Recherche appliquée

292 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont hébergées seules et soumises à un régime gras et sucré pauvre en fibres pendant dix semaines, avec des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces sur près de deux ans, pour étudier l'effet d'une rupture de la symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement et la descendance. Le porteur surveille la perte de poids pour qu'elle ne dépasse pas 20 %, seuil au-delà duquel les souris seraient mises à mort. Les retombées annoncées pour l'humain restent renvoyées à une compréhension future, et il affirme que le recours à l'animal s'impose faute de pouvoir modéliser cette dynamique.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles (obésité, diabète, asthme, cancer, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à une mauvaise alimentation. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres dans la composition du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Cette altération de la symbiose microbiote-hôte est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Cette symbiose altérée est associée à différentes maladies chroniques et a été décrite chez l’animal et l’humain. Elle se caractérise souvent par une diminution de la richesse du microbiote et de ses fonctionnalités. L’objectif de notre projet est d’évaluer la possibilité d’une rupture de la symbiose microbiote-hôte par l’utilisation d’un régime dit « occidental », riche en gras, en sucre et appauvri en fibre, qui chez l’animal induit une perméabilité intestinale et une inflammation intestinale et globale. Au travers de ce projet, nous souhaitons évaluer l’impact de la rupture de symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement des animaux et sa transmission à la descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’homme et permettront d’indentifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée et en partie associées à une mauvaise alimentation. De nombreux travaux en lien avec un régime alimentaire déséquilibré témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal associée à une dérégulation métabolique de l’hôte. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance d’un déséquilibre dans la symbiose microbiote-hôte conduit souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire déséquilibré et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et riche en gras et en sucre d'une durée de 10 semaines susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout au long de l'expérimentation excepté lors des périodes de reproduction et de sevrage. Les cages seront transparentes et sans couvercle filtrant afin de maintenir des contacts visuels, olfactifs et sonores entre congénères. Des prélèvements de sang (n=24) pendant 96 semaines seront effectués sur toute la durée de la procédure. Nous effecturons aussi des gavages (n=30) et prélèvements de fécès (n=150) tout au long de l’étude. La durée d'un prélèvement de sang est d'une trentaine de secondes de même que celle d'un gavage . Les fèces seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne, hebdomadaire ou mensuelle en fonction des différentes périodes établies dans la procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur ingéré alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition au régime. Le poids et l'ingéré de ces animaux sera surveillé hebdomadairement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. Les contentions, les prises de sang et le gavage des animaux avec des solutions neutres pour leur santé pratiqués par un expérimentateur confirmé constitueront un stress modéré et limités dans le temps (quelques secondes).

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nous proposons d’étudier l’impact d’un régime nutritionnel de type occidental à la fois sur la longévité de l’animal et sa descendance. D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 168 animaux, pour le groupe expérimental et 124 animaux pour le groupe controle, sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les animaux hébergés individuellement auront des contacts visuels, olfactifs et sonores. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux et leur comportement.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris C57Bl6. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris est anesthésiée et intubée pour recevoir dans les poumons une injection unique d'un composé induisant une inflammation de type BPCO. Le porteur indique une possible blessure de la trachée et des difficultés respiratoires liées au développement de l'emphysème. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne reproduit la complexité de la maladie et de la circulation des cellules immunitaires, les applications thérapeutiques étant renvoyées au long terme.

Objectifs

La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est une maladie chronique respiratoire. Chez les personnes atteintes, une inflammation des voies aériennes entraîne des perturbations dans le fonctionnement normal des poumons. Les alvéoles pulmonaires qui permettent les échanges gazeux lors de la respiration sont progressivement détruites, conduisant à un emphysème. On estime que la BPCO atteint 3,5 millions de personnes en France, soit 7,5% de la population. La maladie est plus fréquente chez les fumeurs, le tabac étant le principal facteur de risque. Les cellules du système immunitaire participent à la maladie et pourraient constituter une cible thérapeutiques intéressante. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires dans la BPCO.

Bénéfices attendus

A court terme sur un plan fondamental, ce projet permettra de faire avancer les connaissances scientifiques concernant la circulation et la prolifération des cellules immunitaires. Sur un plan pathologique, ce projet pourra déterminer la contribution des cellules immunitaires dans la BPCO. A plus long terme, cela permettra de proposer des applications thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires dans cette pathologie.

Procédures

La BPCO est induite chez les souris par une injection unique, directement dans les poumons, d'un composé provoquant une inflammation. Pour cela les souris sont anesthésiés (environ 20 minutes) et intubées le temps de l'injection (environ 5 minutes).

Impact sur les animaux

En de rares occasions, une blessure de la trachée pourra être observée . Le développement de l’emphysème pourrait s’accompagner de difficultés respiratoires.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Une évaluation exhaustive de la bibliographie nous a confirmé qu'il n’existe pas de modèle non animal permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes à l’œuvre au cours de la BPCO et de la circulation des cellules immunitaires entre les organes. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons utilisé une analyse statistique a priori afin de limiter le nombre d’animaux au strict minimum.

Raffinement

La méthodologie utilisée a été optimisée dans le laboratoire afin de limiter l'utilisation des animaux. Les souris feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter tout stress et souffrance et d'y pallier. Avant la procédure expérimentale, les souris seront anesthésiées afin d’éliminer la souffrance potentielle due à la procédure. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle n'utilisant pas les animaux capable de reproduire la complexité de la réponse immunitaire, le recours à l’animal est donc nécessaire. La souris est couramment considérée comme le modèle le plus proche de l'Homme pour l’étude du système immunitaire. L'utilisation de souris jeunes est indispensable puisque l’altération des poumons est un processus normal du vieillissement qui pourrait impacter sur les résultats.

15 910 souris et 972 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un modèle de souris à phénotype dommageable dont environ 30 % meurent dans les premières 48 heures et 10 % développent des complications sévères comme une hydrocéphalie ou des troubles respiratoires. Les souris subissent des prélèvements sanguins jusqu'à sept fois par semaine, une biopsie d'oreille et des injections, les mini-porcs des prélèvements de sperme, de sang et des injections. Il affirme que le projet ne peut se faire sans modèle animal, le bénéfice pour les patients d'une maladie osseuse rare étant présenté comme "éventuel" et à long terme.

Objectifs

Le but de ce projet est de développer un traitement pour une pathologie osseuse rare. Il s'agit d'une maladie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de l'oeil et d’une perte d'audition. Ce projet a pour but de continuer le développement d’un potentiel traitement pour cette pathologie. Ce projet nécessite l'utilisation de souris atteintes de la maladie mimant la pathologie humaine ce qui permettra de tester l’approche thérapeutique validée et l’améliorer.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour cette maladie rare. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice éventuel à long terme pour ces patients.

Procédures

Souris: prélèvements de sangs (30s), maximum 7 fois par semaine pour les microprélèvements et 1 fois par semaine pour les prélèvements de 7,5% du volume sanguin circulant. biopsie d'oreille (quelques secondes), une fois dans la vie de l'animal. Injection 1 à 3 fois dans la vie de l'animal (30sec à 10min) Miniporc: prélèvements de sperme (10-20min), maximum 1 fois par semaine. injections (1-60min), maximum 1 fois par semaine dans la vie de l'animal sauf pour les injections terminales 2 dans la même journée. prélèvements de sang (3-10min), maximum 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

Le modèles de souris utilisé dans ce projet est à phénotype dommageable. En effet, les animaux malades présentent des complications qui surviennent de façon chronologique et si les souris survivent les premières semaines, elles restent modérément atteintes. Environ 30% des animaux malades meurent dans les 48 premières heures et environ 10% développent des complications sévères (hydrocéphalie, pectus excavatum, troubles respiratoires) dans les 3 premières semaines de vie. Une attention toute particulière est apportée à ces animaux qui sont surveillés quotidiennement dès leur naissance. En ce qui concerne les souris et miniporc non malades, il n'y a pas d'effets indésirables prévues suite aux procédures. Il s’agit d’injection et de prélèvements réalisés par des personnes compétentes et formées. Les tampons qui sont prévus d’être utilisés sont à pH physiologique et peu visqueux.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures seront euthanasiès à la fin des procédures afin de pouvoir analyser les organes.

Remplacement

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de cette pathologie osseuse, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé de manière à produire les animaux nécessaires pour la partie expérimentation. Nous avons inclus dans les procédures des contrôles communs dès que possible.

Raffinement

Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude.

Choix des espèces

Ce projet développe un traitement pour une pathologie rare de la croissance. Nous allons avoir besoin de souris pour faire du criblage de thérapie. Cela permet de cribler un grand nombre de molécules rapidement (gestation courte de 3 semaines et 5 à 8 petits en moyenne par portée). Le mini porc est utilisé pour démontrer la pénétration de l'approche thérapeutique dans la plaque de croissance d’une espèce non-rongeur. La plaque de croissance du mini porc est proche de celle de l’homme, donc cette espèce est un bon modèle dans le cadre de cette étude. Nous travaillons sur les porcelets, ce modèle permet d’avoir entre 6 et 10 petits par mise-bas et donc raffiner le nombre de femelles nécessaires. Nous allons utiliser des souris qui sont un mutant spontané caractérisé à l'état homozygote. Ces animaux ont un phénotype de nanisme similaire à la pathologie humaine. Chez la souris, les études de bio distribution seront réalisées sur des animaux âgés de 5 à 8 semaines et pour les études d’efficacité nous utiliserons les animaux de la naissance jusqu’à 18 mois d’âge. Dans le cas des mini porcs, les porcelets seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 12 mois maximum et les génitrices jusqu’à ce que les porcelets soient euthanasiés. Il n’est pas possible de remettre les génitrices en croisement après la mise bas. Cela nous permet de couvrir tous les âges potentiels d’utilisation du traitement chez l’homme.

7 200 souris, 1 200 rats et 1 600 hamsters vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever le sang et les organes lymphoïdes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette société de prestation les expose à des composés vaccinaux ou pharmacologiques par une à cinq injections sous anesthésie, afin de mesurer la réponse immunitaire induite. Le porteur indique attendre des pertes de poids et des douleurs transitoires au point d'injection. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité observée in vivo, l'évaluation chez l'animal étant présentée comme "nécessaire" pour sélectionner les candidats médicaments.

Objectifs

Notre société développe et propose des modèles de recherche, adaptés aux études visant à mesurer l’efficacité et l’innocuité de candidats thérapeutiques et vaccinaux. La réponse du système immunitaire est une composante importante de notre organisme à considérer dans le développement de nouveaux vaccins ou de nouveaux composés pharmacologiques, en particulier d’origine biotechnologique. En pratique, ces études consistent à injecter, dans la plupart des cas à plusieurs reprises à une ou plusieurs semaines d’intervalle, un produit à potentiel immunogène, dans le but d’évaluer la réponse immunitaire induite (dans le sang et les tissus lymphoïdes). Ce programme de recherche s’intéresse à mieux caractériser cette composante chez le rongeur, et plus particulièrement l’immunogénicité de nouvelles formulations ou composés (adjuvants, vaccins, protéines thérapeutiques, etc.). Pour cela, un composé induisant potentiellement une réponse immune sera injecté aux animaux. Afin d’évaluer et de caractériser cette réponse immune, des prélèvements, sanguins notamment, seront ensuite réalisés tout au long de l’étude afin de suivre, par exemple, l’émergence d’anticorps dirigés contre l’antigène injecté dans le sérum, ou l’activation cellulaire associée spécifiquement au composé d’intérêt. Dans cette procédure, aucun challenge infectieux ne sera réalisé sur les animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif de pathologies existantes ou dont l’immunogénicité doit être testée. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées.

Procédures

Les animaux (rats, souris ou hamsters) immunocompétents ou partiellement immunodéficients (à un niveau de déficit n’induisant pas de risque infectieux significativement supérieur pour l’animal) transgéniques ou non, humanisés ou non, seront exposés à des composés de différente nature (entité chimique de type vecteur ou adjjuvant vaccinal, biologique, et/oubiotechnologique (nucléique et protéique), etc.) Les animaux recevront en général 1 à 5 injections administrations du produit potentiellement immunogène avec au minimum une semaine d’intervalle entre les injections mais potentiellement plusieurs mois. Cette procédure aura lieu sous anesthésie générale qui durera environ une heure. Afin d’évaluer de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale,soit sous anesthésie générale d’environ une heure, intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie, oralesoit sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ), sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon). Les volumes administrés respecteront les recommandations. Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au minimum 2 fois par semaine. Le site d’injection sera observé sur les quelques jours suivant l’administration pour surveiller l’absence de réactions dans la zone, et l’état général des animaux sera vérifié. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés au cours de la vie de l’animal pour le suivi des réponses immunitaires ou d’autres paramètres biologiques. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera environ une heure. La fréquence et le volume de ces prélèvements sera conforme aux recommandations vétérinaires pour la voie utilisée. Ces recommandations incluent une potentielle réhydratation sous cutanée des animaux en cas de prélèvements répétés / à volume important. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés. Un prélèvement de sang terminal en intracardiaque pourra être réalisé sous anesthésie générale profonde puis des prélèvements d’organes pourront etre effectués après euthanasie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous pouvons nous attendre à des pertes de poids et des douleurs transitoires au site d’injection et dans la zone (ganglion drainant).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour récupération de grandes quantités de sang et d’organes lymphoïdes afin de vérifier la réponse immunitaire induit par les vaccinations.

Remplacement

Des modèles in vitro permettent d’étudier certains processus de l’immunité et sont utilisés pour présélectionner les composés les plus intéressants mais aucun ne reproduit la complexité observée in vivo. C’est pourquoi l’évaluation chez l’animal des propriétés immunogènes des candidats médicaments chimiques ou biologiques est nécessaire, pour sélectionner le meilleur composé pouvant être amené dans les études cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Entre 3 et 50 animaux seront inclus par groupe. Seuls des rats, souris et hamsters seront utilisés dans le cadre de ce projet. Ces espèces sont utilisées pour tester les effets de composés sur le système immunitaire.

Raffinement

Les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible. Les volumes et fréquences d’administration et de prélèvement sont conformes aux bonnes pratiques et toutes les techniques sont réalisées par du personnel formé et compétent. Enfin, les prélèvements d’organes/tissus sont réalisés après euthanasie. Dans tous les cas, les animaux sont observés régulièrement et des mesures sont mises en œuvre pour arrêter, minimiser ou diminuer la souffrance et/ ou détresse de l’animal en cas d’apparition de signe clinique indésirable.

Choix des espèces

Les études à l’aide des petits rongeurs, notamment les souris, sont depuis longtemps la première étape de l’exploration du rôle physiopathologique du système immunitaire ou de l’efficacité de tout nouvel immunomodulateur, qu’il soit d’origine chimique ou biotechnologie. Selon le type de profil immunologique ou le type de prélèvement nécessaire, le rat et le hamster pourront également être utilisés. L’excellente connaissance du système immunitaire des rongeurs, conduisant souvent à une meilleure connaissance du même système chez l’Homme, permet d’explorer de nouvelles pistes immuno-pharmacologiques. Les animaux pourront être partiellement immunodéficients (à un niveau de déficit n’induisant pas de risque infectieux significativement supérieur pour l’animal), puisque cela s’avère d’un fort intérêt pour certaines approches expérimentales pathologiques e.g. maladies infectieuses. Par ailleurs, les rats, les souris et les hamsters autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement. Seuls les animaux sevrés seront utilisés. Les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles, c’est-à-dire un système immunitaire établi, d’après la littérature sur le sujet.

1 130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue car porteuses d'une pathologie qualifiée de létale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie, des injections répétées par plusieurs voies et une nébulisation pour tester des nanoparticules chargées de chimiothérapie contre la carcinose péritonéale. Le porteur indique des douleurs post-opératoires, un gonflement de l'abdomen et une possible perte de poids, l'imagerie servant à repérer les points limites. Il affirme que les interactions entre système immunitaire et tumeur ne peuvent être reproduites in vitro, les bénéfices étant présentés comme une amélioration attendue du traitement.

Objectifs

Ce projet vise à étudier de nouveaux traitements à base de nanoparticules pour la carcinose du péritoine. La carcinose péritonéale est une évolution fréquente de plusieurs cancers intestinaux et gynécologiques et constitue la principale cause de décès chez ces patients. Les thérapies actuelles ne permettent pas aux agents de chimiothérapie d’atteindre efficacement le péritoine. Cela entraîne une mauvaise distribution et pénétration des principes actifs dans la tumeur, générant une mauvaise réponse au traitement pouvant évoluer vers une résistance aux thérapies.

Bénéfices attendus

L'intérêt de cette approche réside dans l'amélioration du traitement et du pronostic des patients souffrant de carcinose péritonéale. Plus largement, l'utilisation de la nébulisation combinée à l'utilisation de nanoparticules pour délivrer des chimiothérapies améliorera la diffusion des médicaments dans la cavité péritonéale et augmentera la pénétration des médicaments dans les nodules tumoraux. Le bénéfice immédiat pour les patients sera la réduction de la fréquence des traitements, la réduction des effets secondaires dus à l'administration systémique des principes actifs et la détermination d’un nouveau mécanisme d’action des nanoparticules basé sur la modulation de la réponse immunitaire.

Procédures

- procédure chirurgicale - 15 min ; imagerie par bioluminescence - 2 min ; injections - >1 min (voie intraveineuse, voie intrapéritonéale, voie sous-cutanée); nebulisation 5 sec; anesthesie - max 20 min. Nombre d'injections: Si bioluminescence: 15 maximum (1 chaque dueux jours) (voie intrapéritonéale) Si tumeur: 1 (voie intrapéritonéale) Si traitment:1 (voie intrapéritonéale ou voie intraveineuse) Si analgesie: maximum 3 ( voie sous-cutanée)

Impact sur les animaux

Effets dus à la chirurgie: - doleur post-operatoire - diminution des mouvements dans la cage. Effets dus au modele tumoral: - un gonflement de l'abdomen - une éventuelle perte de poids. Effet dus à l'administration des produits: - aucun

Devenir

Tous les animaux sont mis a mort a la fin des procedures car, ils sont tous atteint d'une pathologie lethale

Remplacement

L’utilité prédictive des modèles tumoraux chez la souris ne peut pas être remplacée par des études in vitro. L'activité des cellules immunitaires liée à des tumeurs est régulée par de nombreux facteurs dont la plupart sont encore inconnus et donc impossible à reproduire in vitro. Il est très compliqué de recréer in vitro toutes les interactions entre le système immunitaire, les cellules accessoires secondaires et la tumeur car, à l'heure actuelle, toutes ces interactions ne sont pas encore totalement maitrisées. De plus, l'évaluation d'une nouvelle approche thérapeutique, comme celle décrite dans ce projet, doit tenir compte de l'effet du principe actif et de la procédure sur la santé globale de l'animal, ce qui ne peut être réalisé in vitro. Des tests in vitro ont déjà été réalisés pour évaluer la cytotoxicité des nanoparticules sur les lignées tumorales et la capacité des nanoparticules à libérer correctement le médicament et le moment de la libération.

Réduction

Le nombre d'animaux a été estimé par les biostatisticiens comme étant le minimum nécessaire pour obtenir des résultats exploitables. Cette estimation permettra d'analyser avec précision un nombre suffisant d'animaux et d'obtenir des résultats avec une marge d'erreur très faible, évitant ainsi des résultats non concluants et la nécessité de répéter l'étude pour valider les données. Le projet étant conçu par étapes successives, le nombre d'animaux calculé à chaque étape peut être réduit en fonction des résultats obtenus aux étapes précédentes : en fonction de la précision et de la reproductibilité interindividuelle de la croissance tumorale dans le temps, il sera possible de réduire le nombre d'animaux requis pour les expériences suivantes. Par ailleurs, en cas de croissance tumorale lente, il sera possible d'échelonner les séances de bioluminescence afin de réduire le nombre d'anesthésies et d'injections intrapéritonéales que les animaux devront subir.

Raffinement

Les protocoles les moins invasif et le moins douloureux possibles sont privilégies. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d’élevage et de bien-être afin d’enrichir l’environnement des souris. Les animaux porteurs de tumeur sont suivis quotidiennement pour éviter tout souffrances inutiles, et prendre les mesures adéquate dans le cas éventuelle d’apparition de nuisances. Les animaux ayant subit une chirurgie seront monitorés plus suivant et un protocole antalgique est mis en place. L’imagerie par bioluminescence nous permet de déterminer de manière précoce l’apparition des signes de catégorie point limite et ainsi, d’intensifié le suivi des animaux lors de cette étape intermédiaire et d’agir en conséquence (Analgésique ou mise a mort). L’apparition de signe point limite conduit automatiquement a une mise à mort de l’animale concerné pour lui éviter toute souffrance inutile

Choix des espèces

Les souris utilisées sont le modèle primaire et le plus utilisé pour les études oncologiques impliquant le système immunitaire. Le mécanisme immunitaire des souris est largement décrit dans la littérature et de nombreux outils de diagnostic sont disponibles pour effectuer des analyses immunologiques par rapport à d'autres modèles comme les rats. De plus, la disponibilité de différentes lignées cellulaires tumorales murines qui imitent les tumeurs humaines permet d'utiliser des animaux immunocompétents. Les souris seront adultes, âgées de 8 à 10 semaines, car il est nécessaire que le système immunitaire soit développé et mature.

3 860 souris et 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever la rate et la tumeur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent une immunisation sous la peau et, pour une partie, une implantation de cellules tumorales, le porteur les mettant à mort dès que la tumeur s'ulcère, se nécrose ou dépasse un volume fixé. Il indique tester un adjuvant à base de mélanine pour un futur vaccin contre le glioblastome, tout en affirmant que la souris est l'espèce "la plus adaptée" et que le modèle de gliome implantable n'existe que chez le rat. Les retombées cliniques sont renvoyées après sélection d'un candidat et poursuite du développement pharmaceutique.

Objectifs

Le cancer reste une maladie souvent mortelle, pour laquelle la recherche de traitements innovants est requise. L’induction d’une immunité contre un antigène cible par vaccination à l’aide d’adjuvants classiques (tels que ceux utilisés dans les vaccins anti-infectieux) permet d’obtenir facilement des anticorps circulants. Ces anticorps sont cependant peu efficaces pour lutter contre les tumeurs. L’obtention de lymphocytes T capables de tuer les cellules cancéreuses est plus difficile car les adjuvants disponibles actuellement donnent généralement des réponses faibles ne permettant pas d’induire une réponse antitumorale satisfaisante. Nous avons récemment découvert que la mélanine synthétique utilisée en tant qu’adjuvant vaccinal permettait de stimuler de façon exceptionnelle la réponse immunitaire lymphocytaire contre un antigène peptidique donné (i.e. un fragment de protéine surexprimée ou bien anormalement exprimée par les cellules cancéreuses et présenté à leur surface). Notre but est de poursuivre le développement de notre adjuvant afin d’obtenir à terme un vaccin thérapeutique pour le traitement des cancers humains, en nous concentrant plus particulièrement sur le glioblastome, la plus fréquente des tumeurs cérébrales, pour lequel il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement satisfaisant. Des peptides cibles issus de protéines exprimées dans les glioblastomes humains seront sélectionnés, puis validés par des tests in vitro. La capacité de ces peptides associés à notre adjuvant à base de mélanine à induire une réponse immunitaire et à contrôler la croissance tumorale, sera évaluée in vivo chez la Souris ou le Rat. L’étude chez l’animal est indispensable pour mesurer une réponse immunitaire par lymphocyte et la Souris constitue l’espèce la plus adaptée pour les études immunologiques. Comme il n'existe pas de modèle de gliome implantable en sous-cutané chez la Souris, les effets anti-tumoraux de nos formulations seront évalués chez le Rat, pour lesquels un tel modèle existe.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra la sélection d’un candidat vaccin pour le traitement du glioblastome, dont nous poursuivrons le développement pharmaceutique avant d’initier les essais cliniques chez l’Homme. A l'issue de ce projet nous aurons : 1- Sélectionné deux peptides-candidats issus de protéines surexprimées ou anormalement exprimées par les gliomes humains 2- Déterminé la formulation (ratio peptide/mélanine, temps de contact) permettant d'obtenir une réponse imunitaire optimale pour chacun des deux peptides 3- Réalisé les études de stabilité de notre adjuvant à base de mélanine synthétique sur 3 ans

Procédures

Les immunisations seront réalisées par injection sous la peau sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une ou deux injections (à deux semaines d'intervalle) seront réalisées par animal. Les implantations de cellules tumorales sous la peau seront réalisées sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une seule implantation sera effectuée par animal.

Impact sur les animaux

L’injection du vaccin est susceptible de provoquer une rougeur, un gonflement, une démangeaison ou une douleur au point d'injection, ce qui fera l'objet d'une surveillance quotidienne. Il est cependant à noter qu'aucune des expériences menées à ce jour n'a mis en évidence de tels effets indésirables. Dans les expériences impliquant l’implantation d’une tumeur sous la peau, un effet indésirable potentiel est l'apparition d'une ulcération ou d'une nécrose de la tumeur. Une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place et il sera procédé à leur mise à mort en cas d'ulcération ou de nécrose de la tumeur ou bien dès que celle-ci atteindra un volume déterminé à l’avance et adapté à l’espèce.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chacune des procédures afin de pouvoir obtenir le matériel biologique (rate, tumeur) nécessaire à l'évaluation de la réponse immunitaire.

Remplacement

Il s’agit d’une étude qui nécessite d’être réalisée in vivo pour évaluer la réponse immunitaire et antitumorale après immunisation par voie sous-cutanée. Aucun modèle in vitro n’est en effet prédictif d’une réponse immune chez l’animal ou chez l’Homme, en raison de la complexité des mécanismes biologiques impliqués (interactions cellules présentatrices des antigènes-lymphocytes, interactions cellules immunitaires-tumeur (y compris microenvironnement tumoral)). Cependant, les corrélations entre les résultats obtenus chez l’animal et les résultats des études in vitro menées en parallèle seront évaluées en permanence dans l’objectif de remplacer le modèle in vivo par la prédiction in vitro lorsque cela sera possible.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données. Les protocoles de ce projet utiliseront des modèles validés par la littérature, permettant d’obtenir des résultats reproductibles et ainsi de limiter la multiplication des expériences. De plus, les expériences sont conçues de façon à utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs préparations vaccinales ce qui permettra de limiter encore davantage le nombre d’animaux. Au total, 3980 animaux seront utilisés dans ce projet, 3860 souris et 120 rats.

Raffinement

Les expériences nécessiteront des procédures peu traumatisantes. Toutes les injections sont effectuées sous anesthésie générale. Les vaccins sont formulés de façon à être bien tolérés et à ne pas induire de douleur ou de réaction indésirable au point d’injection. Chez les animaux porteurs de tumeurs, la croissance tumorale est mesurée tous les 2 à 3 jours à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui constitue une procédure non invasive, non douloureuse et peu perturbante pour l’animal. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de déceler précocement des signes de souffrance et d’y mettre un terme par une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

Souris : La souris est le modèle de choix pour l'étude de la réponse immunitaire. Le système immunitaire des souches utilisées dans ce projet est bien caractérisé et de nombreux outils immunologiques sont disponibles (bases de données et outils de prédiction in silico, réactifs et méthodes permettant d’étudier et de mesurer l’intensité la réponse immunitaire). Il existe un modèle de souris transgéniques dont le système immunitaire est capable de reconnaitre les antigènes tumoraux humains, que nous pourrons utiliser pour valider notre candidat vaccin avant passage aux essais cliniques chez l’Homme. Rat : Il n’existe pas de modèle de glioblastome implantable en sous-cutané chez la Souris. En revanche, il existe un modèle reconnu chez le Rat, que nous allons utiliser dans ce projet. Les animaux seront agés de 5 à 7 semaines en début d’expérimentation, ce qui permet d’utiliser des animaux jeunes adultes dotés d’un système immunitaire mature.

288 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans la trachée de la bléomycine puis des cellules bronchiques issues de patients, suivies de quatre à cinq injections et, pour certaines, de deux gavages par jour pendant treize à dix-sept jours. Le porteur indique que les instillations provoquent une gêne respiratoire, que la maladie induite peut aggraver la difficulté respiratoire en fin de protocole et que le gavage peut entraîner une inflammation de l'œsophage voire des saignements. Il conclut que l'étude ne peut se faire qu'in vivo car les réactions dépendent de l'"organisme entier" intact, l'usage clinique de l'anticorps étant renvoyé à un horizon de trois à cinq ans.

Objectifs

Ce projet est une étude pharmacologique visant à tester un anticorps thérapeutique dirigé contre une protéine humaine exprimée dans les poumons et pour le traitement de la fibrose pulmonaire dans un modèle de souris humanisées. La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) chez l'homme est caractérisée par une perte irréversible et progressive de la capacité pulmonaire due à un remodelage de l'arbre pulmonaire avec développement de tissus cicatriciels. Le pronostic de cette maladie est extrêmement limité avec une survie médiane de 2-3 ans. En dehors de la transplantation pulmonaire, aucune option thérapeutique convaincante n'est actuellement disponible. Seules certaines molécules permettent de ralentir la progression de la maladie. Le développement de médicaments pour cette maladie mortelle est donc essentiel. Dans cette maladie, la prolifération aberrante des certaines cellules appelées cellules basales bronchiques contribue au mécanisme pathologique central de la FPI. Ces cellules basales bronchiques humaines (cellules basales des voies aériennes ou cellules ABC) sont des cellules de l'arbre bronchique qui peuvent proliférer in vitro après avoir été prélevées par frottis. Des travaux préliminaires ont démontré qu’un modèle de souris humanisées de FPI peut être établi par administration de ces cellules ABC issues de patients atteints de FPI dans les poumons des souris. En revanche, l'administration de cellules ABC provenant de volontaires sains n'entraîne pas de maladie. À l'aide de ce modèle de souris humanisées de FPI, nous souhaitons tester l’efficacité d’un anticorps thérapeutique qui s’est déjà montré efficace pour le traitement d’autres pathologie du foie et des reins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait développer une stratégie thérapeutique pour les patients qui souffrent de fibrose pulmonaire idiopathique. Cet anticorps est déjà en développement clinique pour le traitement de maladies du foie et des reins. Les résultats positifs de ce projet permettraient utilisation de cet anticorps chez les patients atteints de FPI à moyen terme (3 à 5 ans).

Procédures

Les animaux subiront le premier jour une instillation dans la trachée de bléomycine pour induire la maladie pulmonaire, et le 4ème jour de cellules bronchiques issus de patients. Cet acte est réalisé sous anesthésie générale gazeuse et dure environ 1 minute. Les animaux recevront ensuite 4 ou 5 injections sur une période de 13 à 17 jours. Ces injections sont faites sur animaux vigiles et prennent moins d’une minute à être réalisées. Certains animaux recevront un gavage oral 2 fois par jour pendant 13 à 17 jours. Le gavage oral est également réalisé en moins d’une minute et est réalisé sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les instillations dans la trachée vont engendrer une gêne respiratoire qui peut perdurer quelques heures (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder au prélèvement des poumons.

Remplacement

Les processus réactionnels étudiés dans ce projet dépendent de l'organisme entier intact. Il s'agit d'une analyse structurelle et fonctionnelle de l'architecture pulmonaire, qui ne peut être étudiée dans son intégralité dans des cultures cellulaires. Il n’est donc pas possible de remplacer l’étude sur les animaux pour ce projet.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents nous permettant de conclure quant à l’efficacité de notre approche. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire. La taille des effectifs a été déterminée à priori en se basant sur les résultats d’une expérience menée par des collaborateurs et en utilisant une approche statistique préalable. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques paramétriques et/ou non paramétriques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre de manière précoce les procédures permettant de soustraire les animaux à la souffrance si besoin. Une méthode anesthésique (isoflurane) est appliquée lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement, et une observation scorée est réalisée 2 fois par semaine.

Choix des espèces

Le modèle de fibrose pulmonaire induite chez la souris est un des modèles les plus utilisé pour étudier cette maladie. Les souris utilisées sont immunodéficientes et ne rejettent pas les cellules humaines greffées. Ce modèle nous permet ainsi d’étudier le comportement de cellules pulmonaires (cellules basales des bronches ou cellules ABC) issues de patients atteints de maladie pulmonaire et de tester des approches thérapeutiques dans un contexte humain. Les animaux d’un âge adulte de 10-15 semaines seront utilisé, cette pathologie étant une maladie apparaissant à l’âge adulte, surtout chez les personnes de + de 50 ans.