Recherche appliquée

720 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 tuées pour des prélèvements et 600 remises dans un circuit d'élevage. Après douze semaines de nutrition, ces alevins subissent un stress de confinement de dix minutes destiné à mesurer leur réponse physiologique, pour définir le ratio d'acides gras essentiels de leur aliment. Le porteur indique que le confinement fait monter le cortisol et la consommation d'oxygène, et affirme que le retour à de bonnes conditions limite les nuisances. Il conclut que l'étude porte sur le métabolisme et la résistance au stress et ne peut être menée ni sur lignée cellulaire ni par modélisation, l'objectif affiché étant de remplacer la farine et l'huile de poisson dans les aliments d'aquaculture.

Objectifs

La composition optimale des acides gras alimentaires est une condition préalable à la réussite de l'élevage des alevins de poissons. Un apport adéquat d'acides gras essentiels au cours des premiers stades de développement des alevins de poisson est essentiel pour la progression normale de la neurogenèse (formation de neurones fonctionnels) et ainsi le développement du cerveau. Pour les alevins de poisson, la substitution de l'huile de poisson par des huiles végétales peut potentiellement entraîner des déficiences ou des déséquilibres en acides gras essentiels chez les alevins de poissons, qui ont été impliquées dans une variété de troubles, telles qu'une réponse retardée et accrue au stress, une réduction de l'activité phagocytaire contre les pathogènes, la réduction de la réactivité aux stimuli auditifs et de l'acuité visuelle, une altération du développement cérébral. Dans ce contexte, il est nécessaire de déterminer les besoins en acides gras essentiels des alevins de truite arc-en-ciel dès leur premier repas pour pouvoir établir les effets sur la physiologie métabolique du poisson ainsi que sur leur capacité de tolérance au stress pour à terme pouvoir remplacer, de la manière la plus adaptée aux besoins du poisson, la farine et l’huile de poisson dans les aliments aquacoles. Pour répondre à cela, un essai d’alimentation de 12 semaines comprenant 8 traitements sera conduit en triplicat sur des truites arc-en-ciel dès leur premier repas élevées dans des conditions optimales. Au total, 7200 poissons seront utilisés pour cet essai d'alimentation soit 900 poissons par traitement. Les 8 traitements correspondront à 8 aliments présentant des profils en acides gras différents. Les aliments sont formulés sur la base de la composition des aliments actuellement commercialisés chez la truite, de façon à couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels de l’animal. Après 12 semaines de nutrition, afin d’évaluer la capacité des alevins à tolérer un stress, en d'autres termes la robustesse des alevins, en fonction de l’aliment reçu, un sous-groupe de 720 poissons (n=90 par traitement) sera soumis à un stress de confinement pendant 10min puis remis dans de bonnes conditions. Le reste des poissons mis en élevage ne sera pas stressé.

Bénéfices attendus

Cette expérimentation permettra de définir le ratio optimal en acides gras essentiels dans l’aliment à destination des alevins de truite arc-en-ciel dès leur premier repas pour déterminer l’influence de différents apports en acides gras essentiels par la nutrition sur la sensibilité et la résilience à un stress chez la truite arc-en-ciel et donc des indications sur sa robustesse. Malgré le contrôle des conditions d’élevage, les poissons sont soumis à de multiples perturbations liées aux systèmes de production ou aux variations de leur milieu. Ces perturbations peuvent être à l’origine d’une augmentation de la fragilité des animaux et d’une dégradation de leur bien-être et de leur état de santé. Favoriser la robustesse des poissons est donc une solution pour lutter contre ces perturbations. L'expérimentation permettra d’établir chez la truite arc-en-ciel le lien entre la nutrition en acides gras (stockage, mobilisation et transfert des acides gras), et la réponse physiologique face à un stress (paramètres liés au bien-être, aux systèmes immunitaire et inflammatoire). Cette expérimentation servira de base pour la définition de formules alimentaires durables (sans huile et farine de poisson) adaptées le plus possible aux besoins nutritionnels des alevins de truite dès leur premier repas afin de favoriser la robustesse du poisson.

Procédures

Un sous-groupe de poissons (720) sera soumis après 12 semaines d'élevage à un stress de confinement de 10 min suivi par un retour dans de bonnes conditions d'élevage.

Impact sur les animaux

L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent entièrement aux besoins nutritionnels des poissons. Le stress de confinement (procédure expérimentale réalisée sur 720 poissons) a été réduit au temps minimal permettant de voir une réponse physiologique au stress. Il entrainera une hausse de l'hormone de stress (cortisol) qui entrainera une hausse de la consommation en oxygène. Le retour à de bonnes conditions dès la fin du stress entrainera dans un premier temps une augmentation de l'activité de nage du poisson puis ensuite le poisson reviendra progressivement à son état physiologique avant stress (dans les 2h suivant le stress), cela permettra donc de limiter au maximum les nuisances chez le poissons.

Devenir

120 poissons stressés seront euthanasiés 40 minutes après le stress de confinement pour des prélèvements biologiques en vue d'analyses biologiques. Le confinement est généralement considéré comme un défi stressant pour les poissons, mais, contrairement aux facteurs de stress tels que les changements de température, la disponibilité de l'oxygène ou les infections parasitaires, le confinement ne remet pas directement en cause l'état de santé du poisson donc n'impactera la future vie du poisson. Ainsi, les 600 poissons restants stressés par confinement non utilisés pour les prélèvements biologiques seront remis dans un circuit classique d'élevage mais ne serviront plus à des expérimentations animales.

Remplacement

L'étude porte sur l'impact d'un régime alimentaire sur le métabolisme et la résistance au stress des animaux, elle ne peut donc pas être appréhendée sur lignée cellulaire ou par modélisation.

Réduction

Pour une espèce comme la truite, il est nécessaire d’avoir une biomasse d’élevage minimale d’élevage pour optimiser le bien-être de l’animal et éviter tout comportement agressif (relation dominant/dominé). Une faible densité d’élevage altère la survie, la croissance et l'efficacité alimentaire de la truite arc-en-ciel avec une altération de ses réponses physiologiques. Afin de réduire au maximum le nombre de poisson mis en élevage tout en maintenant une densité d’élevage optimale, les poissons seront élevés lors des premiers jours dans des petits paniers (20x20cm) placés dans des bassins avec un renouvellement d’eau important. Ensuite, les poissons, lorsqu’ils auront atteint la taille de 0.5 gramme, seront transférés dans des cages plus grandes (60 x 60 cm) toujours dans une optique de préserver une biomasse d’élevage optimale. Les effectifs ont donc été calculés à partir de données d’expérimentations précédentes et de la littérature pour maintenir des densités d’élevage optimales qui ne modifient pas le comportement des poissons ainsi que ses réponses physiologiques. Le nombre d’individus à utiliser a ainsi été réduit le plus possible (en adaptant la taille des paniers à celle des poissons) mais calculé pour obtenir des résultats statistiquement fiables. En effet, des études antérieures sur la nutrition des alevins de la truite arc-en-ciel nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet. La croissance, ainsi que le métabolisme des alevins de truite arc-en-ciel, est sujette à une très forte variabilité. Ainsi, le nombre d'animaux utilisés a été calculé au plus juste pour permettre de détecter des différences pour les paramètres physiologiques, biochimiques et moléculaire étudiés. Pour la mise en place du stress par confinement, nous avons prévu un nombre d'animaux minimal en réalisant le stress dans une petite épuisette permettant de réaliser le stress de confinement dans les meilleures conditions possibles

Raffinement

Les mesures de raffinement viseront à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux : volume d'eau adapté avec renouvellement en continu, rythme jour/nuit naturel, et de suffisamment de congénères pour exprimer un répertoire comportemental riche. Au début de l'élevage, les jeunes alevins seront élevés dans des paniers pour pouvoir obtenir une densité d'élevage suffisante au démarrage au vu de la petite taille des animaux. Le panier sera directement plongé dans le courant d’eau. La cuve sera nettoyée tous les jours avec un tuyau siphonnant. Dès que les poissons auront atteint une densité correcte, ils seront relâchés dans un bac d’élevage plus grand. Le stress de confinement a été réduit au temps minimal (10min) permettant de voir une réponse physiologique au stress, le retour à de bonnes conditions dès la fin du stress permettra de limiter au maximum les nuisances chez le poissons. Les animaliers en charge des élevages contrôleront le comportement et les mortalités des animaux au cours du stress mais aussi de l'élevage. En cas de dépassement des points limites, les animaux concernés seront anesthésiés puis euthanasiés par surdose d'anesthésiant.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale (première production piscicole française). L'essai démarrera avec des alevins de truite dès le 1er repas.

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à 8 grays, greffées avec de la moelle osseuse et des lymphocytes T sous anesthésie, puis reçoivent des injections quotidiennes d'anticorps et des prélèvements de sang dans le sinus rétro-orbital, pour tester des traitements de la maladie du greffon contre l'hôte. Le porteur indique que les souris développent perte de poids, poil terne, atteintes cutanées et posture voûtée, qu'aucun antalgique n'est administré car il modifierait le système immunitaire, et que les animaux atteignant un score clinique de 5 sont mis à mort. Sur le remplacement, il affirme que les expériences in vitro ne peuvent pas répondre à son hypothèse in vivo.

Objectifs

Les lymphocytes T régulateurs sont des cellules immunitaires avec un rôle d’inhibition de la réponse immune. Dans le cas de la maladie du greffon contre l’hôte ces cellules peuvent jouer un rôle important en freinant la réponse immune contre le greffon et diminuant le rejet de greffe par conséquence. Ainsi cibler ces cellules est une des stratégies développées par notre équipe dans l’objectif d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l’hôte. Dans ce sens l’objectif de ce projet sera de tester l’efficacité clinique d’anticorps thérapeutiques ciblant cette population spécifiquement. Nous utiliserons des anticorps dirigés contre le CD25 et le TNFR2, des molécules exprimées par les lymphocytes T régulateurs et ayant un rôle dans leur fonction. Nous étudions également l’effet de ces anticorps directement sur les cellules responsables de la maladie qui peuvent temporairement et sous certaines conditions d’activation exprimer les mêmes molécules ou d’autres comme le CD38.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte chez l'homme, une maladie qui requiert aujourd'hui de nouveaux traitements permettant la prise en charge des patients réfractaires aux traitements classiques et de soulager ainsi la souffrance des patients. Dans ce projet, nous allons valider des molécules thérapeutiques pour lesquelles nous avons obtenu des résultats importants.

Procédures

Les souris seront irradiées en 2 fois 5 minutes chacune à raison de 0,8 Gy/min pour un total de 8 Gy. Elles seront ensuite injectées sous anesthésie gazeuse isofluorane avec de la moelle osseuse seul ou de la moelle osseuse avec des lymphocytes T provenant de souris donneuses dans un volume total de 100ul par souris. Ces souris seront traitées selon le schéma choisi (traitement curatif ou préventif) avec 5 injections quotidiennes pendant 5 jours suivi de 5 injections répartis sur 10 jours avec des molécules thérapeutiques dans un volume final de 100ul d’anticorps dilués dans une solution saline et administré par injection intrapéritonéale. Des prélèvements sanguins dans le sinus rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie gazeuse isofluorane à raison d'une à deux fois maximum par expérience. Le premier prélèvement sera effectué 14 jours après le début de l’expérience, le deuxième au moment du sacrifice qui tombe en moyenne à 60 jours après le début de l’expérience. Le volume maximale prélevé sera de 100ul.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des signes cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte caractérisés par une perte de poids associée à un pellage terne, possiblement mais pas systématiquement à des atteintes cutanées voire à une posture voutée de l’animal. Les signes cliniques seront classés suivant un score établi de 1 à 5 avec 5 les signes les plus graves. L’évaluation clinique des animaux (score) se fait de la façon suivante : un score de 1 correspond à la présence d’un des signes suivants et qui peuvent apparaître sans ordre précis : une perte de poids de 10%, une posture voutée, une atteinte des poils, une desquamation de la peau, une diarrhée. Les scores s’additionnent pour arriver à un maximum de 5. Si les souris atteignent un score de 5, elles seront euthanasiées. Il est à noter que quand la perte de poids atteint 20% et en absence d’autre signe clinique, les souris seront aussi euthanasiées. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pour établir le score, mais seront surveillés tous les jours pour vérification de leur état par rapport au jour d’avant. Les souris ayant une aggravation de situation seront alors euthanasiées. Ce score a été évalué par nos pairs spécialiste de la greffe de moelle osseuse, publié dans une revue internationale.

Devenir

Les animaux dont la perte de poids aura atteints 20% du poids initial ou bien un score clinique de 5 seront euthanasiés ainsi que les animaux qui n'auront pas atteints les points limites deux mois après l'irradiation. Les animaux restant à la fin des 2 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus.

Remplacement

Le but de ce projet est d'étudier l'effet de molécule thérapeutique sur le développement de la maladie du greffon contre l'hôte in vivo. Dans ce cadre, les expériences in vitro ne pourront pas remplacer l'utilisation des animaux et ne pourront pas répondre à l'hypothèse émise. Toutefois, toutes expériences pouvant donner des informations sur le mode d'action de la molécule en question sans avoir recours à l'expérimentation in vivo sera réalisée.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés au maximum, les expériences seront regroupé dans le maximum possible. Ainsi, nous testerons par exemple les traitements en préventif et en curatif dans une seule expérience, ceci nous permettra de réduire le nombre d'animaux contrôles nécessaires pour chaque expérience.

Raffinement

Afin d’éviter la souffrance des animaux, les souris ayant atteint un score de 5 soit une perte de poids de 20% seront sacrifiées. Cette méthode impose une analyse fine 3 fois par semaine de chaque animal afin d’établit le score clinique associée à un suivi quotidien de l’état général des souris dans le but d’abréger toute sorte de souffrance. Les drogues antalgiques peuvent agir directement sur le système immunitaire et modifier les résultats, elles ne seront donc pas utilisées dans nos expériences. Toutefois, les animaux seront sacrifiés quand leur état ne permet pas d'envisager une amélioration. Enfin il existe une surveillance quotidienne des animaux greffés par les zootechniciens de la plateforme, lesquels sont informés de la nécessité d'une surveillance accrue des animaux du fait de leur engagement dans une expérience. Des enrichissements sont placés dans les cages à raison de 3 par cage afin de réduire l’angoisse des animaux. Lors de l’injection des cellules et du prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbitale, les souris seront anesthésiées sous isofluorane réduisant ainsi la douleur.

Choix des espèces

La maladie du greffon contre l'hôte a été étudié depuis longtemps dans plusieurs milliers d'études publiées. La disponibilité de modèle génétiquement modifié représente un atout non présent dans les autres espèces et qui nous permet de mieux étudier la réponse immune et de se rapprocher au plus de la maladie chez l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte préférentiellement entre 8 et 12 semaines. A cet âge, il possèdent un système immunitaire bien développé et sont suffisamment matures pour supporter les doese d'irradiations auquelles ils seront soumis.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pulmonaire leur est greffée puis suivie par imagerie répétée sous anesthésie, jusqu'à 39 manipulations par animal, une plateforme réalisant ces études "à la demande de chercheurs extérieurs". Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids et une gêne respiratoire, et que les organes sont prélevés après la mort "à la demande du client". Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer "l'animal entier" et écarte le poisson zèbre, jugé peu adapté à ses appareils d'imagerie.

Objectifs

Au niveau mondial, le cancer pulmonaire représente le type de cancer avec la plus forte mortalité. Parmi les sous-types de cancer du poumon, le cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (ou CPNPC) représente 87% des cas de cancer du poumon avec un pronostic des plus sombres parmi tous les cas de cancers pulmonaires. La majorité des patients avec ce type de cancer sont malheureusement diagnostiqués à un stade avancé, voire très avancé. Notre lanoratoire est une plateforme de services et de R&D spécialisée dans l'imagerie préclinique. Sa mission est de répondre aux besoins d'imagerie de la communauté scientifique, particulièrement dans le domaine de l'oncologie expérimentale. Ce projet a pour but de réaliser, à la demande de chercheur extérieurs à notre laboratoire, des études sur des modèles murins de cancer pulmonaire afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

En fonction des études clients, les bénéfices attendus sont: - Une meilleure connaissance des cancers pulmonaires. - L'étude de nouveaux traitements contre le cancer pulmonaire.

Procédures

Dans le cas des souris induites en sous-cutanée (procédure 1) : Les animaux seront anesthésiés lors de l’induction par piqure d’aiguille. Ensuite, chaque animal aura au maximum, un suivi hebdomadaire par imagerie de bioluminescence suivi d’une mesure au pied à coulisse de la tumeur et d’une imagerie échographique. (soit 3 manipulations/sem x 12 semaines = 36 manipulations). Les autres imageries (photoacoustique, radioisotopique) pourront être mises en oeuvre ponctuellement en fonction des résultats obtenus en cours d'étude soit 3 manipulations supplémentaires. Au maximun 1 souris sera soumise à 39 manipulations sous anesthésie sur 12 semaines. Dans le cas des souris induites par dépôt pulmonaire, les inductions se font sous anesthésie chimique et sur animal vigile pour l’induction par voie intraveineuse (Procédure 2). Chaque animal aura au maximum, un suivi hebdomadaire par imagerie de bioluminescence auquel peut s'ajouter 2 scanners espacés de minimum 2 semaines, 2 imageries radioisotopiques espacés de minimum 2 semaines. ((soit 2 manipulations/sem x 12 semaines) +4 =28 manipulations sur 12 semaines)12 BLI + 2+2 = 16 manipulations sous anesthésie sur 12 semaines Procédure 1 et 2 : Dans le cas où il faudrait injecter des candidats médicaments, suivant la voie d’administration il y aura au maximum 5 traitements par semaine sur souris vigiles (pour IP IV, SC, per Os) ou anesthésiées (pour intranasale ou intratrachéale) sur 12 semaines d’étude Ces administrations seront réalisées par du personnel formé et entraîné Nous pourrons être amené à prélever du sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire: du sang sera prélevé 3 fois en 24h.

Impact sur les animaux

Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont: - La perte de poids. - La gène respiratoire occasionnée par les tumeurs se développant au niveau de la trachée.

Devenir

Procédure 1: Modèle sous-cutané: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les tumeurs sous cutanées ainsi que différents organes seront prélevés à la demande du client pour des études histologiques complémentaires qui complèteront les résultats d'imagerie. Procédure 2: Modèle orthotopique: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les tumeurs pulmonaires ainsi que différents organes pourront être prélevés à la demande du client pour des études histologiques complémentaires qui complèteront les résultats d'imagerie.

Remplacement

Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable. Avant de débuter les études chez l’animal, des tests d’efficacité in vitro seront effectués par nos clients sur des cellules de cancer pulmonaire en culture. Ainsi, les molécules qui ne présentent pas d’effet in vitro ne seront pas testées in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en œuvre des techniques d’imagerie qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris. Nombre d’animaux utilisé dans ce projet : Sur 5 ans nous prévoyons 20 études qui seront réparties ainsi : -Pour le modèle sous-cutanée (procédure 1), 10 études, 800 souris sur 5 ans. -Pour le modèle orthotopique (procédure 2): 10 études, soit par induction en intraveineuse, soit par dépôt pulmonaire 800 souris sur 5 ans. Soit un total de 1600 animaux pour ce projet sur 5 ans. Ce nombre pourra être revu à la baisse en fonction des études clients.

Raffinement

Pour ces procédures expérimentales, la stratégie d’observation des animaux retenue est l’étude comportementale des animaux. La bonne connaissance de l’état clinique normal de la souche de souris utilisée nous permettra d’observer précisément et d’interpréter rigoureusement les signes cliniques de souffrance des animaux. Les souris seront suivies par inspection visuelle chaque jour de la semaine et les critères comportementaux, et tumoraux pris en comptes pour l’évaluation du palier de douleur. Lorsqu’un des points limites est atteint, l’animal est mise à mort afin d’arrêter sa souffrance car elle ne peut être ni diminuer ni stopper. Ces point limites sont présentés dans chacune des procédures. Les animaux seront étudiés par imagerie in vivo non invasive qui n'induit pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille et permet de réduire le stress infligé au cours de l’expérimentation puisque les animaux sont anesthésiés durant les examens d'imagerie.

Choix des espèces

Les modèles de cancer humain et murins sont classiquement mis en oeuvre chez la souris pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique. Les modèles orthotopiques de carcinome pulmonaire H460, LL-2, A549, 4T1 et mélanome B16 sont uniquement disponibles chez cette espèce animale. Le modèle zebrafish utilisé en cancérologie pour les xénogreffes pourrait être intéressant car de moindre degré de douleur mais le poisson reste peu adapté aux modalités d'imagerie mises en oeuvre dans notre établissement qui ne dispose pas d'un agrément pour ce modèle . Par ailleurs, la transplantation orthotopique n'est pas possible chez le poisson pour des cellules issues de cancer du poumon et du sein. (Raby et al., "Bulletin du cancer", Vol 107, janv 2020) Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale. Ce modèle est validé au laboratoire depuis 10 ans.

144 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis pendant six mois à des régimes incluant des arrêts de nourriture de trois jours, à des tests de tolérance au glucose avec ponctions répétées de la queue et à des IRM sous anesthésie avec pose d'un cathéter dans la veine caudale, pour évaluer les effets du jeûne sur le cœur. Le porteur indique que les ponctions et la pose du cathéter peuvent provoquer stress, douleur et risque d'infection. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico n'existe et que l'expérimentation animale est "nécessaire" pour valider son hypothèse de cardioprotection.

Objectifs

Le jeûne est une méthode d’alimentation consistant à ingérer peu ou aucune nourriture sur une période allant de 12h à plusieurs semaines chez l’Homme. Cette coutume ancestrale est pratiquée par de nombreuses religions et, plus récemment, a reçu une attention croissante pour d’autres raisons de santé, économique et écologique. On distingue le jeûne intermittent, qui consiste à se priver de nourriture pendant une période de 14h sur une journée, le jeûne intermittent prolongé (3 – 5 jours) et le jeûne thérapeutique (1 à 3 semaines). En France, jeûner n’est pas proposé dans un cadre médicalisé. Pourtant, il a été prouvé que le jeûne retarde les processus liés à l’âge (stress oxydant, inflammation…), protège le cerveau des maladies neurodégénératives et diminue la croissance tumorale. Le jeûne intermittent prévient et réverse tous les aspects du syndrome métabolique chez le rongeur et chez l’Homme. En cardiologie, des études précliniques sur des rats mâles ont démontré une diminution de la fibrose myocardique liée à l’âge en prévenant l’inflammation et en maintenant les antioxydants. De plus, le jeûne intermittent diminue l’apoptose et l’inflammation puis prévient le remodelage du myocarde sur modèles d’infarctus du myocarde. Plusieurs jours de jeûne améliorent la diffusion de l’oxygène du capillaire à la mitochondrie de myocarde murin suggérant une amélioration de l’énergie cellulaire. Les objectifs de cette étude sont de caractériser les effets du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique sur le cœur de rat et de déterminer si ces derniers sont protecteurs lors d’un stress aigu induit par un épisode d’ischémie-reperfusion et dans un modèle de cardiomyopathie prédiabétique (induit par un régime riche en graisse et en sucre). Plus précisément, nous souhaitons caractériser le profil cardiométabolique du jeûne, notamment le métabolisme énergétique et le profil lipidique myocardiques. Notre hypothèse est que les changements physiologiques et métaboliques induits par le jeûne intermittent et/ou thérapeutique seraient cardioprotecteurs. Enfin, nous souhaitons déterminer s’il y a un effet du genre et comparer les mécanismes du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux caractériser les effets des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la fonction cardiaque, le métabolisme énergétique et le remodelage du profil lipidique. Nous souhaitons savoir si ces méthodes sont cardioprotectrices envers un stress aigu (ischémie/reperfusion) et chronique (modèle de prédiabètes induit par le régime riche en graisse et en sucre). Enfin, nous évaluerons l’effet du genre de ces régimes.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents régimes décrits ci-après : régime normal pendant 6 mois ; régime normal pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux pendant 3 mois ; - régime normal pendant 3 mois avec deux arrêts de la nourriture pendant 3 jours (à 4.5 et à 6 mois) ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux avec le même régime pendant 3 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois avec 2 arrêts de la nourriture pendant 3 jours à 4.5 et 6 mois. Tous les animaux seront soumis à trois tests de tolérance au glucose sur animaux vigiles. Celui-ci comprend une injection intrapéritonéale et 6 prélèvements de gouttes de sang dans la queue de l’animal (mesure de glycémie). Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois. Tous les animaux seront soumis à trois examens d’imagerie IRM avec insertion d’un cathéter dans la veine caudale sous anesthésie générale. Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois.

Impact sur les animaux

La procédure sur la mise en place des régimes peut entrainer un léger stress chez les animaux mais ne doit pas entrainer d'effet indésirable notable et a déjà fait l’objet de nombreuses publications au niveau international. L'eau quant à elle restera à disposition ad libitum. Le test de tolérance au glucose fait l’objet d’injection en intrapéritonéale et de ponctions répétées au bout de la queue de l’animal pour mesure de la glycémie pouvant générer un stress pour l’animal et un risque d’infection. Les animaux réagissent et cicatrisent bien, notre groupe a l’habitude de travailler avec ces mesures et fera le nécessaire pour surveiller tout évènement indésirable (stress, infection). Les anesthésies et les examens d’imagerie in vivo par IRM sont également des nuisances pour les animaux mais l’imagerie reste l’exploration la moins invasive de nos jours. Enfin, la pose d’un cathéter se fera sous anesthésie pou diminuer le stress de l’animal, cela peut augmenter la douleur après réveil ainsi que le risque d’infection que nous surveillerons quotidiennement.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure (après l'IRM à 9 mois) pour pouvoir prélever le cœur et réaliser des expériences ex vivo en cœur isolé afin de caractériser le métabolisme énergétique et le profil lipidique cardiaque par spectroscopie par résonance magnétique.

Remplacement

A l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode de substitution in vitro et in silico pour étudier l'effet des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la physiologie et le métabolisme cardiaque. De plus, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider notre hypothèse de cardioprotection de ces régimes face à des stress aigu et chronique selon le sexe. De nombreuses similitudes existent entre la physiologie cardiaque des rongeurs, particulièrement celle du rat, et celle de l'homme. Les modèles pathologiques chez les rongeurs sont utilisés au laboratoire depuis de nombreuses années et toutes les techniques d'imagerie/ spectroscopie de résonance magnétique dans ce projet ont été caractérisées au sein même du laboratoire.

Réduction

Notre approche expérimentale permettra de réduire de façon drastique le nombre d'animaux en accord avec la règle des 3R. En effet, l'étude in vivo permettra de réaliser un suivi longitudinal de l’animal sans sacrifice et l'étude ex vivo sera réalisée sur le même animal. Le nombre d'animaux dans ce projet est le minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Nous souhaitons obtenir un effectif final de n=10 par groupe et nous envisageons 20% de perte de données (problème technique d’imagerie et de spectroscopie, problème de prélèvement du cœur pour l’expérience ex-vivo). Nous prévoyons donc 10 + 2 (20% de perte) = 12 rats par groupes. L’effectif de 10 animaux par groupe est déterminé à l’aide d’une analyse statistique (Statistica) prévoyant, pour un risque alpha de 5% et un risque béta de 10%, une amélioration de 25% de la fonction cardiaque dans nos modèles animaux pathologiques pour revenir à des valeurs physiologiques observées chez des animaux contrôles.

Raffinement

Les rats seront acclimatés pendant 14 jours avant le début de l'étude. La procédure sur la mise en place des régimes ne doit pas entrainer d'effets indésirables. Les durées et fréquences sont déterminées en fonction des données de la littérature (1 jour sur 2 pour le jeûne intermittent et 3 jours de jeûne thérapeutique). L'eau sera mise à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Tout au long des régimes et du projet, le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. Un animalier ou un chercheur contrôlera le bien-être des animaux tous les jours. Pour le test de tolérance au glucose et la mesure de l'insuline à jeun ou l'anesthésie ne peut pas être réalisée, une compresse d'eau chaude sera placée sur la queue de l'animal afin de faciliter le prélèvement de la goutte de sang le plus rapidement possible. Afin d'éviter toute infection, la queue de l'animal sera désinfectée avant et après la procédure avec de la Vétédine. Les jours suivants, nous vérifierons la bonne cicatrisation de la queue de l'animal. Pour la procédure d'IRM in vivo, les rats seront anesthésiés par un mélange d’isoflurane (Vetflurane 2%) et d’oxygène (1L/min) à l’aide d’une chambre d’induction et le bien-être animal sera assuré par le maintien des constantes vitales de l'animal. Durant les anesthésies, les yeux seront hydratés (Ocrygel) et la température maintenue à 37°C par couverture chauffante et monitoring par sonde rectale. Durant l'IRM, une injection d'adénosine (poudre chez Sigma Aldrich) à 0.33 mg/kg/min diluée en solution de chlorure de Sodiul à 0.9% à usage vétérinaire (B.Braun) sera réalisée via un cathéter disposé dans la veine caudale, le volume maximal est de 3 ml pendant 10 minutes maximun. La respiration et l'ECG seront surveillés pendant toute la durée de l'examen. Le comportement des animaux sera étroitement surveillé et une grille d'évaluation de la douleur sera remplie et le point limite déterminé en fonction des principes de Morton et Griffiths. Enfin, pour la procédure ex vivo sur le coeur isolé perfusé, nous réaliserons une euthanasie par injection d'euthasol (140mk/mg, IP) avant de prélever le cœur afin de ne pas faire souffrir l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de rat soumis à ces régimes a été choisi car des études des jeûnes ont été réalisé sur cette espèce. De plus, nous souhaitons comparer nos résultats de cardioprotection avec ce qui a déjà été fait dans le laboratoire dans un souci de respect des 3R. Nous souhaitons également tester la cardioprotection des jeûnes sur le modèle de rat nourri avec un régime HFS qui permet de développer un modèle de prédiabète reproduisant la même genèse que chez l’Homme et de suivre ces effets sur l’organisme, en particulier le coeur. Le modèle HFS a été récemment décrit par notre équipe pour induire un état prédiabétique. Les rates soumises à ce régime présentent une altération de l’homéostasie glucidique, une dysfonction cardiaque précoce des trois mois de régime, ainsi qu’une sensibilité plus importante aux lésions d’ischémie-reperfusion caractérisée par une altération du métabolisme énergétique et de la fonction cardiaques, par comparaison aux rates contrôles sous-alimentation normale.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de tumeur de lymphome humain sous la peau, puis jusqu'à trois injections de composés sur animal vigile, la pousse tumorale étant surveillée jusqu'à un point limite. Le porteur teste une molécule immunostimulante déjà évaluée dans ce modèle et vise un futur essai clinique. Il affirme que la sensibilité des cellules tumorales dépend du microenvironnement et qu'il faut donc travailler sur un organisme entier.

Objectifs

Ce projet vise à étudier et quantifier l’efficacité antitumorale d'une molécule seule ou formulée avec des molécules encapsulées (qui rends la molécule moins toxique) sur un modèle humain de tumeur. Que ce soit la molécule ou la molécule encapsulée, les deux sont conçues stérilement et développées spécifiquement pour être compatible avec une injection intraveineuse. Cette molécule "prototype" seule ou encapsulée a déjà été évalué dans ce même modèle humain de tumeur. Dans les deux cas il a été observé une très bonne tolérance et des très bonnes réponses anti-tumorales. Afin d'évaluer la molécule dans des essais cliniques et pour répondre aux contraintes de la production à grande échelle, la molécule seule et la molécule encapsulée ont été optimisées. C'est pourquoi la Dose Maximale Tolérée (DMT) de la molécule industrielle doit être déterminée et son efficacité antitumorale doit être confirmée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de tester l’efficacité antitumorale d’une molécule immunostimulante. Le projet va permettre de développer en phase préclinique des molécules et des combinaisons qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, au pire de ralentir la progression tumorale.

Procédures

- Implantation de tumeur en sous-cutané sur animal vigile (une fois au début de l'expérimentation, degré de gravité léger, quelques minutes) - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite (lorsqu'il n'y a pas de réponse au traitement, la pousse tumorale prend une vingtaine de jours) - injection intraveineuse ou intrapéritonéale de composés thérapeutiques non toxiques (degré de gravité léger, quelques minutes), pour un maximum de 3 injections espacées de 7 jours.

Impact sur les animaux

- Perte de poids >10% non améliorée par ajout de nourriture humidifiée dans le fond de la cage en maximum 24h (peu probable) - Perte de poids >20% (très peu probable qui conduirait à la mise à mort de l’animal) - Injection de cellules tumorales en sous cutané : quelques minutes - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite. Il n’y a pas de métastase attendue avec ce modèle tumoral. - Injection dans la veine caudale sur animal vigile sous contention de composés thérapeutiques: douleur caudale si inflammation du point d’injection (très peu probable), 2 heures maximum, pour un maximum de 3 injections espacées de 7 jours.

Devenir

Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, l’efficacité de notre molécule et de notre formulation a déjà été validée sur un modèle in vitro utilisé au laboratoire. En effet, nous avons déjà pré-validé notre molécule et notre formulation liposomale en in vitro par toutes les techniques pertinentes pour l'étude de nos produits. Nous devons passer maintenant à l'in vivo pour évaluer son effet sur un organisme entier. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement du microenvironnement. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant sur l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour toutes ces raisons nous devons effectuer les études d’efficacité sur la souris.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire au autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

vant toute manipulation les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en prenant la température corporelle par voie rectale (avec une sonde enveloppée avec un gel anesthésiant) une fois par jour pendant 5 jours. les souris seront observées quotidiennement 5 jours sur 7 . les expérimentateurs ont une très bonne expérience et détectent très rapidement le moindre signe de douleur afin d'appliquer les meilleurs mesures. Leur état général sera aussi suivi et annoter dans le cadre de l’expérimentation. Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai. Les animaux feront l’objet d’un suivi très soutenu le jour J de l’injection, puis toutes les 24h jusqu’à 72h par les expérimentateurs. Par ailleurs, le personnel animalier inspecte quotidiennement les animaux et renseigne une grille de suivi basée sur des critères comportementaux (activité, isolement ...), physiques (poils hérissés, dos vouté …) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Nous souhaitons évaluer nos traitements anticancéreux in vivo, grâce à l’utilisation d’une lignée cellulaire tumorales d'origine humaine (implantées chez la souris), avec des traitements utilisés en clinique humaine. L'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter les phénomènes de rejet des cellules ou des tissus implantés et favoriser la prise des greffes. En effet la souris immunodéprimée est un modèle reconnu pour l’implantation de xénogreffes. Notre équipe a une forte expérience de l’utilisation de souris immunodéprimées pour l’étude d'implantation de cellules humaines. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux (rats) et il est préférable d’avoir recours aux modèles murins. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser a prise tumorale.

240 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 tuées en fin d'étude et les autres réutilisées, dont 80 gardées un mois avant d'être tuées pour des travaux pratiques de dissection. Chaque poisson reçoit l'antibiotique par voie intraveineuse, orale et par gavage sous sédation, puis subit trois séries de prélèvements sanguins. L'étude vise à réévaluer le dosage de l'oxytétracycline en pisciculture pour lutter contre la furonculose. Le porteur affirme que la pharmacocinétique ne peut s'étudier que sur animal vivant, tout en indiquant qu'un modèle in silico permettra ensuite de s'en affranchir.

Objectifs

Le projet FEAMP Medic’EAU vise à évaluer et optimiser les pratiques vaccinales et thérapeutiques appliquées par les pisciculteurs afin de contrôler la furonculose, une maladie causée par la bactérie Aeromonas salmonicida subsp Salmonicida (ASS). Pour la partie thérapeutique qui fait l’objet de la présente demande, l’objectif est de proposer une méthodologie qui permette de réévaluer le schéma posologique des antibiotiques, afin d’améliorer leur efficacité thérapeutique, de réduire la mortalité associée à la furonculose, mais également de limiter l’impact de l’antibiothérapie sur la sélection et dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques. Une compréhension fine de la pharmacocinétique (= interaction entre l’antibiotique et l’organisme de l’animal) de l’antibiotique (oxytetracycline) chez la truite Arc-en-ciel est indispensable pour s’assurer d’une exposition suffisante d’Aeromonas chez l’animal infecté, et optimiser ainsi le schéma posologique. Une méta-analyse des données pharmacocinétiques déjà existantes dans la littérature nous a permis d’évaluer les lacunes et d’identifier les covariables d’intérêt (c’est-à-dire les éléments qui peuvent modifier de manière importante le comportement de l’antibiotique chez la truite Arc-en-ciel : poids, température de l’eau, voie d’administration, forme galénique, ploidie. Ce projet va donc nous permettre de réaliser une étude pharmacocinétique de l’oxytétracycline chez la truite Arc-en-ciel, en station expérimentale, par une approche en cross-over. Cette approche classique chez les mammifères est rarement conduite chez le poisson, car elle nécessite plusieurs prélèvements, et donc des poissons d’une taille suffisante. Ainsi, chaque poisson recevra le médicament par voie intraveineuse et par voie orale, ce qui permettra de mieux caractériser la variabilité de la pharmacocinétique dans cette espèce, notamment la variabilité interindividuelle, et de quantifier plus finement l’influence des différentes covariables d’intérêt. Ces données seront intégrées dans un modèle pharmacocinétique dit « de population » qui permettra par la suite de prédire le comportement de l’oxytétracycline chez la truite. Une optimisation du schéma posologique pourra alors être proposée, pour un usage plus vertueux des antibiotiques, garantissant une efficacité optimale tout en limitant le risque de sélection de dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques.

Bénéfices attendus

A très court terme, à l’issu de ce projet, nous disposerons d’une modélisation décrivant le comportement de l’oxytétracycline chez la truite Arc-en-ciel. Ce modèle nous permettra également de prédire la pharmacocinétique de cet antibiotique dans différentes situations sans devoir recourir à de nouvelles expérimentations animales. A court terme (d’ici 1 an), dans le cadre du projet MEDIC’EAU, nous réévaluerons le schéma posologique de l’oxytétracycline pour le traitement de la furonculose chez la truite Arc-en-ciel, afin de s’assurer d’une meilleure efficacité dans la lutte contre la furonculose tout en limitant le risque de sélection de gènes de résistance aux antibiotiques. A moyen/long terme, l’ambition est que cette méthodologie soit aisément duplicable pour réévaluer par la suite d’autres antibiotiques couramment utilisés en fermes piscicoles, et dont les schémas posologiques posent question

Procédures

L’oxytétracycline sera administrée aux 240 truites avant chaque séquence de prélèvement : - Par voie IV, par injection dans le sinus veineux caudal, sous anesthésie générale - Par prise spontanée par voie orale : un aliment médicamenteux sera distribué aux animaux, sans manipulation particulière, après 24h de mise à jeûn - Par gavage oral : l’aliment médicamenteux sera administré aux animaux sous sédation, après 24h de mise à jeûn. Après le gavage, le poisson sera transféré dans un réservoir individuel pendant quelques minutes pour surveiller le réveil et la régurgitation. Trois séquences de prélèvement sanguin sont prévues, espacées d’au moins 4 semaines de washout, principalement pour s’assurer d’une récupération complète de l’hématocrite des animaux. Durant chaque séquence, 3 prélèvements de sang seront réalisés sur chaque truite. Chaque prélèvement représente un volume sanguin de 0,4 mL (seringue à insuline), soit un prélèvement total de 1,2 mL de sang maximum par poisson par séquence, ce qui représente moins de 15% du volume sanguin circulant de la truite Arc-en-ciel. Les prélèvements seront répartis sur 15 jours pour une même séquence.

Impact sur les animaux

La réalisation de pharmacocinétiques longitudinales permet à la fois de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, d’évaluer la variabilité inter-individuelle ainsi que de mieux caractériser l’influence des différents cofacteurs. Cette approche est permise par le choix de travailler avec des animaux plus gros, qui tolèrent plusieurs prises de sang, et sont plus représentatifs de la population de truite cible (la furonculose en élevage touche des animaux plus âgés que les classes d’âge habituellement choisies en expérimentation animale). Le protocole expérimental peut entraîner de la nuissance chez les poissons, liée à la ponction de sang dans le sinus veineux et au gavage. Une anesthésie est donc systématiquement mise en œuvre pour chaque manipulation, l’anesthésie se fait par balnéation à l’aide de tricaïne (80 mg/L).

Devenir

120 poissons seront euthansiés à la fin de la procédure. 80 animaux seront gardés en vie 1 mois pour ensuite être euthanasiés dans le but d'être utilisés pour les TPs dissection/démarche nécropsique réalisés sur poissons fraichement tués à l'école vétérinaire de Maisons Alfort. 40 animaux pourront être gardé en vie pour permettre la mise en place d'essai pour un projet sur le bien-être animal, DAP sera déposée fin d'année 2022.

Remplacement

L’objectif étant d’évaluer la pharmacocinétique de l’oxytétracycline chez la Truite Arc-en-ciel, cela ne peut se faire que sur animaux vivants. Toutefois, l’utilisation d’outils de modélisation moderne permet de mieux valoriser les données récoltées, en quantifiant la variabilité de chaque covariable d’intérêt plutôt que de travailler en valeurs moyennes comme historiquement. De plus, dans un second temps, le modèle créé in silico permettra de s’affranchir de l’expérimentation animal pour définir le schéma posologique optimum, sans devoir réaliser des essais de dose/titration nécessitant un grand nombre d’animaux de laboratoire.

Réduction

Réaliser une étude pharmacocinétique en cross over, avec plusieurs prélèvements par poisson, permet de réduire significativement le nombre de poissons, chaque poisson étant son propre témoin. Le nombre de poissons nécessaire à cette expérimentation a été déterminée en considérant les objectifs scientifiques mais également en posant plusieurs postulats qui ont permis de réduire le nombre de modalités à tester, et donc d’animaux nécessaires. Ainsi, toutes les modalités d’intérêt identifiées seront testées sur les truites triploïdes (ce qui nécessite le recours à 180 poissons), alors que ces modalités seront réduites sur les diploïdes (soit 60 poissons uniquement).

Raffinement

Les animaux sont observés deux fois par jour durant toute la durée du protocole (4 mois + temps d’acclimatation) Les points limites sont : (1) d’une part les paramètres d’ambiance de l’élevage (oxygène, qualité de l’eau). Les paramètres de températures et d’oxygénation sont mesurés en permanence via des sondes. Si les point critiques sont atteints (oxygène 20°C) et ne peuvent être rectifiés, l’expérimentation sera arrêtée. La qualité de l’eau (pH, teneurs en nitrites et en nitrates) est vérifiée chaque semaine. (2) d’autre part la santé des poissons. Les poissons moribonds (nage erratique sur le dos, apathie, anorexie) seront retirés de l’expérimentation et euthanasiés par surdosage d’anesthésique. La densité sera de 15 kg/m3 (en début d’expérimentation) à maximum 30 kg/m3 (en fin d’expérimentation, en raison de la croissance des animaux), ce qui est bien en deça de ce qui est réalisé en élevage (50-70 kg/m3). Les bacs sont de plus enrichis de tubes permanents permettant aux poissons de se cacher. Pour nous assurer d’un minimum incompressible de 3 prises de sang par poisson par séquence de prélèvement, nous avons choisi de travailler avec des poissons de grande taille, de minimum 300g, ce qui reflètera également plus fidèlement la biologie des animaux qui seront traités en élevage. Nous pourrons ainsi prélever 1,2 mL de sang par séquence de prélèvement, à raison de 0,4 mL par prise de sang sur une période d’environ 15 jours (soit 0,4% du poids vif total). L’approche populationnelle retenue permet également d’espacer les prélèvements sur chaque poisson. Enfin, une période de wash out d’au moins 4 semaines sera appliquée entre chaque séquence de prélèvement, pour s’assurer que les poissons ont retrouvé un hématocrite normal.

Choix des espèces

La truite Arc-en-ciel est un hôte naturel d’Aeromonas salmonicida subsp salmonicida. C’est de plus l’espèce de poisson la plus élevée en France. C’est enfin l’espèce sur laquelle nous voulons optimiser l’utilisation de l’oxytétracycline dans un contexte « one health ». Les truites utilisées pèseront minimum 300g. La furonculose est une maladie que l’on observe à différents stades d’élevage (alevins, truites portions = 200/250 g, grosse truite = >1 kg). Du fait des contraintes de la station aquacole (taille des bassins), il ne nous est pas possible de loger des truites Arc-en-ciel de poids trop important en nombre suffisant pour permettre l’acquisition de résultats interprétables. L’étude sur des poissons de 300g est un compromis entre le poids total des poissons pouvant entrer dans la station, une taille suffisante pour permettre des prélèvements de sang répétés, et la volonté d’un modèle qui soit le plus proche possible de la population de truite à évaluer. A ce poids (300g), les animaux sont considérés comme physiologiquement proches des animaux d’un poids plus élevé (hors période de gamétogenèse).

2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent des greffes de tumeurs d'ostéosarcome puis des traitements par voie orale deux à quatre fois par semaine pendant trois à dix semaines, en portant sous la peau des tumeurs pouvant donner des métastases. Le porteur décrit une molécule première de sa classe censée vaincre la résistance aux chimiothérapies, les bénéfices pour les patients étant renvoyés aux essais cliniques à venir. Il affirme que les modèles cellulaires ne rendent pas la complexité de l'organisme et conclut au caractère indispensable du recours à l'animal.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’activité d'une molécule et d'évaluer spn efficacité anti- tumorale et de mieux comprendre les mécanismes ciblés par cette molécule, en vue de vaincre la résistance aux traitements et d’améliorer la réponse des patients à mauvais pronostics (ostéosarcome pédiatrique). Après nos résultats prometteurs obtenus avec la molécule seule et en association avec des chimiothérapies in vitro, nous évaluerons la sensibilité de cette molécule in vivo sur des modèles d’ostéosarcome (lignées cellulaires et des modèles dérivés de patients), administré seul et en combinaison avec les traitements standards qui devraient avoir une synergie avec la nouvelle molécule. Nous étudierons les mécanismes d’action de cette molécule et évaluerons leur application thérapeutique pour des ostéosarcomes de mauvais pronostic.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera les éléments précliniques permettant d’évaluer l’effet thérapeutique d'une nouvelle molécule et de mieux comprendre les mécanismes liés à cette molécule. Cette molécule a le potentiel de vaincre la résistance des cancers à certaines chimiothérapies et est la première de sa classe à entrer en clinique prochainement. Le traitement pourra être utilisé dans des essais cliniques sur l’ostéosarcome pour améliorer la survie des patients de mauvais pronostic.

Procédures

Une procedure chirurgicale unique sera réalisée pour le développement des greffes de tissus de patients, avec une durée maximale de 5-10min par souris. Les souris seront soumises à des traitements par voie orale de 2 à 4 fois par semaine pendant 3 à 10 semaines (durée 1 minute). Un prélèvement de sang unique sera réalisé, sous anesthésie générale, pour les études fonctionnelles (durée: 5-10 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables seront liés aux interventions (greffes, gavages) et à la présence de tumeurs sous la peau. Dans le cas des modèles d’ostéosarcome sous-cutané les animaux peuvent aussi potentiellement développer des métastases.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin d'étudier au mieux la réponse antitumorale mise en place après traitement par notre molécule.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, osseux…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l’efficacité de la molécule XCE853 et son lien avec les mécanismes oncogéniques et métastatiques des cancers à mauvais pronostics mais également explorer et valider l'efficacité de thérapies susceptibles d’être utilisées chez les patients.

Réduction

Peu de modèles d’ostéosarcome sont décrits, ce qui montre la difficulté d'obtenir un modèle stable et représentatif de cette maladie. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les doses seront calibrées par rapport à la littérature et sur nos résultats obtenus in vitro. Pour les modèles issus des patients, la quantité de tissu disponible est limitée donc, selon les évaluations sur les lignées cellulaires in vivo, les modèles PDX seront choisis afin de compléter les observations sur les lignées cellulaires in vivo. Considérant un taux d'échec de greffe de 50%, nous considérons donc un effectif de 30 animaux par groupe pour obtenir 15 animaux traités par groupe pour l’efficacité et un effectif de 20 animaux par groupe pour obtenir 10 animaux traités pour la pharmacodynamique.. Trois modèles cellulaires (2 lignées résistants au traitement actuel et la lignée parental) et 5 modèles PDX d'ostéosarcome, représentant l'hétérogénéité de la maladie seront utilisés et chaque modèle sera traité avec la molécule d'intérêt administrée seule et en combinaison avec des chimiothérapies utilisées dans le traitement de la maladie et supposées avoir une synergie avec la nouvelle molécule d’après nos études préliminaires. Afin de réduire le nombre d'animaux implantés, nous avons choisi de réaliser un suivi du développement tumoral longitudinal par imagerie. Dans notre étude, l’imagerie sera utilisée pour une analyse, de façon à confirmer la présence/croissance tumorale et le développement des métastases.

Raffinement

Les souris sont greffées et imagées sous anesthésie générale . Les animaux sont surveillés chaque jour après la chirurgie afin de détecter toute modification dans le comportement/déplacement de l'animal. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de détecter précocement un développement de la tumeur. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. De plus, si nous détections des signes de douleur, nous donnerions un antalgique ou morphinique pour soulager les animaux. Toutes les injections seront précédées d’une anesthésie locale . Les animaux sont stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement adapté à l'espèce sera systématiquement ajouté dans les cages. Un enrichissement supplémentaire pourra être ajouté si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie notamment du fait de l'existence de souches immunodéprimées qui permettent le développement de tumeur d'origine humaine. D'après notre expérience, nous avons pu observer que l’ostéosarcome se développe mieux chez la souris immunodéficiente, aussi les métastases semblent se développer davantage chez ces souris, ce qui en fait un modèle de choix pour notre projet. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance et l'adolescence. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des jeunes animaux âgés de 4 semaines à 6 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement.