par inoculation de PbA, les souris induites pour la malaria cérébrale sont de jeunes adultes (entre 8 et 12 semaines). Plusieurs études ont montré une résistance au développement de la malaria cérébrale chez des animaux plus âgés. Nous induirons donc la malaria cérébrale chez des animaux âgés de 8 semaines.
Evaluation de l’efficacité d’un ingrédient naturel sur l’inflammation intestinale du porcelet
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
24 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit par voie orale une inflammation intestinale se traduisant par une diarrhée, avant de prélever l'ensemble du système digestif. Le projet évalue un ingrédient naturel censé limiter cette inflammation après le sevrage et réduire le recours aux antibiotiques. Le porteur indique vouloir croiser ces résultats avec un modèle de cellules intestinales in vitro pour, à terme, réduire ou supprimer le recours aux animaux.
Objectifs
L’objectif du projet est d’une part de valider un modèle d’inflammation intestinale par voie orale sur le porcelet puis d’utiliser ce modèle pour évaluer l’efficacité d’un ingrédient naturel sur l’inflammation. L’objectif est d’autre part de mettre en parallèle ces résultats avec ceux déjà obtenus in vitro sur modèle de cellules intestinales porcines afin de construire un modèle pharmacologique permettant de limiter les études sur animaux.
Bénéfices attendus
Dans la production porcine, le sevrage précoce et brusque est un événement très stressant obligeant le porcelet à s’adapter rapidement à des changements drastiques (changements brusques du régime alimentaire, séparation de la mère, nouvel environnement, etc.). Ces évènements ont des conséquences négatives sur la santé intestinale du jeune porcelet, ce qui augmente la susceptibilité aux maladies et entraîne également une diminution des performances. Au niveau intestinal, le sevrage induit en effet une dégradation de la barrière intestinale. La production incontrôlée de molécules inflammatoires contribue à influencer négativement l’intégrité intestinale et donc la barrière avec par exemple modifications de la perméabilité aux macromolécules, du transport des nutriments et des ions. La composition du microbiote intestinal est également affectée et l'association avec l’inflammation intestinale locale peut entraîner une expansion de bactéries pathogènes intestinales qui se traduit par l’apparition de diarrhée phénomène classique en post-sevrage pouvant conduire à l’utilisation d’antibiotiques. L'utilisation de molécule naturelle pourrait permettre de diminuer l'utilisation d'antibiotique et l'amèlioration du bien-être de l'animal.
Procédures
Il n' y a pas d'intervention sur animaux vigiles pendant la durée des procédures. Les prélèvements seront réalisés sur animaux non vigiles.
Impact sur les animaux
L’objectif est d’induire une inflammation digestive modérée. Elle pourra se traduire par l’apparition de diarrhée légère chez l’animal. Ce type de diarrhée n'a pas d’impact fort sur le comportement et/ou la consommation d’aliment et d’eau des porcelets.
Devenir
L'ensemble du système digestif doit être prélevé pour pouvoir évaluer l'effet protecteur de l'ingrédient.
Remplacement
L’objectif des procédures expérimentales nécessitent l’utilisation d’animaux pour valider les résultats obtenus in vitro et déterminer les doses à appliquer in vivo. En effet il n'est pas possible de simuler dans les tests in vitro (culture cellelaire intestinale) la réponse de l'organisme à l'inflammation intestinale et donc de modéliser la réponse physiologique. L'étude permettra de corréler les réponses obtenus in vitro et in vivo afin de pouvoir identifier les manques du modèle in vitro. A terme l’objectif majeur est de réduire ou de supprimer le modèle animal
Réduction
Un nombre minimal de porcelets a été calculé en tenant compte de l’amplitude de réponse attendue sur l’expression des gènes et de la variabilité de la réponse, en effectuant un calcul statistique du nombre de sujet nécessaire. Ces calculs nous ont permis de fixer un nombre d'animaux par groupe et qui au total représente un nombre de 24 animaux.
Raffinement
Les porcs seront hébergés en box individuels. Cependant, les cloisons entre les box permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porc voisin. Des jouets seront mis à disposition : balle et/ou rouleau et/ou jouets à macher suspendus. Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites et critères d’arrêt ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux
Choix des espèces
La problématique de ce projet concerne la gestion des diarrhées chez le porcelet en post-sevrage. Le porcelet d’élevage est donc l’espèce cible retenu pour réaliser ce projet. Stade de développement : sevrage. Ces porcelets seront âgés de 28 jours et pèseront environ 8.5 kg. L’âge de 28 jours du porcelet correspond au passage de l’allaitement vers la phase sevrage de l’animal. La problématique de ce projet concerne la gestion des diarrhées chez le porcelet au stade de développement "sevrage". Ce stade est choisi car il représente une période de stress importante pour le porcelet d’élevage. En conséquence nous avons choisi ce modèle pour réaliser ce projet et améliorer le bien-être des animaux durant cette phase de sevrage
Contrôle optique de l’activité cardiaque à l’aide de l’implantation d’un stimulateur optique dans un modèle de rat.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. Ils subissent une thoracotomie et l'implantation d'un dispositif optique sur le cœur, avec injection de peptides photosensibles, avant d'être tués par une dose létale d'anesthésique. Le projet cherche à démontrer la possibilité de contrôler par la lumière l'activité électrique cardiaque chez un animal vigile. Le porteur affirme que seule l'expérimentation animale peut établir l'intérêt clinique de cette approche, un criblage in vitro ayant précédé la sélection des peptides.
Objectifs
Les troubles du rythme cardiaque d’origine génétique, médicamenteuse ou bien secondaires à une pathologie cardiaque ischémique conduisent dans de nombreux cas à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Les approches thérapeutiques actuelles requirent l’implantation d’un défibrillateur automatique ou bien l’utilisation de molécules anti-arythmiques dont la fenêtre thérapeutique est étroite en raison des effets secondaires associés à ces molécules. L'objectif de ce projet est de démontrer la possibilité de contrôler optiquement l’activité électrique cardiaque dans un modèle de rat vigile préalablement implanté d’un dispositif optique permettant l’activation de peptides photo-sensibles injectés sous forme inactive. L’illumination à 365-405 nm de la zone sur laquelle est implanté le dispositif permet un clivage du groupement protecteur et l’activation du peptide uniquement dans les zones illuminées. Les peptides utilisés dans ce projet ont été sélectionnés in vitro et ex vivo pour leurs effets sur des cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors d’études précédentes. Ainsi, par cette approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque, il sera possible de cibler les zones arythmogènes du cœur dans des modèles murins arythmiques ou bien chez le gros animal afin de proposer une nouvelle approche dans la prise en charge des arythmies.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre : 1. de faire la preuve de concept du contrôle optique, chez un animal vigile, de l’activité de composés ciblant les canaux ioniques présents dans le cœur et impliqués dans la génération des arythmies cardiaques, et 2. de contrôler, chez un animal vigile, la survenue d’arythmies cardiaques en s’affranchissant des effets secondaires dans les zones du cœur non ciblées, offrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
La totalité des animaux sera soumise à une thoracotomie et un enregistrement de l'activité électrique cardiaque. Le temps total de l’intervention sera inférieur à 45 min. Après pose de l'implant, des prélèvements sanguins seront réalisés afin de s'assurer de la bonne santé de l'animal et des composés activiés par la lumière seront injectés par voie veineuse.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale mise en œuvre lors de ce projet nécessite la mise en place d’une mini-thoracotomie. La gestion peropératoire de la douleur doit empêcher la survenue d’effets indésirables. Une étude précédente a démontré chez le rat l’absence d’effets indésirables de l’injection d’un peptide protégés similaires à ceux utilisés dans cette étude.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux sont euthanasiés par injection de dose léthale d'anesthésique après sédation en raison de l'efficacité de l'approche et de la non utilisationdes tissus par la suite.
Remplacement
Cette étude requiert une exploration fonctionnelle afin de valider in vivo une approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque. Seule l'expérimentation animale peut permettre de déterminer si l’approche testée présente un intérêt clinique en limitant la survenue d’arythmies. Les peptides qui seront testés chez la souris ont été sélectionnés pour leurs effets sur les cibles thérapeutiques à l'issue d'un screening réalisé in vitro sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.
Réduction
Un maximum de 90 rats seront utilisés dans cette étude. La première étude visant l’adaptation à nos conditions d’un modèle déjà décrit et validé vise à raffiner le modèle et les conditions expérimentales. La mise en place rapide du modèle par des utilisateurs expérimentés permettra de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une puissance suffisante pour les analyses statistiques lors de la seconde étude. Au fur et à mesure de l'inclusion des données, des analyses statistiques seront réalisées. Si une différence statistiquement significative entre les conditions « sans activation » et « avec activation » des composés apparait (une valeur de p
Raffinement
Avant la procédure, les rats seront hébergés par couple en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids pendant à minima 2 semaines. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie (sevoflurane) avec une prise en charge analgésique adaptée. Les peptides à tester, sous leur forme protégée, ayant été sélectionnés pour leur absence d’activité sur leurs cibles, nous n'anticipons pas de douleur ou d'effets indésirables suite à leur injection. Toutefois, si l'un des peptides devait entrainer des effets indésirables détectables comme des difficultés respiratoires ou des convulsions, l'examen serait interrompu et le rat euthanasié. Au cours de la chirurgie, un saignement abondant non maitrisable, une perforation pulmonaire non resolvable conduirait à une euthanasie de celui-ci. Ce projet se base sur l’utilisation de points limites gradés, précis et adaptés. Leur application se fera en lien avec la SBEA à l’aide d’un arbre décisionnel visant à l’arrêt des souffrances.
Choix des espèces
Le rat constitue un bon modèle pour l’étude des arythmies cardiaques et de part la taille du cœur, offre une approche plus aisée que la souris pour le contrôle optique et localisé de l’activation des composés injectés. L'étude sera réalisée sur des rats adultes de 10 semaines pour faciliter les abords chirurgicaux et en raison de la taille de l’implant.